检测OTOF基因C3316_3321INSC突变的试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102864215 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102864215 A *CN102864215A* (21)申请号 201210172352.6 (22)申请日 2012.05.29 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 王秋菊 地址 100853 北京市海淀区复兴路 28 号 申请人 中国人民解放军总医院 (72)发明人 王秋菊 (74)专利代理机构 北京律诚同业知识产权代理 有限公司 11006 代理人 黄韧敏 (54) 发明名称 检测OTOF基因c.3316_3321insC突变的试剂 盒 (57) 摘要 本 发 明 提。

2、 供 了 检 测 OTOF 基 因 c.3316_3321insC 突变的试剂盒， 通过检测患者 中是否存在该突变基因而诊断感音神经性聋及听 神经病 / 听神经病谱系障碍发生的原因和类型。 该突变基因和检测方法将有利于临床上开展感音 神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍患者 的 OTOF 突变筛查工作， 为感音神经性聋及听神经 病 / 听神经病谱系障碍患者的诊断和治疗提供依 据。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 12 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 12 页 附。

3、图 8 页 1/1 页 2 1. 一种用于检测与感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍相关的位于 OTOF 基 因的 c.3316_3321insC(X1177) 突变的试剂盒， 所述试剂盒包括 ： 从待测样品中提取 DNA 的试剂 ； 用于扩增样本 DNA 的 PCR 反应试剂 ； 对 PCR 扩增产物进行测序的试剂 ； 其中， 所述扩增样本 DNA 的 PCR 反应试剂包括 PCR 引物， 所述 PCR 引物扩增的目标片段 包含 OTOF 基因第 3316-3321 位碱基。 2. 如权利要求 1 所述的试剂盒， 其中所述 PCR 引物为选自下述引物中的一对 ： OTOF-F-1:5。

4、 -CAGATCATGGCAAACAACTCAT-3 ， OTOF-R-1:5 -GGGATGACAAGCCACTTCC-3 ； OTOF-F-2:5 -TTTCCCTGTCTCCCCAGAT-3 ， OTOF-R-2:5 -CCTCCTGGGTCCTCAGACT-3 ； OTOF-F-3:5 -CTCTCCTACCCATCCTGACCA-3 ， OTOF-R-3:5 -GGGACATGGGAGTGCGACTT-3 ； OTOF-F-4:5 -CTGGGGGCGTGGTCCTTAG-3 ， OTOF-R-4:5 -CAGGAGCCTGGGTCTGCTG-3 。 3. 如 权 利 要 求 1 或。

5、 2 所 述 试 剂 盒， 所 述 试 剂 盒 用 于 检 测 位 于 OTOF 基 因 的 c.3316_3321insC 突变的方法， 包括以下步骤 ： 1） 采集待测个体的血液、 体液或组织样本， 提取 DNA ； 2） 以该 DNA 为模板， 以 PCR 引物进行 PCR 反应， 得到 PCR 反应产物 ； 其中， 所述 PCR 引物扩增的目标片段包含 OTOF 基因第 3316-3321 位碱基 ； 3） 将得到的PCR反应产物进行直接测序， 并将测序结果与OTOF正常基因的序列进行比 较， 确定是否存在 OTOF 基因的 c.3316_3321insC 突变位点。 4. 如权利要求。

6、 3 所述试剂盒， 所述步骤还进一步包括下述步骤 ： 4） 按照正常阅读框架进行翻译以确定 c.3316_3321insC 突变使氨基酸序列自 1108 位 发生移码改变， 并使氨基酸的编码提前终止于第 1177 位的氨基酸 （p.I1108H fsx69） 。 5.如权利要求1所述的试剂盒在用于检测感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障 碍中的用途。 权 利 要 求 书 CN 102864215 A 2 1/10 页 3 检测 OTOF 基因 c.3316_3321insC 突变的试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及基因检测领域， 具体涉及用于检测 OTOF 基因突变的试剂盒 ； 本发明还。

7、 涉及新的 OTOF 突变基因及其在诊断和 / 或治疗感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系 障碍的应用。 背景技术 0002 听 神 经 病 / 听 神 经 病 谱 系 障 碍 （Auditory Neuropathy Spectrum Disorders,ANSD） 是由第颅神经的听支受损而引起的一种特殊的感音神经性聋。表现为 声音可以通过外耳、 中耳正常的进入到内耳， 但声音信号不能同步地从内耳传输到大脑的 听功能异常性疾病。临床听力检查表现为诱发性耳声发射正常、 听性脑干反应严重异常的 一组听功能障碍症候群。听神经病谱系障碍多自幼年或青春期起病， 在高危婴幼儿中发病 率约为 0.23。

8、%， 在各种原因所致的 ABR 异常的聋病患儿中的发病率高达 11%， 无性别差异。 目前研究表明， 听神经病谱系障碍的发病主要和遗传、 免疫、 感染、 中毒、 代谢等相关因素相 关。 0003 按照是否合并其他系统疾病可将遗传性听神经病谱系障碍分为两类 ： 一类是合并 有其它颅神经和 / 或周围神经病损的综合征型疾病， 如 Charot Marie Tooth 综合征 :CMT1 型(脱髓鞘型)及CMT2型(轴突型)、 费里德赖希共济失调综合征等 ； 另一种是仅有听力下 降表现的非综合征型听神经病谱系障碍。非综合征型听神经病谱系障碍由于表型单一， 基 因型与表型之间有较好的对应关系， 逐渐成。

9、为近年来的研究热点。 Starr等根据发病部位的 不同将其分为 TYPE I 型 （病变部位在听神经） 和 TYPE II 型 （病变部位在内毛细胞及突触） 。 0004 按照遗传模式的不同可将遗传性听神经病谱系障碍分为常染色体显性遗传 （AUNA1)、 常染色体隐性遗传 （NSRAN） 和 X 连锁隐性遗传 （AUNX1) 以及线粒体 DNA 突变等。 2003 年， Varga 等运用连锁分析的方法， 将四个家系定位在包含 OTOF 基因所在的 2p23 区 域内， 确定 OTOF 为第一个发现且较为常见的与非综合征型听神经病谱系障碍相关的基因。 OTOF 基因 DNA 序列全长 1014。

10、96bp， 包含 48 个外显子， 定位于 2p23。OTOF 基因的编码区， 含 终止密码子， 如 SEQ ID NO.1 所示。OTOF 长亚型变异体的 mRNA 长度为 7172bp， 所编码的 蛋白质 otoferlin（如 SEQ ID NO.2 所示） 包含 1997 个氨基酸， 可能参与突触囊泡的融合。 Otoferlin 具有 6 个钙离子结合区域 （C2domain） ， 其中后 4 个含有完整的 5 个天冬氨酸残 基， 可以与钙离子结合， 且存在 1 个羧基端跨膜区域 （TM） ， 这些结构在脊椎动物都是高度保 守的。2006 年， Petit 教授研究小组观察到小鼠 ot。

11、of 基因编码的蛋白质 otoferlin 在耳 蜗内毛细胞与传入神经元所形成的带型突触处呈高表达。敲除 otof 基因的纯合小鼠表现 为极重度耳聋， 其内毛细胞带型突触形态保持正常， 钙离子流通也正常， 但是突触囊泡的胞 吐作用却完全废止， 因此得出结论 ： otof 基因编码的蛋白质 otoferlin 作为一种钙离子感 应器， 在内毛细胞带型突触处触发膜融合， 从而在内毛细胞突触囊泡的胞吐过程中发挥着 重要作用。因此由该基因突变导致的感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍患者病 变部位多在耳蜗内毛细胞或突触， 人工耳蜗手术治疗效果较好。而国内外对于听神经病谱 说 明 书 CN 10。

12、2864215 A 3 2/10 页 4 系障碍患者 OTOF 基因的筛查发现， 携带有该基因突变的听神经病谱系障碍患者临床多以 Type II 型表现为主， 适合于人工耳蜗植入手术治疗并可取得良好的效果。而 TYPE I 型听 神经病谱系障碍患者病变部位在听神经， 位置深在， 目前尚无有效的治疗方法。因此， 利用 对感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者的OTOF基因的检测进行辅助分型， 对 于临床治疗具有重要的指导意义。 发明内容 0005 本发明的一个目的在于提供用于检测OTOF突变c.3316_3321insC(X1177)基因的 试剂盒， 其技术方案为 ： 0006 一种用于检。

13、测与感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍相关的位于 OTOF 基因的 c.3316_3321insC(X1177) 突变的试剂盒， 所述试剂盒包括 ： 0007 从待测样品中提取 DNA 的试剂 ； 0008 用于扩增样本 DNA 的 PCR 反应试剂 ； 0009 对 PCR 扩增产物进行测序的试剂 ； 0010 其中， 所述扩增样本 DNA 的 PCR 反应试剂包括 PCR 引物， 所述 PCR 引物扩增的目标 片段包含 OTOF 基因第 3316-3321 位碱基。 0011 具体地， 上述 PCR 引物为选自 ： 0012 OTOF-F-1（SEQ ID NO.3） :5 -C。

14、AGATCATGGCAAACAACTCAT-3 ， 0013 OTOF-R-1（SEQ ID NO.4） :5 -GGGATGACAAGCCACTTCC-3 ； 0014 OTOF-F-2（SEQ ID NO.5） :5 -TTTCCCTGTCTCCCCAGAT-3 ， 0015 OTOF-R-2（SEQ ID NO.6） :5 -CCTCCTGGGTCCTCAGACT-3 ； 0016 OTOF-F-3（SEQ ID NO.7） :5 -CTCTCCTACCCATCCTGACCA-3 ， 0017 OTOF-R-3（SEQ ID NO.8） :5 -GGGACATGGGAGTGCGACTT-。

15、3 ； 0018 OTOF-F-4（SEQ ID NO.9） :5 -CTGGGGGCGTGGTCCTTAG-3 ， 0019 OTOF-R-4（SEQ ID NO.10） :5 -CAGGAGCCTGGGTCTGCTG-3 ； 中的一对。 0020 本 发 明 的 另 一 个 目 的 在 于 提 供 上 述 试 剂 盒 用 于 检 测 位 于 OTOF 基 因 的 c.3316_3321insC 突变的方法， 包括以下步骤 ： 0021 1） 采集待测个体的血液、 体液或组织样本， 提取 DNA ； 0022 2） 以该 DNA 为模板， 以 PCR 引物进行 PCR 反应， 得到 PCR 。

16、反应产物 ； 0023 其中， 所述 PCR 引物扩增的目标片段包含 OTOF 基因第 3316-3321 位碱基 ； 0024 3） 将得到的PCR反应产物进行直接测序， 并将测序结果与OTOF正常基因的序列进 行比较， 确定是否存在 OTOF 基因的 c.3316_3321insC 突变位点。 0025 进一步地， 上述方法还包括下述步骤 ： 0026 4）按照正常阅读框架进行翻译以确定 c.3316_3321insC 突变使氨基酸序列 自 1108 位发生移码改变， 并使氨基酸的编码提前终止于第 1177 位的氨基酸 （p.I1108H fsx69） 。 0027 本发明的又一个目的在于。

17、提供上述的试剂盒在用于检测感音神经性聋及听神经 病 / 听神经病谱系障碍中的用途， 将为在感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍患 者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法 ； 同时可以指导临床治疗， 并为将来利用这一 说 明 书 CN 102864215 A 4 3/10 页 5 突变作为靶点开展耳聋的基因治疗提供坚实的基础。 0028 使用本发明的试剂盒的检测方法为通过检测来自于患者的待测样本中是否存在 OTOF 基因 c.3316_3321insC 突变， 而判断该患者感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系 障碍发生原因及类型。其中， OTOF 基因的 c.3316_3321ins。

18、C 碱基突变使氨基酸序列自 1108 位发生移码改变 （p.I1108H fsx69） ， 并使氨基酸的编码提前终止于第 1177 位的氨基酸 （标 记为 X1177） ， 形成 Otoferlin 的截短肽链， 丧失其功能， 不成熟的表达产物诱导启动体内调 节机制， 使变异的 mRNA 降解。 0029 OTOF 基因突变相关的感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍以常染色体 隐性遗传的方式传递。发明人应用候选基因筛查的方法对 17 例非综合征型听神经病谱系 障碍患者和 100 例听力正常且无家族史的对照进行筛查， 在一例听神经病谱系障碍患者发 现OTOF基因的c.3316_3321i。

19、nsCX1177） 突变， OTOF基因突变与听神经病谱系障碍表型共分 离。目前国际上报道与感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍相关的突变有 80 余 种， 尚无 c.3316_3321insC 突变的报道。 0030 图 1 给出 OTOF 编码区氨基酸与核酸碱基的对照图， 并示出突变位点 （方框标记 处） ， 该突变使位于 OTOF 基因编码区的第 3316-3321 位中插入一个 C 碱基， 使得氨基酸编码 自第1108位发生移码， 在第1177位的氨基酸密码子变为终止密码子， 突变发生后基因表达 产物由正常的 1997 个氨基酸变成了 1176 个氨基酸肽链。截断的氨基酸肽链启。

20、动体内调节 机制， 使变异的 mRNA 降解。 0031 检测该突变可用本领域的任何检测点突变的方法来进行， 例如 PCR（聚合酶链反 应） - 测序法、 采用标记的 OTOF 基因 DNA 探针杂交法或用限制性片段长度多态性方法或序 列特异性引物的方法等等。 0032 在本发明的一个实施方案中， 采用PCR扩增-直接测序法来检测样本， 具体包括下 述步骤 ： 0033 1） 采集待测个体的样本， 例如血液、 体液或组织， 提取基因组 DNA ； 0034 2） 以该 DNA 为模板， 以针对 OTOF 基因或 OTOF 编码区第 3316-3321 位碱基附近设 计的 PCR 引物进行 PC。

21、R 反应， 得到 PCR 扩增产物 ； 0035 3） 将得到的PCR产物进行直接测序分析， 将所得到的序列与OTOF正常基因的序列 进行比较， 确定是否存在 OTOF 突变位点。 0036 4） 根据以上结果判断待测个体是否为 OTOF 基因突变 c.3316_3321insC 导致的听 神经病谱系障碍。 0037 进一步的， 该方法可以选择性的包括如下步骤 ： 0038 5） 按正常阅读框进行翻译以确定氨基酸是否存在自第1108位的移码至第1177位 的编码终止改变 （p.I1108H fsx69） 。 0039 在发明人进行的实验中， 通过聋病门诊及资源收集网络收集各种感音神经性耳聋 患。

22、者， 包括听神经病谱系障碍患者， 建立资源库。在患者自愿的前提下， 签署知情同意书 后， 留取 5-10ml 血样， 并建立门诊病历资料库， 详细记录患者病情、 家系中的发病情况以及 联系方式。然后， 应用酚氯仿抽提的方法提取基因组 DNA， 定量后入库， -20 C 保存， 每份 DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。 然后， 应用在线引物设计软件Primer3设计引 物， 包含 OTOF 整个编码区， 应用 PCR 扩增。PCR 产物直接测序 ： 测序引物与 PCR 扩增引物相 说 明 书 CN 102864215 A 5 4/10 页 6 同， 正反向测序， 应用 ABI 公司 37。

23、00DNA 测序仪。得到的序列与 Genbank 中的序列 （登录号 ： NC_000002.11） 比较确定 OTOF 突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定 OTOF 的突变位点。 0040 上述步骤 2 所得到的 PCR 反应产物还可以用杂交探针来检测， 所用的杂交探针可 以是与正常的 OTOF 核苷酸序列杂交， 或与突变的核苷酸序列杂交， 或与它们的互补序列杂 交的探针。 这些探针可以用放射性同位素、 发色物质或荧光物质标记， 尤其是可利用等位基 因特异探针， 也可用限制性酶切的方法筛查是否存在已被确定的突变。 0041 因此， 检测 PCR 扩增产物的试剂选自测序检测试剂、 限制性内切。

24、酶酶切检测试剂、 限制性长度多态性检测试剂、 序列特异性引物检测试剂和探针杂交检测试剂。在上述方法 中使用的PCR引物可以依据已知的核苷酸序列设计， 通常为1530个碱基， GC含量为45 50% 左右， 在适当的温度下与末端特异性结合， 其可以利用专门的计算机程序设计。在本发 明的一个具体实施例中， 应用在线引物设计软件 primer 3.0 设计了一对 PCR 引物， 其序列 为 ： 上游引物 :OTOF-F-1:5 -CAGATCATGGCAAACAACTCAT-3 (nt84507-nt84528) 下游引物 ： OTOF-R-1:5 -GGGATGACAAGCCACTTCC-3 （n。

25、t84767-nt84785） 0042 OTOF 正常基因的标准序列可以参考例如 Genbank ： NC_000002.11。 0043 用于检测 OTOF 基因 c.3316_3321insC 突变的试剂盒中可以包含以下试剂 ： 0044 用于扩增样本 DNA 中 OTOF 基因或 OTOF 基因编码区第 3316-3321 位碱基附近的 PCR 引物 ； 以及以下一种或几种试剂的组合 ： 0045 从待测样品中提取 DNA 的试剂 ； 0046 PCR 反应试剂 ； 0047 对 PCR 扩增产物进行直接测序的试剂。 0048 例如， 本发明的一个实施方案中提供一个检测OTOF基因c.。

26、3316_3321insC突变的 试剂盒， 容器内装有用以检测 OTOF 基因 c.3316_3321insC 突变的成分， 与之同时提供的可 以是经政府药物管理机构审核的、 有关药品或生物制品的制造、 使用及销售信息。例如， 采 用 PCR 扩增后， 直接检测样品中 OTOF 基因 c.3316_3321insC 突变位点的试剂盒， 可含有扩 增引物、 dNTPs、 用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液、 或测序反应所需试剂等的一种或多 种。本领域技术人员已知， 以上组分仅是示意性的， 例如， 所述的引物可以采用上述的一对 OTOF-F-1 和 OTOF-R-1 引物， 所述用于 PCR 。

27、反应的 DNA 聚合酶是能够用于 PCR 扩增的酶。 0049 所述试剂盒的使用方法主要包括如下步骤 ： 0050 （1） 提取待测血样的 DNA， 利用上述的一对 OTOF-F-1 和 OTOF-R-1 引物， 进行 PCR 反应， 得到 PCR 反应产物 ； 0051 （2） PCR 反应产物纯化后直接测序， 将所得的序列与 Genbank 中的标准序列比较确 定突变位点的存在 ； 0052 所述步骤还可进一步包括 ： 0053 （3） 按正常阅读框进行翻译以确定是否存在自第 1108 位氨基酸的移码至第 1177 位氨基酸的终止改变 （p.I1108H fsx69） 。 0054 该试剂。

28、盒可简便快捷地检测 OTOF 突变位点， 从而应用于感音神经性聋及听神经 病 / 听神经病谱系障碍相关基因的检测及其诊断或治疗方法中。 0055 本发明也提供了 OTOF 突变基因在诊断或治疗人类感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍中的应用。通过检测来自患者的待测样本中是否存在 OTOF 基因 说 明 书 CN 102864215 A 6 5/10 页 7 c.3316_3321insC 突变而判断该患者感音神经性聋及听神经病 / 听神经病谱系障碍的发生 原因及类型， 进而为临床诊断和治疗提供依据 ； 此外， 在进一步的临床治疗方面， 在检测为 发生了OTOF基因c.3316_3321。

29、insC突变之后， 可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并 在其中表达， 它可与内源性突变基因发生重组， 从而可以进行基因治疗。 0056 本发明提出了通过检测患者中是否存在 OTOF 基因新的突变而诊断感音神经性聋 及听神经病 / 听神经病谱系障碍发生的原因和类型的检测方法， 这将有利于为感音神经性 聋及不同类型听神经病 / 听神经病谱系障碍患者确定个体化治疗方案， 避免人工耳蜗植入 无效而造成的不必要的经济损失。 0057 下面结合附图， 通过对本发明较佳实施方式的说明， 详细描述但不限制本发明。 附图说明 0058 图 1 为 OTOF 基因编码区核苷酸与氨基酸的对照 (NM_19424。

30、8.2， NP_919224.1) ： 突 变位于 OTOF 基因第 3316-3321 位中一个 C 碱基， 用方框圈起来的是突变的碱基和对应的氨 基酸， 突变后的碱基序列使氨基酸自 1108 位发生移码 （下划线部分的氨基酸） ， 并提前终止 于第 1177 位氨基酸 （ “*” 标记处） 。 0059 图 2 为本发明方法中 PCR 反应过程示意图， 示出了反应温度和时间， 其中 * 表示每 个循环降低 0.5。 0060 图3为本发明方法中， 对PCR产物进行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱， 图中示出 了定量 Marker 的片段位置。 0061 图 4 为本发明方法中 OTOF 基因测。

31、序结果的局部图， 4A 为杂合突变序列 （患者序 列） ， 4B 为野生型序列， 方框示突变位点位置。 具体实施方式 0062 本发明所用试验材料， 如无特别说明， 均为市售购买产品。 0063 【实施例 1】 待测血样提取与 OTOF 基因编码区的 PCR 扩增 0064 一、 待测对象血样 DNA 的制备 0065 1、 研究对象 0066 对 17 例散发非综合征型听神经病谱系障碍患者和 100 名无家族史的听力正常对 照按照下述方法进行 OTOF 基因的筛查。17 例患者中， 1 例患者的 OTOF 基因检测发现患者 为 c.3316_3321insC 杂合突变和另外一种突变的复合杂合。

32、子。对 100 名听力正常者的筛查 中未发现 c.3316_3321insC 突变者。 0067 对所有参加者详细调查其病史以及家族史， 并对其进行体格检查， 耳科检查包括 耳镜检查、 听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样 5 10ml。 0068 2、 基因组 DNA 提取 0069 采用酚氯仿抽提法。 0070 第一天 0071 1） 抗凝血用 PBS 作 1 倍稀释。 0072 2） 在离心管中加入 2 倍体积的淋巴分离液 （18 C 28 C） ， 上面铺一层 1 倍体 积已稀释的血液， 室温， 1000g, 离心 20 分钟。 说 明 书 CN 102864215 A 7 6。

33、/10 页 8 0073 3） 吸弃上清液， 小心吸出中间有核细胞层， 转入 5ml Ep 管中， 5000g, 离心 10 分 钟， 然后用 PBS 洗一次。5000g, 离心 10 分钟。 0074 4） 将细胞悬于 2ml TE 缓冲液 （10mM Tris.HCl， 1mM EDTA， pH8.0） 中， 加 10% 的 SDS （十二烷基硫酸） 至终浓度 0.5%（100l） ， 蛋白激酶 k 100 200g/ml（10mg/ml） ， 50 C 水浴 3 5 小时。 0075 5） 用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚， 加入混匀， 5000g, 离心 10 分钟。 0076 6）吸上。

34、清液至新离心管中， 弃下层沉淀， 加入等体积酚 ： 氯仿混合物， 混匀， 5000g, 离心 10 分钟。 0077 7） 吸上清液至新离心管中， 弃下层沉淀， 加入等体积氯仿 ： 异戊醇混合物， 混匀， 5000g, 离心 10 分钟。 0078 8） 吸上清液至新离心管中， 弃下层沉淀， 加入 1/10 体积的乙酸钠， 混匀。 0079 9） 加入 2.5 倍体积的无水乙醇。 0080 10） -20 C 沉淀 DNA 过夜。 0081 第二天 0082 11） 高速离心， 10000g， 10 分钟， 4 C。 0083 12） 弃上清液， 加入 75% 乙醇 2ml， 高速离心 100。

35、00g， 5 分钟 0084 13） 弃上清液， 吹干。 0085 14） 用 TE 缓冲液溶解 （200l TE/5ml 全血， 400TE/10ml 全血） 。 0086 15） 分装。1% 琼脂糖电泳和分光光度计定量。 0087 二、 OTOF 基因编码区的 PCR 扩增 0088 1、 引物序列 0089 上游引物 :OTOF-F-1:5 -CAGATCATGGCAAACAACTCAT-3 (nt84507-nt84528) 0090 下游引物 ： OTOF-R-1:5 -GGGATGACAAGCCACTTCC-3 （nt84767-nt84785） 0091 注 ： OTOF 基因序。

36、列检索号 ： NC_000002.11 0092 2、 PCR 反应体系的建立 （表 1） 0093 表 1 OTOF 基因的 PCR 反应体系 0094 0095 0096 其中， PCR 扩增使用鼎国公司 Buffert、 鼎国公司 Taq 酶、 鼎国公司 dNTP、 Sigma 公 司 Betaine、 电泳 TaKaRa MarkerDL2000。 0097 反应条件 ： PCR 反应在 BIORAD S1000 热循环仪上进行， 反应过程 （包括温度和时 说 明 书 CN 102864215 A 8 7/10 页 9 间） 如图 2 所示。 0098 【实施例 2】 OTOF 基因编。

37、码区 PCR 扩增产物的纯化和定量 0099 一、 PCR 产物的纯化96 孔板法 0100 1、 向装有 PCR 产物的 96 孔板中加入 50l 无菌水， 混匀。 0101 2、 将其转移到Millipore纯化板中， 放到真空泵上抽滤约3分钟， 看到纯化板中没 有水即可。 0102 3、 向纯化板中再次加入 50l 的去离子水， 继续抽滤， 直到纯化板中没有水为止。 0103 4、 将纯化板从真空泵上取下， 向板中加入20l的去离子水， 静止15分钟， 再震荡 15 分钟， 然后吸到一新 96 孔板内。 0104 5、 保存在 -20冰箱中。 0105 二、 电泳定量 0106 1、 样。

38、品准备 0107 取一96孔点样板， 每孔先加上样缓冲液6l， 在从装有PCR产物的腔板中， 每孔用 排枪移出 PCR 产物 （2l） ， 转移到点样板上、 混匀、 离心 （腔板孔号要与 96 孔点样板一一对 应） 。 0108 2、 流程 0109 1） 配胶 （0.8% 琼脂糖） ： 称取 2.4g 琼脂糖， 悬浮于 300ml 0.5TBE 中 （500ml 锥形 瓶） 。 0110 2） 溶胶 ： 微波炉中高火加热至沸， 持续沸腾数分钟， 注意不要沸出， 其间取出混匀。 0111 3） 凉胶 ： 待胶完全溶解， 从微波炉中取出， 凉至 60左右， 加入 1 滴 EB（约 10l， 10。

39、mg/ml） , 摇匀。 0112 4） 铺胶 ： 平板两端用胶布封严， 把 250ml 胶液全部倒入平板， 插入梳尺。 0113 5） 上胶 ： 将平板放入已盛有电泳液 （0.5TBE， 液面距胶面 1 至 2mm） 的电泳槽中， 拔下梳尺。 0114 6） 加样 ： 用排枪按规定格式加样， 最后用单枪加入 DNA 标准品。 0115 7） 走胶 ： 盖上电泳槽盖， 检查正负级， 开启电泳仪， 调节电泳电压。 0116 8） 定量 ： 当溴酚蓝走离加样孔 1.5 至 2cm 处， 关闭电泳仪， 小心取胶， 放入摄相仪 照相， 进行定量。 0117 定量 marker 为 DL 2000， 如。

40、图 3 所示， 经过电泳后， 有 6 条带可见， 片段长度分别 是 2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp， DL2000 的总浓度是 300ng/5l。电泳时取 5l DL2000， 因此每条带的含量为 50ng。PCR 产物电泳时取 3l（PCR 产物） +5l（上样 缓冲液） 进行电泳。根据 PCR 产物电泳后的灰度值与 DL2000 的灰度值的比较判断 PCR 产物 的含量。 0118 【实施例 3】 纯化的 OTOF 基因编码区 PCR 扩增产物的直接测序 0119 一、 PCR 产物 DNA 模板的纯度与用量要求 0120 DNA 纯度 ： OD。

41、260/OD280=1.62.0。 0121 DNA 浓度 ： PCR 产物 10ng/l。 0122 DNA 用量 ： 0123 PCR 产物 说 明 书 CN 102864215 A 9 8/10 页 10 0124 0125 二、 测序反应 0126 1、 测序反应所需试剂应为新鲜配制， 需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使 用。测序反应所需的器材 （如 384 孔板、 tip 头等） 同样应为洁净无菌的。 0127 2、 为了保证测序样本及反应试剂的新鲜， 加样时应在冰上操作。 0128 3、 目前的反应体系为 5l， 各种试剂加入量如表 2 所示。 0129 表 2 OTOF 基因 。

42、PCR 扩增产物的测序反应体系 0130 0131 0132 *BigDye 3.1 为美国应用生物系统公司 （ABI） 生产的一种用于测序反应的荧光染 料。 0133 4、 样品放于 PCR 仪上， 所作反应的过程见表 3。 0134 表 3 OTOF 基因 PCR 扩增产物的测序反应过程 0135 0136 5、 反应完的样品要及时从 PCR 仪上取下， 短时间内要进行纯化的样品放置于 4 冰箱中， 超过一天以上才能纯化的样品放置于 -20冰箱冷冻。 说 明 书 CN 102864215 A 10 9/10 页 11 0137 三、 测序反应物的纯化和测序 0138 1、 向每孔中加入20。

43、l 80%乙醇， 4,000rpm离心30min ； 将样品板放在折好的纸巾 上， 在离心机中倒甩， 倒甩时速率不能超过 1,000rpm ； 0139 2、 在每孔中加入 30l 70乙醇， 4,000rpm 离心 10min， 倒甩 ； 0140 3、 重复第 2 步的操作 ； 0141 4、 重复第 2 步的操作 ； 0142 5、 将样品板放于干净的抽屉中， 避光干燥 30min ； 0143 6、 加入 5l 甲酰胺， 封膜， 离心后置于 -20冰箱中 ； 0144 7、 上机器前 95变性 5 分钟， 放置冰上 2 分钟， 离心后上样。 0145 测序图如图 4 所示。 0146 。

44、【实施例 4】 检测耳聋相关基因 OTOFc.3316_3321insC 突变位点试剂盒及其应 用 0147 1、 试剂盒的组成 0148 （1） 扩增用引物 ： 0149 上游引物 :OTOF-F-1:5 -CAGATCATGGCAAACAACTCAT-3 (nt84507-nt84528) 0150 下游引物 ： OTOF-R-1:5 -GGGATGACAAGCCACTTCC-3 （nt84767-nt84785） 0151 注 ： OTOF 基因序列检索号 ： NC_000002.11 0152 （2） PCR 扩增用 Taq 酶 5U/l 0153 （3） 10 缓冲液 （含 15ml。

45、 MgCl2） 0154 （4） dNTP 2.5mM 0155 （5） Big-Dye mix 0156 2、 使用方法 0157 主要包括如下步骤 ： 0158 1） PCR 扩增 0159 用软件 Primer 3 对 OTOF 基因的编码区设计 PCR 引物， 反应条件为 94 C 预变性 5 分钟， 94 C 变性 30 秒， 64 C 退火 45 秒， 72 C 延伸 30 秒， 30 个循环， 反应结束后再 72 C 延伸 7 分钟， 4 C 保存 （图 2） 。 0160 2） PCR 产物纯化 0161 将含有 PCR 产物的 MltiScreen-PCR 板抽真空， 加入去。

46、离子水， 静置， 随后将 MltiScreen-PCR 板置于混合器上震荡， 纯化后的 PCR 产物重新溶解后转移至另一洁净的 96 孔板中。 0162 3） 测序反应及验证 0163 以PCR引物作为测序引物进行测序反应， 在BIORAD S1000热循环仪上进行测序反 应。反应结束后， 延伸产物上样于 ABI PRISM 3700DNA 序列分析仪。将所得到的测序图谱 进行分析， 与 NC_000002.11 的标准序列比较以确定突变位点是否存在。 0164 具体方法参见实施例 1、 2、 3、 4。 0165 【实施例 5】 用以下任一对 PCR 扩增引物， 重复上述实施例 1-4 的步。

47、骤， 均能达到相 同的检测结果 ： 0166 OTOF-F-2:5 -TTTCCCTGTCTCCCCAGAT-3 ， 说 明 书 CN 102864215 A 11 10/10 页 12 0167 OTOF-R-2:5 -CCTCCTGGGTCCTCAGACT-3 ； 0168 OTOF-F-3:5 -CTCTCCTACCCATCCTGACCA-3 ， 0169 OTOF-R-3:5 -GGGACATGGGAGTGCGACTT-3 ； 0170 OTOF-F-4:5 -CTGGGGGCGTGGTCCTTAG-3 ， 0171 OTOF-R-4:5 -CAGGAGCCTGGGTCTGCTG-3 。

48、。 0172 以上对本发明的详细描述并不限制本发明， 本领域技术人员可以根据本发明作出 各种改变和变形， 只要不脱离本发明的精神， 均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。 说 明 书 CN 102864215 A 12 1/12 页 13 0001 0002 序 列 表 CN 102864215 A 13 2/12 页 14 0003 序 列 表 CN 102864215 A 14 3/12 页 15 0004 序 列 表 CN 102864215 A 15 4/12 页 16 0005 序 列 表 CN 102864215 A 16 5/12 页 17 0006 序 列 表 CN 102864215 A 17 6/12 页 18 0007 序 列 表 CN 102864215 A 18 7/12 页 19 0008 序 列 表 CN 102864215 A 19 8/12 页 20 0009 序 列 表 CN 1。