微流控芯片流式生化分析仪及检测生化组分的方法 【技术领域】
本发明属一种应用于生物化学、药学研究、生物医学研究及临床诊断等的生化分析仪及使用该生化分析仪检测核酸、抗体或抗原、肽类及化学因子等的方法。
背景技术
与本发明相近的现有技术为有机荧光染料编码微球和以荧光染料编码微球为基础的流式细胞仪。以荧光染料标记的微球为基础的定量流式细胞术已被用于准确地定量测定细胞表面受体等，其结果可与传统的Scatchard分析法相媲美，并可用于实验室间的标准化研究，因此已有几家公司开始生产高质量的荧光校准微球。
将有机荧光染料编码微球与传统流式细胞仪结合，进行多组分同时检测的仪器已经上市，例如美国Luminex公司的产品。该流式细胞仪的结构原理如图1所示。主要由激光光源1、流动室2、分光装置和检测系统构成。流动室2是样品和鞘液(缓冲液)相混的小室，常以有机玻璃、光学玻璃或石英等制成，是流动系统的心脏。被检测的样品粒子(细胞或微球)与鞘液流分别从样品流入孔3和鞘液流入孔4进入流动室2的流样管5处并被经聚焦的激光照射。采用气压进样的方法使被检测的样品粒子与鞘液流动。分光装置包括两片二色性反射镜6。与样品粒子有关的特定地光信号按光的波长被二色性反射镜6反射或透射，进行分光，再通过带通滤光片7和凸透镜8，最终到达检测系统。检测系统包括光电倍增管9和硅光电二极管10，两个光电倍增管9和一个硅光电二极管10分别接收两束反射光和透射光并对其强度进行检测。
由于流动室2做工精巧，尺寸准确，在设计上要求在流体力学上、光学上、机械学和电学上都十分稳定，因而具有加工困难、体积较大、价格昂贵的缺点。同时由于采用气压进样的方法，同时需要大量的鞘液，更增加了其微型化的难度。由于采用光电倍增管9和硅光电二极管10作为检测器，用二色性反射镜6作为分光装置，使得其光学结构相当复杂，调节也相当困难，操作复杂，需要经专门训练的人员进行操作，并且只能对几种特定的发射波长进行检测，波长种类越多价格越高，仪器体积也越大。
所说的样品粒子是采用荧光染料进行编码过的微球。由于有机染料激发光谱和发射光谱靠的较近，且峰形不对称，发射峰“拖尾”严重，亮度较低且光褪色现象较严重。并且由于光褪色问题，此种标记微球并不稳定，不易保存。并且很难选择同一个激发光源同时激发几种荧光染料(一般＜3种)，因此很难利用他们作大量微球的标记，目前市售的标记微球总数为64种，据说将有100种不同编码的微球即将推出，但这与人类基因总共有约3-4万种相比，仍然是远远不够的。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是克服背景技术的不足，设计一种流式生化分析仪以及用量子点编码微球检测生化组分的方法，使仪器的整体性能稳定、流动室及检测器体积变小、被检测的样品量与鞘液用量减少、价格低廉、可对所有波长上的光强进行检测，一次性得到每个波长处的数据；使用的编码微球亮度高、不褪色、易保存，用同一个激发光源可同时激发更多种编码微球，从而可以对更多种生物或化学组分进行同时快速检测。
本发明的微流控芯片流式生化分析仪的结构主要包括有：激光光源、微流控芯片分析系统、分光检测系统(CCD全谱仪)。
所说的微流控芯片是两层薄板经过蚀刻及粘接而制成，薄板可以玻璃或塑料或其它材质的，两层薄片之间刻有十字交叉的通道，通道的终点处分别是样品流入孔、相对的两个缓冲溶液流入孔、废液流出孔并与外界相连。在样品流入孔、缓冲溶液流入孔、废液流出孔中各插有一个电极。激光光源发出的激光经平面镜、凸透镜后聚焦在微流控芯片的十字交叉通道的检测点。通道内的物质发出的荧光由芯片下方的光纤接收，然后传入分光检测系统。所说的分光检测系统是指一个体积仅为几立方厘米的CCD光谱检测器，其内部由一准直用光平行凹面镜、分光光栅和阵列检测器构成，光纤出口与CCD光谱检测器间由螺旋密切连接。
微流控芯片上的样品流入孔、缓冲溶液流入孔、废液流出孔均粘接有相应的储液池，用来分别承装样品、缓冲溶液及废液。各储液池中插装有电极，它们可以由铂丝、金丝、铂片或金片做成，但从稳定性、导电性能及造价等方面考虑，选择铂丝作为电极最为合适。微流控芯片大小为1-15cm2，但为了保证一定大小的电场强度，芯片无须做得过大，以1-6cm2为宜；每条微通道长度为1-5cm，以0.5-1.5cm为最佳；每条微通道宽度为10-150μm，以20-100μm为最佳。微流控芯片的材质可为单晶硅、无定型硅、玻璃、石英、环氧树脂、聚脲、聚氨、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯及二甲基硅氧烷。可以通过化学蚀刻法、准分子激光刻蚀、塑膜法及热压法等方法得到价格低廉、深宽比较大的高分子材料的微流控芯片。微流控芯片可反复使用，亦可一次性使用。
激光光源可为蓝色或绿色半导体激光器或氩离子激光器，但由于半导体激光器具有体积小，无需水冷，预热时间短，价格低廉等优点，且蓝色激光能够激发的荧光范围较宽，尤其是对于量子点，各种发射波长的量子点都可以使用蓝色激光来激发，故以蓝色半导体激光器为最佳。
本发明用以检测生化组分的方法采用的技术方案是：使用发光量子点编码微球为载体，首先激活微球表面的羟基。然后将编码微球与捕捉抗体耦联，即将核酸、抗体或抗原、肽类或细胞因子等物质吸附在不同编码的发光量子点编码微球上制成标记微球。再将其与待测样品混合，通过DNA杂交反应、免疫反应等特异性相互作用，将各种待测样品中的特异性核酸、抗体或抗原、肽类或细胞因子等也全部吸附到对应的发光量子点编码微球上。最后使用微流控芯片流式生化分析仪检测分析待测样品中相关因子的含量。
所说的发光量子点编码微球已有大小均匀、包含各种特定比例不同种类发光量子点进行编码的聚苯乙烯或乳胶聚合物的微球产品。本发明采用直径范围为1-20μm、量子点的发射带宽＜20nm的微球。微球直径范围以2-6μm为最佳，直径偏差＜±5％。
所说的将编码微球与捕捉抗体耦联也就是对编码微球进行修饰，在其上固定核酸、抗体或抗原、肽类、细胞因子等生物和化学物质。
所说的与待测样品混合也就是使微球标记的探针通过DNA杂交反应、免疫反应及分子识别等与样品中相应的待测组分结合。
在检测生化组分的方法中，样品储液池所加电压为600-1800V，缓冲液储液池为200-1500V，电压增加则流动速度加快，可缩短检测时间，但由于电解及焦耳热等各种因素的影响，最佳电压为样品池1000-1500V，缓冲液池为600-1200V，并且操作电压可由系统操作软件进行控制。每秒钟检测的微球数为2-500个，由于检测器相应速度和计算机处理速度及检测时间的限制，以每秒钟检测30-200个为宜。测试所需样品体积为0.04-0.5mL，最佳体积为0.05-0.1mL。
在检测生化组分的方法中，可以采用流动注射进样技术，使用计算机对流动注射系统进行控制，可直接引入一定体积的样品及试剂，操作更加方便准确。
该仪器具有专用的配套软件，使用VC或VB编程，可将不同种类的编码微球依据其荧光波长及相应的强度进行分类、计数，并可将各种编码微球的个数同步的直观地显示于屏幕上。
本发明的微型流式生化分析仪，集进样、液流控制、排废、分光检测于一体，体积小，重量轻，结构紧凑，可同时获得多种波长荧光强度值，并且响应速度较快，达毫秒级，可将每个快速流过的微球的全波长谱图记录下来，从而可以同时检测最多数百万种待测组分。使用微流控芯片能全自动操作，且可免清洗、流动注射连续进样及排废，每次进样量为μL级，并可精确控制。使用微芯片系统及动电聚焦技术可以减小仪器体积，再加上采用CCD光谱检测器作为检测系统，使得仪器结构更加简单，并可对所有波长上的光强进行检测，一次性得到每个波长处的数据，这样做的好处是在选择荧光试剂时可以不受其种类和发射波长的限制，增加灵活性，从而使得应用范围扩大，灵活性提高，亦使得仪器操作变得简单，并且降低了成本。由于不稳定因素的减少使得仪器的整体性能也更加稳定。该仪器除了有传统流式细胞仪的功能外，还增添了分子识别作用，因而可广泛用于生物化学物质分析、化学成分分析、药物筛选、临床诊断等领域。
本发明的检测生化组分的方法还将流动注射进样技术用于微型流式生化分析仪，在减小仪器体积和重量的同时将大大提高分析速度；采用自行研制加工的微芯片，试样试剂消耗少，检测费用低，大大降低了检测成本；仪器的液流控制则采用动电聚焦技术，使微球在缓冲液的包围下形成均匀的层流单列流动，并且每个微球一个一个地单独通过检测器，因而可得到每个编码微球的全谱图，也省去了使用大量鞘液引入样品等繁琐步骤。本发明的优点是一次检测即可同时获得同一样品中多种核酸、抗原或抗体等的含量，以便用于各种相关疾病如肿瘤、各种炎症以及自身免疫性疾病等的诊断、鉴别诊断或疾病的早期发现以及药物筛选等。
【附图说明】
图1是背景技术的流式细胞仪的结构原理图。
图2是本发明的微流控芯片流式生化分析仪的结构原理图。
图3是微流控芯片外观图。
图4是微通道内溶液及微球流动情况示意图。
【具体实施方式】
实施例1 结合附图进一步说明本发明的结构和工作过程
附图中，1为激光光源，最好是蓝色半导体激光器；12为平面镜；13为凸透镜；14为微流控芯片，其内有两条十字交叉的几微米到一百多微米宽的通道21，在微通道21的四个终点处分别有样品流入孔17、相对的两个缓冲溶液流入孔18、废液流出孔与外界相连，样品流入孔17、缓冲溶液流入孔18、废液流出孔20上面分别粘接有相应的储液池，其内各插入一个电极；24为检测区，位于通往废液流出孔20的通道21上；15为光纤，其一端与十字交叉通道21的检测点24相对，另一端与检测系统16紧密相连；检测系统16为CCD光谱检测器。
微流控芯片14可以是由两片几平方厘米到几十平方厘米大小的玻璃或者其它材质粘合在一起构成，其中一片上刻有两条十字交叉型几微米到一百多微米宽的通道21，十字交叉通道21分成四段，分别为样品通道22、两段缓冲液通道23和废液通道25。在每条通道的终点处各有一个直径1-2mm的小孔将微通道与外界相连，小孔上面可各粘接一个储液池，它们分别是样品储液池17用来承装样品、两个缓冲液储液池18用来承装缓冲溶液、废液储液池19用来承装废液。电极可以是四段铂丝分别插在四个储液池内，使得通道21内在施加一定的高压后会产生相应大小的电场，样品及缓冲液在电场的作用下同时流入废液储液池19。
微流控芯片14可以放在一个三维调节架上面，并通过可左右调节宽度的塑料夹子夹住，使之固定不动，在仪器外面即可通过旋钮对微流控芯片14的位置进行调节，以保证激光恰好汇聚于检测点24上，使用方便且精确度可达微米级。
检测样品时，由激光光源1发出的激光束经平面镜12和凸透镜13后聚焦在微流控芯片14的十字交叉点的下游约50μm处的检测点24。编码微球在缓冲液的包围下呈层流流动，并可呈单列通过通道21的十字交叉处，每个单独的微球经激光激发后发出多种不同波长的荧光信号恰好可被光纤15的一端收集，并由光纤15导入检测系统16，进行全波长检测分析。
上面所得的光强信号转换为可被计算机识别的数字信号后，通过软件对每个微球上的荧光波长和强度的差别进行区分，对每种编码分别计数，最后根据数据特征得出检测结论。
电极上所加电压也可由计算机统一控制。软件使用VC或VB语言进行编程，每种编码微球的个数可以直观的显示在屏幕上。
样品引入及废液引出均可以由流动注射系统完成，可实现多种样品连续测定，无需清洗微流控芯片14。
检测系统16亦可使用多个光电倍增管作为检测器，采用多个双色性滤光片将各种单色光分开，从而检测每个微球上各种波长荧光的强度，此种方法虽然响应速度较快，灵敏度较高，但装置相当复杂，体积也要庞大得多。
实施例2 检测样品中所含抗原：
1、将编码微球于漩涡振荡器和超声振荡器中振荡使其悬浮均匀；向前述悬浮液中加入硫化N-羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)混匀，然后加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐(EDC)混合振荡，于室温放置20min，将微球表面的羧基激活。
2、激活后的微球用PBS溶液清洗3次，然后用漩涡混悬，迅速加入捕捉抗体，混合后于室温下振荡孵育30min，200g离心15min，弃上清液。
3、使微球悬浮于含有1mg/mL的BSA和0.02％吐温20中，4℃孵育30min，200g离心15min，弃上清液；用上述缓冲液将微球洗两次，使其悬浮于1mL的细胞培养液中，4℃孵育20min；用血细胞计数器计数，调节悬浮的微球浓度为2×106/mL，并且于4℃暗处放置；
4、将待测样品与连有各种特异性抗体的微球于小试管中混合，混悬振荡，4℃孵育30min；200g离心15min，弃上清液。
5、加入用量子点或者其它颜色的有机染料标记的抗种属特异性IgG抗体，4℃孵育45min；200g离心15min，弃上清液。用PBS清洗两次以除去过量的检测抗体，悬浮于50μL的PBS-FTN溶液中；将上述处理的样品放入该微型流式生化分析仪中的芯片上面的样品池中，进行分析检测。
6、阴性对照组设定：每一样品均设非特异对照组，以PBS代替特异性抗体，其余操作同上。
实施例3 微球标记受体检测细胞因子
1、激活微球表面的羟基过程同实施例2。
2、分别在每种微球中加入IL-1、2、6、12等受体，每种微球对应于一种受体，混合后于室温下振荡孵育30min，200g离心15min，弃上清；
3、使微球悬浮于含有1mg/mL的BSA和0.02％吐温20中，4℃孵育30min，200g离心15min，弃上清液；用上述缓冲液将微球洗两次，使其悬浮于1mL的细胞培养液中，4℃孵育20min；用血细胞计数器计数，调节悬浮的微球浓度为2×106/mL，并且于4℃暗处放置；
4、加入含有待测细胞因子的溶液100μL，于4℃孵育45min；于200g离心15min，弃掉上清液。
5、加入另一系列颜色的量子点或荧光染料标记的IL-1、2、6、12等抗体，与连有各种受体的微球于小试管中混合，漩涡振荡，4℃孵育45min；于200g离心15min，弃掉上清液；用PBS清洗两次以除去过量的检测抗体，加入50μL PBS(含0.1％叠氮化钠)缓冲液，上机分析。测定每种细胞因子的百分含量。
6、阴性对照组设定：同实施例2。
实施例4 微球标记寡核苷酸探针进行基因检测
1、激活微球表面的羟基过程同实施例2。
2、向每个试管中加入一种编码的微球和IL-1、2、6、12基因的寡核苷酸片断F1、F2、F6、F12中的一种，每种微球对应于一种寡核苷酸片断；混匀后置室温、暗处孵育15min-30min，于200g离心15min，弃掉上清液。
3、使微球悬浮于含有1mg/mL的BSA和0.02％吐温20中，4℃孵育30min，200g离心15min，弃上清液；用上述缓冲液将微球洗两次，使其悬浮于1mL的细胞培养液中，4℃孵育20min；用血细胞计数器计数，调节悬浮的微球浓度为2×106/mL，并且于4℃暗处放置；
4、加入待测样品10μL，室温暗处孵育30min，200g离心15min，弃掉上清液。
5、加入另一系列颜色的量子点或荧光染料标记的IL-1、2、6、12基因的寡核苷酸片段R1、R2、R6、R12各5μL(F与R序列不互补)；混匀后置室温、暗处孵育15min-30min，200g离心15min，弃掉上清液；用PBS清洗两次以除去过量的检测抗体，加入50μL PBS(含0.1％叠氮化钠)缓冲液，上机分析，测定每种寡核苷酸的百分含量。
6、阴性对照组设定：每一样品均设非特异对照组，以PBS代替特异性探针，其余同上。
实施例5 微球标记肽进行检测特异性受体
1、激活微球表面的羟基过程同实施例2。
2、向每个试管中加入一种编码的微球和IL-1、2、6、12肽段F1、F2、F6、F12中的一种，每种微球修饰一种肽；混匀后置室温、暗处孵育15min-30min，于200g离心15min，弃掉上清液。
3、使微球悬浮于含有1mg/mL的BSA和0.02％吐温20中，4℃孵育30min，200g离心15min，弃上清液；用上述缓冲液将微球洗两次，使其悬浮于1mL的细胞培养液中，4℃孵育20min；用血细胞计数器计数，调节悬浮的微球浓度为2×106/mL，并且于4℃暗处放置；
4、加入待测样品，室温避光孵育30min，200g离心15min，弃掉上清液。
5、加入另一系列颜色的量子点或荧光染料标记的IL-1、2、6、12受体的抗体RAb1、RAb2、RAb6、RAb12各5μL；混匀后置室温、暗处孵育15min-30min，200g离心15min，弃掉上清液；用PBS清洗两次以除去过量的检测抗体，加入50μL PBS(含0.1％叠氮化钠)缓冲液，上机分析，测定每种肽的百分含量。
6、阴性对照组设定：同实施例2。