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1、(10)申请公布号 CN 102895677 A (43)申请公布日 2013.01.30 CN 102895677 A *CN102895677A* (21)申请号 201210424867.0 (22)申请日 2012.10.30 CCTCCNo ： M 2012395 2012.10.11 A61K 48/00(2006.01) A61K 39/385(2006.01) A61K 39/295(2006.01) A61P 31/20(2006.01) A61P 31/04(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/34(2006.01) C12R 1/125。
2、(2006.01) (71)申请人 无锡海健生物科技有限公司 地址 214092 江苏省无锡市滨湖区梅梁西路 88 号生物医药外包区二期 7 号楼一楼 (72)发明人 不公告发明人 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 殷红梅 (54) 发明名称 一种新型对虾多价载体疫苗及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一种新型对虾多价载体疫苗， 其 特征在于 ： 所述疫苗包括利用基因工程方法得到 的枯草芽孢杆菌重组菌株， 该菌株的分类命名是 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） HT5303， 已 保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏号为CCTCC NO ： 。
3、M 2012395。本发明的枯草芽孢杆菌疫苗株， 形成芽孢后能够在芽孢表面展示对虾白斑综合症 病毒 VP281 蛋白， 在形成营养细胞时分泌表达穿 膜肽、 白斑综合症病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘 油醛脱氢酶 （GAPDH） 形成的融合蛋白。本发明的 多价载体疫苗相对于其它疫苗具有交叉保护和保 护期长， 并且该疫苗能够添加到饲料中， 耐受饲料 的高温定型， 具有广阔的商业开发景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表。
4、 2 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种新型对虾多价载体疫苗， 其特征在于 ： 所述疫苗包括利用基因工程方法得到的 枯草芽孢杆菌重组菌株， 该菌株的分类命名是枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） HT5303， 已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏号为 CCTCCNo ： M 2012395。 2. 如权利要求 1 所述的新型对虾多价载体疫苗， 其特征在于 ： 所述枯草芽孢杆菌重组 菌株在营养细胞状态时能够分泌白斑综合症病毒 VP19 和哈氏弧菌 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH） 形成的融合蛋白。 3. 如权利要求 2 所述的新型对虾多价载体疫苗， 其特征在于。
5、 ： 所述枯草芽孢杆菌重组 菌株的染色体上有由枯草芽孢杆菌sacB基因、 人工合成tat基因和白斑综合症病毒 VP19 基因和哈氏弧菌 3- 磷酸甘油醛脱氢酶gapdh基因相融合所获得的sacB-tat-vp19-gapdh 融合基因序列 （SEQ ID NO: 1） 。 4. 如权利要求 1 所述的对虾多价载体疫苗， 其特征在于 ： 所述枯草芽孢杆菌重组菌株 在形成芽孢后能够在芽孢表面展示对虾白斑综合症病毒 VP281 蛋白。 5. 如权利要求 4 所述的对虾多价载体疫苗， 其特征在于 ： 所述枯草芽孢杆菌重组菌株 的染色体上整合有以枯草芽孢杆菌衣壳蛋白基因cotB为分子载体并与对虾白斑综合。
6、症病 毒 VP281 基因相融合的融合基因片段 （SEQ ID NO: 2） 。 6. 权利要求 15 任一项所述的新型对虾多价载体疫苗在对虾养殖中防治白斑综合症 病毒和弧菌引发病害的防治应用。 7. 如权利要求 6 所述的应用， 其特征在于 ： 所述抗对虾白斑综合症和弧菌病多价载体 疫苗是以枯草芽孢杆菌芽孢形式添加到对虾饲料及饲料添加剂中， 以口服方式免疫。 8. 如权利要求 6 或 7 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的对虾为中国对虾和南美白对虾。 权 利 要 求 书 CN 102895677 A 2 1/7 页 3 一种新型对虾多价载体疫苗及其应用 技术领域 0001 本发明属于基因生。
7、物工程技术领域， 涉及一种新型对虾白斑综合症病毒 （WSSV） 和 弧菌病多价载体疫苗及其应用， 具体地说是用于防治对虾白斑综合症和弧菌病的多价载体 疫苗及其应用。 背景技术 0002 对虾是主要在亚洲和拉丁美洲特别为出口目的生产的高价值水产品， 目前我国主 要的养殖品种为南美白对虾、 斑节对虾和中国对虾。然而在过去的 10 多年里， 对虾养殖生 产中出现了相当严重的问题， 其中白斑综合症病毒 （White spot syndrome virus， WSSV） 、 桃拉病毒 （Taura Syndrome Virus， TSV） 和弧菌为重要病害元凶。对虾白斑综合症 （white spot s。
8、yndrome， WSS） 是由对虾白斑综合征病毒 （WSSV） 引起的以感染对虾甲壳内侧出现 直径为 0.5 2 mm 大小的白色斑点为主要特征的暴发性传染病。该病感染率和死亡率都 极高， 给养虾业造成了巨大的经济损失。到目前为止， 在世界大部分对虾养殖区都爆发了 白斑综合症， 该病已成为全球对虾养殖业面临的最严重的挑战之一。除病毒病之外， 弧菌 病 （Vibriosis） 也是影响对虾养殖业最为常见、 危害较重的一类疾病， 它多发于 6-9 月间， 在虾苗孵育阶段临床症状主要表现为发光， 肠道破坏， 病害爆发时可一夜间导致 100死亡 率。 白斑综合症和弧菌病已成为我国和全球对虾养殖业健康。
9、可持续发展的严重制约因素。 0003 白斑综合症病毒 （WSSV）是属于 Nimaviridae 科 Whispovirus 属的代表种， 是一 种无包涵体、 有囊膜的杆状病毒 （van Hulten， et al.2001.Virology.286（1） :1-22） 。它 能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾， 此外还可以侵染淡水及海洋生态中的多种蟹类、 克氏鳌虾类、 端足类等甲壳纲动物， 具有较广泛的宿主范围， 给水产养殖造成严重的经济损 失。因此世界范围内针对对虾白斑综合症病毒的防治技术开发受到广泛关注。 0004 近年的研究表明， 白斑综合症病毒 （WSSV） 的重组囊膜蛋白可以诱导对。
10、虾产生抗病 保护效应。WSSV 的主要结构白蛋有 VP28、 VP19、 VP24、 VP26、 VP15 等。VP19 和 VP28 是主要 的囊膜蛋白。VP19 在囊膜蛋白的成分中所占比例仅次于 VP28， 国内外的研究将其作为设计 免疫预防性药物的靶位点 （Van Hulten M.C. et al. 2001. Virology. 286: 7-22） 。目 前， VP19 基因已在原核或真核生物表达系统内表达， 并且发现表达产物具有显著的抗病毒 保护效应， 保护效应次于 VP28 囊膜蛋白。VP281 是 WSSV 的次要结构蛋白， 由 ORF1050 编码， VP281 中存在一细。
11、胞黏附序列 （RGD 三肽序列） ， 提示此囊膜蛋白可能在介导 WSSV 感染时发 挥重要作用 （Huang C H， et al.2002. Journal of General Virology 83: 2385-2392） 。 0005 目前， 国内外在研究 WSSV 疫苗上取得了很大的进展。已研发的包括有核酸类疫 苗 （Rout N， et al. 2007.Vaccine. 25:2778-2786 ； Rajeshkumar S， et al. 2009. 26 （3） :429-437 等） 和重组疫苗 （Witteveldt J， et al. 2004b. J Virol.7。
12、8:2057-2061 ； Witteveldt J， et al. 2004a. Fish Shellfish Immunol.16:571-579 ； Mavichak R. et al. 2010. J Fish Dis. 33:69-74等） 。 Witteveldt J等发现VP28的亚单位疫苗对对虾免 受WSSV的感染起到重要的保护作用， 其免疫保护率达到70%。 宁德刚等人 （D. Ning， et al. 说 明 书 CN 102895677 A 3 2/7 页 4 2011 Journal of Applied Microbiology 111:1327-1336） 通过枯草。
13、芽孢杆菌芽孢衣壳蛋 白展示系统将 VP28 蛋白展示到枯草芽孢杆菌的表面， 通过口服的方式免疫克氏鳌虾， 21 天 的免疫保护率为 30%。2011 年美国 Harris 等人证明在注射的条件下 VP19 的免疫保护率要 优于 VP28（J.Dustion Loy， DVM global aquaculture advocate May/June 2011） 。2007 年 Namita Rout 等人 （Namita Rout， et al.2007.Vaccine.25:2778-2786） 制备的 VP281 的 DNA 疫苗使对虾免受病毒感染的保护作用达到了 50 天。基于上述前人的研。
14、究结果， 本发明 采用的 WSSV 的抗原蛋白是 VP281 和 VP19。 0006 弧菌是一类条件致病菌， 分布广泛， 当水体环境变化， 弧菌尤其是致病性弧菌繁殖 迅速， 如数量超过阈值则容易引发对虾弧菌病。 目前对虾弧菌病的主要病原为哈氏弧菌、 副 溶血弧菌和鳗弧菌等。多年来弧菌病主要采用抗生素治疗， 但抗生素治疗带来一系列严重 后果， 主要是产生耐药菌株， 造成水体污染。 以抗生素为代表的化学疗法已经在水产病害防 治中的成效逐渐丧失并在越来越多的国家受到限用或禁用。 因此探索新的免疫和治疗途径 势在必行。 0007 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH） 作为一个传统糖酵解蛋白基因广泛。
15、存在于几乎所 有的生物体中。然而近年来的研究表明 GAPDH 在不同的亚细胞部位显示出和糖酵解无关 的多种生物学活性 （Sirove， M.A.， 1997， J Cell Biochem， 66（2） ： 133-40 ； Sirove， M.A.， 1999， Biochim Biophys Acta， 1432（2） ： 159-184） 。在许多微生物 （酵母， 细菌和致病性寄 生虫） 的研究中发现， GAPDH 不仅存在于细胞质中还定位于细胞膜上。从而 GAPDH 做为外膜 蛋白的生物学功能受到广泛的关注。1997 年 Gil Navarro 等人首先在白色念珠菌中发现 GAPDH 。
16、具有免疫原性 （Gil Navarro et al.， 1997， J Bacteriol， 179 ： 4992-4999） 。目前在 布鲁氏菌和迟钝爱德华氏菌中已经证实， GAPDH能够激发宿主的保护性免疫反应 （Kawai K. et al， 2004， Vaceine， 22 ： 3411-3418 ； Rosinnha G.M. et al.， 2002， J Med Mierobiol， 51 （8） ： 661-671） 。目前的研究也表明， 许多致病弧菌的 GAPDH 的同源性非常高， 具有很高的保 守性。 X. Li等已证实GAPDH是重要的广谱性保护抗原， 在不同的病原菌间。
17、具有显著的交叉 免疫力 （X.Li et al.， 2012， Letters in Applied Microbiology， 54（1） :1-9） 。因此， 以 哈氏弧菌gapdh基因作为应用靶点开发成为针对多种弧菌病的疫苗具有具大的应用价值。 目前尚未有利用 GAPDH 作为抗原开发虾类疫苗的报道。 0008 但目前已有的研究工作也存在着很多不足之处 ： 1） 给药不方便， 主要以注射的方 式给药， 难以进行生产性养殖应用 ； 2） 现有的疫苗免疫保护期难以超越 28 天， 无法满足对 虾生产养殖中对免疫保护期的实际需要 （40 天以上） ， 故没有生产应用价值和开发前景。 0009 。
18、枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 作为一种好氧性的革兰氏阳性细菌， 是国际 公认的具有良好生物安全性的非致病性宿主菌， 可作为多种抗原蛋白的表达载体宿主菌。 它在营养缺乏或其他胁迫条件下， 能形成具有抗逆性的休眠体芽孢， 芽孢在肠道内定植后 可萌发成营养体， 而营养体枯草芽孢杆菌是常用的益生菌之一， 它在水产养殖中可起到净 化水质的作用， 同时枯草芽孢杆菌对水产中的弧菌、 大肠杆菌和杆状病毒等有害细菌有很 强的抑制作用。 而芽胞良好的抗逆性使疫苗能够耐受胃液中的酸性环境， 储存时间长， 可顺 利通过胃肠屏障， 快速诱导机体产生保护性免疫反应。枯草芽孢杆菌芽孢的形成是一系列 。
19、基因程序性表达的结果。这些基因包括芽孢衣壳蛋白基因以及其调控基因， 如cotA、 cotB、 cotC、 cotF、 cotG和cotX等 20 余种。利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白的基因为分子载体， 说 明 书 CN 102895677 A 4 3/7 页 5 通过分子生物学技术和芽孢表面展示技术将外源目的蛋白展示于重组枯草芽孢杆菌芽孢 表面， 构建具有生物活性的重组芽孢备受关注。2001 年 Isticato R 等人第一次利用 CotB 作为芽孢表面展示外源抗原的融合载体蛋白， 成功地在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示了破 伤风毒素 （TTFC） C末端的片段。 宁德刚等人 （D. Ning， e。
20、t al. 2011 Journal of Applied Microbiology 111:1327-1336） 通过基于 CotB 和 CotC 衣壳蛋白基因展示系统将 VP28 蛋白 展示到枯草芽孢杆菌的表面， 通过口服的方式免疫克氏鳌虾， 7 天的免疫保护率为 77%， 21 天的免疫保护率为 30%。 0010 蛋白质转导结构域 （protein transduction domain， PTD） 或称细胞穿膜肽是一条 以肽为载体的有效运输各物质进入细胞及细胞核的系统。通过 PTD 携带的物质有全产蛋白 质、 DNA、 化学药物、 寡核苷酸等。现在研究最多的、 应用范围最广的蛋白转导。
21、结构域来源于 人免疫缺陷病毒 I 型的转录激活因子 （trans-activating transcriptional activator， TAT） TAT 蛋白。早在 1994 年， Fawell 等就已证实， TAT 蛋白来源的多肽能够携带外源分子 转导进入细胞， 但是到目前为止， 关于 TAT 蛋白转导结构域进入细胞的分子机制还没有完 全研究清楚。尽管其进入细胞的机制还没有完全研究透彻， 但是 TAT 已经广泛应用于药物 的研究 （L. Crombez， et al.2009， Mol. Ther.， 17 ： 95103 ； S.C. Pero， et al. Cancer 96 ：。
22、 1520-1525） 和疫苗的开发 （Zhang Y et al， 2012， Journal of virological methods 181 （ 1 ） : 59-67） 。2012 年孟小林等人 （Yi Z， et al.2012.Journal of Virological Method 181:59-67） 将TAT-VP28制备成亚单位疫苗免疫克氏鳌虾， 发现14天的免疫保护率 提高了 14%， 达到 67.8%。因此， TAT 在疫苗方面有着潜在的应用价值， 但是将 TAT 蛋白应用 于水产载体疫苗的开发目前还处于空白。 0011 虽然目前已有将 VP28 展示于枯草芽孢杆。
23、菌表面制备成载体疫苗的研究， 也有将 TAT-VP28 融合蛋白制备成亚单位疫苗的研究， 但是其免疫保护期相对较短， 在大规模的水 产养殖应用上存在诸多弊端。目前国际上只有 2007 年 Namita Rout 等人 （Namita Rout， et al.2007.Vaccine.2778-2786） 将对虾疫苗的免疫保护期提高到50天。 作者将VP281和VP28 制备成DNA疫苗以注射的方式免疫黑虎虾， 结果发现， 随着检测免疫保护期的延长VP281的 保护效果要优于 VP28（25 天时 VP28 免疫保护率是 53%， VP281 的免疫保护率是 50% ； 50 天 时 VP28 。
24、免疫保护率是 30%， VP281 的免疫保护率是 35%） 。 0012 综上所述， 本发明的目的在于提供一种可口服并且具有较长免疫保护期的抗对 虾白斑综合症和弧菌病的多价载体疫苗， 该载体疫苗由枯草芽孢杆菌经基因工程改造而 获得， 在该重组枯草芽孢杆菌形成芽孢时， 芽孢表面展示有对虾白斑综合症病毒 VP281 蛋 白， 在该重组枯草芽孢杆菌形成营养体细胞时， 胞外分泌表达穿膜肽 TAT、 白斑综合症病毒 VP19 和哈氏弧菌 GAPDH 构建的融合蛋白。在本发明作出以前， 这样的载体疫苗迄今尚未见 于任何类似的报道或发明专利。 发明内容 0013 本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，。
25、 提供一种可口服并且具有较长免 疫保护期的抗对虾白斑综合症和弧菌病的多价载体疫苗， 该疫苗是以枯草芽孢杆菌重组菌 株作为核心制备而成的一种新型的口服剂型多价载体疫苗， 该疫苗在营养细胞状态时可以 分泌穿膜肽、 白斑综合症病毒 VP19 和哈氏弧菌 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH） 形成的融合 说 明 书 CN 102895677 A 5 4/7 页 6 蛋白， 而在诱导形成芽孢后可产生表面展示对虾白斑综合症病毒 VP281 蛋白的芽孢。 0014 按照本发明提供的技术方案 ： 一种新型对虾载体疫苗， 其特征在于 ： 所述疫苗包 括利用基因工程方法得到的枯草芽孢杆菌重组菌株， 该菌株的分类。
26、命名是枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） HT5303， 已保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏号为 CCTCCNo ： M 2012395。 0015 作为本发明的进一步改进， 所述枯草芽孢杆菌重组菌株在营养细胞状态时能够分 泌白斑综合症病毒 VP19 和哈氏弧菌 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH） 形成的融合蛋白。 0016 作为本发明的进一步改进， 所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上还重组整合有 由枯草芽孢杆菌分泌信号肽sacB基因、 人工合成tat基因、 白斑综合症病毒 VP19 基因和哈 氏弧菌 3- 磷酸甘油醛脱氢酶gapdh基因形成的相融合所获得的sacB-。
27、tat-vp19-gapdh融 合基因序列 （SEQ ID NO: 1） ， 该枯草芽孢杆菌重组菌株在营养细胞时能够胞外分泌表达穿 膜肽、 白斑综合症病毒 VP19 和哈氏弧菌 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH） 形成的融合蛋白。 0017 作为本发明的进一步改进， 所述枯草芽孢杆菌重组菌株在芽孢状态时能够在芽孢 表面展示对虾白斑综合症病毒 VP281 蛋白。 0018 作为本发明的进一步改进， 所述枯草芽孢杆菌重组菌株的染色体上重组整合有以 枯草芽孢杆菌衣壳蛋白基因cotB为分子载体并与对虾白斑综合症病毒 VP281 蛋白相融合 的融合基因片段 （SEQ ID NO: 2） ， 通过诱导。
28、该枯草芽孢杆菌重组菌株形成芽孢后， 可产生 表面展示对虾白斑综合症病毒 VP281 蛋白。 0019 本发明还提供了所述新型对虾多价载体疫苗在对虾养殖中防治白斑综合症病和 弧菌病的应用。 0020 作为所述应用的进一步改进， 所述新型对虾多价载体疫苗是以枯草芽孢杆菌芽孢 形式添加到对虾饲料及饲料添加剂中， 以口服方式免疫。 生物材料样品保藏 ： 枯草芽孢杆菌 HT5303（Bacillus subtilis） HT5303， 于 2012 年 10 月 11 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址 ： 中国武汉， 武汉大学， 保藏号 CCTCCNo ： M 2012395。 0021 本发明与。
29、现有技术相比， 优点在于 ： 本发明的枯草芽孢杆菌疫苗株， 形成芽孢后能 够在芽孢表面展示对虾白斑综合症病毒 VP281 蛋白， 在形成营养细胞时分泌表达白斑综合 症病毒 VP19 和哈氏弧菌 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 （GAPDH） 形成的融合蛋白。本发明利用芽孢 所具有的独特抗逆性， 将该枯草芽孢杆菌多价载体疫苗以芽孢形式添加到对虾饲料中口服 免疫。本发明构建的多价载体疫苗， 相对于其它疫苗具有多价交叉保护和保护期长 （35 天 以上） ， 并且该疫苗能够添加到饲料中， 耐受饲料的高温定型， 具有实际的生产应用开发价 值。 附图说明 0022 图 1 是口服免疫接种多价载体疫苗的南美白对虾在。
30、停止免疫一段时间时， 攻对虾 白斑综合症病毒后的各实验组的累计死亡率统计曲线图。 0023 图 2 是口服免疫接种多价载体疫苗的中国对虾在停止免疫一段时间时， 攻对虾白 斑综合症病毒后的各实验组的累计死亡率统计曲线图。 0024 图3是口服免疫接种多价载体疫苗的南美白对虾和中国对虾在停止免疫28天时， 说 明 书 CN 102895677 A 6 5/7 页 7 攻弧菌病原菌后的各实验组的累计死亡率统计曲线图。 具体实施方式 0025 下面结合具体附图和实施例对本发明做进一步描述。 0026 实施例 1 ： 抗对虾白斑综合症和弧菌病多价载体疫苗的制备 1、 培养基配制 （1） DSM 液体培养。
31、基 ： 细菌营养肉汤 （Difco） 8g， 10%（w/v） KCl 10ml， 1.2%（w/v） MgSO4 7H2O 10ml， 1M NaOH 1.5ml， 调 pH 至 7.6， ddH2O 定容至 1000ml。高压灭菌后， 冷却至 50， 在使用前分别加入已灭菌的 1M Ca（NO3） 2、 0.01MMnCl2、 1mMFeSO4各 1ml。 0027 （2） PBS 缓冲液 ： Na2HPO42H2O 2.74g/L， NaH2PO4H2O 0.63g/L， 将所述成份溶解 于 1000ml 蒸馏水， 于 121灭菌 20 分钟。 0028 （3） LB 培养基 ： 胰蛋白。
32、胨 （Tryptone） 10g/L， 酵母提取物 （Yeast extract） 5g/L， 氯化钠 （NaCl） 10g/L， 调 pH 至 7.0。 0029 2、 平板培养基复苏 ： 取 -80保存的保藏号为 CCTCCNo ： M 2012395 的枯草芽孢杆 菌重组菌株种子划线接种于 LB 固体平板上， 在 37培养过夜， 使枯草芽孢杆菌重组菌株复 壮， 形成单菌落。 0030 3、 种子的制备 ： 挑取单菌落接种于 100ml DSM 液体培养基中， 37培养 18h， OD600 至 2.0， 作为种子液。 0031 4、 发酵液的制备 ： 制备的种子液按照 1% 的接种量接种。
33、到 5L 生物反应器中， 采用 DSM液体培养基， 培养温度37， 通气量2L/分钟， pH7.5， 培养25-30h， 至芽孢形成率90%以 上， 终止发酵， 得发酵液。 0032 5、 枯草芽孢杆菌芽孢菌粉的制备 ： 将上述发酵液于室温以 5000g 离心 10 分钟， 收 集菌泥， 向菌泥中加入 15% 重量百分比的淀粉， 喷雾干燥， 得到水分重量百分含量 无锡海健生物科技有限公司 一种新型对虾多价载体疫苗及其应用 2 1 1865 DNA 人工序列 1 acggattagg ccgtttgtcc tcatggaccc gtataaaaag aatgatattg agcgttttga 6。
34、0 ccgtgagccg gatgtgatct gcgagtatat taaaaaccgt tcacaatacc tcaaagatca 120 tttaagtatt ttatgaatgc gtgaaaatgg gtattcgcgg aaaaagcgac aattaggcta 180 ttgaattagt tcaacaaata aatgtgacac gtatatatgc agtatgttta tcatctatgt 240 ataagtgact aggaggaatt tgaatgagca agaggagaat gaaatatcat tcaaataatg 300 aaatatcgta ttataac。
35、ttt ttgcactcaa tgaaagataa aattgttact gtatatcgtg 360 gaggtccgga atctaaaaaa ggaaaattaa cagctgtaaa atcagattat atagctttac 420 aagctgaaaa aaaaataatt tattatcagt tggagcatgt gaaaagtatt actgaggata 480 ccaataatag caccacaaca attgagactg aggaaatgct cgatgctgat gattttcata 540 gcttaatcgg acatttaata aaccaatcag ttcaa。
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39、gttgagcacg ccgatttttt actggaccga atgacacccg 1380 taagcgagga agatattgaa ggtttcgctg cttctacttt taaggaggta tcagattcaa 1440 aaactgcaac agtcatagtt aaggcagatt gtgaaacggg ggatatcgat gaagtgtata 1500 atcttgcacc atcattcggc gtcactcaag aaattaaaat atataggtca aacaattcct 1560 cggaattgga taatgtcgca gattctttcc atatt。
40、tataa aatttctgca acagatagcg 1620 acagtggcaa tactaaaaaa ttgttgtatg ggttaaggaa taaaaaagca ggttatacgt 1680 gtttgtgtag aatttttgca gaaattgaat cagatgggat tatggccaat acaaatatcg 1740 gtgtcgctga aaacaacaga gatgaaattg atgaaaacga agaaggtaaa tatggttttt 1800 序 列 表 CN 102895677 A 10 2/2 页 11 taatacccaa acaaccagct。
41、 ggtgctaaat tgatcatcta cttcttttta aattgttgga 1860 cataa 1865 2 1482 DNA 人工序列 2 atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60 gcaggaggcg caactcaagc ttttgcctac ggccgtaaaa aacgtcgtca acgtcgtcgt 120 atggccacca cgactaacac tcttcctttc ggcaggaccg gagcccaggc cgctggccct 180 tcttacacca t。
42、ggaagatct tgaaggctcc atgtctatgg ctcgcatggg cctctttttg 240 atcgttgcta tctcaattgg tatcctcgtc ctggccgtca tgaatgtatg gatgggacca 300 aagaaggaca gcgattctga cactgataag gacaccgatg atgatgacga cactgccaac 360 gataacgatg atgaggacaa atataagaac aggaccaggg atatgatgct tctggctggg 420 tccgctcttc tgttcctcgt ttccgccgcc。
43、 accgttttta tgtcttaccc caagaggagg 480 cagtaaatga ctatcaaagt aggtattaac ggttttggcc gtatcggtcg tttcgtattc 540 cgtgcagcgc aagagcgcaa cgacatcgaa gttgtaggta ttaacgacct tatcgacgta 600 gattacatgg catacatgct taagtacgac tcaactcacg gccgtttcaa cggtactgtt 660 gaagttgaag gcggtaacct aatcgttaac ggtaaaactg tacgtgta。
44、ac tgcagagcgc 720 aacccagaag acctaaaatg ggacgcaatc ggtgttgacg tagtagctga agcaactggt 780 cttttcctaa ctgacgagac tgcacgtaag cacatcactg ctggcgcgaa gaaagttgtt 840 ctaactggtc cttcaaaaga cgctactcca atgttcgtaa tgggcgttaa ccacgctact 900 tacgctggtc aagacatcgt ttctaacgct tcttgtacta ctaactgtct agcgcctatcv 960 g。
45、ctaaagttc ttaacgacaa gttcggtatc gaatctggtc ttatgactac agttcacgct 1020 actacagcaa ctcaaaaaac tgtagacggt ccttctgcta aagactggcg cggtggtcgt 1080 ggtgcttctc aaaacatcat cccatcatca actggtgctg ctaaagctgt aggcgttgtt 1140 cttccagaac taaacggcaa actaactggt atggctttcc gcgtaccaac agctaacgtt 1200 tctgtagttg acctaa。
46、cagt taacctaaaa gaaggcgcat cttacgaagc tatctgtgca 1260 gcaatgaaag aagcttctga aggcgaacta gctggcgtac taggctacac tgaagaccaa 1320 gttgtttctc aagacttcat cggtgaagtt caaacttcag tattcgatgc taaagctggt 1380 atcgctctaa ctgataactt cgttaaagtt gtatcttggt acgacaacga aatcggttac 1440 tcaaacaaag ttctagacct aatcgctcac atctctaagt aa 1482 序 列 表 CN 102895677 A 11 1/2 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102895677 A 12 2/2 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 102895677 A 13 。