开花的遗传学控制 本发明涉及植物中开花的遗传学控制以及其中涉及的基因的克隆和表达。更特别地，本发明涉及拟南芥的CONSTANS(CO)基因和来自包括蔓菁的其它种的同系物的克隆和表达，以及该基因在植物中的操纵和使用。
植物的有效开花很重要，特别是当所希望的产物是花或从其产生的种子时。这一点的一个方面是开花的时间选择：使开花的开始提前或延迟对于农民和种子生产者可能有用。对于影响开花的遗传学机制的理解提供了一种用于改变目标植物的开花特性的方法。开花对于作物产量具有重要性的种属很多，基本上所有作物均从种子生长，其重要实例为谷类，稻和玉米，很可能是较暖气候带中农学上最重要的，以及在较温气候中的小麦，大麦，燕麦和黑麦。重要的种子产物为油料种子油菜和canola，制糖甜菜，玉米，向日葵，大豆和高梁。很多作物收获其根，当然地，每年从种子生长，而任何类地种子的产生非常依赖于植物开花，被授粉和播种的能力。在园艺学中，对开花的时间选择的控制非常重要。可控制开花的园艺学植物包括莴苣，苣荬菜和蔬菜芸苔属植物包括甘蓝，花茎甘蓝，花椰菜，和石竹属植物和老鹤草属植物。
拟南芥是一种兼性长日照植物，在长日照下开花早而在短日照下晚。由于它具有小的，经很好鉴定的基因组，相对易于转化和再生并具有快速生长期，拟南芥属是研究开花和其控制的理想模型植物。
我们已发现对光周期的这种反应所需要的基因之一是CONSTANS或CO基因，也称为FG。我们发现携带此基因的突变的植物与它们的野生型相比，在长日照下开花晚而在短日照下同时开花，因而我们总结出，CO基因产生参与长日照下开花的促进。
Putterill等，在分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)239：145-157(1993)中描述了初步的克隆工作，涉及使用酵母人工染色(YAC)文库的染色体步查和拟南芥属染色体5上1700kb的邻近DNA，包括含基因CO的300kb区的分离。该工作的不足在于未克隆和鉴定CO基因。
我们现在已克隆并测定了CO基因的序列(Putterill等，1995)，并在本文中提供。当制造克隆时遇到了意外的困难和复杂情况，使克隆工作比预期的更困难，如下文实验部分中所述。
按照本发明的第一方面，提供了一种核酸分子，它包含编码具有CO功能的多肽的核苷酸序列。本领域技术人员应理解“CO功能”可用于指象拟南芥的CO基因一样在表型上影响开花的时间选择的能力(该时间选择基本不受春化作用的影响)，特别是补充拟南芥中CO突变的能力，或另一种属中的CO表型。CO突变型在长日照下表现延迟开花，开花的时间选择基本不受春化作用的影响(见，如，Korneef等，(1991))。
按照本发明的核酸可具有拟南芥的CO基因的序列，或为所提供序列的突变型，衍生物或等位基因。优选的突变型，衍生物和等位基因为编码保持由野生型基因编码的蛋白的功能特性，特另是如本文中所讨论的促进开花的能力的蛋白者。其它优选的突变型，衍生物和等位基因编码一种蛋白，它与野生型或具有所提供序列的基因相比使开花延迟。为生产突变型或衍生物而对序列作改变，可通过在核酸中1或多次加入，插入，缺失或取代1或多个核苷酸，导致在编码的多肽中一或多个氨基酸的加入，插入，缺失或取代。当然，不改变被编码氨基酸序列的核酸改变也包括在内。
CO基因的优选核酸序列显示于图1中，同时也显示了具有CO功能的多肽的编码氨基酸序列。
本发明也提供一种包含带有所提供序列的任意一种的核酸的载体，优选可表达由核酸序列编码的多肽的载体。优选该载体适合转化入植物细胞。本发明还包含用这样的载体转化的宿主细胞，特别是植物细胞。因此，提供了一种包含按照本发明的核酸的宿主细胞，如植物细胞。在该细胞中，该核酸可掺入染色体中。每个单倍体基因组可有一个以上异源核苷酸序列。这一点，例如，使与内源水平相比基因产物的表达增加，如下所讨论。
包含按照本发明的核酸的载体不必包括一个启动子或其它调节序列，特别是如果该载体是用于将核酸导入细胞以供重组入基因组时。
按照本发明的核酸分子和载体可从它们的自然环境分离而提供，以基本纯或同源的形式，或不含或基本不含所研究种属的核酸或基因，或来自不编码能影响开花的多肽的序列，例如在拟南芥中非CO序列的核酸。
当然，核酸可为双链或单链的，cDNA或基因组DNA，RNA，全部或部分合成的，根据需要而定。
本发明还包括所公开的任何核酸序列的表达产物以及通过在适当条件下在适当宿主中通过编码核酸的表达制备表达产物的方法。本领域技术人员可容易地构建载体和设计方案以进行表达和回收重组基因表达产物。适当的载体可被选择或构建，包含适当的调节序列，包括启动子序列，终止子片段，多腺苷酸化序列，增强子序列，标记基因和其它合适序列。详情参见，如，分子克隆：实验室手册：第二版，Sambrook等，1989，冷泉港实验室出版社。转化程序取决于所使用的宿主，但是是公知的。
本发明还包括包含含有根据本发明的核酸的植物细胞的植物，以及自身的或杂种的子代和这种植物的任何后代，和这种植物的任何部分和繁殖体，子代或后代，包括种子。
本发明还提供了一种方法用于从拟南芥外的其它植物种属鉴定和克隆CO同系物，该方法使用来自图1显示的核苷酸序列。其序列显示于图5和图6的基因用这种方法被克隆。来自这些的序列本身可用于鉴定和克隆其它序列。本文提供的核苷酸序列信息，或其任何部分。可用于数据库搜索以发现同源序列，并可测定这些同源序列的表达产物影响开花特性的能力。这些可具有“CO功能”或补充突变型表型的能力(特别是在长日照下)，优选地，开花的时间选择基本不受春化作用的影响，如本文所公开。另外，核酸文库可使用本领域技术人员公知的技术进行筛选，并将所鉴定的同源序列进行测定。
本发明还延伸至编码使用衍生自图1中显示的核苷酸序列获得的CO同系物的核酸。CO同系物序列显示于图5和6。本发明还包括编码使用衍生自显示于图5或图6的序列的核苷酸序列获得的CO同系物的核酸。
该CO蛋白在蛋白的氨基末端含有半胱氨酸排列，是锌指的特征，如GATA转录因子中包含的那些(Ramain等，1993；Sanchez-Garcia和Rabbitts，1994讨论)。七种独立分离的CO突变型已被描述，并且我们已鉴定了序列改变引起在所有7种情况下CO活性下降。其中5种在从它们的序列推测形成锌指的区中被改变，另外两种在蛋白羧基末端的临近氨基酸中具有变化。这些改变的位置支持我们如下的解释，即CO编码含锌指的蛋白，它很可能结合DNA并起到转录因子的作用。
拟南芥CO基因的序列信息的提供使从其它植物种属获得(obtention)同源序列成为可能。在Southern杂交实验中，一个含有拟南芥CO基因的探针与从黑芥，蔓菁和花椰菜提取的DNA进行杂交。这些种属的不同变种在它们的DNA用限制性酶剪切并与CO探针杂交时表现限制性片段长度多态性。这些RFLP可随后用于CO基因相对于其它已知位置的RFLP的绘图。以这种方式，例如，三种CO基因同系物被绘制于蔓菁的连锁群N5，N2和N12(D.Lydiate，未发表)。用于RFLP绘图的种群已预先进行开花时间的评分并且已证实CO同系物的特定等位基因与影响开花时间的等位基因变异共分离。绘制在连锁群N2和N12的座位显示开花时间选择的最大等位基因变异。
两种蔓菁同系物的成功克隆描述于实施例5中。
这证实与拟南芥属的CO基因同源的基因调节其它植物种属中的开花时间。
因此，本发明包括编码作为拟南芥的CO的同系物的氨基酸序列的核酸分子。同源性可在核苷酸序列和/或氨基酸序列水平。优选地，该核酸序列与来自拟南芥外的其它种属的图1的核苷酸序列编码的序列享有同源性，优选约50％，或60％，或70％，或80％同源性，最优选约90％同源性，并且所编码的多肽享有拟南芥CO基因的一种表型，优选为影响开花的时间选择的能力。这些与拟南芥CO相比可促进或延迟开花，而突变型，衍生物或等位基因与野生型相比可促进或延迟开花。
CO基因同系物还可从经济上重要的单子叶作物如稻或玉米鉴定。虽然编码单子叶和双子叶植物中相同蛋白的基因在核苷酸水平显示相对小的同源性，但氨基酸序列是保守的。我们最近在公共序列数据库中鉴定了数种拟南芥属cDNA克隆序列，它们在随机测序程序中获得并在公知对其活性重要的蛋白的区中与CO享有同源性。类似地，在随机测序的稻cDNA中我们鉴定了一个克隆，该克隆在DNA水平享有相对小的同源性但在氨基酸水平享有高度同源性。此克隆，和我们已从玉米鉴定的另一个，可被用于鉴定来自稻和其它谷类作物的整个CO基因家族。通过这些克隆每一个的序列测定，研究它们的表达型和检查改变它们的表达的效果，可获得在调节开花时间方面具有与CO类似功能的基因。当然，这些序列的突变型，衍生物和等位基因包括在本发明的范围内，按照与上述拟南芥CO基因相同的说法。
按照本发明的核酸可包含编码能补充一种延迟开花的突变型表型，开花的时间选择基本不受春化作用的影响。延迟的开花可在长日照下。本发明还提供包含一种核苷酸序列的核酸，该核苷酸序列是编码具有影响开花时间选择能力的多肽的野生型基因的突变型或衍生物，该突变型或衍生物表型为提早或延迟的开花，开花的时间选择基本不受春化作用的影响。这些与Lee等报告的LD基因不同。
春化作用是低温度(通常刚高于0℃)处理植物(幼苗)或种子一段通常为数周的时期，很可能约30天。这是一些植物在它们含苞或开花前需要的一种处理，模拟冬季寒冷的作用。
按照本发明还提供了在其基因组中掺入了一段本发明提供的核苷酸序列的植物细胞，位于控制表达的调节序列的操作性控制之下。本发明的另一方面提供了一种制造这种植物细胞的方法，涉及向植物细胞中导入包含该核苷酸序列的载体，和引起或允许在载体和植物细胞基因组间发生重组以向基因组中导入核苷酸序列。
还提供了包含按照本发明的植物细胞的植物，以及其任何部分或繁殖体，种子，自身或杂种子代和后代。
本发明还提供影响植物开花特性的一种方法，包含在植物的细胞中表达异源CO基因序列(或其突变型，等位基因，衍生物或同系物，如上所讨论)。术语“异源”表明该被研究核苷酸的基因/序列已通过使用遗传工程学即通过人类干预而导入该植物的所述细胞。该基因可位于基因组外载体上或优选稳定地掺入基因组中。异源基因可置换内源等价基因，即在开花的控制中行使相同或类似功能者，或者该插入序列可以是内源性基因以外附加的。导入异源基因的有利之处在于能够置基因的表达于所选择的启动子控制之下，以便能够根据偏好影响基因表达和因而影响开花。而且，野生型基因的突变型或衍生物，例如比野生型具有更高或更低活性的，可替代内源性基因使用。
使用本发明可改变的主要开花特性是开花的时间选择。CO基因的基因产物的低表达导致延迟开花(如CO突变型表型所提示)，过表达可导致早开花(如携带CO基因额外拷贝的转基因拟南芥属植物和通过CaMV35S启动子的表达所示)。例如，这种控制的程度可用于保证在杂种生产中雄性和雌性亲本系的同步开花。另一项应用是根据气候的支配使开花提前或延后以延长或缩短生产季节。这可能涉及到反义或正义调节的使用。
可能改变的第二项开花特性是花在抽枝上的分布。在拟南芥中，花开在抽枝的侧面而不是顶部。这通过LEAFY基因的表达的位置决定(Weigel等，1992)，而引起LEAFY在抽枝的顶部表达的突变如“末端开花因子”(terminal flower(shannon和Meeks-Waguer，1991)也导致花在顶部开花。有证据说明CO为LEAFY的完整活性所需要(Putterill等，1995)。因而通过增加或改变CO表达的类型，LEAFY表达的水平和位置，进而花的发育，也可被改变。这一点在实施例4中举例说明。这一点可有利地被采用以产生具有改变的花排列的园艺学种属新变种。
按照本发明的核酸，如CO基因或同系物，可被置于外部可诱导基因启动子的控制下，以使开花的时间选择处在使用者的控制下。可诱导启动子的使用在下文描述。这一点的有利之处在于花的产生和随后的事件如种子结成，可安排时间而适应市场需求，例如，在插花(cutflower)或装饰性花盆植物中。延迟盆栽植物的开花有利于延长从生产者向销售地点运输可能的时间。而延长开花期则显然对购买者有利。
应用于启动子的术语“可诱导”是本领域技术人员熟知的。实质上，在可诱导启动子控制下的表达是对给予的刺激的“接通”或反应的增加。刺激的属性在启动子间不同。一些可诱导启动子在缺乏适当刺激时引起小的或不可测水平的表达(或无表达)。其它可诱导启动子在缺乏刺激时引起可测的组成型表达。不管在缺乏刺激时表达水平如何，在存在适当刺激时来自任何可诱导启动子的表达均增加。优选的情况是当以足够改变表型特征的量应用相关刺激时表达的水平增加。因此可使用一种可诱导(或“可接通”)启动子，它在缺乏刺激时引起基础水平的表达，该水平低至不足以带来所希望的表型(实际上可为零)。在给予刺激时，表达增加(或接通)达到带来所希望表型的水平。
适合的启动子包括花椰菜镶嵌病毒35S(CaMV 35S)基因启动子，它以高水平在基本所有植物组织中表达(Benfey等，1990a和1990b)；玉米谷胱甘肽-S-转移酶同种型II(GST-II-27)基因启动子，它在给予外源性防护剂时被激活(WO/93/01294，ICI有限公司)；花椰菜meri5启动子，它在植物顶部分生组织以及植物体中很好定位的位置，如内韧皮部，花原基，根和幼芽的分枝点表达(Medford，1992；Medford等，1991)；和在花发育的很早期表达的拟南芥LEAFY启动子(Weigel等，1992)。
当向细胞内导入所选择的基因结构物时，某些问题必需考虑到，这对于本领域技术人员是公知的。应将要插入的核酸装配入一个结构物中，该结构物含有驱动转录的有效调节因子。必需有一种方法可将该结构物运送入细胞。一旦该结构物已在细胞膜内，将发生或不发生向内源性染色体物质的掺入。最后，如果所关心的是植物的话，该靶细胞类型必须为能再生为整株植物的细胞。
用含有该序列的DNA片段转化的植物可通过用于植物的遗传学操纵的标准技术生产。可使用任何适当技术将DNA转化入植物细胞中，如利用了其自然的基因转移能力的土壤杆菌所携带的去防卫Ti质粒载体(EP-A-270355，EP-A-0116718，NAR12(22)8711-87215 1984)，颗粒或微粒轰击(美国5100792，EP-A-444882，EP-A-434616)微注射(WO 92/09696，WO/00583，EP 331083，EP 175966)，电穿孔(EP 290395，WO 8706614)，或其它形式的直接DNA摄取(DE 4005152，WO 9012096，美国4684611)。土壤杆菌转化被本领域技术人员广泛用于转化双子叶种属。虽然已有报导土壤杆菌能转化外源DNA入一些单子叶种属(WO 92/14828)，但微投射轰击，电穿孔和直接DNA摄取是优选的，而土壤杆菌是不够的或无效的。另外，可联合应用不同技术以增加转化过程的有效性，例如用土壤杆菌包被的微颗粒轰击(EP-A-486234)或微投射轰击以诱导伤害继以用土壤杆菌共培养(EP-A-486233)。
转化技术的特定选择取决于其转化某种植物种属的有效性和用选择的特定方法实施本发明的人员的经验和偏好。技术人员应明白将核酸导入植物细胞的转化系统的特定选择并非必须的或限制本发明。
在本发明中，通过在正义方向导入核苷酸序列可获得过表达。因而，本发明提供了一种影响植物开花特性的方法，该方法包含引起或允许在植物细胞内从核酸表达一种多肽，该多肽由按照本发明的核酸的核苷酸序列所编码。(见实施例4)。
可通过使用反义技术或“正义调节”获得该基因产物多肽的低表达。使用反义基因或部分基因序列以降调节基因表达现已确定。DNA被置于一种启动子控制下，从而使DNA的“反义”链的转录产生与从目标基因的“正义”链转录的正常mRNA互补的RNA。对于双链DNA，这通过在启动子控制下将编码序列或其片段置于“反向”而实现。一般认为该互补反义RNA序列随后与mRNA结合以形成双螺旋，抑制内源性mRNA从靶基因翻译为蛋白。这是否为作用的真实模式尚未确定。然而，该技术的有效性是确定的。参见，Rothstein等，1987；Smith等，1988；Zhang等，1992。
因此，本发明也提供了一种影响植物的开花特性的方法，该方法包含引起或允许在植物的细胞内从按照本发明的核酸的反义转录。
当目标基因的附加拷贝正义插入，即与目标基因同方向时，产生许多表型，包括其中一些个体发生过表达而另一些发生来自目标基因的蛋白的低表达。当插入基因只是内源性基因的一部分时，在转基因群体中低表达个体的数量增加。有意义的调节，特别是降调节产生的机制尚不很明确。然而，此技术也经常在科学和专利文献中报告并被常规用于基因控制。见，如，Van der Krol，1990；Nopoli等，1990；Zhang等，1992。
因此，本发明也提供了一种影响植物开花特性的方法，该方法包含在植物细胞中引起或允许从按照本发明的核酸的表达。这可用于抑制具有影响开花特性能力的多肽的活性。在此，该多肽活性的受抑制优选作为植物细胞内低表达的结果。
如上所述，CO基因可通过将其与外源启动子融合而使其表达类型改变。例如，帝国化学工业有限公司的国际专利申请WO 93/01294描述了一种分离自玉米谷胱甘胱-S-转移酶，同种型II基因的27KD亚单位(GST-II-27)的化学可诱导基因启动子序列(见图2)。已发现当连接于一个外源基因并通过转化导入植物中时，该GST-II-27启动子提供外部调节该外源基因表达的一种方法。该CO基因的结构区在翻译起始位点的下游融合于GST-II-27启动子，如图2所示。
已显示GST-II-27基因启动子受可施用于生长植物的某些化学物质的诱导。该启动子在单子叶植物和双子叶植物两者中都有功能。因而它可用于控制许多遗传学上改变的植物的基因表达，包括大田作物如Canola，向日葵，烟草，制糖甜菜，棉花；谷类如小麦，大麦，稻，玉米，高粱；水果如番茄，芒果，桃，苹果，梨，草莓，香蕉，和甜瓜；以及蔬菜如胡萝卜，莴苣，甘蓝和洋葱。GST-II-27启动子也适合用于许多组织中，包括根，叶，茎和繁殖组织。
因而，本发明进一步提供了一种包含可操作地连接于本发明提供的核苷酸序列的可诱导启动子的基因构建物，这些核苷酸序列如拟南芥的CO基因，来自其它植物种属的同系物或其任何突变型，衍生物或等位基因。这使基因的表达能够控制。本发明还提供用所述基因构建物转化的植物，以及包含将这种构建物导入植物细胞中和/或通过应用适当的刺激及有效的外源诱导因素而在植物细胞中诱导一种基因构建物的表达的方法。启动子可为GST-II-27基因启动子或任何其它可诱导植物启动子。CO活性的促进作用引起早开花。
降低CO活性的突变引起在诱导性长日照条件下晚开花，表明CO与在长日照下促进开花有关。可能在非诱导性短日照下不需要，因为CO突变在这些条件下对开花无影响。在长日照下CO转录本的丰度很低，只有通过使用PCR扩增cDNA才可被检测到。一些带有含CO的T-DNA的转基因植物在长日照下开花稍早于野生型而在短日照下明显早于野生型的观察资料提示，特别是在非诱导性短日照下，CO转录者的水平限制开花时间。这提示可通过使用外来启动子改变基因的表达而操纵开花。
引起在非诱导性条件下早开花
在非诱导性条件下CO转录本水平的操纵可导致提早的，或受调节的开花。如本文中所公开的启动子融合使在非诱导性条件下以高于在野生型植物中发现的水平表达CO mRNA成为可能。使用CaMV 35S或meri5融合导致早开花而使用GSTII融合导致受调节的开花。
引起在诱导性条件下早开花
在诱导性条件下野生型拟南芥属植物开花特别快而CO基因在开花前表达，虽然是在低水平。尽管如此，一些含有CO的额外拷贝的转基因野生型植物已显示比野生型植物稍早开花。可通过导入启动子，如CaMV 35S或meri 5，融合而增加CO产物水平。可诱导性启动子，如GSTII。可用于调节开花，例如通过首先产生一种特定种属的CO突变型并随后以受调节方式导入能够与突变互补的可诱导性启动子-CO融合。
抑制CO活性以引起晚开花
CO突变型引起拟南芥属的晚开花。在一些植物种属中转基因方法可用于降低CO活性并从而延迟或防止开花。可使用许多策略。
正义或反义RNA的表达
在一些情况中，内源性植物基因的活性已通过来自转基因的同源反义RNA的表达而减低，如上所述。类似地，来自转基因的正义转录本的表达可降低基因的相应内源性拷贝的活性，如上所述。CO反义或正义RNA的表达应降低内源性基因的活性并引起晚开花。
CO蛋白修饰版本(modified version)的表达
转录因子和其它DNA结合蛋白经常带有一个模块结构，其中DNA结合，二聚作用或转录激活所需的氨基酸序列被蛋白的不同区编码(Ptashne和Gnn综述，1990)。这使只表现DNA结合蛋白的一种功能的截短的或融合蛋白的构建成为可能。对于CO来说，基因的体外改变和蛋白改变型的表达可导致内源性完整蛋白的显性抑制并从而延迟开花。这可以多种方式完成，包括下列：
只编码DNA结合区的截短CO蛋白的表达
含有CO区的锌指(zinc-finger)对于允许向DNA结合是必需和足够的。如果只编码DNA结合区的截短或突变蛋白以高于内源性蛋白的水平表达，则大部分CO结合位点将会被突变型占据从而妨碍完全活性的内源性蛋白的结合。突变型蛋白的结合应能具有防止CO作用的效果，因为突变蛋白不包含在生物学过程如转录激活，转染抑制或蛋白-蛋白相互作用中可能涉及的任何其它区。
对含有类似于CO的锌指的鼠转录因子GF1的体外分析，提示具有上述性质的截短CO蛋白可被设计。Martin和Orkin(1990)证实只含有锌指的截短型GF1保持DNA结合活性，但不能转录激活。类似地，含有黄猩猩果蝇PANNIER蛋白的锌指是抑制毛形成所需基因的激活所需要的。在不含锌指的区中的突变引起基因活性的显性超-抑制，可能因为这些蛋白结合DNA但不从野生型蛋白所用的方式与其它蛋白相互作用(Ramain等，1993)。
不编码DNA结合区的突变型CO蛋白的表达
可设计第二种形式的抑制分子，前提是如果CO必须二聚化，或与其它蛋白形成复合物以得到其生物学效应，并且如果这些复合物可以不需要CO结合于DNA形成。在这种情况下，在DNA-结合区内突变但含有野生型蛋白的所有其它性质的CO蛋白的表达将具有抑制性效应。如果突变型蛋白以高于内源性蛋白的浓度存在并且CO正常地形成二聚体，则大多数内源性蛋白将与突变型蛋白形成二聚体而不能结合DNA。类似地，如果CO与其它蛋白形成复合物，则突变形式的CO将参与这些复合物的大多数使它们不能随后结合DNA。
具有这些性质的DNA-结合蛋白的突变形式以前已报导。例如，在酵母中，含GAL4的转录激活区的蛋白的表达能降低CYC1基因的表达。CYC1通常不被GAL4激活，所以推测是GAL4激活区封闭于CYC1激活所需要的蛋白(GILL和Ptashne，1988)。黄猩猩果蝇的PANNIER蛋白的锌指区中的突变具有显性表型，可能是因为突变型蛋白封闭了PANNIER活性所需要的蛋白并降低了它们与野生型蛋白相互作用的有效性(Remain，1993)。
现在将根据附图，以实施例方式阐明本发明实施方案的不同方面。其它方面和实施方案对于本领域技术人员将是显见的。在本文提及的所有文献在此并入作为参考。
在图中：
图1显示按照本发明的一项实施方案的核苷酸序列，为来自拟南芥的CO ORF序列(SEQ ID NO.1)，和预测的氨基酸序列(SEQ IDNO.2)。核苷酸序列显示于氨基酸序列之上。以粗体显示的区被认为包含两个锌指区。
图2显示GST-II-27基因启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)。用干制造融合的片段两侧有显示为粗体的Hind III和Nde I位点。
图3显示包含从拟南芥获得的CO基因的基因组DNA的核苷酸序列，包括单个内显子，启动子序列和存在于转录终止密码子之后的序列(SEQ ID NO.4)。所示该基因组区在翻译起始位点上游2674bp开始，并恰在多腺苷酸化位点后结束。CO开放阅读框以粗体显示，并被该单个内显子中断。
图4显示用作CaMV 35S启动子来源的PJIT62质粒。显示为深色粗线的KpnI-HindIII片段被用作该启动子的来源。
图5显示按照本发明的另一实施方案的核苷酸序列，为从蔓菁获得的CO ORF(SEQ ID NO.5)，和预测的氨基酸序列(SEQ IDNO.6)。
图6显示按照本发明的另一实施方案的核苷酸序列，为从蔓菁获得的第二CO ORF(SEQ ID NO.7)，和预测的氨基酸序列(SEQ IDNO.8)。
实施例1-CO基因的克隆和分析考斯质粒和RFLP标记
DNA和λCHS2获自R.Feinbaum(麻省总医院(MGH)，波士顿)。总DNA作为放射标记的探针被用于YAC文库菌落滤过物和植物基因组DNA印迹。考斯质粒g6833，17085，17861，19027，16431，14534，g5962和g4568得自Brain Hauge(MGH，波士顿)，在30μg/ml卡那霉素存在下培养，并作为甘油贮存种维持于-70℃。总考斯质粒DNA被作为放射标记的探针用于YAC文库菌落滤过物和植物基因组DNA印迹。考斯质粒pCIT 1243由Elliot Meyerowitz(Caltech，Pasadena)提供，在100μg/ml链霉素/壮观霉素存在下培养并作为甘油贮存种维持于-70℃。PCIT30载体序列与PYAC4衍生的载体有同源性，因而YAC文库菌落滤过物与从考斯质粒提取的插入DNA杂交。PCIT1243的总DNA被用作植物基因组DNA印迹的放射标记的探针。YAC文库
EG，abi和S文库得自Chris Somerville(密西根州立大学)。EW文库得自Jeff Dangl(Max Delbruck实验室，Cologne)并且Yup文库得自Joe Ecker(宾夕法尼亚大学)。该文库的原版拷贝贮存于-70℃(详细描述见Schmidt等，澳大利亚植物生理学杂志(Aust.J.PlanlPhysiol)19：341-351(1992))。工作贮存液在4℃维持于选择性kiwlbfew琼脂上。kiwibrew是一种选择性，完全性最低培养基减去尿嘧啶，并含有11％酪蛋白氨基酸。这些文库的工作贮存液每3个月使用96-尖-复制仪复制。酵母菌落滤膜
含有来自8-24个文库板的大量酵母菌落DNA的Hybond-N(Amersham)滤膜(8cm×11cm)被生产和加工(如Coulson等，自然335：184-186(1988)所述并改良(如Schimidt和Dean基因组分析，Vol.4：71-98(1992)所述)。杂交和洗涤条件按照制造商的指示。放射标记的探针DNA通过随机六聚体标记制备。通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)的酵母染色体制备和分级
用单个酵母菌落接种5微升Kiwibfew并在30℃培养24小时。通过在室温用2.5mg/ml Novozym(Novo Biolabs)温育1小时产生酵母原生质球形体，然后加至1M的山梨醇使原生质球形体的终浓度为50μl。向原生质球形体加入80微升1M山梨醇中的融化LMP琼脂糖(1％Incert琼脂糖，FMC)，将该混合物短时间旋动并用吸管处理为栓形，将这种栓置于1.5ml Eppeudrof管中在50℃在1ml 100mM EDTA中的1mg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim)，pH8，1％Sarkosyl中温育4小时。置换溶液并将此栓温育过夜。将此栓用TE洗涤3次，每次30分钟，并用0.5×TVBE洗涤2次，每次30分钟。使用Pulsaphor系统(LKB)进行PFGE。将1个栓的1/3装载在1％琼脂糖凝胶上并在4℃在0.5×TBE电泳，以170V，20秒脉冲时间，达6小时。DNA标记为λDNA的多连体，按照Bancroft和Wolk，核酸研究，16：7405-7418(1988)的描述制备。DNA通过用溴化乙锭染色而可视。用于限制性酶消化和反向多聚酶链反应(IPCR)的酵母基因组DNA
除酵母原生质球形体按如上所述制备外，酵母基因组DNA基本按照Heard等所述(1989)制备。最后，DNA用苯酚/氯仿提取两次，用氯仿提取一次并用乙醇沉淀。从5ml培养物的产量为约10μg DNA。通过IPCR分离YAC末端片段
酵母基因组DNA(100ng)用AluI，HaeIII，EcoRV或HincII消化。消化物用苯酚-氯仿提取1次并随后用乙醇沉淀。DNA片段通过在2U连接酶(BRL)存在下在16℃在100μl容积中连接而环化。连接混合物在65℃温育10分钟后，使用反向引物对对10μl连接混合物进行IPCR。IPCR条件和C和D引物对已由Schimidt等人描述(1992)。JP系列得自M.Hirst(IMM分子遗传学研究组，牛津)。
在用所指定的酶消化后，下列引物对被使用：
对于左一末端IPCR：
AluI，EcoRV；D71 5′tcctgctcgcttcgctactt 3′
和C78 5′gcgatgctgtcggaatggac 3′
HaeIII；JP1 5′aagytactctcggtagccaag 3′
和JP5 5′gtgtggtcgccatgatcgcg 3′
对于右一末端IPCR：
AluI，HincII；C69 5′ctgggaagtgaatggagacata 3′
和C70 5′aggagtcgcataagggagag 3′
HaeIII；C69和JP4 5′ttcaagctctacgccgga 3′
IPCR反应的等分试样通过在1.5％琼脂糖凝胶上的电泳检查并将反应的1μl通过PCR再扩增，使用I.Hwang(MGH，波士顿)建议的条件和引物系列。再扩增的条件与IPCR相同，只是使用30个周期(1分钟，94℃；1分钟，45℃；和3分钟，72℃)。F引物在非常接近克隆位点处退火并从而降低存在于PCR产物中的载体序列总量。另外在非常接近EW和S YACs的被破坏克隆位点处，它们导入了一个FokI位点。
用于左末端IRCR产物的再扩增的引物如下：
对于EG，abi和S YACs
AluI，F2 5′acgtcggatgctcactatagggatc 3′
和C77 5′gtgataaactaccgcattaaagc 3′；
HaeIII，F2和JP5；EcoRV，F2和78。
对于EW和Yup YACs：AluI，
F6 5′acgtcggatgactttaatttattcacta 3′
和C77；HaeIII，F6和JP5；EcoRV，F6和C78。
下列引物用于右末端IRCR产物的再扩增：
对于EG，abi和S YACs：AluI，
F3 5′gacgtggatgctcactaaagggatc 3′
和C71 5′agagccttcaacccagtcag 3′；HaeIII，F3
和JP4；HincII，F3和C70。
对于EW和YUP YACs：AluI，
F7 5′acgtcggatgccgatctcaagatta 3′
和C77；HaeIII，F7和JP4；4HincII，F7和C70。
所产生的PCR产物通过使用最初与BamHI C EG和abi YACs或EcoRI(YUP YACs)一起用于消化的酶剪切而提纯并在1％LMP琼脂糖凝胶上分离。YAC末端探针使用随机引物(random priming)在融化的琼脂糖中被放射标记，并在适当情况下用FokI消化以去除载体序列并随后用作杂交探针。通过质粒援救(plasmid rescue)的YAC左末端探针分离
YAC左一末端片段从EG，abi和EW YACS的质粒援救按照Schmidt等(1992)所描述进行。植物基团组DNA的分离
植物基因组DNA基本按照Tai和Tanksley，植物分子生物学报告(plant Mol.Biol.Rep.)8：297-303(1991)所述从暖房培养植物分离，区别在于组织是在液氮中磨碎并且省略了RNA酶步骤。使用这种方法进行大规模(2.5-5g树叶)和微量制备(3-4片树叶)DNA的制备。凝胶印迹和杂交条件
向Hybond-N的凝胶转移，杂交和洗涤条件按照制造商的指示，只是DNA通过UV stratalinker处理(1200μJ×100；Stratagene)固定于滤膜上和/或在80℃烘烤2小时。放射标记的DNA通过随机六聚体标记而制备。RFLP分析
2至3微克的植物基因组DNA从用于杂交中的亲本植物制备并在300μl容积中使用17种限制性酶的一种进行剪切：这17种酶为DraI，BclI，CfoI，EcoRI，EcoRV，HincII，BglIII，RsaI，BamHI，HindIII，SacI，AluI，Hinfl，Sau3A，TaqI和MboI。被消化的DNA用乙醇沉淀并在0.7％琼脂糖凝胶上分离和印迹至Hybond-N滤膜上。放射标记的考斯质粒λ或YAC末端探针DNA与滤膜杂交以确定RFLPs。在CO的附近携带重组事件的植物的选择
选择重组体的第一步是产生携带CO突变并与标记密切相连的品系。为不同的侧翼标记将此步骤进行两次。在第一个实验中制造了携带CO-2等位基因(Koornneef等，1991)和tt4的Landsberg erecta系。tt4突变防止花青苷产生并已被提出是编码苯丙烯酰苯合酶的基因中的一种损伤。因为它被绘制于类似的位置(Chang等，1988)。将此双突变型与Niederzenz生态型的个体杂交并将产生的杂种自受精以产生F2群体。随后对此群体进行表型筛选以寻找重组发生于CO-2和tt4之间的个体。另外，两种突变的F2植物纯合体被用于确定标记RFLP g4568相对于CO-2的位置。
第二项实验通过使用两种标记的品系作为亲本进行。其第一种在landsberg erecta背景中含有ChpT并来自于Maarten Kooynneef(Wageningen)，它来自未确定背景的品系(得自George Redei)对Landsberg erecta的杂交。第二亲本含有标记lu和alb2。这通过MaartenKoorneef从带有alb2突变(M4-6-18；Relichova 1976)的S96背景的植物对含有CO-1和lu的品系(得自Koornneef，来自J.Relichova，但最初来自Cr.Redei)的杂交而选择。然后将chp 7，CO-1系与lu，alb2系杂交并通过杂种的自受精作用而产生F2代群体。该群体值被用于分离lu和CO-1间和CO-1和alb2间的交换体。两组重组体均作为lu纯合体被表型识别。这些只在重组发生于lu和alb2间时存在，因为alb2在纯合时是致死的。CO(FG)位点的分离
CO基因位于染色体5的上臂并在tt4近侧2CM。在拟南芥属中1CM的平均物理化离约为140kb。因此可估计从CHS到CO的距离大约为300kb。
我们从将4个与CHS紧密连接的(在约2cm之内)RFLP标记与EG和EW YAC文库杂交开始。这产生18种杂交YACs，它们在脉冲场凝胶上流出，Southern印迹并与适当的RFLP克隆杂交。这证实了菌落杂交结果并测定了YACs的大小。它们的大小范围为50kb至240kb。将YACs随后用限制性酶消化，与RFLP标记DNA杂交并将片段的类型与标记的作比较。这使我们能够确定是否它们含有所有RFLP标记中的片段或只含有其中一些并使我们能够推断YACs相互之间的位置。这种排列在大多数情况下随后通过反向多聚酶链反应(PCR)产生的片段的分离和将它们与适当的重叠YACs杂交而证实，这些片段位于插入YAC中的拟南芥属DNA的末端。
围绕RFLP标记的短contigs随后被延伸。我们从这一区获得了两套重叠考斯质粒克隆并将适当的那些用于YAC文库。这鉴定了两种新YACs。我们已鉴定的来自20YACs中大多数的末端探针随后被用于筛选文库并且鉴定了在两个方向延伸被克隆区的新的YACs。总共需要67个YACs的详细分析。这使我们能够装配包括RFLP标记6833，CHS，pCIT 1243和5962并约为1700kb长的拟南芥属DNA的一个邻近节段。
在含有与CO非常紧密相连接的交换的重组体分离后，通过详细的RFLP分析确定CO在contig中的位置。该重组体通过使用侧翼表型标记鉴定。首先我们制造一个用CO和tt4标记的Laulsberg erecta染色体。然后我们将它与Niedersenz杂交并筛查1200 F2植物得到携带CO和tt4间的交换的重组体染色体。以这种方法我们发现了12个通过后代的表型评分被证实的重组体。这些重组体的罕见证实了tt4和CO间的极度紧密连接。这些重组体随后被用于确定CO在Contig上的位置。例如，它们中的一些在交换的tt4侧含有Landsberg DNA并在CO侧含NiedersenzDNA。通过使用小片段作为RFLP标记并将它们与从重组体提取的DNA杂交，在我们的工作中分离的DNA被定位于相对于CO的位置。通过筛查CO和alb2间的重组体，我们在近侧使用相似的方法。这项工作初步将CO定位在相互分开约300kb的两个YAC末端探针间。
为更精确切确定CO在300kb中的位置，筛查CO和侧翼表型标记间的更多交换。使用如前所述的类似基本原理，鉴定了CO和Alb2(在CO近侧间隔1.6cm)间总共46个交换，和CO和lu(在CO远侧间隔5.3cm)间的135个交换并用来自我们的contig的适当的RFLP标记进行分析。这将该基因定位于由两个YAC末端探针确定的非常短的区。这些被用于筛查明尼苏达大学向我们提供的一个考斯质粒文库，并构建了一个跨整个区的包含3个考斯质粒的短考斯质粒contig。对这些质粒的分析表明详细的RFLP制图已将CO定位于一个约38kb长的区。
为确定该基因在考斯质粒中的位置，将它们的每一种导入CO突变型中并检测产生的植物以确定那一种考斯质粒改正了CO突变型表型。对CO-2和tt4突变纯合的植物的根与含有每一种考斯质粒的土壤杆菌属株系共培养(Olszewski和Ausubel，1988；Valvekens等，1989)并再产生卡那霉素抵抗植物。再生体(T1代)自受精并将它们的后代播种在含卡那霉素的培养基上以证实它们含T-DNA(表1)。
共有含有考斯质粒A的5种独立的转化体，9种含考斯质粒B的和13种含考斯质粒C的产生卡那霉素抵抗T2后代并被进一步研究。在长日照暧房中测定来自这些T2家族的每一种的20-40株植物的开花时间。所有用考斯质粒A制造的转基因植物的后代开花与CO-2突变型一样晚，提示此考斯质粒不含CO基因。然而，来自含考斯质粒B和C的植物的数个家族包含早开花个体。总共，来自含有考斯质粒B的植物的9个家族中的6个和来自携带考斯质粒C的13个家族中12个含有开花与野生型一样早的植物。所有这些早开花个体产生浅颜色的种子，表明它们携带存在于用于转化的系中的tt4突变，并因而不简单地是实验被野生型植物的种子污染的结果(实验方法)。这些结果强烈提示CO基因包含在考斯质粒B和C两者中。
进一步的实验在T3代中进行以证实互补作用结果。总共5种来自考斯质粒B的T2早开花植物和6种来自考斯质粒C的被自受精并进一步在T3代中被研究。此分析选用的每一种T2植物来自不同的转化体，为T2家族中的最早开花植物并且为显示了卡那霉素抵抗幼苗比1卡那霉素敏感的一些家族，因而可能只在一个位点含有转基因(表1)。在这些T3家族中的所有幼苗对卡那霉素抵抗，证明亲本T2植物对T-DNA是纯合体。这证明最早开花的T2植物对CO转基因是纯合的。
在所使用的长日照条件下，CO-2突变型植物开花明显晚于野生型对照(表1)。T3植物在给定的长日照条件下开花至少与野生型一样早，并且一些个体开花早于野生型(表1)。这一分析证实考斯质粒B和C可纠正CO-2突变对长日照下开花时间的效应，提示这两种考斯质粒都包含CO，并且因而该基因位于它们的重叠区中。这一区为6.5kb长。
我们确定了考斯质粒B和C共有的6.5kb的序列。它只含有一个我们可从DNA序列鉴定的基因。多聚酶链反应被用于从3个独立分离的CO突变型扩增此基因，并且，这些基因的序列测定证实所有这3种都含有突变。这与互补分析一起，是此基因为CO基因的结论性证据。CO的推测氨基酸序列与以前报告的基因显示无同源性。然而，氨基末端含有两个被推测形成锌指的区，提示此蛋白产物与DNA结合并可能是一种转录因子。在由REG17B5和LEW4A9限定的300kb区中鉴定CO中的意外困难1.通过更详细的RFLP制图和互补定位基因
如前所述，Patterill等分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)239：145-157(1993)描述了将CO定位在300kb的区中。为更确切地通过RFLP制图定位CO，需要两项物质：更多的在300kb区内携带交换的重组体，和更多的用作针对这些重组体的探针的RFLP标记。
lu和CO间或co和Alb2间的重组体被选择。总共鉴定了lu和co间1.6cM中的68个交换，和co和alb2间5.3cM中的128个。这相当于6.8cM中196个交换，或平均每cM29个交换。在这些重组体中，在此300kb内的交换意外地低体现：300kb相当于约1.5cm，所以在此区中预期应有43(2.9×1.5)个交换。但只发现了23个。
这些交换的分析也困难，因为没有一个落在此300kb内的YAC末端探针可被用作RFLP探针。这是因为它们之中没有一个在用于制造重组体的亲本间检测RFLPs。一个RFLP标记可在此区内使用，并且当它被用于分析重组体时，被发现是在REG17B5和CO之间，从而将该基因定位于pCIT1243和LEW4A9之间。然而，该基因的更确切位置不能通过此方法获得，因为缺乏适合的探针。
在pCIT1243和LEW4A9间的交换的分布是不对称的：在pCIT1243和CO间有1个而在CO和LEW4A9间有19个。我们猜测该基因可能与pCIT1243接近。因此使用来自此区的一个探针池(LEG4C9，Labi19E1，pCIT1243，LEG21H11和REG4C9)来筛选一个考斯质粒文库以提供从pCIT1243向LEW4A9延伸的一系列考斯质粒克隆。用单个探针对这些克隆的分析显示三种考斯质粒A，B和C在需要的方向从pCIT1243延伸。这些随后被用作RFLP标记并且证实该基因位于这些考斯质粒上。
该步骤因此比Putterill等的文章中设想的更复杂，是因为在300kb区内制造足够的重组体和鉴定适当的RFLP标记中的困难。2.通过互补鉴定基因
这3种考斯质粒A，B和C被导入突变型植物，并且显示B和C可纠正突变的效应。因此该基因肯定位于B和C共有的DNA上，但在Putterill文章中提出的CO基因的最终鉴定方法失败了。曾假想CO转录本的鉴定可通过使用互补DNA作为针对Northern印迹的探针，或者7个等位基因之一可在Southein印迹上显示能引导至该基因的重排。但事实上，我们不能在Northern印迹上检测CO转录本，也无任何重排表明基因可能在哪里。
这种方法的失败使我们把与突变互补的基因组DNA按顺序排好。地这种DNA的计算机分析确定了两个互相邻近的开放阅读框，我们推测这些可能代表CO基因。我们还没有这些开放阅读框(ORF)被活跃地转录的证据，如人们对一个基因所期待的，因为在Northern印迹上未检测到转录本并且在几个cDNA文库中未检测到cDNA。因此我们使用多聚酶链反应(PCR)以从RNA标本扩增cDNA。这显示这两种ORFs确实代表一种活性基因。对CO等位基因进行序列分析随后证实它们含有单个碱基改变，或在一种情况下含有一个9bp缺失，通过Putterill等人的文章中提出的方法是不可能检测到的。基因结构
为确定该基因结构，使用RT-PCR鉴定CO基因的cDNA(实验步骤)。该cDNA的序列含有1122bp ORF，该ORF通过去除233bp内含子从在基因组序列中鉴定的两种ORFs得到。此开放阅读框的翻译预期可形成分子量为42kd，含373个氨基酸的蛋白。转录开始位点未被确定，但一个框内翻译终止密码子位于ATG上游三个密码子，表明整个被翻译区已得到确定。通过3′-RACE产生的四个片段的序列测定，转录本的3′末端被定位。它们均在相互之间5个碱基之内的不同位置含有多聚-A尾部。
搜寻可得到的数据库以寻找与CO基因的推测翻译产物享有同源性的蛋白。对PROSITE目录的搜寻未检测到CO蛋白内的基序。而且，将CO蛋白序列与GenBank中的蛋白序列相比较的FASTA搜寻未检测到显著同源性。将co序列与LUMINIDENS，即从拟南芥属克隆的另一种开花时间基因(Lee等，1994)，的序列的直接比较未检测到同源性。然而，用眼对蛋白序列的分析确定了一个引人注目的半胱氨酸残基的排列，它存在于接近CO蛋白的氨基末端的两个区中。这些区中每一个含有以C-X2-C-X16-C-X2-C方式排列的4个半胱氨酸，这类似于GATA-1转录因子的锌指区(C-X2-C-X17-C-X2-C)。
比较在预期的CO蛋白序列中直接互相邻近并且每1个各自含有一个推定的锌指的2个43氨基酸连续部分，显示显著的同源性：氨基酸的46％相同而且86％为相同或相关。该保守性在每个突指的羧基侧最明显，这又使人想起GATA1转录因子，在该因子中此区是DNA结合所需要的一个基本区并且是高度保守的(Trainor等，1990；Brendel和Karlin，1989；Ramain等，1993)。在CO蛋白中此区还带正电荷：在邻近氨基突指的区中带有6个净正电荷并且在邻近羟基指突的区中带有3个。
使用Wisconsin套件的FASTA程序将CO锌指的CO蛋白序列与含有hGATAI的锌指并且在GATAI家族的成员中保守的116氨基酸作比较(见Ramain等，1993)，鉴定了一个跨过CO的两个锌指并排列好hGATAI的锌指和CO的锌指的半胱氨酸的同源81氨基酸区。在CO和hGATAI的这些区之间，21％的氨基酸是一致的并且65％是相似或一致的。因此虽然CO不是GATAI家族的一员，它在锌指区显示对它们的相似性，并代表了含锌指蛋白的新的一族。
这些区对CO活性的重要性的另一个指征是在CO-1和CO-2等位基因两者中的突变影响在推测的锌指区之间保守的残基：CO-2改变N-末端突指的羧基侧的一个精氨酸为组氨酸，而CO-1缺失去除了C-末端突指的羧基侧的3个氨基酸。在长和短日照生长植物中CO mRNA的表达
通过筛查数个拟南芥属cDNA文库未发现CO cDNA克隆，而且在从3-4叶阶段的幼苗提取的多聚A mRNA的Northern印迹上未检测到该mRNA(资料未显示)。因此使用RT-PCR继以Southern印迹和对CO特异性探针的杂交以检测CO转录本。这些实验中使用的RNA分离自3-4叶阶段的幼苗，因为这正处于在长日照下花芽可见之前并因此看来可能是基因将要表达的时间。
从在长日照下生长的植物制造的六个独立的RNA标本均产生了COcDNA预期大小的杂交片段。在野生型或CO-1突变型植物之间未测到CO转录本含量的不同，提示CO基因的活性不是促进其自身转录所需要的。在长日照下开花时间受CO基因剂量影响
对野生型等位基因和CO-1或CO-2杂合的植物在长日照下在介于CO纯合体和Landsberg erecta之间的时间开花(Kooineef等，1991；F.Robson，未发表)。对这些突变型等位基因的序列测定证实它们均含有氨基酸序列的框内改变。这可能提示CO的不完全显性的两种模型。突变型等位基因可能产生阻碍成花诱导的产物，或者突变可能在杂合体中引起功能丧失功CO蛋白水平的两倍下降导致开花时间的延迟(单倍体不足(haplo-insufficiency))。本文所包括的结果倾向于单倍体不足的解释。
在互补实验中，含有两拷贝考斯质粒B或C并且对CO-2等位基因纯合的转基因植物在长日照下常在与野生型植物相同的时间开花。如果突变型等位基因编码一种阻碍野生型蛋白活性的产物，则预期这不应发生。而且，需要使用RT-PCR检测CO转录本这一点提示它以非常低的水平存在，这与转录本水平的进一步降低引起晚开花的可能性是一致的。
CO剂量的增加可导致在长日照下开花稍稍提前。这是从一些携带CO基因的额外拷贝的转基因系开花稍早于野生型植物的观察结果总结出的(表1和表2)。这种观察结果，与上面讨论的单倍体不足表型一起，提示CO的表达水平是长日照下拟南芥属开花时间的关键决定因子。方法生长条件和开花时间的测定
开花条件通过在20℃在Sanyo Gelleukamp控制的环境室中培养植物在限定条件下测定。短日照包含10小时的光照射，使用400瓦金属卤化物能量之星灯补充以100瓦卤化钨灯照亮。这提供了113.7μmol光子/m2 S的有效光合照射水平和2.41的红：远红外线比例。类似的保温室和灯被用于长日照。光照射期是在短日照时使用的相同条件下10小时并单使用卤化钨灯再延长8小时。在此保温室中，用于10小时阶段的灯的组合提供92.9μ mol光子/m2 S的PAR和1.49的红：远红外线比例。8小时延长产生14.27μmol光子/m2 S的PAR和0.66的红：远红外线比例。
大群体植物的开花时间在暖房中测定。在夏季只简单地在阳光下培养植物。在冬季提供补充光照以使最短日长度为16小时。
为测定开花时间，将种子在4℃在湿滤纸上放置4天以打破休眠并随后种在土壤上。发芽的幼苗在前1-2周通常用粘性薄膜或繁殖密封盖封闭以防止脱水。开花时间通过在花蕾可见时计数瓣形体中包括子叶在内的叶数而测定。叶数以95％可信限处的标准误显示。也记录了从播种至花芽出现的天数，但未显示。以前已证实对于Landsbrg erecta和CO等位基因在叶数和开花时间之间存在密切关联(Koorneef等，1991)。植物材料
使用的标准野生型表型为拟南芥Landsberg erecta。CO-1突变由Redei分离(1962)并且是在ERECTA背景中，在我们的实验中显示与Landsberg erecta无可检测的RFLPs或序列变异。CO-2等位基因从Landsberg erecta中分离(Koornneef等，1991)。CO的精确RFLP制图使用的系的详情已在以前被描述(Putterill等，1993)。
在所有被描述的情况下，携带CO-2的系也携带tt4，虽然为了不使文中的表型描述过于复杂这一点未被提起。tt4突变是在苯丙烯酰苯合酶基因中并且防止种皮中的花青苷积蓄，但不影响开花时间(Koornneef等，1983)。该突变位于染色体5上，离CO约3.3cM(Putterill等，1993)。CO-2 tt4系的使用在证实个体植物确定携带CO-2突变中有用途。RNA提取
RNA使用Stiekma等(1988)所述方法的改良版方法提取。在液氮中冷冻的约5g组织在咖啡豆磨具中磨碎并用15ml苯酚和15ml提取缓冲液(50mM Tris pH8，1mM EDTA，1％SDS)的混合物提取。该混合物被振荡，离心并回收25ml水层。然后将它与0.7ml 4M氯化钠，10ml苯酚和10ml氯仿的混合物剧烈摇动。在离心后回收水层并用25ml氯仿提取。随后通过加入2ml 10M的LiCL从25ml水层中沉淀RNA，并通过离心回收沉淀物。将沉淀物溶于2ml DEPC水中并通过加入0.2ml 4M氯化钠和4ml乙醇沉淀RNA。离心后将沉淀物溶于0.5mlDEPC水中并测定RNA浓度。DNA提取
拟南芥属DNA通过Dean等(1992)描述的GAB提取方法进行。通过RT-PCR的cDNA分离
总RNA从暖房中长日照下生长的2-3叶阶段整株幼苗分离。对第一条链cDNA合成，将10μl容积中的10μg RNA加热至65℃3分钟，然后快速在冰上冷却。制造10μl反应混合物，包含1μl RNAsin，1μl标准dT17-转换器引物(1μl/μl，Frohman等，1988)，4μl 5×逆转录酶缓冲液(250mM Tris Hcl pH8.3，375mM KCl，15mMMgCl2)，2μl GTT(100mM)，1μl dNTP(20mM)，1μl逆转录酶(200单位，M-MLV Gibco)。此反应混合物随后被加至RNA中，产生20μl的终容积。该混合物在42℃温育2小时并随后用水稀释至200μl。
将10μl稀释的第一条链合成反应物加至90μl PCR混合物中，此混合物含4μl 2.5mM dNTP，10μl 10×PCR缓冲液(Boehringcrplus Mg)，1μl每种引物的100ng/μl溶液，73.7μl水和0.3μl 5单位/μl Taq多聚酶(Boehringer or Cetus Amplitaq)。使用的引物为CO49(5′GCTCCCACACCATCAAACTTACTAC 5′末端位于CO翻译起始点上游38bp)和CO50(5′CTCCTCGGCTTCGATTTCTC 5′末端位于CO的翻译终止密码子上游57bp)。反应在94℃进行1分钟，进行34次在55℃1分钟在72℃2分钟的循环并最后在72℃10分钟。
将20μl反应物通过琼脂糖凝胶分离，并且通过用溴化乙锭染色证实存在期望大小的片段。将DNA转至滤膜，并且目标片段显示与来自CO基因的短DNA片段杂交。PCR反应的剩余物被加载至另一凝胶上，提取被扩增的片段，用T4 DNA多聚酶处理并连接至用EcoRV剪切的蓝本(Bluscript)载体(Stratagene)。该PCR反应以双份进行，并将两份独立扩增的cDNA测序以保证检出任何PCR引起的错误。通过3′RACE的cDNA片段分离
第1条链cDNA合成使用如上所述与RT-PCR相同条件，RNA标本和dT17-转移器进行。该PCR随后使用标准转移器引物(5′gactcgagtcgacatcg；Frohman等，1988)和上述CO49引物进行。PCR条件除扩增循环前加上在72℃40分钟的延伸外与上述相同。将20μl反应物通过琼脂糖凝胶分离，并检测到少量长度在550bp和1.6kb之间的片段。反应物的剩余部分被加至类似的凝胶上，切下预测含有1-2kb片段的区，提取DNA并进行第二轮使用转换器引物和另一CO特异性引物(CO28，5′tgcagattctgcctacttacttgtgc，5′末端位于CO的翻译开始位点下游94bp)的PCR。当在琼脂糖凝胶上监测此PCR时，检测到约为1.3kb预期大小的片段。此片段从凝胶上被提取，用T4 DNA多聚酶处理并连接至用EcoRV剪切的蓝本DNA。从这两种独立的扩增回收的四个被扩增片段进行完整的序列测定。所有四个片段都在稍微不同的位置被多腺苷酸化，如文中所述。通过RT-PCR检测CO转录本
除了RNA是从生长于受控制环境室的植物在不同阶段分离外，第一条链合成完全按照上述用于分离cDNA克隆的方法进行。所有样本都以双份收获和分析。
用于扩增CO cDNA的引物在文中和以前在实验方法中描述。用于扩增用作对照的基因的cDNA的引物为CO1(5′TGATTCTGCCTACTTFTFCTC)和CO2(5′GCTTGGTTTGCCTCTTCATC)。DNA序列测定
使用Sanger方法以测定插入蓝本质粒载体中的被研究片段的序列。反应使用序列测定酶试剂盒进行(美国生物化学公司)。分离含有7个CO等位基因中的每一个的克隆
DNA从对于每一种等位基因纯合的植物提取。约1ng基因组DNA用水稀释至10μl并被加至90μl反应混合物，如上所述，只是使用引物1041(5′ggtcccaacgaagaagtgc 5′末端位于CO的翻译起始密码子上游263bp)和CO42(5′cagggaggcgtgaaagtgt5′末端位于CO的翻译终止密码子下游334bp)。PCR条件为：94℃3分钟，继以34次94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟的循环，最后是72℃10分钟。在每种情况中，这产生了预期大小1.95kb的一种主要片段。对每一等位基因，该PCR以双份进行。在每一种情况，该反应物都用苯酚和氯仿提取，乙醇沉淀并用T4 DNA多聚酶处理。反应物随后通过琼脂糖凝胶分离，片段被纯化并连接于sk+用EcoRV剪切的蓝本。连接物被导入E.coli DH5 atpha并将重组体质粒用菌落PCR筛选以寻找携带期望大小的插入者。来自每种等位基因的两种独立扩增的片段的DNA序列被测定。筛选噬菌体和考斯质粒文库
考斯质粒文库的溶菌产物(Olszewski和Ausubel，1988)被用于E.coli DH5 alpha，并用本中描述的探针筛选2万菌落。筛选3个cDNA文库以试图鉴定CO cDNA。筛选的噬菌斑数目为，5×105来自“气生部分(aerial parts)”文库(由EC拟南芥属贮存种中心(ArabidopsisStock Center)，MPI，Cologne提供)，3×55个噬菌斑是从生长于灭菌烧杯中的植物制造的文库(由Dr A.Bachmair制造并由EC拟南芥属贮存种中心提供)，以及1×106噬菌斑来自CD4-71-PRL2文库(由俄亥俄州立大学拟南芥属生物资源中心(Arabidopsis BiologicalResource Center)提供)。拟南芥属的转化
含有来自CO的邻近的DNA的考斯质粒被移动入根瘤杆菌属C58C1中，并且T-DNA按照Valvekens等，1988所述导入拟南芥属植物中。体外培养的植物的根被分离并在愈伤组织诱导培养基(ValVekens等，1988)上培养2天。随后根被切为短片段并与携带所研究质粒的根瘤杆菌属共培养。将根外植体在印迹纸上干燥并置于愈伤组织诱导培养基上2-3天。洗去土壤杆菌，根被干燥并置于抽枝诱导培养基上(Valvekens等，1988)，此培养基含有万古霉素以杀死土壤杆菌和卡那霉素以选择转化的植物细胞。在约6周后，根上的绿愈伤组织开始产生抽枝。将它们移去并置于含发生培养基(Valvekens等，988)的皮特里盘或品红罐中。这些植物在品红罐中产生种子。它们随后被播种于含卡那霉素的发生培养基上以鉴定含有转基因的被转化幼苗(Valvekens等，1988)。实施例2-融合于CO开放阅读框的启动子的构建：
将含有整个CO基因的PvuII-EcoRV片段插入蓝本TM质粒的独特EcoRV位点。CO基因片段以特定方向插入以使EcoRV位点限定的末端邻近于蓝本TM多连接体(polylinker)中的HindIII位点。该质粒被称为PCOl。插入PCO1的PvuII-EcoRV片段含有两个HindIII位点，二者都是CO蛋白翻译开始点的5′。PCO1经HindIII剪切产生一个含有从翻译起始位点上游63bp至多腺苷酸化位点下游的PvuII位点的整个CO开放阅读框的片段，以及来自通过多连接体内对HindIII位点的连接事件产生的PvuII/EcoRV接点的所有蓝本载体。以适当方向将含有片段的启动子与此片段连接产生了该启动子对CO开放阅读框的融合。例如，许多启动子可在此位置被插入，如下所述。一种GSTII启动子对CO开放阅读框的融合
GSTII含启动子片段作为一个HindIII-NdeI片段来自质粒pGIE7(由Zeneca提供)，其序列显示于图2中。将一个寡核苷酸转化器(5′TACAAGCTTG)在NdeI位点插入以转化其为HindIII位点。所产生的质粒随后用HindIII剪切，并将含启动子的片段连接于含有CO开放阅读框的HindIII片段。按照适当方向含有GSTII启动子以使转录向着CO开放阅读框方向发生的一种重组质粒通过PstI消化被鉴定。该GSTII-CO融合体随后被移入Jones等(1992)描述的二元载体，作为一种ClaI-XbaI片段。
该二元载体可被导入土壤杆菌株系并用于向双子叶种属导入该融合体，或者可通过裸DNA转化步骤将该融合体导入单子叶种属。转化的程序对于许多种属已建立，如以前所述。
通过施用一种外源性诱导物如除草剂防护剂dichloramid和flurazole，GSTII启动子可用于诱导CO基因的表达，如WO 93/01294(帝国化学工业有限公司)中所述。一种热休克启动子对CO开放阅读框的融合
另一种诱导系体采用已被很好地进行特征描绘的大豆热休克启动子，Gmhsp 17.3B，它通过许多植物种属中暴露于高温引起的表达诱导(Balcells等讨论，1994)。该启动子可作为一种440bp Xba-XhoI片段得到(Balcells等，1994)，它在用T4 DNA多聚酶处理后可插入用HindIII剪切的pCO1，如上关于GSTII融合体所述。所产生的融合体可随后被导入二元载体，土壤杆菌属和转基因植物，如前所述。CO表达可通过将植物暴露大约40℃的温度而诱导。对含有四环素抵抗基因操纵基因的改良CaMV 35S启动子的CO基因的融合
含有来自细菌四环素抵抗基因的3个操纵基因的改良CaMV 35S启动子已被发展为一种化学可诱导系统。在四环素基因阻遏蛋白存在下此启动子是无活性的，但这种抑制作用可通过向植物提供四环素克隆(Gatz等，1992)。这是可融合于CO开放阅读框的另一种化学可诱导启动子。此启动子可以作为SmaI-XbaI片段获得(Gatz等，1992)，它在用T4 DNA多聚酶处理后可插入用HindIII剪切的pCO1，如前所述。在向也含有阻遏蛋白基因的植物中导入此融合体后，可通过向植物提供四环素诱导CO表达。一种CaMV 35S启动子对CO开放阅读框的融合
CaMV 35S启动子从质粒pJIT62分离(其物理图显示于图4)。通过连接于用HindIII和KpnI剪切的质粒pCO1，含有CaMV 35S启动子的KpnI-HindIII片段被融合于CO开放阅读框。然后通过插入转换器寡核苷酸(5′TATCGATAGTAC)将单KpnI位点转变为ClaI位点，并随后将含有融合于CO ORF的启动子的ClaI-BamHI片段插入一个二元载体中。通过使用根瘤杆菌属或作为裸DNA，该融合体可被导入转基因植物中。如前所述。meri 5启动子对CO开放阅读框的融合
meri 5启动子可作为2.4kb BglII StuI片段获得(Medford等，1991)。它可用T4 DNA多聚酶处理并插入pCO1的HindIII位点，如上所述。该融合体可随后被导入转基因植物，如上所述。实施例3-携带CO的额外拷贝的植物在短日照下的开花时间
在短日照条件下，野生型植物和CO-2纯合体两者在近似相同的时间开花(表1)，提示CO产物不是在这些条件下开花需要的。然而在短日照下，携带来自考斯质粒B和C的T-DNA的CO-2 tt4家族中的数种开花早于亲本CO-2系和野生型两者(表1)。特别地，携带考斯质粒C的两系(4和6)开花更早于野生型。这提示在一些家族中，CO的转基因拷贝以高于原始拷贝的水平表达，或异位表达，因而这导致了在短日照条件下开花早于野生型植物。
考斯质粒B也被导入野生型Landsberg erecta植物，并且在单个位点对转基因纯合的T2植物以上述相同方式被鉴定(表1)。在T3代中分析的3种独立转化体中，一种在长日照下开花稍早于野生型植物，并在短日照下明显地更早(表1)。这再一次提示，至少在一些染色体位置，CO基因的额外拷贝可引起早开花。实施例4-使用CaMV 35S启动子/CO基因融合体影响开花特性
CaMV 35S启动子对CO开放阅读框的融合体被导入CO突变体拟南芥属植物。首先将实施例2中描述的ClaI-BamHI片段插入二元载体SLJ 1711的ClaI-BamHI位点(Jones等，1992)。携带此载体的根瘤杆菌株系随后被用于拟南芥属根外框体的转化，随后是被转化的植物的再生，如Valvekens等所述(1988)。
在诱导性和非诱导性两种条件下，所产生的转基因植物开花显著早于野生型。例如，在诱导性长日照条件下，野生型植物在形成约5片叶后开化，而转基因植物在3-4片叶时开花。在非诱导性短日照下，野生型植物在有约20片叶时开花，而转基因植物形成3-4片叶。使用启动子融合体以增加CO mDNA的丰度，或改变CO转录的特性，可因而被用于引起比野生型植物显著提早的开花。
另外，一些携带CaMV 35S启动子对CO基因的融合体的转基因植物在抽枝的末端形成顶生花。野生型植物的抽枝显示无限的生长，无限地在抽枝的侧面生长和形成花。然而，顶生花(tfl)突变型显示有限的生长，通过在抽枝顶部形成花而提前终止抽枝发育。在野生型植物中，TFL基因被认为能防止在抽枝顶部花的形成，是通过防止促进花发育的基因如LEAFY(LFY)在顶部细胞中的表达实现的。支持这一点的观察结果为：LFY在tf1突变型的抽枝顶部表达但不在野生型植物中表达，以及CaMV 35S启动子对LFY的融合体引起转基因植物形成顶生花(Weigel和Nilsen，1995)。意在不受任何特定理论的束缚，因而CO对CaMV 35S启动子的融合体可能通过在抽枝顶部激活象LFY那样的基因而引起顶生花。
CO对CaMV 35S启动子的融合体引起的两种表型即早开花和形成顶生花，可通过使用其它启动子分开。例如，通过使用一种主要在顶分生组织中表达的启动子如上述meri 5基因的启动子，可使顶生花形成最优化，而通过来自在顶分生组织中不良好表达的启动子如热休克启动子的基因的表达可导致早开花而无顶生花。实施例5-来自蔓菁的CO纯合体的克隆
低严格性杂交(Sambrook等，1989)被用于筛查从蔓菁DNA制造的λ基因组DNA文库。阳性杂交克隆通过构建它们的限制性酶剪切位点图谱(使用HindIII，XhoI，EcoRV，XbaI，EcoRI和NdeI)分析和分类。CO纯合体能够与CO基因家族的其它成员区分开的原因在于它们的限制性酶图谱与拟南芥属CO基因的图谱的相似性，以及因为位于拟南芥基因组中紧临CO的第二基因显示出现于芸苔属克隆中相似位置。两种CO同系物，即对应于存在于蔓菁连接基因N10和N19(Sharpe等，1995)上的基因随后被亚克隆入质粒并测序。来自N10连接基团的基因的序列显示于图5而来自N9连接基团的显示于图6。由这些基因编码的蛋白的氨基酸序列非常类似于拟南芥属CO基因的，特别是在通过突变发生证实对蛋白的功能重要的区中；跨锌指区的86个氨基酸84％一致，蛋白的羧基末端的50个氨基酸区，即在两种拟南芥属突变型中受影响的区，为88％相同。这两个区非常保守，而蛋白中部插入的187个氨基酸为64％相同。
此序列分析表明CO同系物可从拟南芥属外的其它植物种属分离。另外，限制性片段长度多态性绘图强烈提示CO同系物对调节其它种属的开花时间是重要的。在黑芥中CO同系物与开花时间的一个主要定量特征位点紧密共分离(U.Lagercrantz等，印刷中)，以及在蔓菁中绘制于连接基团N2和N12的CO同系物与开花时间的等位基因变异共分离。表1.在携带考斯质粒B或C植物T-DNA的co-2的T2和T3代
中的开花时间和卡那霉素性抵抗性的分离评分的转基因co tt4系T2代幼苗中卡那霉素抗性的比例在长日照下T3个体开花时的平均叶数2在短日照下T3个体开花时的平均叶数2T3代幼苗中卡那霉素抗性的比例考斯质粒B系1 3∶1 4.6+/-0.4 14.0+/-2.5 1∶0考斯质粒B系2 3.7∶1 4.2+/-0.3 18.5+/-1.1 1∶0考斯质粒B系3 2.9∶1 4.6+/-0.8 13.5+/-4.1 1∶0考斯质粒B系4 2.4∶1 4.6+/-0.8 16.4+/-2.2 1∶0考斯质粒B系5 3.0∶1 5.1+/-0.5 18.5+/-1.1 1∶0考斯质粒C系1 2.9∶1 4.6+/-0.6 20.6+/-3.8 1∶0考斯质粒C系2 3.4∶1 3.9+/-0.4 11.7+/-3.2 1∶0考斯质粒C系3 3.3∶1 4.0+/-0.4 20.4+/-1.2 1∶0考斯质粒C系4 4.9∶1 3.7+/-0.3 37.6+/-5.3 1∶0考斯质粒C系5 3∶1 4.9+/-0.6 17.7+/-2.1 1∶0考斯质粒C系6 3.8∶1 3.5+/-0.5 6.6+/-1.4 1∶0 Landsberg erecta - 5.1+/-0.8 18.9+/-2.4 - co-2 - 12.4+/-1.0 18.1+/-3.4 -
通过计数花蕾出现于瓣形体中央时存在的叶数测量开花时间(Koornneef等，1991；实验方法)。
1.在每一家族中80株以上植物被测定，但对于考斯质粒B系3，其中只使用了35株植物。
2.每一家族中10株植物被测定。
3.此群体中的大标准误是由于2株植物带有18片叶开花，而其它8株在开花时叶数为5.1+/-1。使用T-DNA片段作为探针进行Sourtheen分析，鉴定了6个杂交片段。开花时间的变异因此是由于一种早开花所需要的T-DNA拷贝的分离，或由于在一些个体中转基因抑制活性的共抑制的发生。
表2-携带10基因额外拷贝的转基因野生型植物的开花时间Landsberg erect转基因系T21中的Km在长日照下T3个体开花时的平均叶数2在短日照下T3个体开花时的平均叶数2T3代幼苗中卡那霉素抵抗性的比例考斯质粒B系1 3.4∶1 4.4+/-1.0 18.1+/-2.1 1∶0考斯质粒B系2 5.9∶1 3.2+/-0.6 10.1+/-2.2 1∶0考斯质粒B系3 2.8∶1 4.0+/-0.5 19.6+/-2.2 1∶0 Landsberg erecta 5.1+/-0.8 18.9+/-2.4 - co-2 12.4+/-1.0 18.1+/-3.7 -
1.每一家族中80株以上植物被测定。
2.每一家族中10株植物被测定。
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