青蒿素衍生物的新组合物及其应用 本发明涉及萜类化合物，更具体地说涉及青蒿素衍生物的组合物及它的应用。
自1981年发现第一例艾滋病(AIDS)患者以来，全世界受艾滋病毒感染者越来越多，发病者已近800万，我国自1985年从美国游客身上发现艾滋病以来，艾滋病毒感染者也呈上升趋势。艾滋病在世界上逐步蔓延，大大影响了人民的身体健康及社会的稳定，全世界的科学家对其的发病原因，传播途径等等进行了深入研究并取得了较大的进展，艾滋病的治疗也有了进一步的发展。自第一个报道用于治疗艾滋病的药物苏拉明(Suramin)后又发现叠氮脱氧胸苷(AZT)等药物在体外抗艾滋病毒具有活性，并进行了临床研究，1987年FDA批准了AZT作为治疗艾滋病药物上市，至今正在研究的新化合物和复方组合物已有几百种，希望从中能找到较为理想的治疗艾滋病的临床应用药物。
双脱氧肌苷(DDI)，双脱氧胞苷(DDC)亦先后被批准临床试用。但由于它们的毒副作用较为严重，而且最近又发现抗AZT的艾滋病毒，故第11届国际艾滋病研讨会发布新的治疗准则，第一步应停止单用AZT疗法，代之以更为有效的药物联合治疗(包括AZT与DDC、DDI或与3T℃伍用)。虽然这一复方给艾滋病患者带来希望，但仍存在有联合的耐药性和相似的毒副反应，并且治疗费用昂贵，因此寻找新型结构、有效、价格低廉的治疗艾滋病药物乃是当务之急。
1994年Jung等对青蒿素类衍生物进行抗艾滋病毒的研究，认为青蒿素(I)脱羰青蒿素(II)对艾滋病毒无效，蒿乙醚(IIIc)和高脱羰青蒿素(IV)有一定作用，而12-正丁基脱羰青蒿素(V)显示出较好的抗艾滋病毒的活性，但比AZT还差得多。IIIa R＝OHIIIb R＝CH3IIIc R＝C2H5IIId R＝COCH2CH2COOHIIIe R＝CONHCH3IIIf R＝CH2CN
国内曾毅等筛选了不少青蒿素衍生物，发现化合物青蒿琥酯(IIId)，青蒿素甲氨基甲酸酯(IIIe)等有抗艾滋病毒HIV-1的作用。(中国专利申请号93108651.5，申请号93108650.7)。
本发明目地：从天然产物青蒿素出发合成腈代蒿甲醚(IIIf)，通过筛选、剂型改进、复方组合、寻找出更有效且无毒付作用的新型抗艾滋病药物。
本发明的主要活性成分腈代蒿甲醚(IIIf)是由下列步骤合成获得：
I→IIIa→IIIf
1、双氢青蒿素(IIIa)的制备可参照已知文献进行(专利CN1132207A)将青蒿素溶于甲醇，用钾硼氢在0-5℃还原，反应完全后，用酸中和，然后倒入盐水，滤出固体，即得粗制品，产率95％。
2、将上述制备的干燥的双氢青蒿素(284mg，1mmol)溶入氯代烷的溶剂中，加入乙醇腈(300mg，2.6mmol)和酸性催化剂，反应完全后，用水洗，有机层用无水硫酸镁干燥、浓缩后残留物用层析法纯化(硅胶，石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1)，重结晶后得194mg针状结晶(产率60％)，熔点150-2℃。 元素分析 C H N
理论值 63.14 7.79 4.33
实测值 63.09 8.00 4.23
核磁共振(CDCl3，400MHz)，δ0.92(3H，d，J＝3.0Hz)，0.94(3H，d，J＝1.8Hz)，1.42(3H，s)，4.36，4.42(2H，AB系J＝5.7Hz)，4.90(1H，d，J＝3.5HZ)，5.38(1H，s)
[欧洲专利EP0362730(1989年)只报道了该化合物的11％产率和熔点]。
腈代蒿甲醚(IIIf)对艾滋病毒的体外筛选：
实验材料：
腈代蒿甲醚溶于二甲基亚砜(DMSO)，配制成原液浓度为1mg/1ml，在实验时再以无血清培基稀释不同浓度1×10-1，1×10-2，1×10-3若1×10-3仍有抑制病毒作用则不断进行10倍释释。
阳性对照：AZT
细胞：MT4
艾滋病毒：HIV-1(由法国巴斯特研究所蒙特利亚教授赠送)
实验所用病毒量是为100TCID50/ml，在药物抑制实验前，进行病毒滴度测定，按Reed及Muench法计算TCID50。
实验方法：
a.将新鲜培养的MT4细胞(5×105ml)与病毒液(100TCID50/ml)共同培育，CO2培养箱中37℃作用1-1.5小时，以PBS洗涤，离心吸去上清液，反复洗三次，加带血清培基校正浓度备用。
实验于96孔板中进行，每孔中加入0.1ml上述感染病毒的MT4细胞悬液，然后加入0.1ml不同浓度的药液。另设阳性药AZT对照组，同时还设无药液的病毒对照(仅有病毒感染的MT4细胞)，每个浓度的药液设两孔。试验组和对照组于37℃下CO2培养箱中培养，三天后换药液，六天后进行下列实验观察；
b.细胞生长情况观察，以胎芬兰染色法(Trypan blue dye)观察各组活细胞量；
c.病毒P24抗原表达的测定：以免疫酶法检查病毒抗原表达，即用带圆孔的载玻片各组细胞分别涂于孔内，每个药物浓度涂两孔，冷丙酮固定，并滴加抗HIV阳性血清，在37℃下CO2培养箱中培养30分钟后，以PBS洗三次，再滴加酶标SPA与上述同样条件培育30分钟，以PBS洗三次，然后置于显色液中染色2-3分钟，蒸馏水洗清玻片，在显微镜下观察，正常细胞为无色，带有病毒的细胞呈桃红色。
结果判定：
“-”表示全孔未见阳性细胞，“+”表示全孔仅有2-3个阳性细胞，实验重复二至三次，以完全抑制病毒的最小浓度判断药物效价：浓度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
(50μg/ml) (5μg/ml) (0.5μg/ml) (0.05μg/ml) (0.005μg/ml)IIIf - - - - +AZT - - - - /
IIIf完全抑制病毒所需最小浓度为0.05μg/ml(即0.15μm)。
腈代蒿甲醚(IIIf)预防治疗SIV感染猴模型的效果试验：
试验方法：
1、动物：恒河猴5-7公斤，雄性，实验前体检无异常，经血清学检查无猴免疫缺陷病毒(SIV)，猴逆转录D型病毒(SRV)和猴T细胞性I型病毒(STLV-1)抗体。
2、感染毒株和剂量：用美国Aaron Diamond艾滋病研究中心Marx博士赠的SIVmac251病毒液1∶50释释，相当于2MID100(2个100％猴感染剂量)，1ml静脉注射。
3、实验治疗方案：腈代蒿甲醚与花生油配制混悬液，每猴每次口服2-2.5ml，动物共分三组：对照组(以花生油代药)，小剂量组(5毫克/公斤/日)和大剂量组(25毫克/公斤/日)。各组3只猴。
大剂量组、小剂量组、对照组于SIV感染的当日先给药15分钟然后感染病毒，以后每天上午定时给药一次，连续3周停药观察，直至感染3个月结束实验。
4、感染前、后观察：感染前除一般体检外、秤体重、淋巴结活检、感染和治疗后继续作一般观察和检查、并按程序定时采血测定血浆病毒滴度和抗体滴度，最后处死动物取淋巴结和脾脏作病理组织学检查。
血浆病毒滴度的测定：动物感染SIV后间隔一定时间连续采血， 血浆用于分离病毒，每标本接4-6个浓度即20μl；4μl；8μl；1.6μl；0.32μl和0.064μl，各相当于每毫升血浆SIV-5、25、125、625、3125或15625 TCID，实验组和对照组各时期猴的病毒滴度平均值和标准差见表1和图1。
图1显示IIIf小剂量组、大剂量组和对照组血浆病毒水平的动态变化。
其中：-●-小剂量组，-▲-大剂量组，-○-对照组
表1 治疗组对照组各阶段血浆病毒滴度的平均值
血浆病毒血症水平(TCID/ml ±SD) 7 10 14 18 22 30 52 90(天)IIIf 0 8.3± 1291± 5218.3± 225± 211.6± 0 0(5mg/kg) 14.4 1607.3 9062.4 346.4 358IIIf 0 0 5416.6± 258.3± 10.0± 18.3± 0 0(25mg/kg) 8846.2 321.5 13.2 11.5对照组 0 250.5± 1291.6± 1051.6± 5425± 210.0± 41.6± 1.6± 330.7 1607.3 1795.6 8838.5 359.4 72.2 2.9
从病毒学检测结果表明IIIf小剂量组(5mg/kg)和大剂量组(25mg/kg)均有降低血浆病毒血症水平作用，尤以大剂量组较为明显。
从淋巴结和脾脏的病理组织学改变比较淋巴系统细胞反应表明IIIf大剂量组的反应较强。小剂量组次之，对照组较弱，这显示IIIf对SIV感染的细胞组织有激活作用。
综合上述结果表明，IIIf在猴体实验中有一定抑制SIV作用和激活机体免疫细胞功能作用。
本发明的组合物由一定量的腈代蒿甲醚组成单方组合物也可与青蒿琥酯(IIId)或与青蒿素甲氨基甲酸酯(IIIe)或与青蒿琥酯和青蒿素甲氨基甲酸酯组成复方组合物，它们的配制，加不同的辅料，按不同剂型的要求，采用各种方法配制而成，供动物或临床的应用。包括固体形式的片剂，胶囊、栓剂、微型胶囊、粉剂、颗粒散、透皮软膏、脐敷膏等。腈代蒿甲醚(IIIf)单方的组合物中，IIIf占组合物重量的0.1％-10％，优选范围为1％-3％，按照不同剂型的要求根据主要活性成分的比例加入不同比例的辅料，使之成为百分之百，例如片剂中加入羧甲基纤维素，淀粉，硬脂酸镁等与水配制成颗粒然后压片。
腈代蒿甲醚复方的组合物中，活性成份占组合物重量的0.1％-10％。
复方的配比如下：
腈代蒿甲醚∶青蒿琥酯＝1∶1～0.1按照不同剂型要求，根据主要活性成分的比例，加入不同比例的辅料，使之成为百分之百，例如栓剂的制备，活性成分加入聚氧乙烯(40)单硬酸酯，吐温-80，加热使之熔化，然后注模，即成栓剂。
腈代蒿甲醚∶青蒿素甲氨基甲酸酯＝1∶1～0.1。
按照不同剂型要求，根据主要活性成分的比例，加入不同比例的辅料，使之成为百分之百，例如胶囊的制备，活性成分加入淀粉，聚乙烯基吡咯烷酮混合均匀，过筛，按剂量要求分装入胶囊。
腈代蒿甲醚∶青蒿琥酯∶青蒿素甲氨基甲酸酯＝1∶1～0.1∶1～0.1。将三种有效成分混合在一起，按上法配制成各种所需的制剂。
用以下实施例进一步说明本发明。
最佳实施例：
1.栓剂制法：
腈代蒿甲醚(IIIf)14克，聚氧乙烯(40)单硬酸酯(代号为S40)127.9克，吐温-80 2.1克，将S40和吐温80置于容器中在60～90℃水浴中加热熔化，再将腈代蒿甲醚(IIIf)的细粉，分批加入混匀注模即成。
2.取石蜡20克放置容器中，水浴中加热熔化石蜡，加入可可豆油200克，并调匀，用绸布过滤去除不溶的杂质，冷却到38～40℃时，加入已研细的腈代蒿甲醚24克，混匀，混匀后注模即成。
3.片剂制法：
取腈代蒿甲醚80克，青蒿素甲氨基甲酸酯20g、粉碎、过筛、加入羧甲基纤维素20克，淀粉20克，硬脂酸镁10克，搅拌均匀，加水制成颗粒，然后压成片剂，每片含50毫克的活性物质。
4.胶囊制法：
取腈代蒿甲醚80克，青蒿素甲氨基甲酸酯10g，青蒿琥酯10g、粉碎、过筛、加入淀粉50克、聚乙烯基吡咯烷酮20g，混合均匀、过筛，然后装入4000个胶囊，每个胶囊含有25毫克的活性物质。