《一种热稳定性提高的蛋白酶及其构建方法和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种热稳定性提高的蛋白酶及其构建方法和应用.pdf（6页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102936588 A (43)申请公布日 2013.02.20 CN 102936588 A *CN102936588A* (21)申请号 201210528244.8 (22)申请日 2012.12.10 C12N 9/50(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/57(2006.01) C12N 15/75(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 陈坚 张娟 刘柏宏 堵国成 (7。
2、4)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 11419 代理人 何自刚 王玉松 (54) 发明名称 一种热稳定性提高的蛋白酶及其构建方法和 应用 (57) 摘要 本发明公开了一种热稳定性提高的角蛋白酶 及其应用， 属于遗传工程领域。 本发明采用定点突 变技术将地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis BBE11-1 的角蛋白酶 （ker） 基因进行定点突变并 克隆连接到枯草芽孢杆菌表达载体 pMA 0911， 转化 Bacillus subtilis WB600， 经纯化验证得 到一株可以产具有较好热稳定性角蛋白酶的重 组枯草芽孢杆菌 Bacillus。
3、 subtilisWB600-pMA 0911-kerTB， 该菌株表达的角蛋白酶在 60的 T1/2为 78min， 比野生型角蛋白酶 T1/2提高了近 9 倍。这为角蛋白酶的应用奠定了良好的基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一 种 热 稳 定 性 提 高 的 角 蛋 白 酶， 其 特 征 在 于 在 GenBank accession nos. JX504681 公布的基因序列基础上， 其成熟区的四个位点发生氨基。
4、酸突变， 具体为 N122Y,N160C,A193P,N217S。 2.一种获得权利要求1所述角蛋白酶的方法， 其特征在于以GenBank accession nos. JX504681 公布的基因为出发基因 , 将其成熟区的四个位点进行氨基酸的取代。 3. 产权利要求 1 所述产角蛋白酶的基因工程菌或转基因细胞系。 4. 权利要求 3 所述产角蛋白酶的基因工程菌的构建方法， 其特征在于包括如下步骤 ： 1） 采用化学全合成或 PCR 方法克隆编码权利要求 1 所述蛋白酶的基因 kerTB ； 2） 将步骤 1） 获得的 kerTB 基因连接到大肠杆菌表达载体， 得到重组表达载体 ； 3） 将。
5、步骤 2） 获得的重组表达载体转化 Bacillus subtilis WB600 得到基因工程菌。 5. 权利要求 4 所述的基因工程菌， 其特征在于所述表达载体为 pMA0911。 6. 应用权利要求 4 所述基因工程菌发酵生产角蛋白酶的方法， 其特征在于以产角蛋白 酶基因工程菌为生产菌株， 斜面活化制备种子后， 以 3% 的接种量转入已优化的基本发酵培 养基， 于 37、 200rpm 条件下培养 24h。 7.权利要求6所述的方法， 其特征在于基本发酵培养基组成为胰蛋白胨10g/L， 酵母抽 提物 5g/L， NaCl10g/L， 葡萄糖 10g/L， 0.1g/L MgSO4。 权 。
6、利 要 求 书 CN 102936588 A 2 1/3 页 3 一种热稳定性提高的蛋白酶及其构建方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种热稳定性提高的重组角蛋白酶及其构建方法和应用， 属于遗传工 程技术领域。 背景技术 0002 角蛋白酶 (Keratinase) 是一种可以特异性降解角蛋白的酶类， 由细菌、 放线菌和 真菌等多种微生物产生。羽毛作为家禽饲养和屠宰工业的副产物每年产量巨大， 且蛋白质 和氨基酸含量丰富， 是潜在的优良蛋白质资源。羽毛的合理利用一方面可以减少废弃物对 环境的污染， 同时可以作为一种饲科蛋白质应用于畜禽的饲养。在传统利用羽毛过程中主 要采用酸碱水解。热降解等。
7、方法， 前者存在污染环境问题， 后者对能源消耗比较大， 且可以 破坏部分氨基酸， 降低了产品的营养价值。其他常见的角蛋白为动物的毛发， 如牛毛、 羊毛 和人发等， 这类角蛋白质部分作为商业原料进行加工外， 其余多作为废物处理， 也造成了环 境的污染和蛋白资源的浪费。角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽和氨基酸， 既可用于农业肥 料的生产， 又可作为畜禽的饲料蛋白源 ； 角蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子， 其在皮肤病 治疗方面的研究还有待于进一步挖掘。另外， 角蛋白酶可 “消化” 导致疯牛病和人类克雅 氏症的毒蛋白， 从而可应用于医疗和实验仪器的净化 ； 它还可用于皮革脱毛鞣制， 配制润肤 露、 浴皂、。
8、 洗发水和脱毛膏等美容品。 0003 拥有较差热稳定性的酶严重影响该酶在工业上的应用， 提高角蛋白酶的热稳定性 在利于工业化应用的同时有助于角蛋白酶在应用过程中更好的渗透入底物表面并作用于 底物， 而且能够减少杂菌的生长。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性提高的角蛋白酶。 上述角蛋白酶是 在GenBank accession nos.JX504681公布的基因序列基础上， 其成熟区的四个位点发生氨 基酸突变， 具体为 N122Y,N160C,A193P,N217S， 其获得方法为以 GenBank accession nos. JX504681 公布的基因为出发基因。
9、 , 通过化学全合成或定点突变的方式将其成熟区的四个 位点进行氨基酸的取代。 0005 产所述产角蛋白酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。 0006 本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建产角蛋白酶的基因工程菌的构 建方法， 具体包括如下步骤 ： 0007 1） 采用化学全合成或 PCR 方法克隆编码权利要求 1 所述蛋白酶的基因 kerTB ； 0008 2） 将步骤 1） 获得的 kerTB 基因连接到大肠杆菌表达载体， 得到重组表达载体 ； 0009 3） 将步骤 2） 获得的重组表达载体转化 Bacillus subtilis WB600 得到基因工程 菌。 00。
10、10 所述表达载体优选 pMA 0911。 0011 应用上述产角蛋白酶基因工程菌发酵生产角蛋白酶的方法， 将其斜面活化制备种 说 明 书 CN 102936588 A 3 2/3 页 4 子后， 以 3% 的接种量转入基本发酵培养基， 于 37、 200rpm 条件下培养 24h。 0012 所述基本发酵培养基组成为胰蛋白胨 10g/L， 酵母抽提物 5g/L， NaCl 10g/L， 葡萄 糖 10g/L,0.1g/L MgSO4。 0013 检测重组角蛋白酶热稳定性指标 （T1/2） 的定义方法 ： 酶在指定温度下酶活损失一 半时所需要的时间。 0014 本发明采用定点突变技术将地衣芽胞。
11、杆菌 Bacillus licheniformis BBE11-1 的 角蛋白酶 （ker） 基因进行定点突变并克隆连接到枯草芽孢杆菌表达载体 pMA 0911， 转化 Bacillus subtilis WB600， 经纯化验证得到一株可以产具有较好热稳定性角蛋白酶的重 组枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis WB600-pMA 0911-kerTB。该菌株表达的角蛋白酶在 60的 T1/2为 78min， 比野生型角蛋白酶 T1/2提高了近 9 倍。这为角蛋白酶的应用奠定了良 好的基础。 附图说明 0015 图 1 ： 蛋白电泳 （SDS-PAGE） 实验结果。M ： 蛋白质分。
12、子量标准 (Protein Molecular Weight Marker) ； 1 ： 不含质粒的 Bacillus subtilis WB600 ； 2 ： 含质粒 pMA0911-ker 重组 菌 ； 3 ： 含质粒 pMA0911 重组菌。 0016 图 2 ： 分子改造后重组角蛋白酶在 60的 T1/2和野生型 （未改造） 酶在 60的 T1/2 的比较。 具体实施方式 0017 实施例 1 热稳定性提高的角蛋白酶 0018 本发明的角蛋白酶是在 GenBank accessionnos.JX504681 公布的基因序列基础 上， 其成熟区的四个位点发生氨基酸突变， 具体为 N122。
13、Y,N160C,A193P,N217S， 可以通过化 学全合成或定点突变的方式将其成熟区的四个位点进行氨基酸的取代。 0019 实施例 2 产角蛋白酶基因工程菌的构建及鉴定 0020 采用化学全合成方法获得编码实施例 1 中角蛋白酶的 ker 基因， 将其克隆到 pMA0911， 获得含有 kerTB 基因的重组表达质粒 pMA 0911-kerTB。 0021 重组质粒pMA 0911-kerTB转化Bacillus subtilis WB600感受态细胞， 得到能在 含有卡那霉素 （30mg/mL） 的 LB 平板上正常生长的基因工程菌， 并经过鉴定命名为 Bacillus subtili。
14、s WB600-pMA 0911-kerTB。 。 0022 实施例 3 重组菌的酶活测定和蛋白电泳 0023 角蛋白酶酶活测定方法 ： 将发酵液离心 10min（10000g， 4） 取发酵上清液， 吸 取 200uL 适当稀释的酶液， 加入 300uL 0.05mol/L gly-NaOH 缓冲液 （pH9.0） 溶解 1% 的底 物 （角蛋白） ， 50培养 20min， 加入 500uL 4M TCA 溶液以终止反应。离心 10min， 吸取 200uL 上清液移入到新的试管中， 后依此加入 1mL 福林酚试剂和 200uL 0.5MNa2CO3后 50 度显色 15min。空白为在加。
15、入酶液的同时， 加入 500uLTCA 溶液， 经过相同过程反应的过滤清液作为 空白。在 660nm 处检测吸光值， 根据酪氨酸标准曲线定义每 15min 内释放 1ug 酪氨酸定义 为一个酶活单位。 0024 培养基 ： 种子和斜面培养基为 LB 培养基 （1L） ： 胰蛋白胨 10g， 酵母抽提物 5g， NaCl 说 明 书 CN 102936588 A 4 3/3 页 5 10g ； 斜面培养基添加琼脂 15g ； 基本发酵培养基为添加葡萄糖的 LB 培养基 （1L） ： 胰蛋白胨 10g， 酵母抽提物 5g， NaCl 10g， 葡萄糖 10g ； 0025 培养方法 ： 将 37、。
16、 200rpm 下培养过夜的种子以 3% 的接种量转入基本发酵培养 基， 于 37、 200rpm 条件下培养 ； 0026 以空载体作为对照， 通过蛋白电泳 （SDS-PAGE） 得到一条分子量大小约为 30kDa 的 蛋白条带 （见图 1） ， 纯化后测定该重组角蛋白酶在 60的 T1/2为 78min， 比野生型角蛋白酶 T1/2提高了近 9 倍 （见图 2） 。 0027 可以理解的是， 对本领域普通技术人员来说， 可以根据本发明的技术方案及其发 明构思加以等同替换或改变， 而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保 护范围。 说 明 书 CN 102936588 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102936588 A 6 。