反义抑制c-myc以调节平滑肌细胞的增殖 【发明领域】
本发明涉及利用对c-myc原癌基因进行反义疗法从而对平滑肌细胞的增殖进行调节。
【发明背景】
在超过90％的病人中，冠状血管成形术会成功地产生非外科手术的再血管化。1990年美国共进行了300,000多例冠状血管成形术。然而冠状血管成形术的主要限制在于在术后的头六个月内30-40％的病人会发生再狭窄。
已经证明在冠状血管成形术后发生的动脉粥样硬化及再狭窄中，血管平滑肌细胞(SMC)起了很重要的作用。在两种损害中均已证实有SMC的存在，并且，主要是由于SMC由收缩型表型向合成型表型的转变。这一显著的特点是与SMC的增殖、其由中膜向内膜的游走以及胞外基质的合成相结合的，而所有这些现象均导致新生内膜的形成(动脉的狭窄)。与延续数十年的动脉粥样硬化过程不同，血管的再狭窄代表了一种对囊(balloon)损伤的迅速的反应，通过在最初张开的脉管中形成新生内膜而在几个月的时间内最终导致显著的再狭窄。因此，很明显须抑制SMC的生长以控制再狭窄过程。
在过去地十年中，已进行了深入的实验及临床调查研究以预防再狭窄。一些介入疗法，例如抗血小板、抗凝血、抗炎及血管舒张剂疗法，已显示出令人可喜的降低实验性囊损伤后新生内膜增殖的严重性的作用。见Powell等人，Science 1989，245，186-188；J.Castellot等人，J.Cell Physiol 1985，124，21-38；Fox等人，Science 1988，241，453-456。
最近，已有尝试使用新的机械装置来限制再狭窄(例如，扩张机，atherectomy，激光器，rotablator等)，然而，初步的数据显示这些介入仅能起有限的作用，因为在机械介入改善冠状血管成形术的最初结果的同时，机械技术会加大这一过程中的血管壁的损伤，因此不能降低SMC的增殖及再狭窄率。另外，机械介入仅能应用于一小群具有最佳的冠状解剖结构的病人。
亦已建议使用抗促细胞分裂疗法来防止再狭窄。例如，浓缩肝素已被试验用作抗增殖剂以控制成形术后的再狭窄问题，见Wolinsky和Thung，JACC 1990，15(2)，475-481.γ-干扰素被证实是另一种用于治疗再狭窄的潜在有用的疗法，见1990年4月5日公开的WO90/03189。然而通过全身给药使用的抗增殖剂的剂量可能不足以达到预期效果的剂量。因此，被测试的药物在更复杂的临床条件下不足以显示有利的效应。
最近在细胞生物学和分子生物学方面的进展使得对SMC增殖的分子机理有了了解，其机理是由于信号(例如生长因子)从胞外环境向细胞核的传导所致。在SMC的表型调节过程中一些基因被暂时激活(Gabbiani等人，J.Clin Invest 1984，73，148-152；Walker等人，Proc Natl Acad Sci USA1986，83，7311-7315；Miano等人，Am JPathol 1990，137，761-765；Majesky等人，Circulation Research 1992，71，759-768)。这些发现激发了人们对确定在SMC生长中非正常基因表达的作用，以及选择潜在的基于分子水平途径治疗获得性心血管疾病例如血管再狭窄的治疗靶子方面的兴趣。最近，Speir和Epstein(Circulation 1992，86，538-547)显示了使用高浓度的与增殖细胞核抗原mRNA互补的反义寡核苷酸对大鼠平滑肌细胞生长的抑制作用。
细胞核原癌基因是与细胞增殖紧密相关的高度保守的磷蛋白。已经表明随着细胞进入G1期，在促细胞分裂的刺激后细胞核原癌基因mRNA暂时增加，并且这种增加对于G1至S期转变似乎是必要的。在培养SMC的研究中证实，原癌基因c-fos，c-myc以及c-myb在各种促细胞分裂刺激后不久均被激活(Kindy等人，J Biol Chem 1986，261，12865-12868；Brown等人，J Biol Chem 1992，267，4625-4630)。在一类似于体外研究的一种模型中，囊(balloon)剥落(denudation)后，在血管壁中也诱导了原癌基因的表达(Miano等人，AmJPathol 1990，137，761-765)。上述的观察以及信号传导途径的多余度(redundancy)均提高了下述可能性，即细胞核原癌基因的活化是许多不同的促分裂信号趋同现象的最终相同途径，从而使其成为一潜在的治疗靶子。Collins等人(J.Clin.Invest.1992，89，1523-1527)发现互补于c-myc的反义寡核苷酸抑制集落性癌细胞的集落形成。其它的研究小组致力于原癌基因cmyb的研究并已发现抑制cmyb可抑制平滑肌细胞的增殖。最近，Simon和Rosenberg (Circulation Research 1992，70，835-843)显示了c-myb反义寡核苷酸在大鼠平滑肌细胞中的抑制生长的效果。
反义技术是作为降低特异性基因产物表达水平的一项有效的措施而出现的。该技术基于下述发现，即这些“反义”序列与一个基因或有关的靶多核苷酸杂交，并分别根据沃森-克里克或Hoogsteen式结合方式形成稳定的双螺旋或三螺旋，随后这些特殊结合的反义化合物或者使得其靶子更易于进行酶降解，阻断翻译及加工；或者阻断或抑制靶多核苷酸的功能。当靶多核苷酸为RNA时，所述的反义分子与特异的RNA转录物杂交，打断正常的RNA加工、稳定性及翻译，因而阻止靶基因的表达。已经表明使用反义寡核苷酸或转移能够产生互补于目标mRNA的胞内反义序列的表达结构可以在体外及体内阻断特定基因的翻译。例如，致力于研究c-myc的Holt等人(Mol CellBiol 1988，8，963-973)在人骨髓原白血病HL-60胞中发现了与靶mRNA形成的胞内双螺旋以及c-myc蛋白的选择性降低。
非常希望有调节与任何血管床的再狭窄有关联的平滑机细胞的增殖的方法，这类方法应该能用于广范围的血管疾病包括冠状血管和外周血管狭窄(即阻滞)的病人。另外，该方法应具有高功效。本发明就提供了这类方法。
本发明概述
根据本发明，将平滑肌细胞与c-myc特异性反义寡核苷酸接触以调节这些细胞的增殖。
本发明的一个较佳实施方案提供了一种调节平滑肌细胞增殖的方法，其包括将平滑肌细胞与编码c-myc的mRNA的一段区域互补的寡核苷酸接触。
本发明的另一个较佳实施方案提供了一种治疗患有再狭窄的病人的方法，其包括给予所述的病人有效治疗量的与编码c-myc的mRNA的一段区域互补的寡核苷酸。
本发明的再一个较佳实施方案提供了一种在易患再狭窄的病人中防止发生血管再狭窄的方法，包括给予所述的病人有效治疗的与编码c-myc的mRNA的一段区域互补的寡核苷酸。
附图的简要说明
图1为静止期和增殖期的人SMC中的c-mycmRNA在6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的放射自显影。
图2为与10μM c-myc反义寡核苷酸(●)、有义寡核苷酸(▲)以及错配寡核苷酸(○)一起培养的人SMC的生长曲线的示意图。对照组细胞(△)培养时未加寡核苷酸。
图3为加入c-myc反义寡核苷酸后人SMC的剂量依赖的生长抑制的示意图。结果是以平均值±SD表示的。
图4示出了过量的有义寡核苷酸对c-myc反义寡核苷酸的生长抑制效果的影响。第一天的抑制百分比是以三次重复计算的，数据是以平均值±SD表示。
图5是用有义或反义寡核苷酸处理的人SMC的c-myc mRNA在6％变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳后的放射自显影。C：对照(无寡核苷酸)，S：c-myc有义寡核苷酸(10μM)，A：c-myc反义寡核苷酸(10μM)。
图6示出了人SMC中寡核苷酸在胞内的积聚。胞内寡核苷酸的含量是用闪烁计数器测定结合放射活性的细胞而得出的。
图7展示了在猪的血浆中35S标记的寡聚物的药物动力学曲线，其中寡聚物是通过多孔气囊导管在4个大气压的压力下注入冠状动脉(1mg/血管)。在注入寡核苷酸后的30分钟、1天、3天和7天后剖杀实验动物。
图8是与图7相同的猪的冠状动脉中35S标记的寡聚物的药物动力学曲线。
图9A和9B是进行血管成形术一个月后的猪冠状动脉的截面照片。c-myc有义寡聚物(序列号为2的序列)是在血管成形术后立即通过壁内注射而给予的。可以观察到显著的新生内膜增厚(箭头所指)。
图10A和10B为类似于图9A和9B的照片，只是动物接受的是c-myc反义寡核苷酸(序列号为1的序列)而不是c-myc有义寡核苷酸。可以看到明显的新生内膜厚度减小。
图11示出在有义-治疗(○)的猪和反义-治疗(●)的猪中新生内膜面积和冠状动脉损伤程度(损伤积分)之间的函数关系。所绘出的回归线代表了新生内膜和损伤积分之间的关系。斜率(p＜0.01)的明显降低反映了在反义-治疗的动物中新生内膜生成减少。
图12示出了以人SMC中的c-myc mRNA为靶子的各种反义序列的生长抑制效果。对序列号为1和6-12的反义寡核苷酸在浓度为8μM和16μM时、和有义寡核苷酸、错配寡核苷酸(MIS)以及无规配(scrambled)有义寡核苷酸(SCR)在第3天的抑制百分率进行了估算。
本发明详述
反义寡核苷酸在治疗多种人类疾病中作为治疗剂有着很大的潜力。理论上讲，设计能利用碱基配对与一级结构如RNA分子相互作用的化合物比设计一个与酶的活性位点相互作用的分子要容易得多。寡核苷酸以Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对方式特异性地与DNA、mRNA前体或成熟mRNA的互补序列结合(杂交)，从而打断了遗传信息由DNA向蛋白质的流动。反义寡核苷酸的特异于其靶序列的特性还使其非常通用。由于反义寡核苷酸是四个单体单元的长链，因此可以很容易地合成用于任何靶序列的反义寡核苷酸。很多最近的研究报道了使用反义寡核苷酸用作研究靶蛋白的生化工具，如Rothenberg等人，J.Natl.Cancer Inst.1989，81，1539-1544；Zon，G.，Pharmaceutical Res.1988，5，539-549。由于最近在寡核苷酸化学和具有增强稳定性的耐核酸酶寡核苷酸的合成方面的进展，现在可以考虑用反义寡核苷酸作为一种新的治疗方法。
目前的治疗或防止再狭窄发生的方法在治疗或预防再狭窄时仅仅表现出有限的效果。而本发明则直接涉及对平滑肌细胞增殖的调节，因此满足了到目前为止尚未被其它方法满足的需要。
在本文中采用的名词“寡核苷酸”是指由核苷酸连接起来所形成的多核苷酸。另外，“寡核苷酸”包括天然的寡核苷酸或由天然亚单位或设计用来使寡核苷酸具有特殊性质以使其在生物体系中更稳定或与靶序列结合更紧密的类似的亚单位所形成的合成寡核苷酸，还包括修饰的寡核苷酸，例如将其与其它化合物键合以便促进其向细胞或细胞核以及细胞内其它部位的输送。此外，本发明的寡核苷酸可能合有修饰的核苷酸间键合以提供对核酸酶的稳定性。例如，本发明包括硫代磷酸寡聚脱氧核糖核苷酸。因此，“寡核苷酸”包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸的未修饰的寡聚物，以及其中一或多个嘌呤或嘧啶组分、糖组分或核苷酸间键合进行化学修饰的寡聚物。
在不限定上述一般概念的前提下，本文中采用的“寡核苷酸”定义包括天然或修饰的单体或键合，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、α-异头物，的线性寡聚物，聚酰胺核酸等等，这些能通过常规的单体-单体作用方式，如Watson-Crick式碱基配对、Hoogsteen或反Hoogsteen式碱基配对或类似的碱基配对等，特异性地与靶多核苷酸结合。通常单体通过磷酸二酯键或类似的方式连接形成大小为几个单体，例如3-4个，到数百个单体的寡核苷酸。磷酸二酯键相似键合方式包括：硫代磷酸、二硫代磷酸、硒代磷酸、二硒代磷酸、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、phosphoramidate等等，这些在下文将有详细描述。本文中所用的“核苷”为包括2’-脱氧型和2’-羟基型在内的，例如在Kornberg和Baker的DNA Replication，第2版(Freeman，San Francisco，1992)中描述的天然核苷。核苷的“类似物”包括具有修饰的碱基组分和/或修饰的糖组分的合成核苷，例如在Scheit的Nucleotide Analogs(John Wiley，New York，1980)中作了概述。这种类似物包括合成核苷，设计用来增强结合特性，如双螺旋或三螺旋的稳定性、特异性等。
“c-myc特异的反义寡核苷酸”，或“c-myc反义寡核苷酸”是一种具有一种(i)能够与c-myc原癌基因的一部分形成稳定三螺旋的，或(ii)能够与c-myc原癌基因的mRNA转录物的一部分形成稳定双螺旋的序列的寡核苷酸。
双螺旋或三螺旋形成的“稳定性”大体上是指一种反义寡核苷酸与其靶序列结合的紧密程序；更精确地说，是指在生理条件下形成双螺旋或三螺旋的自由能。例如，如下所述，在标准条件下的解链温度就是一种常用的双螺旋和/或三螺旋稳定性的检测方法。优选的是，本发明的反义寡核苷酸在下述设定的标准条件下的解链温度至少为50℃；因此，在生理条件下以及优选的浓度时，更容易形成双螺旋或三螺旋，而非寡核苷酸与其靶序列处于解离状态。应该理解的是，在某些实施方案中稳定的双螺旋或三螺旋也可以包括碱基对之间和/或在三螺旋情况下的碱基三联体中的错配。优选的是，本发明的反义寡核苷酸与其靶多核苷酸形成完全正确配对的双螺旋和/或三螺旋。
优选的是，对本发明的寡核苷酸进行修饰以增加其稳定性并防止胞内和胞外的降解。更优选的是，将本发明的寡核苷酸进行修饰以增加其对靶序列的亲和性，并且当其以活性药物形式输入哺乳动物时，促进其向适当的细胞和细胞的各部分的传输。
靶多核苷酸可以是单链或双链DNA或RNA；单链DNA或RNA靶序列是优选的。应该理解，本发明的c-myc反义寡核苷酸定向的靶序列包括c-myc原癌基因的等位基因。在有关选择反义寡核苷酸的特定靶序列的文献中有一主要的原则，给出了靶多核苷酸序列方面的资料，例如，Peyman和Ulmann，Chemical Reviews，90：543-584，1990；Crooke，Ann Rev. Pharmacal Toxicol.， 32：329-376；Zamecnik和Stephenson，Proc.Natl.Acad.Sci.，75：280-284 (1974)给出了这方面的资料。优选的是，c-myc反义化合物序列的G-C含量至少为60％。优选的原癌基因mRNA靶序列包括：5’帽位点、tRNA引物结合位点、起始密码子位点、mRNA供体剪接位点以及mRNA受体剪接位点，例如见Good child等人的美国专利4,806,463。
本发明的反义寡核苷酸可以包括能够以常规的单体-核苷作用方式，例如Watson-Crick式碱基配对、Hoogsteen或反Hoogsteen式碱基配对等，与靶多核苷酸特异性结合的任何多聚化合物。本发明的反义化合物还可以包括侧基或组分，或作为聚合物基本重复单位的一部分，或与该基本重复单位分离，其作用是增加特异性、核酸酶抗性、运输或其它与效力有关的特性，其例子有：胆甾醇组分、双螺旋嵌入物如丫啶、聚L赖氨酸、用一或多种耐核酸酶的键合基团如硫代磷酸进行的“末端加帽”，等等。
例如，已知通过用烷基或烷氧基取代核苷酸间磷酸二酯键中的磷酸氧以形成烷基膦酸寡核苷或烷基磷酸三酯寡核苷，以增加脂溶性和/或抗核酸酶的消化。这种非离子型寡核苷酸的特征在于增强了对核酸酶水解的抗性和/或增加了细胞吸收，同时还保持与互补核酸序列形成稳定的复合体。烷基膦酸对核酸酶裂解特别稳定并且可溶于脂类。Tso等人的美国专利4,469,863中公开了烷基膦酸寡核苷的制备方法。
优选的是，通过提供耐核酸酶的核苷间键合使本发明的反义化合物具有耐核酸酶特性。已知现有技术中有许多这类键合，例如：硫代磷酸：Zon和Geiser，Anti-Cancer Drug Design，6：539-568 (1991)；Stee等人，USP5,151,510；Hirschbein，USP5,166,387；Bergot，USP5,183,885；二硫代磷酸：Marshall等人，Science，259：1564-1570(1993)；Caruthers和Nielsen，PCT/US89/02293；氨基磷酸：例如-OP(＝O)(NR1R2)-O-，其中R1和R2为氢或C1-C3烷基；Jager等人，Biochemistry 27：7237-7246(1988)；Froehler等人，PCT/US90/03138；多肽核酸：Nielsen等人，Anti-Cancer Drug Design，8：53-63(1993)，PCT/EP92/01220；甲基膦酸：Miller等人，USP4,507,433，Ts’o等人，USP4,469,863；Miller等人，USP4,757,055；以及各种类型特别是硫代磷酸的P-手性键合，Stec等人，欧洲专利申请506,242(1992)，Lesnikowski，BioorganicChemistry，21：127-155(1993)。其它的核酸酶(抗性)键合包括：硒代磷酸、二硒代磷酸、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、烷基磷酸三酯如甲基-、乙基-磷酸三酯、碳酸酯如羧甲基酯、氨基甲酸酯、吗啉代氨基甲酸酯、3’-硫代缩甲醛、硅烷基如二烷基(C1-C6)-或二苯基硅烷基、氨基磺酸酯，等等。这类键合以及将其引入寡核苷酸的方法在许多参考文献中均有论述，例如，Peyman和Ulmann的综述，Chemical Reviews 90：543-584(1990)；Milligan等人，J.Med.Chem.，36：1923-1937(1993)；Matteucci等人，PCT/US91/06855。
按Dagle等人所述的方法，Nucl.Acids Res. 18，4751-4757(1990)，通过在5’和3’末端用phosphoroamidites修饰核苷酸间键合也可使核苷酸耐核酸酶的消化。
优选的是，本发明的化合物采用磷酸二酯键的磷类似物，例如，硫代磷酸、二硫代磷酸、氨基磷酸、或甲基膦酸。其中更优选采用硫代磷酸作为耐核酸酶的键合。
硫化磷酸寡核苷酸在核苷酸间磷酸二酯键中含有一个硫代氧的结构。这种寡核苷酸同时具有有效的杂交形成双螺旋与高度耐核酸酶消化的性质，同时保持着带电荷的磷酸类似物的水溶性。据信这种电荷是通过一个受体而赋于细胞摄入特性(Lode等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，86，3474-3478(1989)。
应该理解的是，除了优选的键合基团外，本发明的化合物还可以包含其它的修饰，例如，硼酸化碱基，Spielvogel等人，5，130，302；胆甾醇组分，Shea等人，Nucleic AcidsResearch 18：3777-3783(1990)或Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci，86：6553-6556(1989)；以及5-丙炔酸基修饰的嘧啶，Froehler等人，TetrahedronLett.33：5307-5310(1992)。
本发明的寡核苷酸可以通过任何已知的技术方法合成。本发明中优选采用合成化学的方法制备寡核苷酸，例如用在乙腈中的二硫化四乙基秋兰姆的硫化作用的phosphoramidite化学就是例子。参见Vu和Hirschbein，Tetrahedron Lett.1991，32，30005-30008。本发明的寡核苷酸还可以用体内外转录系统进行合成，例如，用T7聚合酶或表达载体进行转录。用体内外转录系统合成的寡核苷酸可以通过本领域技术人员熟知的化学方法进行修饰。这类修饰的例子包括在脂质体中包埋，或与甾类、抗体及细胞受体配体的化学键合。
在希望形成三螺旋的实施方案中，对靶序列的选择有些限制。一般说来，在双链靶子中沿同型嘧啶-同型嘌呤轨迹通过Hoogsteen类型结合的第三条链结合体是最稳定的。通常以T-A*T或C-G*C的形式形成碱基三联体(其中“-”代表WatsonCrick配对，“*”代表Hoogsteen形式的结合)；然而，其它的形式也是可能的。例如，Hoogsteen碱基配对允许在第三条链(Hoogsteen链)和与第三条链结合的双螺旋中富含嘌呤的链之间有平行及反平行方向，这取决于一些条件及链的组成。在文献中有许多指导方法用来选择合适的序列、方向、条件、核苷类型(例如，是采用核糖核苷还是脱氧核糖核苷)、碱基修饰(例如，甲基化胞嘧啶及其类似物)以便于在特定的实施方案中如所希望地那样使三螺旋的稳定性达到最大，或者调节三螺旋的稳定性，这些文献有：Roberts等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，88：9397-9401(1991)；Roberts等人，Science，258：1463-1466(1992)；Distefano等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，90：1179-1183(1993)；Mergny等人，Biochemistry，30：9791-9798(1992)；Cheng等人，J.Am.Chem.Soc.，114：4465-4474(1992)；Beal和Dervan，Nucleic Acids Research， 20：2773-2776(1992)；Beal和Dervan，J.Am.Chem.Soc.114：4976-4982；Giovannangeli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，89：8631-8635(1992)；Moser和Dervan，Science，238：645-650(1987)；McShan等人，J.Biol.Chem.，267：5712-5721(1992)；Yoon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，89：3840-3844(1992)；以及Blume等人，Nucleic Acids Research，20：1777-1784(1992)。在许多参考文献中，例如，Rosenberg等人，PCT/US92/05305；或Szostak等人，Meth.Enzymol，68：419-429(1979)，均阐述了寡核苷酸组分的长度应足够大，以保证只在希望的靶多核苷酸而不在其它错误位点上发生特异性结合。所述长度的上限由若干因素决定，包括合成及纯化大寡聚物的不便及费用，较长寡核苷酸较较短寡核苷酸具有更大的错配容许量，是否存在增加结合或特异性的修饰，是否希望双螺旋还是三螺旋结合，等等。
优选的是，寡核苷酸的长度在5-200个核苷酸之间，更优选的是寡核苷酸的长度在10-50个核苷酸之间，最优选的是长度在15-25个核苷酸之间的寡核苷酸。在优选的实施方案中，寡核苷酸可与一个翻译起始位点特异性杂交。在本发明的一个优选实施方案中，寡核苷酸具有5’AACGTTGAGGGGCAT3’(SEQIDNO：1)序列。这一寡核苷酸与c-myc mRNA的一个片段互补，该片段由翻译起始密码子开始，并向其下游延伸。该翻译起始密码子由c-myc mRNA的第559-562核苷酸组成。由第559-1875核苷酸组成的编码区的旁侧有一个5’非编码区以及一个延伸到第2121核苷酸的3’非编码区。总之，在实施本发明中采用的反义寡核苷酸具有与靶多核苷酸的选定区域完全互补的序列。然而，并不需要绝对的互补性，特别是在较大的寡聚体中。因此，本文中所指的与靶多核苷酸“互补的核苷酸序列”无需意味着与靶片段呈100％的互补性。总之，任何具有足够的互补性、与靶子(例如，c-myc mRNA)能形成稳定的双螺旋的寡核苷酸，即“可杂交的”寡核苷酸，是合适的。稳定双螺旋的形成取决于杂交寡核苷酸的序列和长度以及与靶多核苷酸的互补性程度。一般说来，杂交寡聚物越大，就可能要容许越多的错配。本领域技术人员可以容易地根据得到的双螺旋的解链温度，也即热稳定性确定在任何给定的反义寡聚物和靶序列之间能容许的错配程度。
优选的是，由本发明的反义寡核苷酸形成的杂合体的热稳定性通过熔解曲线或解链曲线进行确定。发生50％解链的温度作为解链温度Tm，反过来Tm提供了一种方便的测量稳定性的手段。测量Tm一般是在pH为中性的生理盐水中进行的，其中所含的靶和反义寡核苷酸的浓度约为1.0-2.0μm之间。典型的条件如下：150mM NaCl和10mM MgCl2溶于10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)或10mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)中。通过将反义寡核苷酸/靶多核苷酸的复合体的样品从室温加热到约85-90℃而积累熔解曲线的数据。随着样品的温度增加，以1℃间隔监测260nm光吸收值，例如，采用Cary(Australia)1E型或Hewlett-Packard (Palo Alto，CA)HP8459UV/VIS型分光光度计以及HP89100A型温度控制仪，或类似仪器。这类技术为测量和比较不同长度和组成的反义寡核苷酸的结合强度提供了一种方便的手段。
根据一个实施方案，设计本发明的寡核苷酸是可与c-myc基因的mRNA杂交。这种杂交完成后干扰信使RNA的正常作用，从而调节其在细胞中的功能。被干扰的mRNA的功能包括所有重要的功能，如RNA向蛋白质翻译位点的转运，从RNA开始的蛋白质的翻译，RNA的剪接以产生一或多个mRNA，以及甚至有可能有RNA介入的独立的催化活性。这类对RNA功能的干扰的最终效果是调节c-myc基因的表达。通过调节c-myc基因的表达而调节或抑制平滑肌细胞的增殖。
在本发明的优选实施方案中，与再狭窄有关的平滑肌细胞的增殖可以作为靶子。因此，优选的平滑肌细胞是血管平滑肌细胞，如动脉、静脉和毛细血管的平滑肌细胞。
为了治疗或预防，应根据本发明使用寡核苷酸。这些寡核苷酸可以配成药物组合物，其中除合有寡核苷酸外，还可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂，等等。在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸可以与其它的对限制或消除再狭窄有效的药物结合使用，例如抗血小板、抗凝聚、抗炎以及血管舒张药物。溶液中还可含有蛋白酶如中性蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶、木瓜蛋白酶。胃蛋白酶或糜蛋白酶。除蛋白酶外，也可使用脂酶。作为温和的除垢剂，溶液中可含有NP-40，Triton X100，脱氧胆酸、SDS或诸如此类等。
本发明的反义化合物包括其在药物学上可接受的盐类，包括碱土金属盐，例如，钠或镁、铵或NX4+，其中X为C1-C4烷基。其它药物学上可接受的盐类包括有机羧酸盐如乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、异乙硫氨酸、乳糖酸及琥珀酸盐；有机磺酸盐如甲磺酸、乙磺酸及苯磺酸盐；以及无机酸盐如盐酸、硫酸、磷酸和氨基磺酸盐。具有羟基基团的化合物的药物学上可接受的盐包括这类化合物的阴离子与适当的阳离子如Na+、NH4+等的结合。
药物组合物的使用可以有若干方式，取决于是希望局部还是全身治疗，以及取决于治疗的部位。可以通过本领域人员熟知的方法进行给药，例如通过静脉给药或用一导管直接在受伤部位治疗。血管内装置及其使用是本领域人员熟知的。
通过导管向相关的创伤脉管局部给药是一种输药方式。c-myc反义寡核苷酸是通过导管由腔内，例如Wolinsky和Thung JACC15：475-481(1990)描述的多孔囊，或用有助于反义化合物缓慢释放的材料，例如Simons等人在Nature 359：67-70(1992)中描述的普卢兰尼克(Pluronic)胶体系穿过外膜(即脉管壁的最外层)，输送到损伤部位附近。其它的局部输药的缓慢释放技术包括用例如Wilensky等人在Trends in Gardiovascular Med.3：163-170(1993)中描述的粘合剂或凝胶将反义化合物涂覆在扩张机上。输送到靶损伤部位的药物剂量为1μg-100mg，更优选为1μg-5mg。优选的输送时间为约30秒-60分钟，更优选为约30秒-约1到2分钟，如Zalewski等人的Coronary Angioplasty的79-87页，Goldberg编辑(Davis，Philadelphia，1988)。
全身静脉给药也进行了研究。希望不受任何理论的限制，据信身体的某些器官可能为寡核苷酸提供了贮藏所，该寡核苷酸在比预期更长的一段时间后返回到循环。据信这种贮藏器官，特别是肾脏和肝脏，可能是在给药后长至72小时在脉管中积累的寡核苷酸的来源。
药物剂量取决于疾病的严重性及对治疗情况的反应，但通常每天1剂或多剂，疗程可以从几天持续到几个月，或者直至病愈，或达到减轻疾病的状态。普通技术术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方式及重复次数。
以下实施例是用来阐明本发明，而非限制本发明。实施例1 细胞培养
人SMC是从进行常规分流外科手术的病人的隐静脉中得到的。采用外植方法分离细胞，外植块放在含有Dulbecco′s modified Eagle′s培养基(DMEM)的组织培养皿中，该培养基中还含有20％热灭活的胎牛血清(FBS)，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素及2mM/ml谷氨酸(20％FBS-DMEM)。培养物在37℃含5％CO2的调湿的培养箱中保温。这些细胞显示出典型的血管SMC的形态学特征，即纺锤形并呈峰谷型(hill-and-valleypattern)。通过原位平滑肌α-肌动蛋白染色进一步鉴定血管SMC。实施例2 寡核苷酸的合成
在Applied Biosystems 394型高流通量DNA合成仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)中合成15头反义，有义及错配寡核苷酸。用于体内研究的较大数量的寡核苷酸是在Applied Biosystems改进型3902大规模DNA合成仪中合成的。将寡核苷酸冻干，重新溶于PBS并用分光光度计定量。在本研究中采用了来自人c-myc基因的翻译起始区的修饰的(硫代磷酸)寡核苷酸。序列如下：有义寡核苷酸(5’ATGCCCCTCAACGTT3’；SEQ ID NO：2)，反义寡核苷酸(5’AACGTTGAGGGGCAT3’；SEQID NO：1)，以及错配寡核苷酸(5’TACGGGGTTGAGCAA3’；SEQ ID NO：3)。实施例3 生长分析
将悬浮于20％FBS-DMEM中的人SMC的早期传代细胞(2和4代)以每孔10000个细胞的密度在24孔板中培养。在铺板后24小时，用生长抑制培养基(0.5％FBS-DMEM)代替最初的培养基继续培养48小时。随后加入20％FBS-DMEM使细胞生长同步化。除非在文中另有说明外，在激发期前24小时、激发期以及激发期后每48小时加入寡核苷酸。在上述的时间时，用胰蛋白酶处理SMC并在Coulter计数器中计数。按下面公式计算抑制率：
抑制百分数(％)＝1－(反义处理的细胞的净生长/有义处理的细胞净生长)×100
人SMC的净生长是从实验中指定的时间点时的细胞数减去起始细胞数(细胞从Go期释放时)而获得的。每个实验均进行三次。数据是以平均值±SD表示的。实施例4 细胞对寡核苷酸的吸收
SMC在含有20％FBS-DMEM的100mm板上生长。在生长抑制进行48小时后(0.5FBS-DMEM)，用20％FBS-DMEM使SMC同步化。为了测定细胞对寡核苷酸的吸收，将SMC与2μM的32P-末端标记的寡核苷酸(5×106cpm/μg)温育1、3、6、16、24和36小时。温育后，用PBS和0.2M甘油(pH 2.8)洗涤细胞以除去与细胞膜结合的寡核苷酸。用闪烁计数器测量剩余的细胞结合的放射活性，其代表了寡核苷酸的胞内吸收。人SMC对寡核苷酸的吸收以pmol/105细胞表示。实施例5 反转录与聚合酶链反应(RT-PCR)
为确定在人SMC中的c-myc mRNA的水平，采用了一种改进的RT-PCR技术。用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取方法进行单步程序分离总RNA。为区分基因组DNA的扩增和c DNA，引物对设计成在c-myc基因组序列中至少包含一个内含子。按如上所述合成引物，引物序列如下：引物A，5’TGGTGCTCCATGAGGAGACA3’(SEQID NO：4)；引物B，5’GTGTTTCAACTGTTCTCGTC3’(SEQ ID NO：5)。根据5’DNA末端标记方法(GI BCO BRL Life Technologies，Inc.Gaithersburg，MD)将引物的5’末端用50μCi的(γ-32P)-ATP标记。用200单位SuperScript反转录酶将2μg的总RNA反转录成cDNA。用GeneAmpRNA PCR方法(Perkin-Elmer Corp，Hayward，CA)进行cDNA的PCR扩增。简单地说，将等份的cDNA加到含有20μM引物和5单位Taq聚合酶的反应混合物中。用DNA热循环仪(Perkin-Elmer Cetus)循环30次进行扩增。一次循环过程为在94℃变性1分钟、在60℃退火2分钟、在72℃引物延伸2分钟。RT-PCR产物在6％聚丙烯酰胺凝胶中电泳并用柯达胶卷曝光。实施例6 人SMC中c-myc原癌基因的表达
为评估c-myc原癌基因在人SMC中的表达水平，测定静止细胞(抑制48小时)和增殖细胞(血清激活后2、4和24小时)中的c-myc mRNA。用特异的c-myc引物按实施例5中所述的方法进行RT-PCR。图1为静止和增殖细胞的扩增mRNA的放射自显影图。如图1所示，静止的人SMC表达低水平c-myc mRNA，相反地，在增殖的SMC中，在细胞生长激活后的2小时和4小时，c-mycmRNA水平增加。在24小时，c-myc mRNA水平下降，尽管保持在高于静止细胞的水平。实施例7 SMC增殖的抑制
如实施例3所述，将人SMC与c-myc反义硫代磷酸寡核苷酸一起温育。同时每次实验进行三份并在不同条件下重复三次而得到相似的结果。结果是以平均值±SD来表示。如图2所示，人SMC与c-myc反义硫代磷酸寡核苷酸温育产生明显的生长抑制效果，而有义或错配寡核苷酸对细胞生长则无效果。连续与寡核苷酸温育，显著的抑制作用至少可以保持4天(p＜0.001)。与硫代磷酸寡核苷酸的生长抑制效果相反，未修饰的反义寡核苷酸在剂量达到40μM时对SMC的生长仍无效果。
根据实施例3所述方法进行的生长试验也表明，正如所预期的那样，c-myc反义硫代磷酸寡核苷酸的抗增殖效果在1-10μM范围内是剂量依赖的，如图3所示。另外，在未经预处理的情况下，人SMC与c-myc反义寡核苷酸(10μM)温育8和24小时分别产生58±13％和70±14％的可比的生长抑制。
在猪SMC中进行了类似的研究以确定c-myc反义寡核苷酸的生长抑制效果。与对照或有义处理的猪SMC相比，c-myc反义处理(12μM)后观察到超过90％的生长抑制。在所有的生长实验中，处理过的SMC仍为正常形态并且在试验剂量范围内没有细胞死亡。
为评估c-myc反义处理对细胞生长的潜在的长期效果，在温育8小时后去掉寡核苷酸，在7天后对人SMC进行传代培养，在此之后的1、2、4和6天进行细胞计数。反义处理的SMC和对照组SMC的生长速率相同，这证明反义寡核苷酸处理后SMC的生存力是正常的。
我们预计通过向SMC培养物中加入过量的有义寡核苷酸将会消除c-myc反义寡核苷酸的抗增殖效果。如图4所示，增大有义寡核苷酸与反义寡核苷酸的比率完全消除了生长抑制，这可能是由于在两种寡核苷酸之间形成异源双链，表明了反义寡核苷酸的序列特异的生长抑制作用。实施例8 c-myc表达的抑制
为了确定反义寡核苷酸的抗增殖作用是否为c-myc表达下降所致，如实施例5所述方法测定在反义和有义处理的细胞中的c-myc mRNA。图5显示c-myc反义硫代磷酸寡核苷酸(10μM)降低了增殖的人SMC中靶mRNA的量，而与未用寡核苷酸处理的细胞相比，有义处理的细胞中c-myc mRNA的水平未发生变化。实施例9 寡核苷酸的细胞吸收与胞内动力学
图6展示了在人SMC中寡核苷酸的细胞吸收的动力学。在细胞激活开始时，将细胞与2μM32P-未端标记的硫代磷酸寡核苷酸一起温育。在指出的时间点上，用PBS和0.2M甘油(pH2.8)冲洗细胞。在早至温育后1小时即可检测到SMC结合的放射活性并迅速持续增加直至16小时。在静止和增殖细胞之间，32P-未端标记的寡核苷酸的细胞吸收无差异。用FITC标记的寡核苷酸在荧光活化细胞分选仪中进行实验得到的结果相似。
由于细胞结合的放射活性不仅可以代表完整寡核苷酸，也可能代表细胞大分子中的含有32P标记的或32P掺入的降解的寡核苷酸，因此测定了人SMC中完整寡核苷酸的积累。完整寡核苷酸的胞内浓度持续增加超过24小时，并且在SMC中未降解的寡核苷酸以相似的含量至少再保持12小时(即暴露后36小时)。因此，尽管胞内半衰期很短，但硫代磷酸寡核苷酸在血清中的稳定性和迅速的细胞吸收使得其在人SMC中保持持续的水平。实施例10 寡聚物在冠状动脉中的药物动力学
为了测定寡取物在壁内输送效率及寡聚物在体内的药物动力学，将c-myc反义寡核苷酸用35S标记。在如实施例11所述的方法进行局部囊损伤后，通过一个多孔囊导管在4个大气压下在损伤部位将等量的标记的寡核苷酸注入猪的冠状动脉(1mg/血管)。输送时间为26±4秒。在寡核苷酸输入后30分钟、1、3、7天剖杀动物。将处理过的冠状动脉剪下并进行均浆化(重量：75-100mg/血管)。用闪烁计数器中计数样品的放射活性。根据已知量的35S标记的寡核苷酸制备的标准计算寡核苷酸的量。结果在图7(血浆寡聚物)和图8(冠状动脉寡聚物)中显示。作为输送后时间的函数的寡核苷酸在器官中的分布列于表1中：
表1器官中寡核苷酸的浓度
μg/g组织器官30分钟 1天 3天 7天骨髓0.37 0.38 0.46 0.45小肠0.53 0.51 0.48 0.11心肌0.45 0.38 1.14 0.34骨骼肌0.34 0.25 0.29 0.35肺0.49 0.42 0.43 0.35肝2.18 2.39 1.71 0.73肾10.12 4.8 0.70 0.57细动脉(未损伤)0.0 0.0 0.0 0.0
图7表明血浆中寡核苷酸的水平。寡核苷酸在血浆中迅速清除，半衰期为约20分钟。虽然在局部输入后24小时血浆中寡核苷酸的浓度下降到背最水平，但是在72小时观察到血浆中的寡核苷酸浓度上升并继续持续96小时。推测寡核苷酸迅速从血浆中排除并在肝、肾和心肌中集聚。这些器官为寡核苷酸提供了贮存场所，并在较长一段时间后返回循环。
图8示出了在局部囊损伤的冠状动脉部位寡核苷酸的药物动力学。如图1所示，在所有的时间点上对照组血管(无寡聚物)均无放射活性。约0.2％的寡聚物沉积在局部囊损伤的冠状动脉部位。引人注意的是，在注射后30分钟，用导管输送寡聚物使得在输送位点的寡核苷酸浓度比各种器官和细动脉中的寡核苷酸浓度要高(增加2-64倍)。在注射后72小时，在动脉壁中的寡核苷酸浓度增加。引人注意的是，远离囊损伤部位的未损伤冠状动脉在任何时间点上均无标记的寡聚物的集聚。可能的解释是，血管壁损伤诱导炎症反应和细胞增殖，从而可能增加寡核苷酸的细胞吸收。由“储存”器官返回到循环中的寡核苷酸可能是再分配到动脉壁损伤部位的寡核苷酸的来源。
令人惊奇的是，由血浆清除至储存器官储存过量的寡核苷酸(即未直接注入动脉壁的寡核苷酸)的结果是，通过从储存器官向循环的血浆中连续地释放寡核苷酸可以保持治疗上足够的动脉中寡核苷酸浓度，并通过在损伤部位从血浆中增加吸收而补充。
在猪模型中的药物动力学数据显示用局部导管输送可以达到维持达到在血管壁中的寡核苷酸水平。该数据还显示用c-myc反义寡核苷酸全身治疗再狭窄的潜在能力，因为令人惊奇的是在循环血浆中非常低的浓度在损伤部位就可以提供治疗上有效的浓度。
潜在的疗效可以通过下述的动物体内研究而惊人地得到证实。上述(实施例7)的体外实验在寡核苷酸的浓度为10μM时，连续与人SMC接触4天，仅能部分抑制SMC生长。尽管这样，以20μg/g血管(约6μM)的浓度在体内短时局部施用寡核苷酸，继之从储存器官吸收，结果是在标准的猪再狭窄模型中新生内膜形成大幅度下降。实施例11 动物研究-用c-myc反义寡核苷酸
抑制再狭窄
通过如下方法测定c-myc反义化合物抑制再狭窄的效率，即在标准的猪再狭窄模型中，用常规的方法，例如参见Karas等人，J.Am.Coll.Card.20：467-474(1992)；和Schwartz等人，Circulation 82：2190-2200(1990)，向冠状成形术部位给予c-myc特异的反义硫代磷酸寡核苷酸(SEQID NO：1)和安慰剂硫化磷酸寡核苷酸(SEQID NO：2)。在实验前叉交猪(Sus scrofa)预先口服阿斯匹林(650mg)。一般的麻醉为肌肉注射氯胺酮(12mg/kg)和赛拉嗪(8mg/kg)。在整个实验过程中静脉给予附加剂量的麻醉剂。在右外颈动脉经手术暴露后，给猪静脉输入肝素(10000U)。在荧光显微镜下，用一个8French SAL1导管(Medtronic Interventional Vascular，Inc.，Danvers，MA)将冠状动脉口套住。在输入c-myc反义寡核苷酸和安慰剂之前，用特大号血管成形术气囊在10大气压下充气，连续进行三次每次保持30秒损伤动脉壁的内膜和中膜层。在血管成形术气囊移走后，立即用另外一个多孔气囊向冠状动脉进行壁内注射(2ml)。在4大气压下注射c-myc反义寡聚物(13次重复)或安慰剂寡聚物(12次重复)，并且平均27秒内完成输入。寡聚物的剂量为每根损伤的冠状动脉1mg。寡聚物的输入没有伴随副作用。输入后1个月将动物剖杀，用形态度量法确定在损伤部位的最大新生内膜面积(NAmax)、新生内膜厚度(NTmax)和残留腔(RL)。这些结果(平均值±SEM)示于下表2和图9-11中。
表2寡聚物重复次数NA max(mm2)NT max(mm) RL(％)安慰剂 12 0.80±0.17 0.48±0.09 64±6反义 13 0.24±0.06 0.20±0.04 81±5P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05
图9A(轻度损伤)和图9B(重度损伤)为损伤后一个月的示范对照冠状动脉样品(即注射有义寡聚物的冠状动脉)的截面照片。组织学损伤程度分成以下几级：I级：内弹性层剌伤，新生内膜只出现在内弹性层的腔面；II级：内弹性层裂孔，新生内膜可见于内弹性层两侧；III级：内弹性层破裂，新生内膜替代了2/3的血管中层；IV：内弹性层破裂，新生内膜延伸至外膜。I级和II级损伤代表轻度损伤，而III级和IV级损伤为重度损伤。在图9A和9B中可以看到明显的新生内膜厚度(箭头所指)。
图10A(轻度损伤)和图10B(重度损伤)为示范的反义处理的冠状动脉样品的截面照片。可见到新生内膜显著减少。当将最大新生内膜面积作为损伤程度的函数进行分析时(图11)，代表新生内膜和损伤级数(即损伤严重程度)之间关系的回归线显示出在斜度上有显著的差异(p＜0.01)。如图11所示，反义寡聚物显著地降低了新生内膜的形成，特别是更严重的损伤时更是如此。
总之，这些结果表明通过导管局部输Ac-myc反义寡聚物显著地降低了动脉壁的气囊诱导损伤后的冠状脉管中新生内膜的形成。实施例12 生长试验-其它的c-myc反义寡核
苷酸
对于除翻译起始区之外的c-myc mRNA区域为靶的反义寡核苷酸的生长抑制作用作了如下研究。以5000/cm2将人SMC铺板并于0.5％FBS中抑制48小时。然后用20％FBS激活细胞，在激活时加入下列之一的与c-myc mRNA的各种靶序列互补的硫代磷酸寡聚物(8μM或16μM)，
5′AAAGTGCCCG CCCGCTGCTG 3′(SEQ ID NO：6)
以5’非编码区的第358-377核苷酸为靶；
5′GGGAGAGTCG CGTCCTTGCT 3′(SEQ ID NO：7)
以5’非编码区的第400-419核苷酸为靶；
5′CCAGTGCAAA GTGCCCGCCC 3′(SEQ ID NO：8)
以5’非编码区的第365-384核苷酸为靶；
5GGCCTTTTCA TTGTTTTCCA 3′(SEQ ID NO：9)
以5’编码区的第1709-1728核苷酸为靶；
5′TCATGGAGCA CCAGGGGCTC 3′(SEQ ID NO：10)
以5’编码区的第1264-1283核苷酸为靶；
5′CGGATCTCCC TTCCCAGGAC 3′(SEQ ID NO：11)
以5’非编码区的第242-262核苷酸为靶；
5′CGTTCTTTTT TCCCGCCAAG 3′(SEQ IS NO：12)
以5’非编码区的第80-89核苷酸为靶。
以翻译起始区为靶的序列5′AACGTTGAGG GGCAT3’(SEQ ID NO：1)作为阳性对照。下列寡聚物作为阴性对照：翻译起始区有义寡聚物(SEQ ID NO：2)；错配寡聚物5′AACGTGGATT GGCAG (SEQID NO：13)，其与SEQ ID NO：1的区别在于有4次错配；无规配对(scrambled)的有义寡聚物5’GAACGGAGAC GGTTT3’(SEQ ID NO：14)。将细胞与寡聚物或不与寡聚物温育3天，用Coulter计数器进行细胞计数。按前述方法计算生长和抑制。
结果见图12。获得了不同程度的生长抑制。c-myc反义寡核苷酸SEQ ID NO：7和10与以翻译起始区为靶的寡聚物SEQ ID NO：1相比对人SMC表现了程度类似的生长抑制。有义、错配(mis)和无规配对(scr)的有义寡聚物不表现出生长抑制。图12中的结果是以三次观察的平均值来表达的。实验重复两次，获得了相似的结果。
所有有关合成、制备和分析过程所引述的参考文献均被列入在本文的参考文献中。
本发明可以以其它特定形式实施，但不得违背本发明的精神或主旨，因此，应以本发明所附的权利要求书，而不是上述的说明书作为本发明范围的指示。
序列表(1)一般信息：
(i)申请人：托马斯·杰弗逊大学
(ii)发明名称：反义抑制c-myc以调节
平滑肌细胞的增殖
(iii)序列数：14
(iv)通讯地址：
(A)地址：Seidel，Gonda，
Lavorgna & Monaco，P.C.
(B)街道：Two Penn Center，Suite
1800
(C)城市：费城
(D)州：宾夕法尼亚州
(E)国家：美国
(F)邮政编码：19102
(V)计算机可读形式：
(A)媒介类型：3.5寸软盘，720Kb
(B)计算机：IBMPS/2
(C)操作系统：MS/DOS
(D)软件：Wordperfect 5.1
(Vi)本申请资料：
(A)申请号：未知
(B)申请日：
(C)分类：
(Vii)在先申请资料：
(A)申请号：004，799
(B)申请日：1993年1月7日
(Viii)代理人信息：
(A)姓名：Daniel A.Monaco
(B)注册号：30，480
(C)文档号：8321-9
(iX )通讯信息：
(A)电话：(215)568-8383
(B)传真：(215)568-5549(2)SEQ ID NO：1信息
(i)序列特征：
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ATGCCCCTCA ACGTT 15(2)SEQ ID NO：3信息
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(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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TACGGGGTTG AGCAA 15(2)SEQ ID NO：4信息
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(B)类型：核酸
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