稳定性改善的肉毒毒素药物液体组合物.pdf

本文公开了一种稳定性改善的肉毒毒素液体药物组合物。它包括肉毒毒素、聚山梨酸酯20和蛋氨酸，以及任选的异亮氨酸。代替衍生自动物的蛋白白蛋白或明胶，使用聚山梨酸酯20和蛋氨酸以及任选的异亮氨酸作为肉毒毒素稳定剂，液体药物组合物免去了人体受衍生自血清的病原体或微生物感染的风险，并可安全地用药到人体上。此外，该组合物便于用作病人的直接注射。在25-37℃以及在冷藏温度下肉毒毒素的保存稳定性方面，使用表面活性剂或氨基酸，本发明的药物组合物对于在紧急条件例如不维持低温的环境下保存肉毒毒素非常有用，优于传统组合物。因为使用表面活性剂和氨基酸(多种氨基酸)而无需冷冻干燥过程，因此液体药物组合物可容易地制备。

1.  一种液体药物组合物，其由肉毒毒素、聚山梨酸酯20和蛋氨酸所组成。

2.  根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，每100单位的所述肉毒毒素为基准存在的所述蛋氨酸量为0.5-100μmol。

3.  根据权利要求2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述蛋氨酸浓度范围为0.5-100mM。

4.  根据权利要求3所述的液体药物组合物，其特征在于，所述蛋氨酸浓度范围为25-75mM。

5.  根据权利要求1-4中任意一项所述的液体药物组合物，其特征在于，每100单位的所述肉毒毒素为基准存在的所述聚山梨酸酯20的量为0.01-50mg。

6.  根据权利要求5所述的液体药物组合物，其特征在于，所述聚山梨酸酯20的浓度范围为0.01-50mg/mL。

7.  根据权利要求6所述的液体药物组合物，其特征在于，所述聚山梨酸酯20的浓度范围为0.1-2.5mg/mL。

8.  根据权利要求1-4中任意一项所述的液体药物组合物，其特征在于，所述肉毒毒素选自以下组中：肉毒毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。

9.  根据权利要求8所述的液体药物组合物，其特征在于，所述肉毒毒素是非复合物形式或者是与蛋白质的复合物形式。

10.  根据权利要求1-4中任意一项所述的液体药物组合物，其特征在于，所述液体药物组合物的pH值范围为5.5-7.0。

11.  根据权利要求1-4中任意一项所述的液体药物组合物，其特征在于，还包括异亮氨酸。

12.  根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述肉毒毒素的浓度范围为50-5,000单位/mL。

稳定性改善的肉毒毒素药物液体组合物
技术领域
本发明大体上涉及一种更稳定的液体药物肉毒毒素组合物，尤其涉及一种包括与聚山梨酸酯20、蛋氨酸以及任选的异亮氨酸相结合的肉毒毒素的液体药物组合物。
背景技术
肉毒毒素是一种通过细菌肉毒杆菌制造的神经毒素蛋白质。该毒素阻碍神经肌肉关节处乙酰胆碱的突触前释放，使得哺乳动物肌肉松驰(松垂)瘫痪。该毒素已经证明对治疗斜视、自发眼睑痉挛和半面痉挛是有效的。此外，最近已经发现它能减缓许多不随意肌的运动障碍，包括痉挛性斜颈、口下颚肌张力障碍和痉挛性发音困难。此外，肉毒毒素已获得FDA批准用于中度到深度皱眉头纹路面部外貌的暂时改善和用于多汗症(过度的腋下出汗)的非外科治疗。
肉毒毒素蛋白质血清型A和B现在配制成剂型以供用于内科应用，例如斜颈、眼睑痉挛、多汗症等的治疗以及用于化妆品的应用如减少皱纹。然而，蛋白质药物，包括肉毒毒素蛋白质，在其制造过程中存在许多问题。这些问题，大部分归因于蛋白质的不稳定性，特别对于配制有极低浓度的活性蛋白质例如肉毒毒素的蛋白质药物是明显的。
当装进容器中时，粘附自身到固态表面上的肉毒毒素蛋白质容易粘附到容器的内壁上，导致活性成分的损失。也需要稳定剂用来防止蛋白质被氧化或降解成碎片。
在肉毒毒素配方中大多数情况下选择白蛋白用作稳定剂。除了稳定药物组合物中的活性蛋白质成分之外，白蛋白即使注射到人体中也享有显示出微不足道的免疫原性的优点。然而，血清产物如白蛋白不会完全免除被污染病原体或微生物的可能性，因此作为疾病的介质，特别是病毒病或克罗伊茨费尔特-雅各布氏病。
通常，明胶用来代替白蛋白。然而，并不推荐将明胶用作药物配方的稳定剂，因为与白蛋白类似，该蛋白质也由动物获得并可减轻疾病。
根据韩国专利号10-079940，衍生自非动物源的稳定剂提供用于肉毒毒素的药物组合物，该专利中，酵母中产生的重组血清白蛋白(rSA)可用于制剂配方。然而，不能完全避免在重组血清白蛋白(rSA)的生产、隔离和回复过程中可能产生的新表位，即一种新的抗原结构因药物的接受而引起免疫反应。韩国专利号10-0665469公开了一种药物组合物，包括肉毒毒素、多醣(包括羟乙基淀粉)和氨基酸如赖氨酸、甘氨酸、组氨酸或精氨酸。该药物组合物通过低压冻干法(lyophylization)制备提供为剂型，遗憾地是必须用冰箱或冷冻机内进行低温保存。临到使用前低压冻干的肉毒毒素解冻或稀释的要求可能引起蛋白质的误差。除了不方便使用外，低压冻干肉毒毒素难以研制成预先充入注射器的给药类型。
美国专利公开号2007-0134199建议了一种用于药物中蛋白质剂稳定的组合物。该组合物包括非离子型表面活性剂(detergents)、优选聚山梨酸酯以及谷氨酸盐和谷氨酸或者是天冬酰胺和天冬氨酸的结合。当在4℃保存时，液相组合物中肉毒毒素的稀释剂观察到可稳定8个月。然而，因为37℃的保存使稀释剂的活性降低到1个月以内，所以该组合物对于室温保存的药物中的蛋白质剂如肉毒毒素来说有有限的用途。根据本发明人的看法，该缺陷归因于极性氨基酸的存在，特别是酸性氨基酸例如谷氨酸或天冬氨酸。
发明内容
技术问题
因此，鉴于现有技术中存在的上述问题而完成了本发明。本发明的目的在于提供一种药物组合物，该组合物即使在室温以及冷藏温度保存长的一段时间后也能保持肉毒毒素的活性，并且具有比低压冻干态更方便使用的液态。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，其中肉毒毒素能够在冷藏或高温条件下稳定地保持，既不使用衍生自动物的蛋白如白蛋白或明胶作为肉毒毒素的稳定剂也不使用极性或酸性的氨基酸如谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸。
技术方案
为了完成本发明，本发明人用许多表面活性剂和氨基酸对高温条件下肉毒毒素的稳定保存进行了详尽又彻底的研究，结果发现聚山梨酸酯20和蛋氨酸以及任选的异亮氨酸的组合能够大大改善室温或更高温度下肉毒毒素的稳定性。
根据本发明的一个方面，提供了一种液体药物组合物，其包括肉毒毒素、聚山梨酸酯20和蛋氨酸。
根据本发明的另一方面，提供了一种液体药物组合物，其包括肉毒毒素、聚山梨酸酯20、蛋氨酸和异亮氨酸。
在液体药物组合物中，每100单位的肉毒毒素为基准存在的蛋氨酸的用量为0.5-100μmol，优选浓度范围为0.5-100mM，更优选为25-75mM。
在本发明的液体药物组合物中，每100单位的肉毒毒素为基准存在的聚山梨酸酯20的量为0.01-50mg，优选浓度范围为0.01-50mg/mL，更优选为0.1-2.5mg/mL。
在本发明的液体药物组合物中，肉毒毒素选自肉毒毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，且可以是非复合的形成或者是与蛋白质的复合形式。优选地，肉毒毒素的浓度范围为50-5,000单位/mL。
根据本发明的液体药物组合物优选的pH范围为5.5-7.0。
有益效果
代替衍生自动物的蛋白白蛋白或明胶，使用聚山梨酸酯20和蛋氨酸以及任选的异亮氨酸的组合作为肉毒毒素稳定剂，根据本发明的液体药物组合物免去了人体受衍生自血清的病原体或微生物感染的风险，并可安全性地用药到人体上。
此外，本发明的液体药物组合物可方便用作病人的直接注射。此外，在25-37℃以及在冷藏温度下肉毒毒素的保存稳定性方面，使用表面活性剂或氨基酸，本发明的药物组合物对于在紧急条件例如不维持低温的环境下保存肉毒毒素非常有用，因而优于传统的组合物。
本发明的液体药物组合物能够容易地制备，因为它使用表面活性剂和氨基酸(多种氨基酸)而无需冷低压冻干方法。
发明内容
本发明提供了一种肉毒菌稳定性改善的液体药物组合物。特别地，液体药物组合物包括肉毒毒素、聚山梨酸酯20和蛋氨酸以及任选的异亮氨酸。
根据本发明包含肉毒毒素、聚山梨酸酯20和蛋氨酸，或者可替换地，包含肉毒毒素、聚山梨酸酯20、蛋氨酸和异亮氨酸的液体药物组合物在肉毒毒素稳定性方面有显著改善。
使用聚山梨酸酯20、蛋氨酸和任选的异亮氨酸代替衍生自动物的蛋白例如白蛋白或明胶作为肉毒毒素用稳定剂，本发明的液体药物组合物免去了受体感染源自血清的病原体或微生物的潜在危险，因而注射到人体是安全的。此外，稳定剂聚山梨酸酯20、蛋氨酸和任选的异亮氨酸的组合使用保证了在25-27℃比单独使用它们有更高的肉毒毒素稳定性。
肉毒毒素，本发明的液体药物组合物的一种组分，可以是选自血清型A、B、C、D、E、F和G之中的一种。术语肉毒毒素是包括由厌氧菌肉毒杆菌制造的毒素属的通称，到现在为止，已经识别了七种免疫不同的神经毒素血清型。这些已经给出了标号A、B、C、D、E、F和G，这些在它们对目标动物、瘫痪程度以及持续时间的影响彼此不同。通过抑制神经肌肉关节处的神经传递介质乙酰胆碱，肉毒毒素的所有血清型已知可用作神经毒素。
根据本发明的液体药物组合物的肉毒毒素可以是非复合形式或者是与另一蛋白质的复合形式。通过肉毒杆菌合成的单独的肉毒毒素血清型A、B、C、D、E、F或G之一自身具有约150Kda的分子量。当在表达肉毒杆菌时，肉毒毒素与有助于和保护其活性的血球凝集素蛋白质和非血球凝集素蛋白质形成各种复合物。天然存在的肉毒菌A型复合物具有约900kDa、500kDa或300kDa的分子量。对于肉毒毒素B型复合物和C型复合物，分子量测量为约500kDa，对于D型复合物约300kDa或500kDa，对于E型和F型复合物约300kDa。
尽管没有严格限制，但根据其通常用途，本发明的液体药物组合物中的肉毒毒素浓度范围优选为50-5,000单位/mL。
在本发明的液体药物组合物中，每100单位的肉毒毒素为基准，存在的蛋氨酸量为0.5-100μmol，优选浓度范围为0.5-100mM，更优选为25-75mM。
一个单位(U)肉毒毒素定义为腹膜注射到每只体重18-20克的雌性瑞士Webster鼠时的LD50(半数致死量)。鼠肉毒毒素LD₅₀约为50皮克。
每100单位的肉毒毒素为基准，蛋氨酸含量小于0.5μmol不能保证在室温长期保存时将肉毒毒素稳定到预期的水平。另一方面，当每100单位的肉毒毒素为基准，蛋氨酸的使用量超过100μmol时，除了引起经济方面的缺点外，过多的增加量不能确定具有附加的稳定效果。在本发明的液体药物组合物中，当肉毒毒素浓度为100单位/mL时，蛋氨酸适当浓度范围为5-100mM。考虑到聚山梨酸酯20的浓度范围，其适当浓度调整为25-75mM。当本发明液体药物组合物中蛋氨酸的浓度低于25mM时，其对室温下肉毒毒素的长期稳定性效果不会达到在适当浓度范围内可获得的预期水平。另一方面，超过75mM的蛋氨酸浓度不会带来任何附加效果。
在本发明的液体药物组合物中，每100单位的肉毒毒素为基准，存在的聚山梨酸酯20的量为0.01-50mg，优选浓度范围为0.01到50mg/mL，更优选为0.1-2.5mg/mL。
聚山梨酸酯是一类用于一些药物和食品制品中的乳化剂。它们经常用于化妆品以将精油溶解成水基(水包油)产物。存在许多种聚山梨酸酯，它们可根据涉及氧烯基总数的数值进行分类，例如聚山梨酸酯20、40、60和80。本发明的液体药物组合物使用了聚山梨酸酯20(市购商品名为吐温20)作为肉毒毒素的稳定剂。
如果每100单位的肉毒毒素为基准，本发明的液体药物组合物包含的聚山梨酸酯20的用量小于0.01mg，其对室温下肉毒毒素的长期稳定性的效果达不到预期的水平。另一方面，聚山梨酸酯20浓度超过50mg/mL除了引起经济方面的缺点外，不能带来任何附加效果。肉毒毒素在本发明的液体药物组合物中的浓度为100单位/mL时，聚山梨酸酯20存在的适当用量为0.01-50mg/mL，当考虑到蛋氨酸时，优选用量为0.1-2.5mg/mL。当本发明液体药物组合物中聚山梨酸酯20的浓度低于0.1mg/mL时，其对室温下肉毒毒素的长期稳定性效果不会达到聚山梨酸酯20的目标浓度可获得的预期水平。另一方面，超过2.5mg/mL的聚山梨酸酯20的浓度不会带来任何附加效果。
根据本发明，液体药物组合物具有5.5-7.0的pH值。在pH值调整到5.5-7.0的本发明的液体药物组合物中，肉毒毒素可在室温(特别是40℃)稳定地保持长的一段时间。
具体实施方式
通过以下实施例可对本发明有更好的理解，实施例声明只是示例，不能解释为是对本发明的限制。
1.实验方法
(1)液体肉毒毒素组合物的制备
在稳定溶液中将肉毒毒素稀释到100单位/mL的最终浓度。
(2)肉毒毒素的稳定性测试
当制备的液体肉毒毒素组合物在某个温度保存时，以预定的间隔从其中取出1mL的样品。使用9mL的注射液对1mL的样品液体组合物进行10倍的稀释。将稀释后的样品腹膜内注射进五只雌性ICR鼠(美国癌症研究所)(每只鼠以0.3mL的剂量，也就是说3单位/鼠)中。当腹膜内注射后观察小鼠3天，分析了死亡数和死亡率。当死亡率为50％或更高时，将液体肉毒毒素组合物评价为保持了肉毒毒素的活性。
2.肉毒毒素稳定剂的选择
制备了包含各种候选肉毒毒素稳定剂的液体肉毒毒素组合物并于25℃或37℃保存期间分析了肉毒毒素随时间变化的稳定性。25℃和37℃的稳定性试验结果分别总结在表1和表2中。在表1和表2中，HAS代表人体血清白蛋白，PED8000表示聚乙二醇8000。
在25℃，如表中所示，在包含L-蛋氨酸(20mM)+聚山梨酸酯20(2mg/mL)+肉毒毒素(100单位/mL)、HAS(5mg/mL)+聚山梨酸酯20(2mg/mL)+肉毒毒素(100单位/mL)、L-异亮氨酸(50mM)+聚山梨酸酯20(2mg/mL)+肉毒毒素(100单位/mL)、羟乙基淀粉(10mg/mL)+聚山梨酸酯20(2mg/mL)+肉毒毒素(100单位/mL)的液体组合物中，肉毒毒素的活性被保持了长的一段时间。在37℃，发现包含L-蛋氨酸(20mM)+聚山梨酸酯20(2mg/mL)+肉毒毒素(100单位/mL)或HAS(5mg/mL)+聚山梨酸酯20(2mg/mL)+肉毒毒素(100单位/mL)的液体组合物保持了长时间的肉毒毒素的活性，如表2中所示。
根据结果可以认识到，蛋氨酸和聚山梨酸酯20的组合可用作稳定剂来替换HAS和聚山梨酸酯20的组合或者羟乙基淀粉和聚山梨酸酯20的组合。此外，异亮氨酸和聚山梨酸酯20的组合可替换传统稳定剂的备选稳定剂。
表1

表2

3.不同浓度蛋氨酸下肉毒毒素的稳定性
试验了包含各种浓度的蛋氨酸与聚山梨酸酯20肉毒毒素稳定剂组合的液体肉毒毒素组合物在37℃保存条件下保持肉毒毒素活性的能力。下面将根据蛋氨酸浓度改变的肉毒毒素稳定性试验结果总结在表3中。
表3

如表3中所示，在0.5-20mM的蛋氨酸浓度时，肉毒毒素的活性稳定保持56天，在50-100mM的蛋氨酸浓度时，保持70天。与单独使用聚山梨酸酯20的组合物相比，使用蛋氨酸和聚山梨酸酯20两者的组合物大大改善了肉毒毒素的稳定性。
4.不同浓度聚山梨酸酯20下肉毒毒素的稳定性
试验了包含蛋氨酸与各种浓度的聚山梨酸酯20肉毒毒素稳定剂组合的液体肉毒毒素组合物在37℃保存条件下保持肉毒毒素活性的能力。下面将根据聚山梨酸酯浓度改变的肉毒毒素稳定性试验结果总结在表4中。
表4


如表4中所示，在0.5-2.0mg/mL的聚山梨酸酯20浓度时，肉毒毒素的活性稳定保持202天，在0.01mg/mL的聚山梨酸酯20浓度时保持167天，在10mg/mL的聚山梨酸酯20浓度时保持120天。与单独使用蛋氨酸的组合物相比，使用蛋氨酸和聚山梨酸酯20两者的组合物大大改善了肉毒毒素的稳定性。
5.不同浓度蛋氨酸和聚山梨酸酯20下肉毒毒素的稳定性
试验了包含各种浓度的蛋氨酸与聚山梨酸酯20肉毒毒素稳定剂组合的液体肉毒毒素组合物在37℃保存条件下它们保持肉毒毒素活性的能力。在不同浓度蛋氨酸和聚山梨酸酯20下(实施例12)保存30天和60天后肉毒毒素稳定性的试验结果(死亡率，％)分别总结在表5和6中。在试验中所用的液体肉毒毒素组合物中，肉毒毒素的浓度为100单位/mL。
表5和6的数据统计分析表明，25-75mM蛋氨酸和0.1-2.5mg/mL的聚山梨酸酯20的组合以最高效率稳定了肉毒毒素。
表5

表6

6.在不同pH值的液体药物组合物中肉毒毒素的稳定性
制备了pH为5.5-7.0的各种液体肉毒毒素组合物(实施例13)，其中蛋氨酸和聚山梨酸酯20以它们各自最适合稳定肉毒毒素的浓度范围进行组合，并试验了40℃保存条件下保持肉毒毒素活性的能力。液体肉毒毒素的pH值用HCl或NaOH进行调节。每种组合物的肉毒毒素浓度为100单位/mL下面将根据液体组合物的pH的肉毒毒素稳定性结果总结在表7中。
如图7中所示，在其pH值范围5.5-7.0的包含25-75mM的蛋氨酸和0.25-0.75mg/mL聚山梨酸酯20组合的液体肉毒毒素组合物中，40℃保存条件下肉毒毒素的活性稳定保持90天。
表7


7.在包含蛋氨酸、异亮氨酸和聚山梨酸酯组合的液体药物组合物中肉毒毒素的稳定性
如上所述，异亮氨酸和聚山梨酸酯20的组合以及蛋氨酸和聚山梨酸酯20组合确定为稳定肉毒毒素的备选物。根据这一结果，试验了蛋氨酸、异亮氨酸和聚山梨酸酯20的组合在37℃保存条件下稳定肉毒毒素的能力。在液体组合物中，肉毒毒素的浓度为100单位/mL。
表8

如图8中所示，通过蛋氨酸、异亮氨酸和聚山梨酸酯20的组合，在37℃保存条件下肉毒毒素的活性保持了长的一段时间(大约200天)，但是发现在液体组合物单独包含异亮氨酸或者包含蛋氨酸或聚山梨酸酯20组合的液体组合物中，该活性在经过30天之前几乎就消失了。
工业实用性
到目前所述，根据本发明的液体药物肉毒毒素组合物显示了显著改善的肉毒毒素稳定性。它在张力障碍、僵硬的肌肉痉挛、神经系统紊乱(偏头痛、腰痛、颈椎疼痛等)的治疗以及在多汗症治疗和皱纹减少的化妆品应用中是有效的。此外，本发明的液体药物肉毒毒素组合物可直接用作注射并且即使在25-37℃以及在冷藏温度下也保证了肉毒毒素的活性长的一段时间，这对运输和销售来说是非常有利的。