稳定的伽马干扰素液态组合物 【发明领域】
本发明涉及含有γ干扰素(IFN-γ，又称免疫干扰素)的稳定的液态药物组合物。具体地，本发明涉及可重复给药用的、含有多剂量的治疗有效量的IFN-γ的稳定的水性药物组合物。
背景技术
IFN-γ是干扰素家族中的一员，它表现出干扰素α和β(IFN-α和IFN-β)所具有的抗病毒和抗增殖特性，但是与这两种干扰素不同的是它是pH2不稳定的。IFN-γ最初是通过对淋巴细胞进行促有丝分裂的诱导而产生的。人IFN-γ的重组生产最早由Gray，Goed-del和共同工作者报导(Gray et al.，Nature 295，503—508(1982))，并且成为美国专利No.4,762,791、4,929,544、4,727,138和4,925,793的主题。Gray和Goddel用大肠杆菌产生地重组人IFN-γ由146个氨基酸组成，分子的N-末端位置由序列Cys TyrCys开始。后来发现，天然的人IFN-γ(即通过对人外周血淋巴细胞进行有丝分裂诱导而产生并随后纯化而得的IFN-γ)是缺乏Gray等人(出处同上)所指出的Cys Tyr Cys N-末端的多肽。最近，得自大肠杆菌的重组人IFN-γ(rhIFN-γ)的晶体结构已被确定[Ealick etal.，Science 252，698—702(1991)]，结果表明该蛋白质以紧密缠绕的非共价同二聚体形式存在，其中两个相同的多肽链以反平行的方式排列。
已知IFN-γ具有多种生物活性，其中包括抗肿瘤、抗微生物和免疫调节活性。重组人IFN-γ(rhifn-γ，Actimmune，Genentech，Inc.South San Francisco，California)在市场上已有供应，是作为治疗慢性肉芽肿疾病(该病的特征是由于吞噬细胞失去功能而导致皮肤、淋巴结、肝、肺和骨的严重的、反复的感染(Baehner，R.L.，Pe-diatric Pathol.10，143—153(1990))。)的免疫调节药物。IFN-γ还被用于治疗特应性皮炎、此病是常见的皮肤炎症(特征是严重的瘙痒、慢性复发过程并且经常恶化、与众不同的皮肤损伤的临床形态学和分布情况)(见PCT出版物No.WO91/07984，1991年6月13日出版)、治疗血管狭窄包括血管成形术和/或血管手术后的再狭窄(见PCT出版物No.WO90/03189，1990年4月5日出版)、多种肺部病症包括呼吸窘迫综合症(RDS)如成人呼吸窘迫综合症(ARDS)和新生儿呼吸窘迫综合症，也被称为特发性RDS或透明膜病(hyaline membrane disease)(PCT出版物No.WO89/01341，1989年2月23日出版)。此外，IFN-γ还被成功地用于多种过敏反应如哮喘，和与HIV感染有关的病症如偶发性感染如卡氏肺囊虫肺炎，以及与创伤有关的脓毒症。
在美国专利No.5,151,265(1992年9月29日授权)公开了包括一剂有效量的没有冻干的IFN-γ以及能够将pH维持在4.0—6.0的缓冲液，稳定剂如甘露醇，和非离子型去污剂的稳定的液态药用组合物。
已知的市售的IFN-γ液态制剂(Actimmune，rhuIFN-γ-1bGenentech，Inc.)是装于单剂量小瓶以供皮下注射的无菌的、澄清的、无色的、未加防腐剂的溶液。每瓶0.5毫升Acfimmune含有100微克(3百万单位，比活性：30百万单位/毫克)的IFN-γ-1b，与20mg甘露醇，0.36mg琥珀酸钠，0.05mg聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯20和无菌注射用水共同配制。因为该制剂不含防腐剂，所以它们是供单剂量的一次性使用，而未用完的部分必须丢弃。
对某些需长期使用并要多次反复给药的适应症，如治疗慢性特应性皮炎或肾细胞肿瘤，有必要开发含有多剂量IFN-γ的稳定的液态药物组合物，其中IFN-γ在建议的储藏条件下可在规定的长时间内保留生物活性和物理稳定性。这种组合物最好含有高达约30倍治疗有效量的IFN-γ，以供打算的治疗使用，并且在第一次施用后至少保持稳定达14天左右。然而，这种多剂量的制剂决非容易制备。
与传统的(有机或无机的)药物不同，蛋白质的分子很大。至少其氨基酸的核心序列应保持完整以保证构象的完整性，这一点对于生物活性是至关重要的。此外，因为蛋白质具有多种官能团，例如由其构组成氨基酸组成的各种侧链，因此在一段相同的时间内存在发生多种降解反应的可能性。如果存在多种降解途径，可能需要不同的活化能，那么降解(生成物)谱会随温度的变化而发生很大的变化。
这种复杂性导致的结果是，蛋白质通常是不稳定的，并且当它们降解时，也很难确定其降解机制和降解谱的特性，包括鉴别限速反应。通常缺乏简易的手段，用于确定降解产物的化学种类和数量。在物理法，生化法和生物检定法测定中，赋形剂一般对蛋白质的稳定性有重大影响，因此仔细选择赋形剂是制剂设计中重要的和困难的方面。
上述问题对IFN-γ尤其存在，它是分子量约15000道尔顿的蛋白质，由143(146)个氨基酸链组成，已知是非常热不稳定的并且易于聚集和蛋白水解(Wetzel，R.L.et al.，“Unfolding and Inactiva-tion”in：Protein Design and the Development of New Therapeu-tics and Vaccines，Hook，J.B.and Poste，G.eds.，Plenum Pub-lishing Corp.，1990，P.79；Mulkerrin，M.G.and Wetzel，R.，Biochemistry 28，6556(1989))。
发明概述
本发明涉及一种稳定的水性药物组合物，它含有药物有效量的没有被冻干的IFN-γ、将pH维持在约4.0—6.0的乙酸盐缓冲液、非离子型去污剂、等渗剂和防腐剂，其中防腐剂选自苯酚、苄基醇和苄甲乙氧铵的卤化物如氯化苄甲乙氧铵。IFN-γ优选地是以多剂量形式存在，而且在不冷冻条件下，最好为2—8℃下可以保持其生物活性和物理稳定性至少约2周。
另一方面，本发明涉及一种含有上述药物组合物的容器，其中含量至少为一个治疗有效量的IFN-γ。容器可以是瓶子或小瓶(vial)，或者是含有并且能够处置药物组合物的装置如注射器或气溶胶容器或喷雾器等。
再另一方面，本发明涉及一种在水性制剂中稳定IFN-γ的方法，它包括将未经冻干的IFN-γ与水、将pH维持在约4.0—6.0的乙酸盐缓冲液、非离子型去污剂、等渗剂和选自苯酚、苄基醇和苄甲乙氧铵的卤化物的防腐剂进行混合。
更另一方面，本发明涉及一种IFN-γ的肺内给药方法，它包括吸入气溶胶颗粒向需要用药的病人给药，其中气溶胶颗粒含有药物有效量的没有被冻干的IFN-γ、将pH维持在约4.0—6.0的乙酸盐缓冲液、非离子型去污剂、等渗剂和选自苯酚、苄基醇和苄甲乙氧铵的卤化物的防腐剂，并且颗粒的大小是足够小从而能够进入肺的肺泡，并从肺泡进入病人的血流。
本发明的这些及其他方面、对于本领域的技术人员是显而易见的。
【附图说明】
图1显示了各种防腐剂对处于未加防腐剂的液态药物组合物中的rhuIFN-γ(Actimmune，Genentech，Inc.South San Francisco，California)的生物活性的影响，在25℃进行。
图2A和2B显示了不同浓度的苯酚防腐剂对处于液态药物组合物中的rhuIFN-γ的生物活性的影响，在25℃进行。
图3显示了0.9％苄醇(防腐剂)对处于分别含1mM和5mM琥珀酸盐的液态制剂中的rhuIFN-γ的生物活性的影响，在25℃进行。
图4显示了0.4％苯酚防腐剂对处于分别含5mM和1mM琥珀酸盐的液态药物组合物中的rhuIFN-γ的生物活性的影响，在25℃进行。
图5显示了苯酚对处于1mM琥珀酸盐vs.10mM乙酸盐制剂中的rhuIFN-γ的生物活性的影响，在25℃进行。
发明详述
为了提供多剂量的IFN-γ制剂，其中在第一次施用后，余下的药物有效量的IFN-γ被保留下来并且仍然适合在规定的长时间内用于治疗，本发明的发明者发现，许多已知的可作为药用的防腐剂，对常规的用于IFN-γ液态药物制剂的其他成分是不相容的，而且这种不相容性导致稳定性的急剧下降。尤其他们发现，添加各种治疗上可接受的防腐剂使得商品化的IFN-γ液态药物组合物(Actim-mune，Genentech，Inc.)不稳定，从而导致形成凝聚物并且导致失去生物活性。本发明是成功的科研成果，研制出一种稳定的、含有防腐剂的水性的IFN-γ的药物组合物。如本文所用，“γ干扰素”、“干扰素γ”或“IFN-γ”可以互换使用，都指在公认的IFN-γ分析中已知有生物活性的所有形式的(人的和不是人的动物)IFN-γ。生物活性分析包括抑制病毒在适当的细胞系中复制(人IFN-γ在人的肺肿瘤细胞系A549中抑制脑心肌炎病毒的复制)、诱导II类抗原、热不稳定性、其他的抗病毒、抗肿瘤、或免疫调节分析，或者被具有针对IFN-γ但不针对IFN-α和IFN-β的免疫活性的抗体所结合。这些术语意指不论是从天然来源而得、或化学合成或者通过重组DNA技术而产生的成熟的、原型的、变异的、或脱去(1—3个氨基酸)(也指脱去Cys Tyr Cys的IFN-γ)形式的IFN-γ。制备重组人IFN-γ(rhuIFN-γ)(包括其cDNA和氨基酸序列)的完整的描述，见上述的美国专利如U.S.专利No.4,762,791。缺乏Cys Tyr Cys的重组人IFN-γ，包括各种截断的衍生物，在如欧洲专利No.146,354中有描述。非人的动物干扰素包括IFN-γ在例如欧洲专利No.88,622中有描述。该术语还包括本技术领域已知和将来出现的天然(野生型)干扰素的多种糖基化形式和其他突变体和衍生物。这种突变体的例子是等位基因，而且包括定点突变产物其中残基被缺失、插入和/或取代(见例如上述的欧洲专利No，146,354)。已知IFN-γ的宿主范围较狭窄，因此可以使用与待治疗的动物的IFN-γ相似的IFN-γ。在人的治疗中，最好使用在美国专利No.4,717,138中公开的脱去CysTyrCys的突变体序列及其类似物，EP77670，而且可以使用在翻译后加工过程中失去最后4个氨基酸的C末端突变体。
从药理学意义上讲，在本发明的上下文中，“治疗有效量”指用IFN-γ能够有效治疗的病症，能有效地防止或治疗该病症的IFN-γ剂量。这些病症的例子有：各种肿瘤、微生物感染、慢性肉芽肿病、特应性皮炎、血管狭窄包括治疗血管成形术和/或血管手术后的再狭窄、呼吸窘迫综合症(RDS)如成人呼吸窘迫综合症(ARDS)和新生儿呼吸窘迫综合症，也被称为特发性RDS或透明膜病(hyalinemembrane disease)、过敏反应如哮喘，和与HIV感染有关的病症如偶发性感染如卡氏肺囊虫肺炎，肺结核等。
术语“药物组合物”意指这样的制剂，它能使活性成分的生物活性明确有效地表达，而且不含有其他对该组合物的施用对象有毒的成分。
“药物学上可接受的”赋形剂(载体、添加剂)是那些能合理地施用于某哺乳动物，从而提供有效量的被使用的活性成分。
用标准的IFN-γ生物活性分析法如A549抗病毒生物检定法进行测定，如果在给定时间后的生物活性为制备该药物组合物时的生物活性的约20％以内，那么则认为在药物组合物中IFN-γ“保留了其生物活性”。
如果用肉眼观察或者用分子排阻HPLC法测定，在药物组合物中没有凝集现象，那么认为在液态药物组合物中IFN-γ“保持了其物理稳定性”。
4.0—6.0的pH范围已经被认为是在水溶液中保持IFN-γ的稳定性的最佳的pH范围。已证明，在约5℃或更高温度下储藏时，液态的、未加防腐剂的且含有未冻干的rhuIFN-γ的制剂具有比含有冻干的rhuIFN-γ的制剂好得多的稳定性，尤其在液态制剂中形成凝集的现象大为减少(见，例如美国专利No.5,152,265，1992年9月29日授权)。
现在发现，在由琥珀酸盐缓冲液维持pH的IFN-γ的液态制剂中添加防腐剂(抗微生物剂)会导致形成不希望有的凝集物，并且在这种溶液中蛋白质会迅速地失去活性。在弄清含有防腐剂的溶液为什么稳定性更低的原因过程中，本发明的发明者发现，凝聚物的形成并不是由于IFN-γ和所用的防腐剂的不相容性造成的，而是由于琥珀酸盐缓冲液和测试防腐剂同时存在而造成的。尽管在形成凝聚物背后的真正的反应性质还不清楚，而且也没有分离到降解产物，但是出人意料地发现，用能够将pH维持在合适的pH范围的乙酸盐缓冲液替换琥珀酸盐缓冲液，可以防止降解并且可以获得稳定的水性药物组合物。
在第一个试验中，研究了各种防腐剂对Actimmune(rhIFN-γ—1b，Genentech，Inc.)中的rhuIFN-γ的生物活性的影响。将IFN-γ透析入选用的缓冲液中。将IFN-γ浓度调节到0.2mg/ml。加入防腐剂并搅拌直至溶解。将每份1毫升转移至3毫升的I型玻璃瓶中，储存在5℃和25℃。定时地挑选一些小瓶(一小瓶/时间点/储存温度)并分析。分析包括SDS-PAGE，ELISA，A549抗病毒生物检定(见，例如，Fish，E.N.et al.，Drug Design and Delivery 2，191—206(1988))，而且每间隔更长时间进行反向HPLC、离子交换及分子排阻色谱分析。仅讨论生物活性和SDS-PAGE数据，因为这些数据对于反映变化最灵敏。列出的实际试验数据是在25℃(以便加快稳定性研究)获得的，因为在5℃需要更长的时间才能观察到变化。
如图1所示，与未加入防腐剂的对照组以及含有两种不同浓度的氯化苄甲乙氧铵的制剂相比，加入1％苄醇或0.4％苯酚作为防腐剂会使IFN-γ的生物活性在25℃急剧下降。
图2A显示了在25℃，不同浓度的苯酚对液态制剂中rhuIFN-γ(Actimmune，Genentech，Inc.)的生物活性的影响。尽管在分别用0.1％和0.2％苯酚作为防腐剂的溶液中，IFN-γ生物活性是令人满意的，但是用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明在这些溶液中凝聚物的形成会增加(图2B)。
图3显示了在25℃，0.9％苄醇对分别用1mM和5mM琥珀酸盐作为缓冲液的制剂中的rhuIFN-γ的生物活性的影响。在含有较低浓度的琥珀酸盐的制剂中生物活性的损失较小，这一事实似乎表明琥珀酸盐缓冲液的存在至少部分造成含防腐剂的rhuIFN-γ溶液所遇到的稳定性问题。图4中所示的结果支持这个结论。在用1mM琥珀酸盐维持pH5.0的水溶液中，IFN-γ生物活性的损失比用含有5mM琥珀酸盐的水溶液中小得多。
接着，在分别含有1mM琥珀酸盐缓冲液和10mM乙酸盐缓冲液的液态制剂中研究0.4％苯酚对rhuIFN-γ的生物活性的影响。如图5所示，用乙酸盐缓冲的溶液的稳定性，用IFN-γ生物活性判断，基本上与分别用琥珀酸盐和乙酸盐缓冲的未加防腐剂的对照溶液相同，而且用肉眼观察或SDS-PAGE分析都检测不到凝聚物。
本发明的药剂组合物含有：
a)未先经冻干处理的IFN-γ；
b)能将pH维持在约4-6(蛋白质在溶液中最稳定时的pH范围)的乙酸盐缓冲液；
c)主要用于稳定蛋白质防止因震动而引起的凝集现象的非离子型去污剂；
d)等渗剂；
e)选自苯酚、苄基醇和苄甲乙氧铵的卤化物如氯化苄甲乙氧铵的防腐剂；和
f)水。
非离子型的去污剂(表面活性剂)可以是，例如，聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(Tween)20，80等)或polox-amer(如poloxamer188)。使用非离子型表面活性剂可以使制剂暴露于剪切表面应力而不会使蛋白质变性。此外，这种表面活性剂可以用于诸如经肺给药的气溶胶装置，以及无针的喷嘴式注射枪(见例如，EP257,956)。
加入等渗剂以保证本发明的液态组合物的等渗性，其中包括多羟基糖醇，最好是三羟基或更多羟基的糖醇、如甘油、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇。这些糖醇可以单独使用或混合使用。或者，也可以加入氯化钠或其他适当的无机盐以赋予溶液等渗性。
乙酸盐缓冲液可以是，例如，乙酸-乙酸钠混合物，乙酸-氢氧化钠混合物等。本发明的液态制剂的pH被维持在约4.0—6.0，较佳为4.5—5.5，最佳为约pH5。
防腐剂苯酚、苄基醇和苄甲乙氧铵的卤化物如氯化苄甲乙氧铵是众所周知的抗微生物药物。
在一个较佳实施例中，本发明的液态药物组合物含有下列组份：
IFN-γ 0.1—2.0mg/ml
乙酸钠(pH 5.0) 5-100mM
Tween 20 0.1—0.01重量％
苯酚 0.05—0.4重量％
甘露醇 5重量％
注射用水，USP 加至100％
其中，百分比含量按组合物的重量计算。苯酚可以用0.5—1.0重量％苄醇替换，而甘露醇可以用0.9重量％氯化钠替换。
更佳地，组合物含有：
IFN-γ 0.1—1.0mg/ml
乙酸钠(pH5.0) 10mM
Tween20 0.01重量％
苯酚 0.2％
甘露醇 5％
苯酚可以用0.75重量％苄醇替换，而甘露醇可以用0.9重量％氯化钠替换。
加入防腐剂的液态制剂最好含有多剂量的治疗有效量的IFN-γ。考虑到该多肽的宿主范围狭小，所以对于治疗病人，最好含有人IFN-γ，更佳为含有天然序列的人IFN-γ的液态制剂。作为生物应答的调节剂，IFN-γ在多种人和非人的哺乳动物中，对多种细胞类型施加许多种作用。当然，治疗有效量取决于多种因素，其中包括待治疗(或预防)的疾病状况、病人的年龄、体重、一般医疗条件、药物史等，而治疗有效量的确定则靠诊治医师的知识经验。有效量一般为约0.001—1.0mg/kg，更佳为约0.01—1mg/kg，最佳为0.01—0.1mg/kg。在这种制剂中，当在A549细胞上对脑心肌炎病毒进行测试时，huIFN-γ最好具有约2×107U/毫克蛋白质的数量级或更大的比活性。应理解，内毒素污染应降至最低从而达到安全标准，例如，小于0.5ng/mg蛋白质。此外，人用的液态组合物还应符合FDA和生物制品所要求的无菌、无热原物质、总体安全和纯度方面的要求。
该制剂最好是反复用于静脉注射(i.v.)，皮下注射(s.c.)或肌内注射(i.m.)给药，或者作为适合鼻内或肺内给药的气雾剂制剂(对于肺内给药，参见EP257,956)。
用于治疗慢性肉芽肿病的病人时，对于体表面积大于0.5平方米的病人建议的剂量为50微克/m2(1.5百万单位/m2)；对于体表面积等于或小于0.5平方米的病人，建议剂量为1.5微克/千克/一次剂量。建议在一周内皮下注射三次。
用于减少受重伤的病人的感染和死亡时，可每天一次皮下注射100微克rhuIFN-γ的剂量。可以用这种方法预防或治疗的感染包括肺炎、菌血症、腹内或胸内感染、严重的伤口感染、vecticulitis/脑膜炎等。
本发明的稳定的水性组合物最好被装在小瓶中，含有高达约30个治疗有效量的IFN-γ。在第一次施用后至少14天，更佳为在第一次施用后至少约200天，IFN-γ的生物活性最好保留第一次施用时的约20％以内的活性。
在说明书中引用的文献和提及的内容在本文中特意加上文献，作为参考。
尽管上面涉及了具体的较佳实施例，但是应理解本发明并不受具体实施例的限制。对于本领域的一般熟练技术人员而言，可以在不改变本发明的总体构思下对公开的实施例进行改动。所有的这些改动都是属于本发明的范围内的。