由HLA-B7限制性肿瘤抗原衍生的优化的隐蔽性肽组成的免疫原性多肽及其用途本发明涉及抗癌疫苗领域。更具体地，本发明涉及优化的嵌合多肽，用于HLA-B7癌
症患者，所述嵌合多肽包含衍生自隐性肿瘤表位的四个优化的肽以增强其免疫原性。
目前开发中的抗肿瘤疫苗采取许多形式，包括游离肽、重组蛋白、装载有肽或肿瘤
裂解物的树突状细胞和DNA。尽管基于肽的疫苗在可行性方面相对于其它形式非常有吸引
力，但是发现靶向优势肿瘤肽的疫苗的许多研究仅引发弱的免疫学和临床应答，具有强的
患者间变异性。在若干临床研究中所测试的来源于gp100的几种肽疫苗、在II期随机试验中
测试的MUC1衍生的BLP25肽和在非常大量的I期和II期临床研究中测试的HER-2/neu衍生的
E75肽，也是如此((Butts et al,2005；Peoples et al,2008；Rosenberg et al,2004)。
优化的隐性肽比转基因小鼠模型中的优势肽更有效地诱导抗肿瘤免疫(Gross et
al,2004)，并且基于该技术的两种疫苗目前处于临床开发中：
-Vx-001，标明为NSCLC癌症HLA-A2患者的TERT衍生的单表位肽，处于IIb期，以及
-Vx-006，也被标明为HLA-A2患者的靶向TERT、MAGE-A和HER-2/neu通用肿瘤抗原
的三表位多肽，处于I期。
使用基于多肽的疫苗引发针对多种抗原的CTL应答的方法具有几个优点。特别地，
至少一种靶抗原的表达应当足以触发疫苗诱导的CTL从而杀死肿瘤细胞，并且肿瘤细胞不
可能同时丢失所有靶抗原，特别是当这些抗原对于细胞存活和肿瘤生长是必需的时候。这
种方法可以引起强烈的免疫应答(Oukka et al,1996)，并增加可能从疫苗中获益的患者比
例。此外，广谱癌症疫苗应靶向被多种肿瘤过表达的通用肿瘤抗原，诸如TERT、HER-2/neu、
MUC-1、CEA、EphA2和MAGE-A(Minev et al,2000；Ofuji et al,1998；Ogata et al,1992；
Reese&Slamon,1997；Slamon et al,1987；Van den Eynde&van der Bruggen,1997；
Vonderheide et al,1999)。这些抗原中的大多数参与肿瘤细胞存活和致瘤性，因此它们下
调以逃避免疫应答可能对肿瘤生长具有有害作用。
为了增加可以从这样的产品中受益的患者的数量，本发明人已经开发了命名为
Vbx-016的指定给表达HLA-B7的患者的基于多肽的疫苗，其靶向四种广泛表达的肿瘤抗原：
TERT、HER-2/neu、MAGE和CEA。已经描述了构成Vbx-016的四种优化的隐蔽肽(表1)(WO2008/
010098、WO2010/143010)。四种肽中的每一种均显示在体内和体外(WO2008/010098、
WO2010/143010)引发针对优化的肽和针对肿瘤细胞天然表达的天然同源肽两者的抗肿瘤
应答(表1)。有趣的是，由MAGE-A273V6L9引发的CTL靶向六种MAGE-A抗原(-A1、-A2、-A3、-A4、-
A6和-A12)。事实上，使用MAGE-A273V6L9诱导的特异性CTL能够识别负载有MAGE-A273A6(包括
在MAGE-A1和MAGE-A4中)、MAGE-A273I6(包括在MAGE-A2和MAGE-A6中)和MAGE-A273V6(包括在
MAGE-A3和MAGE-A12中)的细胞。
表1：天然的和优化的表位序列
通常，在皮下注射之前，将基于多肽的疫苗用佐剂诸如Montanide ISA51VG
(Seppic，Castres，France)乳化。注射后，多肽被内化到专业抗原呈递细胞(APC)中，特别是
局部存在于皮肤中的朗格汉斯细胞。然后，多肽由高尔基体中的蛋白酶体加工，并且表位与
HLA分子相关联被呈递在细胞表面。为了确保多肽的每个表位的有效呈递，必须测试每个连
接(junction)是否被蛋白酶体正确加工。此外，本发明人先前已经描述了对于Vx006三表位
多肽，多表位疫苗序列中各表位的顺序对于表位加工和最终获得针对所有相应表位的免疫
应答是至关重要的(WO2007/073768)。
然后，为了避免测试24个推断的排列，在两个步骤中确定多肽中四个优化的肽的
最佳构造：(i)测试每个连接序列；和(ii)测试相应的完整多肽。
因此测试每个潜在的连接。然后就表2中所呈现的十二种可能的二肽在HLA-B*
0702转基因小鼠中体内测试并在健康供体PBMC培养物中体外测试以下能力：
-二肽被有效加工并诱导能够识别负载有每种优化的表位的细胞的特异性CTL的
能力，
-诱导CTL以识别对应于天然存在于肿瘤细胞表面的序列的同源天然肽的能力。
表2.在转基因小鼠中测试的二肽序列
首先，将每个二肽序列提交到两个主要的计算机模拟(in silico)的蛋白酶体切
割预测软件MAPPP(由和Hans-Joachim Mollenkopf在Max-Planck-
Institute for Infection Biology开发，可在万维网上获得)和PAProC(Prediction
Algorithm for Proteasomal Cleavages用于蛋白酶体切割的预测算法，也可在万维网上
获得)，其预测每个表位的加工概率。
根据PAProC，除了可以产生两个表位(切割位点具有双短划线)的7T5HN3M之外，蛋
白酶体不能正确地加工任何二肽(预测的切割位点用短划线表示，表3)。
表3：二肽的蛋白酶体切割预测(PaProc)
根据MAPPP预测模型，许多组合应允许加工四个表位(数据未显示)。应当确保蛋白
酶体对每个表位有效加工的预测的最佳序列是CEA188L9/MAGE273L9/TERT444A1/HER-2/neu246A1。
然后在HLA-B*0702转基因小鼠中体内测试二肽。如实施例1所述，就应答小鼠的数
目而言，组合7C1HN3M、7C1T5M、7T5HN3M、7M1HN3M和7T5M1M产生比相应的反向序列更好的结
果。7C1M1M和7M1C1M得到相同的结果。
基于这些体内实验数据，然后设计以下理论最佳多肽：CEA188L9/TERT444A1/
MAGE273L9/HER-2/neu246A1。
为了评估表位是否在四肽中被有效加工，在HLA-B*0702转基因小鼠中测试相应的
多肽SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(SEQ ID No：23)诱导特异性CTL和天然存在
于肿瘤细胞表面的四个同源天然肽的能力，所述特异性CTL识别四个优化的表位。如实施例
2所述，在用多肽接种两次后，所有小鼠响应至少一种天然肽，并且大多数接种的小鼠响应
两种或更多种同源天然肽，这证实了多肽被蛋白酶体有效加工。重要的是，在一只接种的小
鼠中所有天然肽均被识别至少一次。
有趣的是，该序列不同于通过蛋白酶体MAPPP切割预测模型选择的序列，原因是与
在体内发生的情况相反，7M1T5M被预测为不被正确处理。
为了在人中体外证实由HLA-B*0702转基因小鼠获得的结果，在来自健康的人类供
体的PBMC培养物中独立地体外测试所定义的多肽的每种连接(CEA188L9/TERT444A1、TERT444A1/
MAGE273L9和MAGE273L9/HER-2/neu246A1)。实施例3中所述结果显示，在人中每个二肽被有效地
体外加工，并且所诱导的特异性CTL能够识别负载有优化的或同源天然肽的细胞。
最后，在来自一个HLA-B*0702健康供体的PBMC培养物中测试多肽
SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(SEQ ID No：23)(实施例4)，这证实所述多肽产
生多特异性CTL免疫应答的能力。重要的是，识别了几种天然肽。这些结果证实多肽被蛋白
酶体有效加工，并且所诱导的免疫应答是多特异性的。
因此，本发明的第一方面是包含序列SPRLQLSNLXXXAPRRLVQLLXXXGPRALVETLXXXAP
KHSDCLA(Seq IDNo：24)的多肽。在该序列中，CEA188L9、TERT444A1、MAGE273L9和HER-2/neu246A1表
位由间隔区XXX分开，其中每个X(彼此独立地)是任何氨基酸或不存在。因此，所述多肽至少
长36个氨基酸；可以通过在表位之间添加间隔区和/或通过在其N-末端和/或C-末端添加有
利于其加工的信号来增加其长度。特别地，根据本发明的多肽还可以在其N末端包含内质网
转运信号序列。几种内质网转运信号序列已经在科学文献中有描述并且可以用于本发明的
情况中。例如，可以根据发明在肽的N-末端添加Igκ-链信号序列(Ishioka et al,1999)和
E3/19-kD蛋白信号序列(Anderson et al,1991)。或者或另外，本发明的多肽可以在其C末
端进一步包含泛素，因为蛋白质的泛素化导致蛋白水解增加。
在本发明的多肽的优选实施方案中，四个表位彼此直接结合而不使用任何间隔区
(对于每个位置X＝不存在)。因此，所述多肽包含序列
SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(Seq ID No：23)。因此，在缺乏泛素和ER-转运信
号的情况下，所述多肽由下面实施例中所示的多肽
(SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA，Seq ID No：23)组成。
在本发明的多肽中，氨基酸可以是L-或D-氨基酸。
本发明的多肽在大多数用所述多肽接种的HLA-B*0702转基因小鼠中诱导针对选
自CEA188、TERT444、MAGE273和HER-2/neu246同源天然肽中的至少一种并且优选至少两种肽的
特异性CD8+T细胞应答。
在利用来自健康HLA-B*0702供体的人PBMC的体外测定中，根据本发明的多肽还诱
导针对选自CEA188、TERT444、MAGE273和HER-2/neu246天然肽中的至少一种并且优选至少两种
肽的特异性CD8+T细胞应答。
为了控制SEQ ID No：23的多肽被正确加工并具有良好的免疫原性，本发明人还已
经证实：
-每个天然肽在HLA-B*0702转基因小鼠中至少被识别一次；
-在利用来自健康HLA-B*0702供体的人PBMC的体外测定中，SEQ ID No：23的多肽
诱导针对选自CEA188、TERT444、MAGE273和HER-2/neu246同源天然肽中的至少一种并且通常两
种或多种肽的特异性CD8+T细胞应答；和
-用来自两个或更多个健康HLA-B*0702供体的PBMC获得了这些特异性应答，并且
每个优化的肽在利用来自HLA-B*0702健康供体的人PBMC的体外测定中被识别至少一次。
在更优选的实施方案中，本发明的多肽显示所有上述性质，其可以容易地由技术
人员使用下文实验部分中描述的操作方案和测定进行测试。
本发明的另一方面是装载有如上所述的多肽的分离的树突状细胞。在本文中，“分
离的”是指所述树突状细胞在患者体外。所述细胞优选离体装载。例如，可以通过
Vonderheide等人描述的技术(Vonderheide et al,2004)用多肽装载所述树突状细胞。
本发明还涉及包含肽递送载体和如上所述的多肽的复合物。可根据本发明使用的
肽递送载体的实例是细胞穿透肽，诸如在公开为WO2013/150338、EP1795539和WO2014/
053629的专利申请中描述的那些，细菌毒素诸如百日咳杆菌(B.pertussis)的腺苷酸环化
酶(Fayolle et al,1999)、白喉毒素(Fayolle et al,1999)、炭疽毒素(Doling et al,
1999)、志贺毒素的B亚基(Haicheur et al,2000)和其他载体诸如蜂毒PLA2(Babon et al,
2005)、脂质体、病毒体(Bungener et al,2002)等。
本发明还涉及包含如上所述的多肽和/或工程化树突状细胞和/或复合物以及药
学上可接受的载体的药物组合物。特别地，本发明的多肽、树突状细胞和复合物可以用于制
备用于抗癌免疫治疗的免疫原性组合物。这些组合物特别可用于表达选自MAGE-A家族、HER
家族、CEA和TERT中的至少一种抗原的肿瘤的免疫治疗，特别是用于治疗HLA-B*0702个体。
本发明可用于治疗(或预防其复发)几乎任何类型的癌症，诸如肾上腺皮质癌，结
肠直肠癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑和中枢神经系统癌症，乳腺癌，子宫颈癌，子宫内膜癌，
食管癌，胃癌，胃肠道类癌瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，卡波西肉瘤，肾癌，头颈癌，肝癌，
肺癌间皮瘤，卵巢癌，胰腺癌，阴茎癌，垂体癌，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，皮
肤癌(例如黑素瘤，非黑素瘤皮肤癌)，睾丸癌，胸腺癌，甲状腺癌，阴道癌，外阴癌和子宫癌。
癌症疫苗接种或治疗方法，所述癌症疫苗接种或治疗方法包括用佐剂乳化多肽的
步骤和将本发明的多肽在体内施用于有需要的患者，以及包括将如上所述的工程化树突状
细胞或复合物施用于个体的步骤的疫苗接种或治疗方法，也是本发明的一部分。
本发明的另一方面是包含至少一个剂量的如上所述的多肽(或复合物)和至少一
个剂量的佐剂的多个部件的试剂盒(a kit of parts)。免疫佐剂是加入到疫苗制剂中以增
加其功效的物质。佐剂可以增加由疫苗接种诱导的免疫应答的量级和持续时间。可用于本
发明的试剂盒中的佐剂的优选实例是衍生自不完全弗氏佐剂(IFA)的那些佐剂。具有这些
佐剂的疫苗制剂是油包水(W/O)乳剂。可用于根据本发明的肽的乳剂的IFA型脱毒佐剂的非
限制性实例包括基于矿物油的 ISA 51和基于角鲨烯的
ISA720(SEPPIC，France)。
根据本发明的另一试剂盒包含至少两个剂量的如上所述的多肽或复合物。所述肽
可以已经与佐剂一起配制或没有与佐剂一起配制。
由于癌症接种需要几种刺激完全有效，本发明的试剂盒可以包含3至50、优选6至
20个剂量的如上所述的多肽。
根据上述试剂盒的优选实施方案，每个剂量的多肽包含0.5至10mg的多肽。
本发明通过以下实施例进一步说明。
实施例
实施例使用以下材料和方法进行：
转基因小鼠。先前描述了HLA-B7H-2I型敲除小鼠(Rohrlich et al,2003)，并由
F.Lemonnier(Institut Pasteur，Paris，France)友情提供。
细胞。转染HLA-B*0702的人T2-B7细胞先前已有描述(Rohrlich et al,2003)。细
胞在补充有青霉素链霉素FCS 20％的RPMI1640培养基中生长。
肽和质粒。肽由Millegen(Labège,France)或Eurogentec(Seraing，Belgique)合
成。
HLA-B*0702转基因小鼠中体内CTL诱导。HLA-B*0702转基因小鼠在尾基部两次皮
下接种与HV核心T13L辅助子(150μg)辅助肽缔合并乳化于不完全弗氏佐剂(IFA)或
Montanide ISA51VG(Seppic，Castres，France)的200μg优化的二肽或400μg的Vbx-016，间
隔两周。
最后一次疫苗接种后7天，取出脾脏，通过Ficoll离心分离T细胞，并离体检测10μM
天然或优化的肽的识别。阳性对照是伴刀豆球蛋白A，阴性对照是仅培养基。所有条件一式
四份进行测试。通过ELISpot使用Diaclone Kit Murine IFNγELISpot定量产生的T
细胞。
当1)在阴性对照和测试肽之间存在超过10个点差异/106个细胞并且2)这两个组
之间具有统计学显著差异的T检验(p<0.05)时，免疫应答被认为是阳性的。
从人PBMC产生CTL。通过白细胞单采术(leukapheresis)从健康HLA-B*0702志愿者
收集PBMC。从在完全合成培养基(AIMV)中用500IU/ml GM-CSF和500IU/ml IL-4培养7天的
贴壁细胞产生树突状细胞(DC)。在第6天，DC用10μM多肽脉冲刺激过夜。在第7天，通过用
CD8Dynabeads Untouched Human CD8的阴性选择来纯化CD8+细胞。在在圆底96孔板的补充
有1000IU/ml IL-6和5IU/ml IL-12、1μg/ml抗CD40和500IU/ml IFNγ的AIMV培养基中，用3
×104个经肽脉冲刺激的DC刺激CD8+细胞(2×105)+CD8-细胞(6×104)。
从第7天开始，在20IU/ml IL-2和10ng/ml IL-7、1μg/ml抗-CD40和500IU/ml IFN
γ存在下，用负载肽的DC每周再刺激培养物。
在第三次再刺激后，CD8细胞在补充有20IU/ml IL-2的AIMV中保持7天。培养物在
一夜间用AIMV饥饿，然后在IFNγELISpot测定中测试。
IFNγELISpot测定。对于一个96孔的培养物，收集24个孔的4个汇集物，将CD8细胞
计数，并且在ELISpot板上每个孔分配50 000个CD8，每个孔含有负载10μM每种天然单肽或
10μM由所述多肽组成的修饰的单肽的25000个T2B7。每个条件进行8个重复。阳性对照是植
物血凝素A，阴性对照是装载有不能结合HLA-B7分子的不相关肽的T2B7。
实施例1：在用所有不同的二肽组合进行两次接种后的HLA-B*0702转基因小鼠中
产生的T细胞免疫应答的评估
使用每种二肽以2周的间隔接种HLA-B*0702转基因小鼠两次，并测试其诱导针对
优化的肽及其同源天然对应物两者的免疫应答的能力。二肽描述于表2中。在每个实验中，
最佳组合以灰色突出显示。就应答小鼠的数目而言，7C1HN3M、7C1T5M、7T5HN3M、7M1HN3M和
7T5M1M给出比反向序列更好的结果。7C1M1M和7M1C1M得到相同的结果。
表4：HLA-B*0702转基因小鼠中每种二肽的测试
实施例2：用Vbx-016两次接种后在HLA-B*0702小鼠中产生的T细胞免疫应答的评
价
为了评估在二肽实验中测定的Vbx-016(SEQ ID No：23)是否是最佳的，将HLA-B*
0702转基因小鼠在尾基部用乳化于不完全弗氏佐剂(IFA)或Montanide ISA51VG(Seppic，
Castres，France)中的400μg的Vbx-016和150μg的HBV核心T13L辅助肽接种两次，间隔两周。
在两次接种后，所有小鼠响应至少一种天然肽，并且13/14接种的小鼠响应两种或
更多种同源天然肽。重要的是，在一只接种的小鼠中每个天然肽被识别至少一次。
表5：HLA-B*0702转基因小鼠中SEQ ID No：23的四肽的测试
实施例3：通过利用在HLA-B*0702转基因小鼠中选择的二肽体外诱导来自人体外
周血单核细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞而评价T细胞免疫应答。
为了评估在转基因小鼠中验证的多肽CEA188L9/TERT444A1/MAGE273L9/HER-2/neu246A1
中存在的连接是否在人中被有效地加工，用每种二肽(CEA188L9/TERT444A1、TERT444A1/MAGE273L9
和MAGE273L9/HER-2/neu246A1)根据方法中描述的操作方案刺激人PBMC。通过测量来自由二肽
刺激的CD8+的特异性IFNγ产生细胞，分成4个用于测试的汇集物，来评估同源天然肽的识
别。当对于感兴趣的肽获得的平均点数优于使用不相关肽获得的平均点数时，进行T检验；
当t检验值小于0.05时，结果被认为是显著阳性的并在下表中以灰色突出显示。
在每个供体中，CTL能够识别优化的和同源的天然肽(以及MAGE-A273L9共有肽的四
种天然肽)，证实每个连接均被蛋白酶体良好加工。
表6：用包含在多肽SEQ ID No：23中的每个二肽刺激的HLA-B7健康供体PBMC的培
养物，irr：无关肽，t检验阳性以灰色突出显示
实施例4：用Vbx-016从人外周血单核细胞体外诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞。
最终将Vbx-016用于刺激来自健康供体的人PBMC。
当对于感兴趣的肽获得的平均点数优于使用不相关肽获得的平均点数时，进行t
检验；当t检验值小于0.05时，结果被认为是显著阳性的并在下表中以灰色突出显示。多特
异性应答被诱导，并且由所诱导的CTL识别几种天然肽，这证实了多肽被蛋白酶体良好加工
并且所诱导的应答是多特异性的。
表7：用多肽SEQ ID No：23刺激的HLA-B7健康供体PBMC的培养物，irr：无关肽，t检
验阳性结果以灰色突出显示
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GALLOU, Catherine
MENEZ-JAMET, Jeanne
<120> 由HLA-B7限制性肿瘤抗原衍生的优化的隐蔽性肽组成的免疫原性多肽及其用
途
<130> F1788-9WO_VM-sf
<150> EP 14306187.7
<151> 2014-07-22
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7C1
<400> 1
Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 2
Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Asp Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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1 5
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7M1HN3M
<400> 20
Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Leu Ala Pro Lys His Ser Asp Cys
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Leu Ala
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7T5M1M
<400> 21
Ala Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu
1 5 10 15
Thr Leu
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7M1T5M
<400> 22
Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Leu Ala Pro Arg Arg Leu Val Gln
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 23
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 23
Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Leu Ala Pro Arg Arg Leu Val Gln
1 5 10 15
Leu Leu Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Leu Ala Pro Lys His Ser
20 25 30
Asp Cys Leu Ala
35
<210> 24
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(12)
<223> X = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (22)..(24)
<223> X = 任何氨基酸或不存在
<220>
<221> 变体
<222> (31)..(36)
<223> X = 任何氨基酸或不存在
<400> 24
Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Leu Xaa Xaa Xaa Ala Pro Arg Arg
1 5 10 15
Leu Val Gln Leu Leu Xaa Xaa Xaa Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr
20 25 30
Leu Xaa Xaa Xaa Ala Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala
35 40 45