一种灵芝多糖及制备方法和应用 【技术领域】
本发明涉及用化学方法从灵芝中提取有效成分，更具体地说从灵芝孢子中提取多糖、确定化学结构及对机体的免疫促进作用。
背景技术
癌症疾病不断威胁人类健康，它已成为人类死亡的主要因素之一，虽经人们的大量研究希望寻找到能克服癌症疾病的、副作用小的抗癌药物，但至今仍未找到专一性强、疗效好、副作用小的抗癌药物。
目前使用的肿瘤药物品种虽很多，但大部分采用化学合成方法制得，毒、副作用较大。近年来有一些抗肿瘤的天然产物问世，但副作用也较大，且多数为粗制品。九十年代后期，生物治疗已成为肿瘤治疗的重要途径，免疫促进剂是用于肿瘤生物治疗的一类药物。本发明提供一种免疫调节剂即从灵芝孢子中获得的多糖。
灵芝在传统医药中是一种良好的滋补品，它的主要活性成分为多糖和灵芝酸。近十年来灵芝特别是灵芝孢子已成为国内外研究的热点。本发明从灵芝孢子中提取获得均一多糖，经化学光谱分析确定了化学结构，并通过药理试验证明该化学结构的多糖具有显著的免疫促进作用，可作为保健品使用，特别作为肿瘤病人的辅助治疗药物。
【发明内容】
本发明目的是提供一种从灵芝孢子中提取出具有免疫促进作用的其结构确定的多糖化合物。
本发明的另一目的是制备该多糖的提取方法及它的医药用途。
本发明通过下列步骤实施：
破壁的灵芝孢子粉于甲醇或乙醇溶液中浸泡数周，取出风干，风干的残渣再用沸水回流提取4-5小时，待冷，过滤，残渣再用相同比例水提取一次，合并两次水提取滤液，滤液减压浓缩至小体积，按1∶1体积比加入15％三氯乙酸于4℃下脱蛋白，离心，上清液用1mol/L NaOH中和至中性。对流水透析三天。未透过液减压浓缩至1/5体积，加入95％乙醇至溶液中乙醇浓度为45-55％，过夜，离心沉淀，干燥得粗多糖。
粗多糖溶于蒸馏水，离心去不溶物，上清液进行DEAE-Cellulose柱层析。水洗脱至糖反应呈阴性，透析，冷冻干燥得固体，固体溶于水，加入乙醇至溶液中乙醇浓度为25-35％，离心，上清液再加入乙醇使溶液中乙醇浓度为45-55％，离心得沉淀，沉淀溶于水，进行Sephacryl S-300柱层析。0.2mol/LNaCl洗脱。示差检测，多糖部分透析，减压浓缩至小体积，再按同样条件Sephacryl S-300柱层析一次，透析，减压浓缩，冷冻干燥。该样品经HPLC检测，结果为一单一对称峰，证明该多糖FB1为纯品。可作为药理试验及结构分析之用。
FB1经HPLC检测其分子量为7.2×105Da。比旋度为[a]D＝-23.37°(C0.860，H2O)。FB1经13CNMR测定，异头碳区域只显示一位于δ104.69的碳信号，说明该多糖的葡萄糖残基为吡喃环型，且糖苷健仅有一种β-型连接方式，这与红外光谱的推测一致。另外，在13CNMR谱中出现强度较大的位于δ86.5地信号，提示FB1的糖链中含有大量1，3-连接的吡喃型葡萄糖残基；信号δ71.7(应归属为支链葡萄糖残基的C-6)的存在，提示多糖FB1为一具有分支的聚合物，分支点之一应位于主链葡萄糖残基的C-6位。碳谱中其他信号，δ77.7、75.4、70.3、和62.9可分别归属于葡萄糖基C-5、C-2、C-4(主链葡萄糖基和C-6。上述结果结合甲基化反应，及高碘酸盐氧化反应，Smith降解等结果，证明FB1的重复结构为一含有6个葡萄糖残基，一个葡萄糖残基的6位上带有一个末端葡萄糖的β-1，3-葡聚糖。详细结构如图所示：
药理试验：
1、小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性：准确称取FB1 1-2克，溶于生理盐水，浓度为4mg/ml。使用时稀释至浓度为10-3、10-2和10-1mg/ml。小鼠以颈椎脱臼致死，无菌条件下取出脾脏并分离脾细胞，以尼龙网过滤，蒸馏水破坏红细胞，调节至等渗，用培养液洗涤三次后，计数，调节细胞浓度为5×106cell/ml。将上述细胞液加样于96孔板中，每孔100ul，设一对照组，再加入不同浓度的待测样品及ConA(5ug/L)或LPS(10ug/L)，置于37℃ 5％CO2的培养箱中培养44小时，加入20ulMTT继续培养4小时。培养终止，向每孔中加入100ul三联液(二甲基甲酰胺和十二烷基磺酸钠)，并于37℃放置过夜。次日，测定每孔溶液于570nm处的吸光度。然后用小鼠脾脏细胞作T，B淋巴细胞增殖活性试验。结果表明对T，B淋巴细胞增殖活性，在浓度10、100ug/ml时P值分别＜0.01及0.001。达显著。
2、小鼠体内免疫试验：
合格ICR小鼠，分别腹腔注射25ug/ml和50ug/ml FB1，对照组注射生理盐水0.2ml，每天给药二次，共给药9天。小鼠给药第三天致敏，第五天解剖测定各项免疫参数。结果表明该多糖FB1在上述二个浓度下其P值分别小于0.01和0.001，达显著。
根据上述药理试验的体内体外试验，表明FB1可作为免疫调节的药物使用。
具体实施方法
取1Kg破壁赤灵芝孢子粉，加入3L 95％乙醇浸泡在三周。每周更换乙醇一次，取出离心。固体物置于通风处凉干，然后用沸水提取，每次加去离子水4L，共提取两次，合并两次滤液，滤液减压浓缩至1L，冷却至4℃，加入15％三氯乙酸1L。加毕，静置3小时，离心，取上清液，上清液用1mol/LNaOH中和至pH6-7，对流动水透析三天。透析袋内液浓缩至0.5L。加入95％乙醇至溶液的乙醇浓度为50％，4℃下静置过夜，离心得沉淀。沉淀经无水乙醇和丙酮依次洗涤后，于40℃真空干燥，得固体粗多糖9.7g。(得率0.97％)。
取粗多糖5g，溶于蒸馏水中，离心去不溶物，上清液进行DEAE-Cellulose柱层析(柱50×10cm)，用水洗脱。根据糖颜色反应合并阳性反应部分，对蒸馏水透析二天。未透过液减压浓缩至小体积，冷冻干燥，得棉花状固体2.1g。固体溶于水，加入乙醇至溶液中乙醇浓度为30％，离心，取上清液，上清液中再加入乙醇至溶液中乙醇浓度为50％，离心，得沉淀1.2g，沉淀溶于水，进行Sephacryl S-300柱(100×2.6cm)层析。0.2mol/L NaCl洗脱。示差检测，合并多糖部分，透析，浓缩，冷冻干燥得固体。然后再按上述条件再进行Sephacryl S-300柱层析一次，透析，浓缩，冷冻干燥，得FB1。经HPLC检测，结果为一单一对称峰，证明FB1多糖为均一组分。可作为理化性质、化学结构及药理试验之用。
理化性质测定：按多糖测定的常规方法，测定分子量为7.2×105。比旋度为[a]D＝-23.37°。
化学结构测定：按多糖的化学结构测定方法，包括光谱方法(13CNMR，1R)及化学方法(全水解、甲基化反应、高碘酸盐氧化反应、Smith降解、部分水解)证明FB1为一含有6个葡萄糖残基，并在五个葡萄糖残基为主链的一个葡萄糖残基的5位上带有一个分支，分支为末端葡萄糖的β-1，3-葡聚糖。
药理试验：取上述FB1分别按试验中提及的药理试验方法进行体内体外免疫试验。结果表明对T，B淋巴细胞的增殖试验中，浓度为10、100ug/ml的体外试验可达显著和非常显著。25ug/Kg和50ug/Kg时体内试验分别可达显著和非常显著。