钝顶节旋藻藻蓝蛋白及其应用 本发明涉及一种新颖的藻蓝蛋白，更具体地，涉及钝顶节旋藻的藻蓝蛋白，含该藻蓝蛋白的组合物，及其用途。
钝顶节旋藻的学名为Arthrospira platensis，俗称螺旋藻，是一种有价值的植物蛋白资源。它含有丰富的蛋白质、β—胡萝卜素等营养物质。
中国专利申请89100036.4公开了一种以蓝藻—螺旋藻为原料，经磨细，浸取，水解，制得蛋白质氨基酸溶液，再用该溶液配制蓝色透明饮料的方法。
中国专利申请No.94112205.0，题为“节旋藻保健食品组合物及其制法”，公开了一种含有节旋藻酶解提取物的食品组合物，及其制法。
1986年，美国哈佛医学院的Schwartz和Shklar经研究发现，颤藻科从螺旋藻属的一种未知品种的藻类提取的藻蛋白混合物，对一些癌细胞有抑制作用，并有抗疲劳等功能。亦有人将其应用于抗衰老和治疗AIDS病(爱滋病)等方面。
总之，现有技术中未见有关从螺旋藻属的藻类中提取藻蓝蛋白的报导，尤其没有从钝顶节旋藻提取藻蓝蛋白的报导。
本发明的一个目的是提供一种新颖的蛋白质，该蛋白质为从钝顶节旋藻中提取分离而得的藻蓝蛋白。
本发明的另一目的是提供一种藻蓝蛋白的制法。
本发明的第三个目的是提供一系列含藻蓝蛋白的食品组合物。
本发明的第四个目地是提供该蓝藻蛋白在荧光检测方面的用途。
为了实现上述目的，本发明人经数年研究，从钝顶节旋藻中提取了一种新颖的藻蓝蛋白，其特征在于，该藻蓝蛋白的分子量约为14500道尔顿，等电点为4.8，其最大光谱吸收值为620mm，此外，该藻蓝蛋白是由α和β亚单位组成的寡聚体，其中α和β亚单位是由160—180个氨基酸构成的多肽链，且两亚单位具有同源性。
本发明还提供了含适量藻蓝蛋白作为主要组份的一系列的食品组合物。
本发明还提供了藻蓝蛋白在荧光检测方面的应用。
本发明的提取自节旋藻的藻蓝蛋白既是某些藻类细胞重要的捕光色素蛋白，又因其极佳的保健功效而与人类生活密切相关。可以将藻蓝蛋白作为有效成分加入到食物组合物中，制成不同的保健食品。这样食品组合物不仅可以制成各种人们常见和常用的形式，而且能起到极佳的保健作用。
节旋藻原产非洲，喜高温、长日照和高pH值等环境。我国原来没有这种植物。1978年，本发明人首先从美国引入藻种进行驯育。通过超微结构等方面的研究发现，被国内外误称为“螺旋藻”的，实为钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)。关于节旋藻的培养方法和条件，以及收获节旋藻的方法，可以参见本发明人于1994年6月18日申请的，申请号No.94112205.0，题为“节旋藻保健食品组合物及其制法”的专利申请。
本发明提取藻蓝蛋白的全过程如下：培养节旋藻，收获后制得干燥的节旋藻，经破壁、离心制得粗提液，粗提液再经盐析，渗析，离子交换层析等步骤制得纯净的藻蓝蛋白。
更具体地，将节旋藻干藻粉加水适量，(为干粉重量的15～20倍)→置—4℃冷冻，→25°～35℃融解，→再冷冻融解，重复3～5次；(或用酶进行酶解)→离心→丢弃沉淀物，取上清液，加硫酸铵分镏，→丢弃下层沉淀物，取上层物，经溶解和渗析→用DEAE纤维柱进行离子交换层析，冷冻干燥得到纯净的藻蓝蛋白。
其中，破细胞壁可采用冻融法或酶解法等方法进行。
其中，酶解时选用的酶可以是(但并不局限于)下列酶的一种或多种：纤维素酶，木瓜酶，菠萝酶，米曲酶，红曲酶，淀粉酶，糖化酶，蜗牛酶等。酶解一般在pH3—8，温度20—50℃进行18—24小时，酶解条件也可按厂商建议的条件。
冻融过程可进行一次或多次。一般以多次，尤其3—5次为好。
制得的藻蓝蛋白经研究发现，其光谱特性如下：最大吸收值为620mm，荧光最大值为640mm。
这表明藻蓝蛋白吸收光谱与绿色植物光合作用光谱恰好互补，这对分布广，原初生产力大而缺乏叶绿素b的藻类来说，更显得重要。
藻蓝蛋白在水溶液中的吸收光谱比在活体中峰值(λmax)稍向蓝移，其光谱形状和强度主要取决于发色基的性质，数量和聚集状态，一般发色基4吡咯系统中共轭双键愈多，λmax愈向红移；(α，β)的吸收光谱只是α，β—亚单位分别吸收的迭加，但进一步聚合则会引起长波吸收峰红移，并伴有吸收系数(εM)增加。
藻蓝蛋白在生活细胞中很少发生萤光，它们一旦被释放到溶液中并给以适量光照时，PE便发出棕色萤光，而PC则发出红色萤光。比较PE、PC、AP和Chla的吸收和发射光谱，PE—PC之间，PC—Ap之间和Ap—Chla之间均有较强的吸收重迭，这暗示能量在这些光合色素间的传递顺序为：PE—PC—Ap—Chla。
对藻蓝蛋白的结构进行了深入研究，发现藻蓝蛋白一般是由α和β单体组成寡聚体，其中α和β亚单位是由大约160—180氨基酸组成的多肽链。
藻蓝蛋白亚单位的同源性在更高水平上还表现在相似的聚合行为和聚合分子构象上，其逐级聚合过程为其在细胞内担负的能量传递功能奠定了结构基础。
纯化后的藻蓝蛋白用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳和等电聚集均得到单一色带，其等电点(IEP)值分别为4.8，通过12％SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS—PAGE)电泳可见钝顶节旋藻的藻蓝蛋白由α和β两个亚单位组成，其分子量为14500。
藻蓝蛋白的氨基酸组成和含量，经测定，数据列于表1。
表1.
钝顶节旋藻藻蓝蛋白的氨基酸组成和含量(％) 氨基酸 藻蓝蛋白天冬氨酸 Asp苏氨酸 Thr丝氨酸 Ser谷氨酸 Glu甘氨酸 Gly丙氨酸 Ala胱氨酸 Cys缬氨酸 Val甲硫氨酸 Met异亮氨酸 Ile亮氨酸 Leu酪氨酸 Tyr苯丙氨酸 Phe 6.15 6.56 6.29 5.45 11.48 10.13 5.37 6.91 — 6.29 5.48 5.70 5.46
赖氨酸 Lys脯氨酸 Pro精氨酸 Arg组氨酸 His色氨酸 Try 5.58 — 4.10 — ND*
*未测定。
从表1可以看出，藻蓝蛋白中所含的二羧基氨基酸(天冬氨酸，谷氨酸)与碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸)之比值较高，所以其等电点(IEP)较低，为4.8。此外，藻蓝蛋白缺乏甲硫氨酸，脯氨酸和组氨酸。
令人惊奇的是，本发明人发现藻蓝蛋白有极其重要的保健作用：它具有较高的促红细胞生成素活性，同时对CFU—E集落形成具有较强的刺激作用(表2)。
表2.
钝顶节旋藻藻蓝蛋白对
胎鼠肝细胞晚期红系祖细胞的影响 样品 剂量 CFU-E集落数 Counts of CFU-Ecolony(/2×104FLC)相当EPO单位 比活 Specific activity(μ/mg) 空白对照 Control(1640) 69±28.5 标准EPO 62.5mu 125.0mu 250.0mu 500.0mu 1000.0mu 97±29.4 128±53.2 165±67.3 223±54.7 283±77.9 藻蓝蛋白 C-Phycocyanin 12.5ng 271±60.4 850 68000
从表2可见，螺旋藻藻蓝蛋白具有较高的促红细胞生成素活性，同时对CFU—E集落形成具有较强的刺激作用。
藻蓝蛋白对正常小鼠CFU—GM的形成也有影响。数据列于表3。
表3.
体外加入钝顶节旋藻藻蓝蛋白对
正常小鼠CFU—GM形成的影响 组别 Group 剂量 (μg/ml) CFU-GM集落数 CFU-GM(Colony/105BMC) 对照组 Control(MCM) 0 119.67±6.1 C－PC＋MCM 10 20 50 100 200 120.33±3.06 127.33±4.73 143.67±9.02* 175.33±5.14*** 140.33±3.45* SPP C－PC 100 100 0 0
注：MCM小鼠肌条件培养液(Conditioned Medium of micemusal)
C－PC：得自节旋藻的藻蓝蛋白。
X±SD n＝5*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001(与对照相比)。
观察了60Coγ射线5Gy照射小白鼠粒单系祖细胞后30天内的恢复情况，发现，在受照后的第1—5天小白鼠粒单祖细胞集落形成最少，第10天开始恢复回升，而给予腹腔注射藻蓝蛋白试验组小鼠，其CFU—GM产率显著高于对照组。说明钝顶节旋藻藻蓝蛋白可显著促进受照小鼠粒单系祖细胞的增殖分化。
此外，藻蓝蛋白对体外照射骨髓细胞CFU—GM形成也有影响。
将正常小鼠骨髓制成单细胞悬液后与不同浓度的藻蓝蛋白一起孵育后，经60Coγ射线照射后再进行CFU—GM培养，其结果见表4。
表4.
钝顶节旋藻藻蓝蛋白对
受照小鼠骨髓细胞CFU—GM形成的影响组别Group 剂量 Dose(μg/ml) CFU-GM集落数 CFU-GM(Colony/105BMC) P对照Control 0 51±4.48藻蓝蛋白C－PC 10 50 100 200 60.6±2.93 72±5.83 88.4±5.37 69±2.24＜0.01＜0.001＜0.001＜0.001
从表4可以看出，与不同浓度的藻蓝蛋白一起孵育的骨髓细胞形成CFU—GM产率明显高于对照组，由此可见藻蓝蛋白能提高骨髓细胞的抗辐射能力。
还研究了藻蓝蛋白对小鼠血清集落刺激活性的影响。
取正常小鼠，腹腔注射藻蓝蛋白，给药1～10天后从眼球取血，所得血清作为集落刺激因子(Colony stimulating factor，CSF)来源培养CFU—GM。数据列于表5。
表5.
钝顶节旋藻藻蓝蛋白对
小鼠血清集落刺激活力的影响组别Group给药时间(天) CFU-GM集落数 CFU-GM(Colony/105BMC) a血清 b血清＋MCM P对照组
Control — 70±1 113±9.17藻蓝蛋白C－PC 1 5 10 86.33±3.05 125±2 98±3.61 137±5.29 109.33±2.54 138.67±1.54＞0.05＜0.05＜0.05
注：a.终浓度10％
b.终浓度5％
从藻蓝蛋白对丝裂原刺激的小鼠脾细胞产生集落刺激因子所造成的影响，也可看出藻蓝蛋白的保健功效。
正常小白鼠腹腔注射藻蓝蛋白5天后，第6天取脾细胞按5×106ml浓度培养于含5μg/ml ConA的无血清培养液中，培养后离心取上清，检测上清液的集落刺激活性，同样在脾细胞培养体系中加入不同浓度的藻蓝蛋白，所得上清液进行集落刺激活性测定。两种方法制备的脾细胞培养上清液的检测结果见表6和表7。
表6.
钝顶节旋藻藻蓝蛋白体内诱导小鼠脾脏
产生集落刺激因子的影响组别Group CFU—GM集落数 CFU—GM(Colony/105BMC) aSF－SCCM bSF－SCCM＋MCM对照组Control 71.73±3.49 106.47±12.68藻蓝蛋白C－PC 101.87±9.98*** 126.2±7.98**
a.终浓度10％
b.终浓度5％
SF－SCCM无血清脾细胞条件培养液
**P＜0.01，***P＜0.001(与对照相比)
由表6可见，腹腔注射藻蓝蛋白，能较显著地诱导小鼠脾细胞产生集落刺激因子。
表7.
钝顶节旋藻藻蓝蛋白体外诱导小鼠脾脏细胞
产生集落刺激因子的影响组别Group剂量Dose(μg/ml) CFU-GM集落数 CFU-GM(Colony/105BMC) aSF－SCCM bSF－SCCM＋MCM对照组Control 81.67±5.03 115±6藻蓝蛋白C－PC 10 50 100 85.67±3.05 97.67±3.05 106.67±3.51** 118.33±4.17 117±4** 142.33±3.05**
a.终浓度10％
b.终浓度5％
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(与对照相比)
从表7可以看出，体外加入藻蓝蛋白能较显著地诱导小鼠脾细胞产生集落刺激因子。
此外，通过藻蓝蛋白对小鼠红系祖细胞(CFU—E，BFU—E)增殖分化的影响。
(a)对正常小鼠和贫血小鼠CFU—E和BFU—E形成的影响。
正常小白鼠腹腔注射藻蓝蛋白5天，第6天进行CFU—E和BFU—E的培养，实验结果表明，钝顶节旋藻藻蓝蛋白能极显著地提高小鼠的CFU—E和BFU—E的产率，说明钝顶节旋藻藻蓝蛋白可促进小白鼠红系造血。
正常小白鼠颈椎脱臼处死，取出股骨制成单细胞悬液，作CFU—E的培养，培养体系以不同浓度的藻蓝蛋白取代EPO或EPO存在时直接加入不同浓度的藻蓝蛋白来培养CFU—E，以1640作空白对照，只加EPO为正常对照，结果如表8中所列。由此可知，藻蓝蛋白对CFU—E有直接的刺激作用，促进CFU—E集落的形成。藻蓝蛋白和EPO同时存在时可显著提高CFU—E的产率(与正常对照组相比)。
表8.
体外加入钝顶节旋藻藻蓝蛋白对CFU—E形成的影响 组别 Group 剂量 Dose(μg/ml) CFU-E集落数 CFU-E克隆计数 (Colony/5×104BMC) 对照组I Control(I)EPO(＋) 对照组I Control(I)EPO(－) 152±11.3 51±17.2 藻蓝蛋白(－EPO) C－PC(－EPO) 0.015 1.000 10.00 50.00 100.0 147±17.9 172.2±14.8* 261.3±15.7*** 227.7±19.6*** 156.9±20.4 藻蓝蛋白(＋EPO) C－PC(＋EPO) 0.015 1.000 10.00 50.00 100.0 244.5±13.7** 273.3±18.2*** 297.8±20.7*** 301.3±22.7*** 279.9±27.7***
EPO促红细胞生成素(Erythropoietin)
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，(与对照组(I)相比)
在BFU—E培养体系中，以终浓度为0.015μg/ml的藻蓝蛋白取代EPO或BPA，或同时取代EPO和BPA，以及EPO和BPA同时存在时加入藻蓝蛋白来培养BFU—E。另设4组对照，EPO和BPA同时加入的正常对照，EPO和BPA其中之一加入以及EPO和BPA都不加入。实验结果如表9。
表9.
不同条件下钝顶节旋藻藻蓝蛋白对BFU—E形成的影响 组别 Group 对照组 Control 实验组I IIIIIIV 1 23 4 5 6 EPO BPA *C－PC HS L-谷酰胺 巯醇 甲基纤维素 RPMI-1640++-+++++ - + - + + + + ++--+++++---+++++ - + - + + + + + - + + + + + + +---+++++ - - + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + BFu-E克隆计数 (克隆/5· 104BMC)30.7±5.4 13.4±3.700 21.3**±5.1 31.8**±7.40 5.1±4.3 (**) 43.3 ±5.5 (**) 51.2 ±7.7
a.终浓度0.015μg/ml
(**)P0.01，与对照组I相比，**P0.01，与对照组II相比。
BPA爆式集落刺激因子
HS马血清
从表9可以看出，加入藻蓝蛋白BFU—E产率不下降与正常对照相同，无BPA存在时，BFU—E不能形成，但加入了藻蓝蛋白后，可以形成极少的集落。因此可以推知藻蓝蛋白有着EPO的活性，并有一定BPA样的作用。
小鼠经60Coγ射线照射和腹腔注射盐酸苯肼后形成贫血症状，其CFU—E和BFU—E产率显著下降。但是不管是照前或是照后给予小鼠腹腔注射藻蓝蛋白，小鼠的CFU—E和BFU—E产率显著高于对照组。
综上所述，从钝顶节旋藻中提纯的藻蓝蛋白具有的保健功效主要表现在：
具有较高的促红细胞生成素活性，同时对CFU—E集落形成具有较强的刺激作用：可促进和加速受60Coγ射线(5Gy)照射后小白鼠白细胞的恢复；能较显著地提高小白鼠骨髓有核细胞数，可以抵抗或显著抵抗照射对小白鼠骨髓有核细胞的损伤，并使其恢复达到正常值；促进小鼠粒单系祖细胞的增殖分化；能显著地诱导小鼠脾细胞产生集落刺激因子；对小鼠骨髓基质祖细胞的形成有促进作用，亦即对骨髓微循环有一定的影响。
所以，为了开发利用这种能促进免疫系统，抵抗各种疾病的天然蛋白质，在实验基础上，本发明人进一步提供了一系列含藻蓝蛋白作为有效组份的保健食品组合物。
保健食品组合物一般含有95％藻蓝蛋白以及5％水和/或辅料。
其中一种保健食品组合物为胶囊或片剂，其组成为95％藻蓝蛋白，以及5％辅料。
另一种保健食品组合物为饮料，其组成为7％藻蓝蛋白，91％水以及2％辅料。
第三种保健食品组合物为口服液，其组成为30％藻蓝蛋白，68％水和2％辅料。
在本发明中，“辅料”指构成保健食品组合物的辅助性原料，即除藻蓝蛋白和水之外的其他次要材料，具体包括：
①谷类；淀粉；糊精；
②蔬菜泥；
③甜味剂—甜菊甙或蛋白糖，或木醇糖等；
④香精；
⑤羧甲基纤维素；
⑥阿拉伯胶；西黄蓍胶等。
采用藻蓝蛋白作为食品组合物中一种特效的保健成分，制作保健食品组合物时，可以采用食品加工及制作领域熟知的方法、工艺、和设备，并且还可加入其他已知的具有保健功效的成份，以更均衡地发挥保健功效。
此外，较作为一种新颖的蛋白质，由于藻蓝蛋白在较宽的pH值范围内有效高萤光产率；它们的萤光不因其它生物分子的存在而消失；可较好溶介于水；以液体或固体状态存在时都极稳定且能保存较长时间等原因，因此能用于免疫检测，萤光显微术，等方面。
下面结合本发明的实施例，进一步详细地阐述本发明。
除非特别注明，否则所有的百分比都是重量百分比。实施例1
藻蓝蛋白粗提液的制作实施例1A
取干藻粉100g加2000ml磷酸缓冲液(pH7.3)加淀粉酶1.5g，置35℃水浴中30分钟，充分搅拌30分钟后，置-20℃环境下速冻，待结成冰块后取出，置35℃水浴中解冻，再搅拌30分钟，再速冻，如此反复三次，冻融后，4℃1000rpm离心30分钟，收集上清液，此即为粗提液。实施例1B
在100g干藻粉内，加2000ml 25℃蒸镏水pH7.3加淀粉酶1.2g，置37℃水浴中45分钟，搅拌30分钟后速冻成冰块，30℃条件下解冻，搅拌40分钟再速冻。重复三次，1500rpm离心，取上清液，(此即为粗提液)。实施例1C
取100g干藻粉加糖化酶1g，加20℃蒸镏水2000ml pH7.3置27℃水浴中30分钟，搅拌30分钟，速冻，20℃条件下解冻，速冻，反复冻融三次后2000rpm离心，取上清液，即得粗提液。实施例1D
取干藻粉10g加200ml磷酸缓冲液pH7.3电磁搅拌30分钟，置-20℃环境中12小时，取出置37℃水浴中解冻，再搅拌30分钟，再结冰12小时后取出解冻，搅拌，冰冻，如此反复冻融三次后，4℃1000rpm离心30分钟，收集上清液(此即粗提液)。实施例2藻蓝蛋白分离、纯化：
将实施例1中得到的粗提液用蒸镏水稀释一倍，上DEAE52纤维素柱(3×18cm)。该柱顶预先用10mM pH7.3磷酸缓冲平衡，280nm检测，待粗提液全部进入纤维柱后，用同一缓冲液洗柱至基线，再改用10mM pH8.0的磷酸缓冲，并加0.3N和0.6N的NaCl，分部洗脱和收集。
取0.3N的NaCl的洗脱峰，加固体硫酸铵至饱和度，4℃静置4小时后2500rpm离心，收集沉淀，加水10ml溶解，并对水透析，更换透析液二次，最后置500ml 10mM pH7.3的磷酸缓冲液中透析平衡过夜。
透析后的液体，2500rpm离心去沉淀，上清液以Seohade×G75凝胶柱过滤(1.5×95cm)凝胶柱预先用10mM pH7.3的磷酸缓冲平衡，一次上样，以同一缓冲洗脱，分部收集，并作CFU—E及电泳分析，冷冻干燥得成品。实施例3
保健食品组合物之一：胶囊(或片剂)的制作
(1)配方：
a.藻蓝蛋白提取物56％，淀粉4％，β糊精20％，糖粉20％；
b.藻蓝蛋白提取物66％，β糊精4％，淀粉30％；
c.藻蓝蛋白提取物85％，β糊精5％，羧甲基纤维素1％，敷料9％；
d.藻蓝蛋白提取物95％，β糊精和羧甲基纤维素5％
(其比例：85∶15)
(2)制法：
纯化藻蓝蛋白粉＋辅料(按配方)→揉制成团，手感适当→18目筛，筛制成颗粒→置80℃以下烘箱内烘干→分别用手工或机器灌装入胶囊内→检验(秤重误差不得大于±0.1g→封装→60Co幅射灭菌→成品；
或将已烘干之颗粒→压制成片，→包或不包糖衣→封(包)装→检验→幅射灭菌→成品。(3)优点
藻蓝蛋白被包含在胶囊里；可根据应用的要求，可使其在胃或肠内崩解；它不仅可以有效的防止其氧化，而且能更好保持特性、有效成份，提高保健效果。实施例4
保健食品组合物之二：饮料和口服液的制作，
a.取提纯的干燥藻蓝蛋白50g加2.5g阿拉伯胶，在干乳钵中研匀，一次加入25ml蒸镏水，匀质机中迅速磨成乳，然后加入甜菊甙水溶液适量，再缓缓加入西黄蓍胶浆(0.7g粉)加水适量制成浆，加入0.1％山梨酸钾，加蒸镏水至1000ml，将其灌瓶、灭菌即成。
b.藻蓝蛋白70％卵磷脂30g，匀质机中研磨成乳，加甜菊甙水溶液适量，继续乳化加山梨酸钾0.1％，加蒸镏水至1000ml用其灌瓶，灭菌即成。
c.藻蓝蛋白30g，甜菊甙，柠檬酸适量，消毒灭菌水使成100ml，装瓶消毒杀菌即成。
口服液和饮料的特点：
纯天然绿色；无任何人工色素无糖含多种氨基酸和元素及微量元素。
尽管，本发明是结合以上的具体实施例进行阐述的，但是，通过阅读本发明的说明书及权利要求书，本领域的技术人员能充分理解本发明的特征及优点，并且能够对本发明的具体实施例在不违背本发明主旨的前提下作出许多修改，增加或删除等变动，但这同样落于本申请的权利要求书所限定的范围中。