一种降低革叶卫矛组培污染率的培养基及其方法技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种降低革叶卫矛组培污染率的培
养基及其方法。
背景技术
革叶卫矛(Euonymus lecleri Lévl.)灌木或小乔木，高1-7米，属于卫矛科卫矛属
植物，是中国特有植物。分布于湖北、湖南、四川、贵州等地，生长于海拔1,300米至2,900米
的地区，多生长于山地林荫和沟边。卫矛属植物在园林应用中应用较为普遍，多用于孤植、
丛植及群植，是优良的园林观赏植物和绿化树种。革叶卫矛作为一种常绿树种，耐荫耐寒，
抗逆性强，在北方地区具有很高的观赏和应用价值。随着“南树北引”的逐渐成熟，革叶卫矛
逐渐被广泛应用于园林景观规划中。
植物组织培养技术作为现代生物技术的重要领域之一，在农业生产领域和工厂化
育苗方面应用广泛，对于植物优良种质资源保存、优良品种的快速繁殖等方面也发挥着重
要的作用。
目前，革叶卫矛的组培技术尚处在研究阶段。在无菌培养中，由于种种原因使革叶
卫矛组培苗很容易受到污染，从而导致一些珍贵材料丢失，这无疑对于组培繁殖来说是致
命的。而目前有关降低革叶卫矛组培污染率的培养技术尚未有报道。因此，如何有效地减少
污染对革叶卫矛组培苗造成的损失，对于构建革叶卫矛植物组织培养快繁体系起到至关重
要的作用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种降低革叶卫矛组培污染率的培养基及其方法，该培养
基能够有效控制革叶卫矛组培苗的污染率，同时保证较高的成活率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种降低革叶卫矛组培污染率的培养基，为含有0.7-1.0mg/L 6-
BA、0.1-0.4mg/L NAA、50-80mg/L抱朴香桂精油、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养
基，pH值为5.8～6.0。
采用本发明提供的培养基配方可使得革叶卫矛组培苗的污染率控制在10％以内，
同时保证成活率达95％以上，大大节省革叶卫矛组培快繁生产成本，提高其组培快繁生产
效率，适宜大规模应用及推广。
优选地，本发明提供的培养基为：含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、50mg/L、30g/L
蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.90。
本发明还提供了一种降低革叶卫矛组培污染率的方法，包括以下步骤：
步骤1：将革叶卫矛外植体接种到权利要求1或2所述的培养基上，获得组培苗；
步骤2：所述步骤1获得的组培苗培养10～15d后，转入含有0.7-1.0mg/L6-BA、0.1-
0.4mg/L NAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基上进行培养。
本发明首次针对减低革叶卫矛的组培污染率的快繁技术进行了研究，通过向培养
基中添加适当浓度的抱朴香桂精油，并结合双诱导培养基法、外植体消毒、外植体前处理改
良操作等，最终在保证组培苗成活率的前提下将组培苗污染率控制在10％以内，同时保证
成活率达95％以上，优化了革叶卫矛组培快繁体系的生产操作流程，大大降低了工厂化育
苗的时间和成本。
其中，双诱导培养基法，是指采用两种培养基进行诱导培养，首先，将革叶卫矛外
植体接种在含有0.7-1.0mg/L 6-BA、0.1-0.4mg/L NAA、50-80mg/L、20～30g/L蔗糖和7～
8g/L琼脂的MS培养基，培养10d后，再转入含有0.7-1.0mg/L 6-BA、0.1-0.4mg/L NAA、20～
30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基。
作为优选，步骤1所述外植体接种之前还包括外植体消毒，所述外植体消毒后再进
行前处理步骤。
作为优选，消毒具体为：取外植体采用流水冲洗30-40min，再用0.1％次氯酸钠浸
泡10min～15min。
在本发明提供的实施例中，外植体的前处理为：取革叶卫矛外植体→酒精浸泡30s
→无菌水冲洗2次，每次2min→0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2次，每次2min→换杯→
0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2次，每次2min→换杯→0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲
洗2min→换杯→无菌水冲洗3min→换杯→无菌水冲洗3min。
优选地，步骤1中的接种具体为：初次接种前酒精灯上烤两把镊子一把刀，一把镊
子处理外植体，一把镊子用来接种；接种前，事先在酒精灯上烤另一把镊子和刀，放置在培
养皿上备用，待此盘接种完毕，再烤一把镊子放置于培养皿上备用，并用事先高温消毒的一
把镊子和刀处理下一盘外植体，以此类推，直到接种完毕。
在本发明提供的实施例中，接种具体为：用蘸有75％酒精的脱脂棉将刀、镊子和接
种盘擦拭一遍，并在酒精灯上高温烤一下，放置在接种盘上。待工具冷却后，将处理好的烧
杯中的外植体放入接种盘中，一次8-10个外植体，将外植体修剪成1～2cm小段。接入培养基
前，用酒精脱脂棉再次擦拭镊子，酒精灯上高温烤过冷却之后，接入事先准备好的培养基
中。
在本发明中，选取带腋芽的茎段、叶片或叶柄作为外植体。优选地，外植体选自2～
3年的实生苗健壮且无病虫害的带腋芽的茎段、叶片或叶柄。其中，外植体的采集为：选取2
～3年生苗，采集当年生健壮且无病虫害的带腋芽的茎段、叶片或叶柄作为组织培养的外植
体，用加有洗涤剂的清水浸泡清洗，去除外植体上残留的虫卵、污渍等，转入烧杯中，用洁净
纱布罩住杯口，在流水下冲洗30～50min。
优选地，本发明中，革叶卫矛组织培养的培养温度为24～26℃，光照时间为12～
18h/d，光照强度为2500～3500lx，相对湿度为45％～50％。
在本发明提供的实施例中，革叶卫矛组织培养的培养温度为25℃，光照时间为
12h/d，光照强度为3500lx，相对湿度为48％。
优选地，革叶卫矛组织培养的过程中还包括组培室灭菌步骤，所述组培室灭菌具
体为：每天早上或者晚上开紫外灯杀菌30min，每周打开臭氧发生器，杀菌15min。
相比传统的培养方式，本发明通过向培养基中添加适当浓度的抱朴香桂精油，并
结合双诱导培养基法、外植体消毒和外植体前处理改良操作等，最终使得革叶卫矛组培苗
的污染率控制在10％以内，同时保证成活率达95％以上，大大节省革叶卫矛组培快繁生产
成本，提高其组培快繁生产效率，适宜大规模应用及推广。
具体实施方式
本发明公开了一种降低革叶卫矛组培污染率的方法及培养基，本领域技术人员可
以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本
领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经
通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文
所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这
些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般
原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不
会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的
最宽的范围。
本发明MS培养基(单位为mg/L)包含：
大量元素：NH4NO3 1650，KNO3 1900，KH2PO4 1700，MgSO4·7H2O 3700，CaCl2 664.4；
微量元素：KI 83，MnSO4H2O 1690，ZnSO4.7H2O 860，H3BO3 620，Na2MoO4.2H2O 25，
CuSO4.5H2O 2.5CoCl2.6H2O 2.5；
铁盐：FeSO4.7H2O 2780，Na2.EDTA3730；
有机成分：肌醇2000，IVB烟酸10，VB6 10，VB1 2，甘氨酸40。
所述培养基需经过高压灭菌锅灭菌15-25min，高压灭菌锅工作温度121℃，压强
115kPa。
所述的6-BA为6-苄基嘌呤，所述NAA为萘乙酸，抱朴香桂精油是一种由河南红枫种
苗股份有限公司从樟科月桂属植物抱朴香桂中提取得到的具有抑菌作用的精油。本发明提
供的革叶卫矛组织培养的培养基及其方法中所用培养基组分均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1革叶卫矛的组织培养
1.生长环境：组培室，光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿
度48％；每天早上或者晚上开紫外灯杀菌30min，每周打开臭氧发生器，杀菌15min。
2.外植体的处理
(1)选取2～3年的实生苗，当年采集生长健康无病虫害幼嫩带芽的茎段、作为外植
体。
(2)采集完成后，用加有洗涤剂的清水浸泡清洗，去除外植体上残留的虫卵、污渍
等，转入烧杯中，用洁净纱布罩住杯口。
(3)先在流水下冲洗30～50min，然后用软毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外
植体，对外植体进行消毒。
(4)消毒完成后，在超净工作台内进行接种前的前处理，依次进行如下操作：用
75％酒精浸泡30s→无菌水2次2min→0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2次2min→换杯(预
先灭菌)→0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2次2min→换杯→0.1％升汞浸泡8min→无菌
水冲洗2min→换杯→无菌水冲洗3min→换杯→无菌水冲洗3min。
3.双诱导培养基培养
(1)打开超净工作台紫外灯杀菌15min。
(2)接种前用75％的酒精喷洒消毒。
(3)在超净工作台内，用蘸有75％酒精的脱脂棉将刀、镊子和接种盘擦拭一遍，并
在酒精灯上高温烤一下，放置在接种盘上。待工具冷却后，将处理好的烧杯中的外植体放入
接种盘中，一次8-10个外植体。将外植体修剪成1～2cm。
(4)用酒精脱脂棉再次擦拭镊子，酒精灯上高温烤过冷却之后，将修建好的外植体
接种到分装好的含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、50mg/L抱朴香桂精油、30g/L蔗糖和7g/L
琼脂的MS培养基的培养基中，1瓶接种给一个。
(5)将接种好的组培苗立即转入上述培养条件的组培室的无菌组培架上进行培
养，进出组培室更换干净的白大褂和拖鞋。
(6)培养10d后，将组培苗转入含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和7～
8g/L琼脂的MS培养基上进行培养。
培养35d后，统计组培苗的诱导成活率和污染率。
实施例2革叶卫矛的组织培养
1.生长环境：组培室，光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿
度48％；每天早上或者晚上开紫外灯杀菌30min，每周打开臭氧发生器，杀菌15min。
2.外植体的处理
(1)选取2～3年的实生苗，当年采集生长健康无病虫害幼嫩带芽的茎段、作为外植
体。
(2)采集完成后，用加有洗涤剂的清水浸泡清洗，去除外植体上残留的虫卵、污渍
等，转入烧杯中，用洁净纱布罩住杯口。
(3)先在流水下冲洗30～50min，然后用软毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外
植体，对外植体进行消毒。
(4)消毒完成后，在超净工作台内进行接种前的前处理，依次进行如下操作：用
75％酒精浸泡30s→无菌水2次2min→0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2次2min→换杯→
0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2次2min→换杯→0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2min
→换杯→无菌水冲洗3min→换杯→无菌水冲洗3min。
3.双诱导培养基培养
(1)打开超净工作台紫外灯杀菌15min。
(2)接种前用75％的酒精喷洒消毒。
(3)在超净工作台内，用蘸有75％酒精的脱脂棉将刀、镊子和接种盘擦拭一遍，并
在酒精灯上高温烤一下，放置在接种盘上。待工具冷却后，将处理好的烧杯中的外植体放入
接种盘中，一次8-10个外植体。将外植体修剪成1～2cm。
(4)用酒精脱脂棉再次擦拭镊子，酒精灯上高温烤过冷却之后，将修建好的外植体
接种到分装好的含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、60mg/L抱朴香桂精油、30g/L蔗糖和7g/L琼
脂的MS培养基中，1瓶接种给一个。
(5)将接种好的组培苗立即转入上述培养条件的组培室的无菌组培架上进行培
养，进出组培室更换干净的白大褂和拖鞋。
(6)培养10d后，将组培苗转入含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、25g/L蔗糖和8g/L
琼脂的MS培养基上进行培养。
培养35d后，统计组培苗的诱导成活率和污染率。
实施例3革叶卫矛的组织培养
1.生长环境：组培室，光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿
度48％；每天早上或者晚上开紫外灯杀菌30min，每周打开臭氧发生器，杀菌15min。
2.外植体的处理
(1)选取2～3年的实生苗，当年采集生长健康无病虫害幼嫩带芽的茎段、作为外植
体。
(2)采集完成后，用加有洗涤剂的清水浸泡清洗，去除外植体上残留的虫卵、污渍
等，转入烧杯中，用洁净纱布罩住杯口。
(3)先在流水下冲洗30～50min，然后用软毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外
植体，对外植体进行消毒。
(4)消毒完成后，在超净工作台内进行接种前的前处理，依次进行如下操作：用
75％酒精浸泡30s→无菌水2次2min→0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2次2min→换杯→
0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2次2min→换杯→0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2min
→换杯→无菌水冲洗3min→换杯→无菌水冲洗3min。
3.双诱导培养基培养
(1)打开超净工作台紫外灯杀菌15min。
(2)接种前用75％的酒精喷洒消毒。
(3)在超净工作台内，用蘸有75％酒精的脱脂棉将刀、镊子和接种盘擦拭一遍，并
在酒精灯上高温烤一下，放置在接种盘上。待工具冷却后，将处理好的烧杯中的外植体放入
接种盘中，一次8-10个外植体。将外植体修剪成1～2cm。
(4)用酒精脱脂棉再次擦拭镊子，酒精灯上高温烤过冷却之后，将修建好的外植体
接种到分装好的含有0.8mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、60mg/L抱朴香桂精油、30g/L蔗糖和7g/L
琼脂的MS培养基中，1瓶接种给一个。
(5)将接种好的组培苗立即转入上述培养条件的组培室的无菌组培架上进行培
养，进出组培室更换干净的白大褂和拖鞋。
(6)培养10d后，将组培苗转入含有0.8mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、25g/L蔗糖和8g/L
琼脂的MS培养基上进行培养。
培养35d后，统计组培苗的诱导成活率和污染率。
实施例4革叶卫矛的组织培养
1.生长环境：组培室，光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿
度48％；每天早上或者晚上开紫外灯杀菌30min，每周打开臭氧发生器，杀菌15min。
2.外植体的处理
(1)选取2～3年的实生苗，当年采集生长健康无病虫害幼嫩带芽的茎段、作为外植
体。
(2)采集完成后，用加有洗涤剂的清水浸泡清洗，去除外植体上残留的虫卵、污渍
等，转入烧杯中，用洁净纱布罩住杯口。
(3)先在流水下冲洗30～50min，然后用软毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外
植体，对外植体进行消毒。
(4)消毒完成后，在超净工作台内进行接种前的前处理，依次进行如下操作：用
75％酒精浸泡30s→无菌水2次2min→0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2次2min→换杯→
0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2次2min→换杯→0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗2min
→换杯→无菌水冲洗3min→换杯→无菌水冲洗3min。
3.双诱导培养基培养
(1)打开超净工作台紫外灯杀菌15min。
(2)接种前用75％的酒精喷洒消毒。
(3)在超净工作台内，用蘸有75％酒精的脱脂棉将刀、镊子和接种盘擦拭一遍，并
在酒精灯上高温烤一下，放置在接种盘上。待工具冷却后，将处理好的烧杯中的外植体放入
接种盘中，一次8-10个外植体。将外植体修剪成1～2cm。
(4)用酒精脱脂棉再次擦拭镊子，酒精灯上高温烤过冷却之后，将修建好的外植体
接种到分装好的含有0.8mg/L6-BA、0.4mg/L NAA、50mg/L抱朴香桂精油、30g/L蔗糖和7g/L
琼脂的MS培养基中，1瓶接种给一个。
(5)将接种好的组培苗立即转入上述培养条件的组培室的无菌组培架上进行培
养，进出组培室更换干净的白大褂和拖鞋。
(6)培养10d后，将组培苗转入含有0.8mg/L 6-BA、0.4mg/L NAA、25g/L蔗糖和8g/L
琼脂的MS培养基上进行培养。
培养35d后，统计组培苗的诱导成活率和污染率。
实施例5革叶卫矛组织培养方法对比试验
对照组1：外植体接种的培养基为含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和7
～8g/L琼脂的MS培养基，不添加抱朴香桂精油；同时，前处理采用如下操作：75％酒精浸泡
30s→无菌水冲洗2次每次2min→0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗5-6次。除此以外，其他
培养条件与实施例1相同。
对照组2：外植体接种的培养基为含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和7
～8g/L琼脂的MS培养基，不添加抱朴香桂精油，除此之外，其他培养条件与实施例1相同。
对照组3：外植体接种的培养基为含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、200mg/L Cef、
30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，除此之外，其他培养条件与实施例1相同。
对照组4：外植体接种的培养基为含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA、150mg/L Cb、
30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，除此之外，其他培养条件与实施例1相同。
分别统计实施例1～4、对照组1～4的培养方法获得的组培苗的污染率和诱导成活
率，结果如表1所示。
表1革叶卫矛污染率和诱导成活率的统计分析
组别
污染率(％)
诱导成活率(％)
实施例1
8
96
实施例2
10
95
实施例3
9
95
实施例4
10
97
对照组1
69
54
对照组2
45
40
对照组3
15
30
对照组4
15
35
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。