一种生物酶法去角质化面膜制作及使用方法技术领域
本发明涉及一种生物酶法去角质化面膜制作及使用方法。
背景技术
随着时代的进步，经济的发展，越来越多的人开始注重个人肤质的保养，其中，面
膜作为清洁、护理及营养面部皮肤的化妆品得到了越来越多人的认可。面膜已成我国日化
行业增长最快的细分市场，2013和2014年在化妆品市场居第3位，占市场销售总额的16.3%，
2015年达300亿元规模，未来市场空间将达2000亿元。凯度消费者指数(Kantar
Worldpanel)发布的最新报告显示，2015年面膜为护肤品市场贡献41%的销售额增量。2015
年有48%的中国城市家庭购买过面膜，其发展已超越护肤品市场发达的韩国与中国台湾。面
膜的渗透率在各个年龄段女性中也都呈现稳步成长态势，在中国一、二线城市，即使是年龄
在46~50岁的女性中，也有9.4%的人群每周使用面膜，可以说“全民面膜”的时代已经来临。
而年轻女性仍然是面膜市场最重要的消费者，过去2年间，20~35岁的女性中，面膜的使用渗
透率提升了3.3个百分点，平均每周使用面膜的渗透率由16%增长到19%，在面膜市场中，抓
住年轻人的心，也就抓住了67%的消费者。
美容护肤品大部分使用人工合成的化学制品作为化妆品用，但随着时间的推移，
人们逐渐发现长期使用化学药品存在安全性问题，其毒性、刺激性和过敏性接踵而至，同
时，产品工业引起的环境保护问题也随之而来。
生物酶法去角质化面膜是一款无毒、无污染产品，无副作用，安全性高的生物科技
产品，该产业注重可持续发展。在目前的面膜市场中，国内没有发现利用纯化的角蛋白酶生
物法去角质化的面膜生产和销售，生物酶法去角质化面膜还大都处于试验阶段，没有具有
代表意义的领导企业。目前市场竞争压力小，是抢占市场的占有率、形成强大的影响力和建
造知名品牌的大好时机。
本专利利用筛选到的具有自主知识产权的菌株分离角蛋白酶，优化酶保护剂，角
蛋白酶低温保存，角蛋白酶结合到棉籽绒材质面膜，室温使用，去除脸上部分角质化的皮
屑，起到无副作用的嫩肤作用，助肌肤去除死皮、滋润脸部，使皮肤更清晰明亮。
发明内容
本发明是为了解决上述不足，提供了一种生物酶法去角质化面膜制作及使用方
法。
上述目的通过以下的技术方案来实现：一种生物酶法去角质化面膜制作方法，其
特征在于，包括以下步骤:
(1)、角蛋白酶诱导原料的预处理：酪蛋白粉碎，高压蒸汽灭菌20~30min，然后烘箱80℃
烘干至恒重；
(2)、制备微生物发酵菌剂:产角蛋白酶细菌按0.5~1%接种量接种于Luria-Bertani培
养基中，160转速/分钟，震荡培养24小时活化；然后按2~4%接种量接种于Luria-Bertani培
养基中，160转/分钟，震荡培养到对数期OD600 0.4~0.6,OD:光密度）得到产角蛋白酶细菌菌
剂；
(3)、产角蛋白酶细菌生产角蛋白酶：预处理酪蛋白8~18g/L，K2HPO4 1.4 g/L，KH2PO4
0.7 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO4 0.1g/L，pH6.5~8.5，表面活性剂吐温-80 0.5%，置发酵罐于
121℃灭菌30 分钟，待培养基冷却到37℃后，加入2~4%的羽毛降解菌剂（，发酵温度27~37
℃，通气气压为0.07~0.09 M Pa，空气流量为0.8 ~1.0L/L·min，100~120小时完成；
(4)、粗酶蛋白分离：发酵液7000 转速/分钟、4℃、离心10~20分钟取其上清液得粗酶
液，加入硫酸铵固体进行盐析分离，使其浓度在40~55%之间，5000 转速/分钟、4℃、离心5~
10分钟，沉淀为粗酶蛋白；
(5)、角蛋白酶纯化：粗酶蛋白加无菌纯水稀释到45~65mg/ml，分离的酶蛋白过交联葡
聚糖G-100凝胶柱，pH7.5的0.2 M （M：摩尔质量）PBS(磷酸缓冲盐溶液)平衡并洗脱柱子，流
速0.4 ml/min，分小管收集十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳检测并测定酶活，调
节浓度到160U/ml，加入1~5mmol/L乙二胺四乙酸二钠，角蛋白酶-20℃保存。
(6)、去角质化面膜制作：室温下，取出保存的酶溶液10ml，均匀滴加在一张折叠的
棉籽绒材质面膜，轻揉面膜，液体吸附在面膜上。
本发明还包括清洁肌肤，热毛巾敷脸3~5min，面膜贴于面部15~25 min后取下，温
水清洗面部，清洗干净面膜残留物。
本发明所述的角蛋白酶诱导原料是酪蛋白。
本发明所述的产角蛋白酶细菌为嗜麦芽窄食假单胞菌，Microbacterium
sp.TSMC-99。
本发明与现有技术相比的优点是：生物酶法去角质化面膜是一款无毒、无污染产
品，无副作用，安全性高的生物科技产品，该产业注重可持续发展。
本方法利用我们分离纯化的产角蛋白酶菌——嗜麦芽窄食假单胞菌，发酵罐发酵
生产分泌型角蛋白酶，制备角蛋白酶低温保存，角蛋白酶结合到棉籽绒材质面膜，室温使
用。
具体实施方式
下面对本发明进一步详述。
一种生物酶法去角质化面膜制作及使用方法，其特征在于：
酪蛋白材料粉碎，高压蒸汽灭菌30min，然后烘箱80℃烘12小时至恒重；
产角蛋白酶细菌按1%接种量接种于100ml LB培养基(Luria-Bertani培养基)中，160
rpm/min（转速/分钟），震荡培养24小时活化；然后按2%接种量接种于150ml LB(Luria-
Bertani培养基)培养基中，160转/分钟，约3~4小时，震荡培养到对数期（OD600 0.4~0.6,
OD:光密度）得到产角蛋白酶细菌菌剂；
5 L发酵罐生产角蛋白酶，装液量3.5 L，预处理过的羽毛、头发、角质化皮肤或酪蛋白
等富含角质化蛋白质的材料52.5g，K2HPO4 4.9 g，KH2PO4 2.45 g，NaCl 1.75 g，MgSO4
0.35g，pH7.0，表面活性剂吐温-80 17.5 ml，加水至3.5 L，溶解混匀，置发酵罐于121℃灭
菌30 分钟，待培养基冷却到37℃后，加入105 ml的羽毛降解菌剂，发酵温度35℃，通气气压
为0.08 M Pa，空气流量为2.8 L/min，110小时完成；
发酵液7000 rpm/min（转速/分钟）、4℃、离心15分钟取其上清液得粗酶液，加入硫酸铵
固体进行盐析分离，使其浓度在50%，5000 rpm/min（转速/分钟）、4℃、离心10分钟，沉淀为
粗酶蛋白；
粗酶蛋白加无菌纯水稀释到55mg/ml，分离的酶蛋白过交联葡聚糖G-100凝胶柱，pH7.5
的0.2 M（摩尔质量） PBS(磷酸缓冲盐溶液)平衡并洗脱柱子，流速0.5 ml/min，分小管收
集。SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）电泳检测并测定酶活，调节浓度到
160U/ml（酶单位/毫升），加入1~5mmol/L乙二胺四乙酸二钠，角蛋白酶-20℃保存。
室温下，取出保存的酶溶液10ml，均匀滴加在一张折叠的棉籽绒材质面膜，轻揉面
膜，液体吸附在面膜上。
清洁肌肤，热毛巾敷脸5min，面膜贴于面部20 min后取下，温水清洗面部，清洗干
净面膜残留物。