本发明涉及抑制由包膜病毒所引起的细胞感染的方法，尤其涉及应用本发明定义的克力克斯（n）芳烃类化合物（Calix（n）arene Compounds）抑制其感染的方法;在有关的方面，本发明涉及抑制经性交传播的包膜病毒感染的方法。 参考文献：
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人们面临的挑战是，需研制出病毒疾病有效的治疗和预防药物，以便抑制病毒过程而不产生严重的副作用，并且最好不产生病毒的抗性。由于病毒的复制需要应用宿主细胞的成分，因此通过抑制病毒地复制而治疗病毒感染也可以使受感染的宿主细胞致死。理想的是在病毒侵袭宿主细胞之前应该使病毒在宿主中被破坏或失去活性。这可以由宿主的免疫系统以不同程度的成绩来完成，但是该机制要求更早期的免疫反应，早期免疫反应可通过先前感染或接种疫苗而建立。此外，许多病毒[例如疱疹单纯病毒（HSV）]可以有效地避免宿主的免疫系统，并且至少一种病毒-人免疫缺陷病毒（HIV）已知能损坏宿主的免疫系统（Gottlieb）。
核苷类似物是目前最广泛应用的抗病毒药物，这一类型药物的作用是破坏病毒的复制，这可经由两种途径来完成：1）抑制核酸过程中所需要的酶，2）或是产生有缺陷的病毒基因组，例如通过导致复制的未成熟终止。例如无环鸟苷为嘌呤类似物，可用于治疗多种病毒疾病，包括疱疹单纯病毒-1（HSV-1）及疱疹单纯病毒-2（HSV-2），无环鸟苷可以在几个重要的方面抑制病毒的复制，包括抑制病毒的胸苷激酶和DNA聚合酶，以及DNA单链延伸（Elion）。三唑核苷为另一个嘌呤类似物，是一种专门用于治疗呼吸道合胞病毒（RSV）感染的药物。该化合物能够降低细胞的GTP水平，能阻止数种依赖GTP的病毒过程（Smith）。叠氮胸苷（Azidothymidine;AZT）为目前最广泛用于治疗HIV感染的药物，叠氮胸苷为一种胸苷类似物，它用于抗人逆转录病毒特别有效。用AZT阻断病毒的依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）具有极高的亲合力，但是它同时也会阻断人DNA聚合酶，从而引起DNA链的终止（Mitsuya）。
其他的核酸类似物包括：ganciclovir，阿糖腺苷，碘苷，三氟胸苷和膦甲酸盐（foscarnet）（一种无机磷酸盐类似物）。如前文所述，所有这些药物均可阻断病毒复制，而同时也具有破坏政党宿主复制和/或DNA复制过程的能力（参见，例如Martin）。
基于对病毒感染和复制机理的了解，推导出另一类可选择的药物治疗法，这包括试图阻断病毒进入宿主细胞，或改变宿主核糖体中蛋白质合成、病毒DNA/RNA的复合以及免疫调节。干扰素是一种糖蛋白，它们具有多种作用（包括增强某种特定的免疫反应以及直接抗病毒的作用）。这一类型药物用于预防感染时要比用于治疗已经确定的感染更有效，同时这些药物通常会引起一些不良的反应，包括急性的严重不适、骨髓抑制、病毒抗性、以及造成宿主免疫系统对干扰素产生反应。
用核酸的“反义（anti-sense）”聚合体进行治疗是一种方法，在该方法中特定的病毒基因组是选择的目标。此种治疗法提供了具有高度辨别力的手段，因此预计有较低的副作用;但是将它用于治疗将会面临以下困难，例如，如何筛选靶标，如何将它引入细胞中，以及如何准确判断抑制各单链产生所需的药量。能附着于并且能干扰宿主核糖核蛋白质合成的药物将可以阻断病毒的复制。这些药物包括毒素蓖麻蛋白、不同的植物蛋白质（例如美洲商陆抗病毒蛋白质、α-帚曲菌素，以及其它低分子量的化合物）。应用这些药物的缺点是，它们缺乏选择性。在治疗HIV感染中，已经研制出又一种疗法，专门用来针对独特的逆转录病毒酶-逆转录酶。非逆转录病毒系统并不会产生或应用该种酶，但若无此种酶的存在，HIV病毒便无法复制。在某些实例中，如果能够对病毒复制机理的结构方面进一步深入了解将能提供更多的药物治疗法。某些病毒（包括正粘液病毒，副粘液病毒，疱疹病毒，囊膜病毒，以及逆转录病毒），在结构上含有一个包围病毒外壳及核酸的病毒包膜。当宿主细胞遭受包膜病毒感染时，宿主细胞的质膜会变化，以便包含含部分带有病毒密码的蛋白质，当在宿主细胞内装配的病毒的核蛋白核心离开宿主细胞时，它由已修饰过的质膜包膜，因而形成病毒包膜。当宿主受病毒感染时，因为上述结构对宿主细胞而言是非常独特的，因此可与正常细胞区分开来，它可用来作为治疗上的另一靶标。
本发明包括治疗由包膜病毒感染的方法。该方法包括将治疗有效剂量的衍生的克力克斯（n）芳烃[calix（n）arene]类化合物用于感染的部位，在该化合物环位置上连接至环的桥键的间位是具有末端羧酸衍生物、膦酸衍生物、亚磺酸衍生物或磺酸衍生物基团的极性取代基。
在一通用实施方案中，克力克斯（n）芳烃具有以下通式：
其中n=4～10，R1为OH、O=、烷基或芳基醚、酯、酸、或其混合体，
R2为带有末端羧酸衍生物（carboxylate）、膦酸衍生物（phosphonate）、亚磺酸衍生物（sulfinate）或磺酸衍生物（sulfonate）基团的极性取代基，包括其可解离的酯类和酰胺类，
R4为＞CHR″、≥CR″或其混合体，这里R″为氢或羧酸衍生物基团。
R1最好为OH，或者在该化合物的部分氧化形式中R1为OH和=O的结合体。
在一具体的实施方案中，本发明化合物具有上式结构，其中n=4、6或8，
R1为OH或=O，或为其混合体，
R2定义同上，
R4为＞CH2或≥CH，或为其混合体。
在更具体的实施方案中，R2为（CH2）mR2′，这里m=1～3，R2′为磺酸衍生物基团SO3R或SO2NRR′，这里R和R′各自为氢或低级烷基。
在另一实施方案中，R2为（CH2）mR2′，这里m=1～3，R2′亚磺酸衍生物基团SO2R或S（=O）NRR′，这里R和R′各自为氢或低级烷基。
在又一实施方案中，R2为（CH2）m-R2′，这里m=0～3，R2′为羧酸衍生物基团CO2R或C（O）NRR′，这里R和R′各自为氢或低级烷基。
在另一实施方案中，R2为（CH2）m-R2′，这里m=0～3，R2′为膦酸衍生物基团PO（OR）2、PO（OH）（OR）、PO（OR）（NRR′）或PO（NRR′）2，这里R和R′各自为氢或低级烷基。
另一方面，本发明涉及以上所述类型的新的克力克斯（n）芳烃类化合物，并且它们具有亚磺酸衍生物、磺酸衍生物、膦酸衍生物和羧酸衍生物的末端基团。
在一实施方案中，所述新的化合物包括具有以上通过结构的氧化或部分氧化的克力克斯（n）芳烃类，其中R1为OH、=O、烷基或芳基醚、酯、酸或其混合体，在克力克斯（n）芳烃化合物中至少1个R1基团为=O;R2为具有末端羧酸衍生物、膦酸衍生物、亚磺酸衍生物或磺酸衍生物基团的极性取代基;并且R4为＞CH2或≥CH或其混合体。在优选的实施方案中，R1为OH或=O，并且在克力克斯（n）芳烃化合物中至少1个R1基团为=O。
在另一实施方案中，新的化合物包括具有以上通式结构的克力克斯（n）芳烃类，其中n=4～10，R1为OH、=O、烷基或芳基醚、酯、酸或其混合体，R2为具有末端羧酸衍生物或亚磺酸衍生物基团的极性取代基，并且R4为＞CH2或≥CH或其混合体。
本发明化合物可以口服给药治疗人免疫缺陷病毒（HIV）、呼吸合胞病毒（RSV）或疱疹单纯病毒（HSV-1或HSV-2）。
本发明化合物可以经吸入给药治疗呼吸合胞病毒，以及局部给药治疗HSV-1或HSV-2。其它的给药方式有如静脉内给药。
本发明还涉及应用克力克斯（n）芳烃类化合物和抗病毒核苷类似物配方治疗病毒感染。可以将所述克力克斯（n）芳烃与核苷类似物配制成软膏剂供局部给药治疗，例如治疗由于HSV-1或HSV-2所引起的损伤。另外，本发明化合物可以配制成液体剂或片剂供口服给药治疗全身病毒感染，或配制成溶液制剂供全身给药。
另一方面，本发明还包括抑制由性交传播的包膜病毒感染的方法。在该方法中，将预防上有效剂量的大环化合物局部地用于可能的性接触部位。所述大环化合物由以连接环的桥键相连的芳环亚单元组成，结果形成相连原子的连续链构成的大环骨架，并且在芳基亚单元的非骨架原子上含有负电荷取代基。该负电荷取代基优选包括磺酸衍生物基团、亚磺酸衍生物基团、羧酸衍生物基团或膦酸衍生物基团。在一实施方案中，所述化合物包括酰胺或酯形式的负电荷取代基，它们可以在体内解离成负电荷形式。
大环化合物的环亚单元优选包括在3和6位有亚磺酸衍生物基团或磺酸衍生物基团的萘亚单元，和/或在4位有负电荷取代基的苯基亚单元，其中在萘或苯基2位环碳原子位置和相邻萘基的7位环碳位置或相邻苯基的5位环碳位置之间有桥键。
在一通用的实施方案中，所述大环化合物含有至少四个萘亚单元，各个萘亚单元在1位和8位有极性基团，在3位和6位有亚磺酸衍生物或磺酸衍生物基团，并且在一个亚单元的2环碳位置和相邻亚单元的7环碳位置之间有桥键。该类型的一个优选的化合物其通用结构式如下：
其中n=4、6或8，
R1为OH、=O、烷基或芳基醚、酯、酸、或其混合体，
R2为磺酸衍生物基团或亚磺酸衍生物基团，R4为＞CHR″、≥CR″或其混合体，这里R″为氢或羧酸衍生物基团。
在一较具体的实施方案中，R1为OH、=O或其混合体，R2为磺酸衍生物基团，R4为＞CH2或≥CH或其混合体。
在另一通用的实施方案中，所述大环化合物含有至少四个苯基亚单元，苯基亚单元在4位有负电荷取代基，并且在一个苯基亚单元的2位环碳位置和相邻的苯基亚单元的5位环碳位置之间有桥键。该类型一个优选化合物的通用结构式如下：
其中n、R1、R2和R4同上。
在一更具体的实施方案中，R2为（CH2）mR2′，这里m=0～3，R2′为磺酸衍生物基团。
在又一更具体的实施方案中，R2为（CH2）mR2′，这里m=0～3，R2′为亚磺酸衍生物基团。
在另一更具体的实施方案中，R2为（CH2）mR2′，这里m=0～3，R2′为羧酸衍生物基团。
在又一更具体的实施方案中，R2为（CH2）mR2′，这里m=0～3，R2′为膦酸衍生物基团。
本发明还涉及应用组合物的方法，该组合物含有如上所述的大环化合物与抗病毒的核苷类似物。
本发明组合物可经局部给药抑制性伙伴之间病毒感染的传播。所述组合物可以为例如凝胶润滑剂、栓剂，并且该组合物含有运载大环化合物的载体，此外，还可以将该化合物用于物理障碍类型器具的表面作抗感染的预防手段。
另一方面，本发明还包括用于抑制经性传播的包膜病毒感染的凝胶润滑剂组合物。该凝胶组合物包括凝胶润滑剂载体和溶于该载体中的如上所述的大环化合物。
又一方面，本发明包括与上述大环化合物组合使用的物理障碍类型器具，用于抑制由性传播所引起的包膜病毒感染。在一实施方案中，上述器具有含有以上所述大环化合物的凝胶润滑剂。
本发明化合物能够有效地预防由性传播的包膜病毒，包括肝炎δ病毒（HDV）、肝炎B病毒（HBV）、肝炎C病毒（HCV），乳头瘤病毒，疱疹单纯病毒（HSV-1及HSV-2），HIV-1及HIV-2，HTLV-Ⅰ及HTLV-Ⅱ。
研究以下有关本发明的详细叙述及附图，本发明上述和其他的目的以及特征将会变得更明显。
图1表示本发明的以萘为亚单元的大环化合物的一般结构式。
图2A及2B表示了图1所列化合物的非氧化（2A）及部分氧化（2B）的形式，其中n=4，亚单元为铬变酸。
图3A及3B表示合成图2A所示的一个大环化合物的两个通法。
图4A及4B表示带有混合的苯基和磺化的萘亚单元的非氧化（4A）及部分氧化（4B）的大环化合物。
图5表示将大环铬变酸上的磺酸取代基转化成甘氨酰磺酰胺和磺酰胺基团的反应。
图6表示将含有铬变酸亚单元的大环化合物中的磺酸基团转化成亚硫酸盐或亚磺酸甲酯或芳基酯的反应式。
图7表示用于本发明的由苯基所组成的大环化合物的一般结构式。
图8表示图7结构式的非氧化形式，其中n=4，亚单元为对磺酸苯酚。
图9A及9B表示合成图8化合物的非氧化及部分氧化形式的通法。
图10表示用乙酰基取代图8化合物上的环羟基的反应式。
图11表示在苯基为亚单元的大环化合物上将磺酸取代基转化成甘氨酰磺酰胺基的反应。
图12表示制备如图8所列类似的大环化合物的反应式，但该化合物带有含羧酸的桥键。
图13表示用羧酸基团取代图8化合物中羟基的反应式。
图14表示由对-叔丁基前体制备克力克斯（n）芳烃的反应式。
图15表示制备具有对-羧基取代基的克力克斯（n）芳烃的反应式。
图16表示制备经亚甲基键连接羧基取代基到对位的克力克斯（n）芳烃的反应式。
图17表示制备如图16所示的类似的克力克斯（n）芳烃的反应式，但其中羧基取代基是经亚乙基键连接到对位上。
图18表示制备具有对-膦酸（酯）取代基的克力克斯（n）芳烃的反应式。
图19表示制备经亚甲基连接膦酸（酯）取代基到对位（C-4）的克力克斯（n）芳烃的反应式。
图20表示制备对-2-溴乙基-O-甲苯磺酰基-克力克斯（n）芳烃的反应式，对-2-溴乙基-O-甲苯磺酰基-克力克斯（n）芳烃可作为制备其他克力克斯（n）芳烃衍生物的前体。
图21表示应用图20所示制备溴乙基-克力克斯（n）芳烃制备具有经亚乙基连接膦酸（酯）基到C-4位置的克力克斯（n）芳烃的反应式。
图22表示制备经亚甲基连接磺酸基到C-4位置的克力克斯（n）芳烃衍生物的反应式。
图23表示制备经亚乙基连接磺酸（盐）基到C-4位置的克力克斯（n）芳烃衍生物的反应式。
图24表示为了在亚甲基桥键上引入其他取代基而制备在亚甲基桥键（图7中R4）上带有氯原子的克力克斯（n）芳烃的反应式。
图25表示制备图12所示的类似的克力克斯（n）芳烃的反应式，起始物质为图24的环化的前体。
图26表示制备有羧甲基连接到桥键亚甲基上的克力克斯（n）芳烃（结构式LⅧ）的反应式，以及应用有机铜酸盐试剂制备在亚甲基桥键上具有经选择的R基团的各种克力克斯（n）芳烃（结构式VX）的通法。
图27表示制备在克力克斯（n）芳烃类的不同环位置上连接有3-磺酰基丙氧基的各种克力克斯（n）芳烃的反应式。
图28表示制备由苯基及萘基环相互交替的大环化合物的反应式。
图29A及29B为以环化合物KY-1（29A）和KY-42（29B）药物剂量为函数的HSV病毒得量曲线图。
图30表示化合物KY-1对3H标记的HSV-1与细胞结合的抑制作用。
图31表示HSV-1病毒蚀斑形成的抑制曲线图，（1）当病毒与化合物KY-1接触之前（空心方块），（2）病毒与化合物接触之后（实心方块），（3）病毒与化合物接触期间（实心园圈），用Vero细胞进行培育。
图32A表示HSV-1蛋白质的SDS-PAGE自动射线照相情形：A带为有巯基乙醇存在的情况;B带为无巯基乙醇存在的情况;以及HSV-2蛋白质的SDS-PAGE自动射线照相情形：C带为有巯基乙醇存在的情况;D带为无巯基乙醇存在的情况;均带有放射性同位素标记的KY-1，E带为染色标记的蛋白质的情形。
图32B表示放射性同位素标记的KY-1化合物的SDS-PAGE自动射线照相情形;A带和B带为该化合物与糖蛋白gD结合的情况;C带和D带为该化合物与糖蛋白gB结合的情况;E带和F带为该化合物与糖蛋白gC结合的情况。
图33（A-D）表示在兔上用目镜施加HSV-1之后，局部应用化合物Y-1的效果曲线图：图33A表示对表皮损伤的效果;图33B表示对结膜炎的效果;图33C表示对虹膜炎的效果;图33D表示对基质疾病的效果。
图34A和34B分别表示HSV-1（34A）和HSV-2（34B）病毒得量的下降情况：实心园圈表示感染的细胞与增加浓度的化合物Y-1单独接触时的情况;空心园圈表示感染的细胞与增加浓度的无环鸟苷单独接触时的情况;实心方块表示感染的细胞与增加的浓度（无环鸟苷+25μg/ml化合物Y-1）接触时的情况;实心隋园表示感染的细胞与增加的浓度（无环鸟苷+50μg/ml化合物Y-1）接触时的情况。
1.定义
除非另有说明，本发明中所定义的术语具有以下意义。
“包膜病毒”意指包围病毒外壳的含有蛋白质病毒包膜的病毒。所述包膜病毒包括：正粘液病毒和副粘液病毒、疱疹病毒、囊膜病毒及逆转录病毒。当细胞遭受包膜病毒感染时，宿主细胞的质膜会改变而含有部份带有病毒密码的蛋白质，当在宿主细胞内装配的病毒的核蛋白核心离开宿主细胞时，病毒蛋白质会被修饰后的质膜包膜，因而形成病毒包膜。
“性传播的包膜病毒”是已知或是疑为性接触传播的包膜病毒。具体地例子包括：δ、B、C型肝炎病毒（HDV、HBV、HCV），乳头瘤病毒、疱疹单纯病毒1及2（HSV-1和HSV-2），HIV-1（也称为HTLV-Ⅲ），HIV-2，HTLV-Ⅰ及HTLV-Ⅱ。
“芳基环”亚单元是含有至少一个芳香环（即必须有6π（Pi）电子以便是芳香性的五元或六元环）的单环或稠合的环结构。例子包括苯、萘、以及稠合的环结构，例如四氢萘，以及杂环结构，包括稠合的环结构，例如喹啉、异喹啉和吲哚。
“由芳环亚单元组成的大环化合物”是通过连接芳环亚单元上的环原子成环链而形成的环状化合物。
“克力克斯（n）芳烃”或“克力克斯芳烃化合物”是指有以下骨架结构的大环化合物：
其中n最好为4-10，在优选的实施方案中，n为4、6或8。
部分氧化的克力克斯（n）芳烃是指具有上式结构的化合物，其中R1基团中至少一个为=O。在完全氧化的克力克斯（n）芳烃中，所有的R1基团均为=O。部分氧化的克力克斯（n）芳烃的结构实例见图9B。此外，由于各个R1均为=O，应认为连在同一芳环上的R4基团为≥CR形式，即该R4基团是双键连接在该芳环上，见图9B。
在克力克斯芳烃化合物中“桥键连接在环上的位置”是指在所述化合物的各个环上的环位置的2及6位。
在克力克斯芳烃化合物中“非桥键位置”是指在所述化合物的各个环上的环位置的1、3、4及5位。
在克力克斯芳烃化合物中“桥键的间位环位置”是指在所述化合物的各个环上的环位置的4位。
“极性取代基”是指辛醇/水分配系数小于1的基团R。
“有末端羧酸衍生物、膦酸衍生物、磺酸衍生物或亚磺酸衍生物的极性取代基”是指有下式的R：-CO2-或R′-CO2-（羧酸衍生物）、-PO3-或R′-PO3-（膦酸衍生物）、-SO3-或R′-SO3-（磺酸衍生物）、-SO2-或R′-SO2-（亚磺酸衍生物），这里R′是可以有效地连接相关的羧酸衍生物、膦酸衍生物或磺酸衍生物基团到克力克斯芳烃的苯环上的有1～4个原子的直链，一个较好的R′直链是（CH2）m′，这里m=1～3。
“羧酸衍生物”基团包括羧酸基团-CO2-、羧酸盐和羧酸的酯和羧酰胺，其可在体内解离。羧酸的酯具有通式-CO2-R，这里R为未被取代的低级烷基或取代的烷基，而羧酰胺具有通式CONRR′，这里NRR′为仲胺或叔胺，即R和R′各自为氢或低级烷基或未被取代的低级烷基。在体内如果羧酸酯或羧酰胺分别经血清酯酶或酰胺酶水解，那么羧酸酯或羧酰胺可以解离为相应的羧酸基团。
“膦酸衍生物”基团包括膦酸基团-PO3-2，包括膦酸盐，以及可以在体内解离的膦酸酯和膦酰胺。膦酸酯具有通式-PO3RR′，这里R和R′为低级烷基或取代的低级烷基，膦酰胺具有通式PO（OR）、（NRR′）、PO（NRR′）2，这里R和R′各自为氢或低级烷基。在体内如果膦酸酯或膦酰胺分别经血清磷酸酶或磷酰胺酶水解，那么膦酸酯或膦酰胺可以解离为相应的膦酸基团。
“磺酸衍生物”基团包括磺酸基团-SO3-，包括磺酸盐，以及可以在体内解离的磺酸酯和磺酰胺，磺酸酯具有通式-SO3R，这里R为未被取代的低级烷基或取代的低级烷基，磺酰胺具有通式SO2NRR′，这里R和R′各自为氢或低级烷基。在体内如果磺酸酯或磺酰胺分别经血清酯酶或磺酰胺酶水解，那么，磺酸酯或磺酰胺可以解离为相应的磺酸基团。
“亚磺酸衍生物”基团包括亚磺酸基团-SO3-，包括亚磺酸盐，以及可在体内解离的亚磺酸酯或亚磺酰胺。亚磺酸酯具有通式-SO2R，这里R为未被取代的低级烷基或取代的低级烷基，亚磺酰胺具有通式SONRR′，这里R和R′各自为氢或低级烷基。在体内如果亚磺酸酯或亚磺酰胺分别经血清酯酶或磺酰胺酶水解，那么亚磺酸酯或亚磺酰胺可以解离为相应的亚磺酸基团。
术语“磺酸衍生物”、“亚磺酸衍生物”、“膦酸衍生物”和“羧酸衍生物”包括相应的酸形式及其任何药学上适用的盐。
“负电荷取代基”是指在生理状况下带负电荷的取代基。可提供负电荷的基团实例包括磺酸衍生物基团（SO3-），亚磺酸衍生物基团（SO2-），膦酸衍生物基团（-PO32），羧酸衍生物基团（-CO2-）。较好的负电荷取代基具有下式：-X-SO3-，-X-SO2-、-X-PO3-或-X-CO2-，这里X为可有效地连接相关羧酸衍生物基团、膦酸衍生物基团、亚磺酸衍生物基团及磺酸衍生物基团到克力克斯芳烃的苯环上的有1～4个原子的直链。一个较好的链为（CH2）m，这里m＝0-3。
“低级烷基”是指含有1-5个碳原子的直链或支链的烷基。
“取代的低级烷基”是指在其碳原子上有一个或一个以上取代基的低级烷基。
Ⅱ.制备芳基亚单元大环化合物
该部分叙述用于本发明方法中的两种基本类型的芳基大环化合物的合成。第一种类型化合物（萘基为亚单元）的合成方法见下面的A部分，第二种类型化合物（苯基为亚单元）的合成方法见B及C部分。从这三部分合成途径，人们将明白由混合亚单元（例如萘基和苯基亚单元）如何制备大环化合物。所述合成方法也可广泛的应用于由杂环亚单元（特别是带有磺酸衍生物基团或亚磺酸衍生物基团取代基的杂环亚单元）合成大环化合物。
A.取代的萘亚单元的大环化合物
图1表明了由取代的萘亚单元组成的用于本发明大环化合物的一般结构式。图2A及2B分别表示了该类型化合物的实例，（Ⅰ）为非氧化的形式，（Ⅱ）为部分氧化的形式。此化合物为铬变酸（1，8-二羟基-3，6-二磺酸萘）亚单元的四聚体，它是由亚甲基或次甲基（＞CH2或≥CH）桥键（R4）连接的。如图所示，亚甲基/次甲基桥键和内部的环原子（在环位置1、2、7及8）构成了一个连续的链，在1和8的位置连有R1=OH或=O极性基团。在环的3-6位上的非链原子（位于环上3-6位每个取代基）连有R2=磺酸衍生物基团或亚磺酸衍生物基团取代基。由H1及C13NMR的研究及质谱分析，推论出了部分氧化结构的特征。
在以下A-C部分的讨论和合成路线的叙述中，通常只提供化合物的非氧化亚单元形式。应该认识到，在加热与酸性情况下，暴露于空气中之后，所述化合物可能会部分或完全地氧化，即如图2B所示，所述化合物含有一个或多个R1酮基（=O），并且在环与相关的桥键（R4）之间有双键。还应该认识到，同样的反应机制通常也适用于化合物的部分氧化形式，例如图2B所示的结构，或是含有另外的R1=O基团的类似结构，例外的是R1修饰反应通常为选择性的修饰R1-OH基团，保留相应的R1=O基团不变。
下面将看出，化合物最好含有其中R1为极性取代基的铬变酸衍生物，极性取代基有例如OH，=O，CO2H，或是醚，硫醚，酯，硫酯连接的烷基或芳基，或是由以上基团的组合，例如其中在部分氧化结构中的OH基团由一个上述基团取代。
如以上所述，R2为磺酸衍生物基团或亚磺酸衍生物基团。
R3为氢原子，不具有电荷或带负电荷的取代基，将受下文所述的活性限制。R3最好为氢。
下面还将看出，连接铬变酸衍生物亚单元的R4桥键最好为＞CHR或≥CR形式（表示在部分氧化的形式中不饱和的桥键），这里R为氢或含碳的小基团，例如低级烷基、链烯基、酮、羧酸基团、或芳基，所述桥键也可为-CH2NR′CH2-形式，这里R′同样地为H或含碳的小基团，例如低级烷基。
另外，在大环化合物中桥键也可为环状结构，包括芳基环结构，如图4所示二聚的大环，或是通过杂环（如吡喃或呋喃环）成桥而形成的类似结构。
亚单元的数目可为4（如图2A结构）至8，较好的大环含有4、6或8个亚单元，在以下所述的反应式中，所形成的大环化合物可以包括由不同数目（n）的亚单元所组成的混合体，例如一个常见的结构，n=4（4个亚单元）的结构以及还有含有6或8个亚单元的结构。
下面表1列出了由R1、R2、R3及R4取代基取代的具有代表性的大环化合物，它们已被合成并测试了其抗病毒活性。表中左栏的KY及Y数目是指相应化合物的类似物名称。例如，其中R1为OH、R2为SO2NH2、R3为H、R4为-CH2-的化合物称为KY-3。虽然在表中并未列出，但这些化合物均可以部分氧化的状态存在，其中一个或多个R1基团为=O，并且相邻的桥键含有双键碳连接到环上。
表1
KY R1R2R3R4
KY-1 OH SO3Na H >CH2
KY-3 OH SO2NH2H >CH2
KY-42 OH SO3Na H >CHCO2H
KY-48 OH SO3Na H >CHCHOHCH2OH
KY-85 OH SO3Na OH >CHC6H6
KY-97 OH SO3Na H >CH2CH=CH2
KY-110 OH SO3Na H >CHO(O)CH3
KY-121 OH SO2C6H3(OH)2H >CH2
KY-123 OH SO2Na H >CH2
KY-143 OH SO3Na OH >CH2
KY-147 OH SO2NHCH3H >CH2
KY-148 OH SO2NHEt H >CH2
KY-151 OCH3SO3Na H >CH2
KY-158 OH SO2CH3H >CH2
KY-171 OH SH H >CH2
KY-175 OH SO3CH3H >CH2
KY-176 OH SO2NHC6H6H >CH2
KY-193 OH SO3Na Br >CHBrCH2Br
KY-194 OH SO3Na Br >CH2
KY-270 OCOCH3SO3Na H >CH2
KY-272 OCOCH3SO3Na H >CHCO2H
KY-276 OCOEt SO3Na H >CH2
KY-277 COEtCl SO3Na H >CH2
KY-280 OCH3SO3Na H >CH2
KY-281 OCOC3H7SO3Na H >CH2
KY-284 OCH3SO3Na H >CHCO2H
KY-285 OCOCH3SO3Na H >CH2
KY-288 OCOPr SO3Na H >CH2
KY-289 OCOC4H9SO3NH4H >CH2
KY-290 OCOBu SO3Na H >H2
KY-291 OCOC5H11SO3NH4H >CH2
KY-293 OCOCH=CHCH3SO3NH4H >CH2
KY-294 OCO(CH2)6CO2H SO3NH4H >CH2
KY-307 O(CH2)5CO2H SO3NH4H >CH2
KY-346 OH SO3Na H -CH2N(CH3)CH2
KY-352 OH SO3NHC6H11O5H >CH2
KY-357 OH SO2NHCH2CO2Na H >CH2
KY-359 OH SO2NHOH H >CH2
KY-395 OCH3SO3Na H -CH2N(CH3)CH2-
KY-397 OCH3SO2NH2H >CH2
KY-398 OCH3SO2NHCH2CO2H H >CH2
KY-399 OCH3SO2NHCH2CO2H H -CH2N(CH3)CH2-
Y-20 OH SO3Na H -CH2C4H2OCH2-
Y-34 OH SO3Na H -CH2C6H4CH2
Y-66 OH SO3Na H >CHCO2H
KYY-19 OH SO2NHCH(CH2)2(CO2H)2H >CH2
图3A及3B说明了制备大环铬变酸化合物的两个较好的合成方法。图3A所述方法涉及铬变酸衍生物（包括铬变酸本身）与醛（RCHO）的环化形成大环化合物，如图2所示的四聚体，其中铬变酸亚单元是通过R取代的亚甲基基团连接，即R4为＞CHR（包括≥CR）。所示合成路线提供了制备具有各种不同亚甲基桥键R基团的大环化合物的简便的方法，该方法是在式RCHO醛存在下进行环化反应。
例如，为了制备带有-CH2-桥键的大环化合物，如KY-1化合物（Ⅳ），使铬变酸（Ⅲ）和甲醛反应。一般的反应条件在实施例1A中KY-1的合成中给出。同样，KY-42是通过二羟乙酸环化而得（实施例1C）;KY-48是在甘油醛存在下制得;KY-85是在苯甲醛存在下制得;KY-97是在丙烯醛存在下制得;KY-110是在丙酮醛存在下制得。人们会明白，各种带有小烷基、链烯基、酸及其它烃R基团的其它的RCHO醛也均适用。此外，R桥键可在环化反应后再加以修饰。例如，KY-193可通过KY-97化合物的溴化制得。
图3B所示的方法中，铬变酸衍生物（Ⅲ）的环化是通过与六亚甲基四胺反应进行的，结果生成-CH2N（CH3）CH2-（Ⅴ）的3-原子链桥。合成KY-346的环化反应见实施例1J。-CH2N（CH3）CH2-桥键在环化反应后可以按已知方法进行修饰，生成-CH2N（R′）CH2-的各种不同的N-取代的桥键，这里R′为各种含碳的小基团。在部分氧化的结构中，一些桥键可以为=CHN（R′）CH2-形式。
如以上所述，图4A所示化合物为典型的带环状桥键（在此为苯基桥键）的大环萘。如实施例3所述，在盐酸存在下，使铬变酸与1，2-苯二甲醇的乙酸液进行反应，得到上述化合物。类似的方法可用于其它环桥键例如呋喃、吡喃、吡咯等连接铬变酸亚单元。图4A及4B表示化合物的非氧化形式（Ⅵ）及部分氧化形式（Ⅷ）。
已知可用两个通法合成带有经选择的R1、R2及R4取代基的大环化合物。其中一个方法是，将铬变酸的衍生物在环化后再加以修饰，结果经环化的产物或者含有经选择的R1、R2和R4取代基，或者含有可容易地改变为经选择的取代基的取代基。该方法通过其中含有SO2NH2R2取代基的KY-3的合成而详细叙述，详见实施例1B。此时经环化的铬变酸（Ⅷ）首先与氯磺酸反应，生成相应的R2=SO2C1衍生物（Ⅸ，图5）。然后使该大环化合物与氨水反应，生成所需的R2=SO2NH2衍生物（Ⅹ，图5）。
可以用类似的方法合成KY-357（R2=SO2NHCH2CO2H），其方法是使最后的亚单元与甘氨酸于碱性pH条件下反应（Ⅺ，图5）。
图6（与图5配合），说明将环化的铬变酸的磺酸基团转变为亚磺酸盐（Ⅻ）及亚磺酸甲基酯（XIV）的方法。如以上所示，整个反应过程的第一步涉及生成相应的磺酸氯衍生物（Ⅸ）。然后用亚硫酸钠处理，生成相应的亚磺酸盐Ⅻ。然后在碳酸氢钠存在下与硫酸二甲酯反应，得到相应的亚磺酸甲基酯（XIV）。
同样，带有各种不同R1取代基的大环化合物可以在环化之后通过修饰铬变酸制得。在合成KY-151时，例如可以使（R=OCH3）环化的铬变酸按实施例1F所述在碱性条件下与硫酸二甲酯反应生成环化的铬变酸二甲醚。同样，在制备KY-307（R1=O（CH2）5CO2H）时，可以在碱性反应条件下使环化的铬变酸与6-溴已酸反应，首先使环化的铬变酸转变成己酸的二醚。
作为另一实施例，在制备化合物例如KY-272和KY-294（其中R1为OCOR形式）中，可以按实施例1J合成KY-285所述，使通过环化铬变酸形成的大环化合物于碱性条件下与式RCOCl酰氯反应。
在第二个通法中，通过萘亚单元的衍生反应，使经选择的取代基在亚单元萘上形成，然后使亚单元环合，生成所需的大环。对于K-175（R2=SO3CH3）的合成，按以上所述使铬变酸与磺酰氯反应，生成相应的R2=SO2Cl取代基。进一步与NaOCH3反应，生成所需的R2取代基，反应的详细叙述参见实施例1H。
人们明白，生成经选择的取代基的大环化合物的合成方法包括首先的铬变酸衍生反应和环合后随后的亚单元的衍生反应。例如在制备KY-397（R1=OCH3，R2=SO2NH2）中，首先在R1位置使铬变酸亚单元反应，生成如以上所述的二甲醚衍生物。与甲醛进行环合之后，如以上所述使所述化合物在R2位置进一步地衍生，将SO3基团转变为所需的SO2NH2取代基。
以上所述KY化合物可以容易地转变为各种亚磺酸衍生物、磺酸衍生物，其酸和盐。按照熟知的方法，使盐和酸形式在一般的阳离子交换树脂上进行交换，用一种阳离子代替另一种阳离子。因此，例如在铵盐（如氯化铵）存在下，通过质子阳离子交换，可以得到表1所示几个KY化合物的铵盐。此外，使大环化合物与各种金属阳离子（如Ca、Ba、Pt、Cu、Bi、Ge、Zn、La、Nd、Ni、Hf或Pd的阳离子）反应，可以得到所述大环化合物的金属盐和金属螯合物，其中金属在所述化合物的内侧极性凹处进行螯合。
如实施例1A、1B、1C和1J所述，用吸收光谱和质谱及核磁共振谱（NMR）研究了本发明制得的几个太环化合物的物理特征。所述化合物包括四聚大环化合物（如图2所示），或四聚形式占主要的混合物。
B.克力克斯（n）芳烃化合物
图7表示可用于本发明方法的此类克力克斯（n）芳烃类化合物通式。该类型的一个实例化合物参见图8，它是由亚甲基桥键连接的苯酚对磺酸亚单元的四聚体（XV）。如图所示，亚甲基桥键与“内侧”环原子（环位置2、1和6）形成连续的链，同时在环的1位有R1=OH基团。在环的4位原子上的非链原子（环位置3～5位上每一个取代基）有R2=磺酸取代基。
图9A列示出生成克力克斯（n）芳烃类化合物的通法。左边所示的前体（XVI）为叔丁基克力克斯（n）芳烃，其中n为该大环化合物中苯酚亚单元（带有对位叔丁基取代基）的数目，桥键为亚甲基。有4、6和8个亚单元的叔丁基克力克斯芳烃市场上是可以买得到的，更多亚单元和奇数亚单元的克力克斯（n）芳烃可以按一般的纯化方法制得。
在图9A所示的磺化反应中，通常将经选择的亚单元数目的叔丁基克力克斯芳烃与浓硫酸于75～85℃反应4～5小时，以便实质上完全地用磺酸基取代4-位叔丁基。磺化反应的详细叙述参见实施例2A。上述方法已用于制备图8所示n=4的大环化合物，以及有6和8个苯酚亚单元的有关大环化合物。
用于制备部分氧化1位OH基团的磺化克力克斯芳烃的类似方法参见图9B所示。此时将叔丁基克力克斯芳烃起始原料用浓硫酸于100℃以上，最好于150～170℃进行处理。该反应可有效地磺化亚单元环和部分地氧化内侧OH基团。如图9B所示，部分氧化反应可产生共轭的克力克斯（n）芳烃结构（XVⅢ），其中桥键提供非定域的电子。上述共轭结构是有色的，而有色产物的显谱可用于监测氧化反应的过程。该反应的详细叙述参见实施例2B。
人们明白，所需的大环化合物也可以按下法直接地制备：在合适的形成桥键的条件下，如按上述制备萘亚单元大环化合物的方法使对磺酸苯酚（或其前体）进行反应。详细叙述参见图12制备含有羧酸桥键基团的大环化合物的反应。在该方法中，按实施例1C所述类似的条件，使苯酚对磺酸与二羟乙酸反应，生成XXⅡ所示的环合结构。在实施例2F中详细叙述了XXⅡ的合成。
按照以上部分ⅡA所示的通法，可以将以上生成的克力克斯（n）芳烃类化合物进行结构修饰，以便得到经选择的R1基团、经修饰的磺酰基、和/或加入R2基团。R1和R2取代基的范围实质上与上述部分ⅡA所述相同。图10、11和13详细叙述了改变已经生成的大环化合物的R1或R4基团的各种反应方法。在图10中，将图8所示的磺化结构用乙酐处理，生成O-乙酰基R1基团。该反应的详细叙述参见实施例2C。
实施例2G叙述了在R1位置生成甲苯磺酸酯的类似反应方法。
图11详细叙述了生成磺酰胺类，如图8化合物的甘氨酰磺酰胺（ⅩⅪ）的通法。类似于图5所述的反应，使磺化的苯基克力克斯（n）芳烃化合物（ⅩⅦ）与氯磺酸反应，生成相应的磺酰氯类似物（XX）。与经选择的胺（如甘氨酸）进一步反应，得到所需的磺酰胺。反应的详细叙述参见实施例2D中R2=SO2NH2化合物的合成，以及实施例2E中甘氨酰磺酰胺化合物的合成。
图13表示基本取代反应：R1=OH由R1=碳基团取代的非专有的一般合成方法。在实施例2H中详细叙述了该反应方法：由作用物（R1=OH，R2=叔丁基，R4＝CH2，n=4）得到一种中间体（R1＝CN，R2=叔丁基，R4=CH2，n=4）。然后再进一步进行改变，得到产物（R1=CO2H，R2=SO3H，R4=CH2，n=4）。
人们明白，在R1位置的取代基的改变可以有选择地在部分氧化的大环化合物（如图9B所示的结构）中的OH位置上进行。即对环OH基团是特异的反应将会保留完整的=O基团，结果得到含有=O基团的混合R1基团。
R3通常为氢，但是可以为不带电荷的或带负电荷的取代基，类似于以上部分ⅡA所述的R3的基团。
连接铬变酸衍生物亚单元的R4桥键最好是＞CHR或≥CR，这里R为氢或含有碳的小基团如以上所述的低级烷基、链烯基、酮或羧酸基团，或芳基，或者R4为-CH2NR′CH2-，这里R′同样地为氢或含有碳的小基团如低级烷基。另外，类似于图4所示的二聚大环化合物，在大环化合物中的桥键可以是环结构，包括芳环结构。
如以上所述，亚单元的数目可以从4（例如图8结构）至8之间变化，含有4、6和8个亚单元的大环化合物较好。在下面所述的反应式中，生成的大环化合物可以包括具有不同的亚单元数目（n）化合物的混合物，例如主要n=4结构（4个亚单元）与另外的含5～8个亚单元结构组成的混合物。
已被合成并测试了其抗病毒活性具有代表性的克力克斯（n）芳烃类化合物是下面表2中被R1、R2和R4取代的化合物。和表1一样，表2左边栏中的KY和Y数字是指相应化合物的类似名称。该表的第2栏表示在R1位置部分氧化的以及有饱和与不饱和桥键亚甲基碳基团的化合物。
表2
合物号 R1R2R4n
Y-1 OH SO3-CH2- 8
KY-226 O/OH SO3-CH2/=CH- 8
Y-49 OH SO3-CH2- 4
KY-225 O/OH SO3-CH2/=CH- 4
Y-77 OH SO3-CH26
Y-48 O/OH SO3-CH2/=CH- 6
KY-268 O/OH SO3-CH2/=CH- 3
KY-269 O/CO2CH3SO3-CH2/=CH- 4
KY-271 O/CO2CH3SO3-CH2/=CH- 3
Y-78 O/OH SO2NH2-CH2- 8
Y-100 O/OH SO2OCH3-CH2- 8
按熟知的方法，根据以上所述通过在酸中进行反应，或在合适的盐存在下进行反应，可以容易地将表2所示化合物以及以上所述化合物的R基团组合物转变为各种磺酸或磺酸盐。
C.带有磺酸衍生物、亚磺酸衍生物、膦酸衍生物和羧酸衍生物基团的大环化合物
根据本发明，一类可有用于抑制包膜病毒感染的化合物是克力克斯（n）芳烃类化合物，其中连接桥键的环位置的间位，即带有取代基R2的4位（图7），由带有末端磺酸衍生物、亚磺酸衍生物、膦酸衍生物或羧酸衍生物基团的带负电荷的取代基取代。
制备其中在环4位带有磺酸衍生物基团的克力克斯（n）芳烃化合物的方法参见实施例2A、2B和2C，包括在环1位带有不同取代基的化合物。带有磺酰胺基团的化合物，包括其末端带有羧基的化合物分别参见实施例2D和2E。
图14表示将叔丁基克力克斯（n）芳烃（XXⅤ）转变为未被取代的克力克斯（n）芳烃（XXⅥ）的方法，化合物XXⅥ可用作为下面一些合成的起始物质。该反应的详细叙述参见实施例2J。
图15表示将带有对乙酰基的克力克斯（n）芳烃（XXⅦ）转变为带有对羧基的克力克斯（n）芳烃（XXⅧ）的方法。详细叙述参见实施例2K。
为了得到图16所示的对羧甲基化合物（XXXⅠ），将上面得到的化合物XXⅥ通过与二甲胺和甲醛反应，使其转变为相应的（二甲氨基）甲基化合物（XXⅨ）。然后将该化合物XXⅨ转变为相应的氰基甲基化合物（XXX），将此化合物XXX在酸中加热，转变为所需的羧甲基化合物（XXXⅠ）。详细叙述参见实施例2L。
图17表示羧乙基克力克斯（n）芳烃（XXXⅢ）的合成方法。将上面（图16）得到的中间体XXⅨ依次与Mel和二乙基丙二酸酯的钠盐反应，得到二乙基丙二酰基甲基化合物（XXXⅡ）。于酸中加热，得到所需化合物XXXⅢ。详细叙述参见实施例2M。
图18表示合成对膦酸（酯）克力克斯（n）芳烃（XXXⅥ）的方法。在该方法中，将上面得到的化合物XXⅥ进行碘化，然后与二乙基亚膦酸酯反应，得到二乙基膦酸酯化合物（XXXⅤ）。在酸中回流，得到所需的化合物XXXⅥ。详细叙述参见实施例2N。
图19表示膦酰基甲基克力克斯（n）芳烃（XXXⅨ）的合成方法。如图19所示，将上面得到的化合物XXⅥ进行氯甲基化，得化合物XXXⅦ，再与三乙基亚磷酸酯反应，得二乙基膦酰基酯化合物（XXXⅧ）。于酸中加热，得到所需的膦酰基甲基化合物详细叙述参见实施例2O。须明白的是，氯甲基中间体还可用于合成磺酰基甲基克力克斯（n）芳烃类似物。
图20表示用于制备膦酰基乙基或磺酰基乙基克力克斯（n）芳烃的对-2-溴乙基化合物的合成，详细叙述参见实施例2P。参考图20，将上面制得的化合物XXⅥ在酚羟基上进行烯丙基化，得到化合物XL，然后进行加热，得到重排产物XLI。进行甲苯磺酰化以保护苯基上的羟基，得到化合物XLⅡ，再使其转变为对羟乙基衍生物XLⅢ。进一步与三苯基膦二溴化物反应，得到所需的对溴乙基化合物XLⅣ。
用类似于上述图19所示反应顺序，将对溴乙基克力克斯（n）芳烃XLⅣ用于合成对膦酰基乙基化合物XLⅥ。图21所示反应式的详细叙述参见实施例2Q。
如图22所示，以上应用的中间体对氯甲基克力克斯（n）芳烃（化合物XXXⅦ）还可用于合成对磺酰基甲基克力克斯（n）芳烃XLⅦ，详细叙述参见实施例2R。
同样，如图23所示，上面所述的对-2-溴乙基中间体XLⅣ可用于合成对磺酰基乙基克力克斯（n）芳烃XLⅨ，详细叙述参见实施例2S。
人们明白，当需要时，通过图6所示方法和实施例1D例举的方法，可以将磺酸衍生物基团转变为亚磺酸衍生物基团。
前面所述的合成方法可用于制备在桥键的间位（C4环位置）有负电荷取代基的克力克斯（n）芳烃化合物，所述负电荷取代基末端带有磺酸衍生物、亚磺酸衍生物、膦酸衍生物和羧酸衍生物基团。所列出的合成方法表明了酸基直接连接到环上或通过烷基键（如甲基键和乙基键）连接。由以上讨论人们会明白如何制备通过较长的烷基基团连接到环上的酸基化合物。如以上所述，还可以将酸基转变为相应的盐。
人们还会明白如何制备本发明大环化合物（例如克力克斯芳烃化合物）中末端酸基的各种酯和酰胺。所述衍生物可用作为“前药”，其中酯或酰胺在体内通过酶催化水解（如通过酯酶）转变为相应的带负电荷的酸基。
一般来说，羧酸和磺酸的酯可以按常规的酯化反应制得，其中例如将酸转变成酰氯，然后与醇（如烷基醇）反应。羧酸或磺酸的酰胺同样可以通过酰氯与胺（如烷基胺）反应而类似地制得。较好的酯包括芳基和低级烷基（如正丁基烷基）碳酸酯。较好的酰胺包括低级烷基的酰胺。
同样可以按照常规的膦酸酯化或酰胺化反应的方法，将膦酸克力克斯（n）芳烃转变为相应的酯或酰胺。参见图21，制备二乙基膦酰酯的一个方法上面已经叙述。
除了在克力克斯（n）芳烃环的C4位有极性取代基之外，本发明还设想使在其他环位置和在大环化合物的桥键位置进行取代的克力克斯（n）芳烃应用于本发明方法。例如，C3和/或C5环位置可以用卤素（如F或C1）进行取代。如以上所述有关的几个萘环大环，在“内侧”环位置（在克力克斯（n）芳烃的C1环位置）进行的取代与抗病毒活性是相适应的，同样，如以上所述，在萘环大环的桥键位置进行的取代与抗病毒活性是相适应的。
图24和25表示连接羧基到克力克斯（n）芳烃的亚甲基桥键上的一个方法。在该方法中，将对叔丁基克力克斯（n）芳烃XXⅤ的羟基进行乙酰化，并在产物L的亚甲基桥键上进行氧化，得酮桥键化合物LI。用硼氢化钠还原，接着与亚硫酰氯进行反应，得到在亚甲基桥键上氯化的化合物LⅢ。详细叙述参见实施例2T和2U。
参见图25，将化合物LⅢ进行氰化，然后与酸反应，在亚甲基桥键上生成羧基。将得到的化合物LV与三氯化铝反应，使其脱去叔丁基，结果得到羧酸化桥键的克力克斯（n）芳烃LVI。另外，如以上所述，通过与硫酸反应，使化合物LV在C4环位置进行磺化，人们明白，类似的方法可用于生成相应的对膦酸或对羧酸克力克斯（n）芳烃类，但是桥键羧基和/或环羟基开始需进行保护。
按图26所示方法，如图26左边所示用合适的铜酸盐试剂，应用上述化合物LⅢ可以制得各种桥键取代基，图26右边所示的反应表示如何将克力克斯（n）芳烃LⅢ转变为有羧甲基连接到亚甲基桥键上的化合物。该反应的详细叙述参见实施例2W和2X。可以将最终反应产物（LⅧ）进行对位磺化，或者如以上所述用其他的酸基团在对位进行派生。
图27表示涉及克力克斯（n）芳烃类和丙烷-1，3-砚的各种派生反应。如图所示，该反应可以有效地在环羟基位置上加成烷基磺酸。该方法提供了制备环连接磺酸基团的克力克斯（n）芳烃的另一途径，举例的反应条件参见实施例2P和2Z。
最后，图28表示制备含有交替苯基和萘基的混合大环化合物的方法。该大环化合物在实施例3B中详述。
Ⅲ.抑制病毒感染
该部分试验含有大环化合物的组合物对各种包膜病毒感染的抑制作用。试验的包膜病毒有疱疹病毒、疱疹单纯病毒-1（HSV-1）和疱疹单纯病毒-2（HSV-2），它们是双股DNA病毒（Roizman）;人免疫缺陷病毒（HIV）（RNA逆转录病毒）（Popovic;Barre-Simoussi）;以及流感A和B病毒和呼吸道合胞病毒（RSV），它们均为RNA病毒（Chanock）。
为了进行比较，也试验了经选择的非包膜病毒，它们包括腺病毒（双股DNA病毒）（Rowe;Hilleman）;以及鼻病毒（单股RNA病毒）（Dick）。病毒感染的抑制通常是用抑制在感染的培养细胞中可检测的细胞致病作用的情况来测定的。HSV-1和HSV-2在培养细胞中的抑制作用也用下述的抑制病毒与可感染的细胞的结合，以及抑制已感染的细胞中的病毒蚀斑形成来表示。
此外，如实施例4所述，应用一组人细胞系，试验了许多具有代表性的芳基大环化合物（包括表1和表2所示化合物）在细胞培养中对细胞株的毒性。简单地说，是将经选择的KY-或Y-化合物以最终浓度5、10、25、50或100μg/ml加到细胞培养物中。3天后洗涤细胞以除去药物，并用活性染色剂染色，测定各培养物中死细胞的百分数。IC50药物浓度（即是使细胞死亡50%的药物浓度数值），KY-143和KY-163为50μg/ml，所有其他受试的KY化合物的IC50为100μg/ml或更大。分子量为1404道尔顿的KY-1其药物浓度为100μg/ml，相当于约66μM。
A.抑制HSV感染：萘亚单元化合物
用含有表1和2中一个化合物构成的组合物试验抑制在培养的HSV感染细胞中的细胞致病作用（CPE）。在实施例5报道的方法中，用HSV-1或HSV-2感染Vero细胞，并使其在培养基中生长，直至细胞致病作用明显地可见。在没有感染的情况下细胞形成均匀的单层成纤维细胞状细胞。用HSV感染，细胞致病作用其特征在于，24小时之后混悬液中圆细胞明显活动，接着在24～72小时之后感染的细胞凝集并溶胞。
在实施例5报道的药物抑制作用中，使细胞与HSV-1或HSV-2病毒接触，同时与经选择的芳基大环化合物接触，化合物的最终药物浓度为10μg/ml。24小时之后检查细胞致病作用。如果药物浓度为10μg/ml仍未观察到明显的细胞致病作用，那么一些化合物用20μg/ml的药物浓度重复进行试验。
下面表3列出了用于本试验的50个萘亚基大环化合物。第2栏中的符号“+”表示该化合物在10或20μg/ml时对抑制细胞致病作用是有效的。符号“-”表示在10或20μg/ml剂量下观察到细胞致病作用（CPE）。
表3
CPE HSV-1 HSV-2
化合物 10,20μg/ml IC50(μg/ml) IC50(μg/ml)
KY-1 + 2.7 1.7
KY-3 + 2.4 2.5
KY-42 + 1 3
KY-48 - N1N
KY-85 - N N
KY-97 + N N
KY-110 - N N
KY-121 + 1.5 1.8
KY-123 + 1.5 1.5
KY-129 + 1 1
KY-143 - N N
KY-147 - N N
KY-148 - N N
KY-151 + 1.25 1.8
KY-158 - N N
KY-171 + 2.5 3
KY-175 - N N
KY-176 N N N
KY-193 GC N N
KY-194 + 1 1
KY-280 + 2 2
KY-272 + N N
KY-276 + 1.3 1.2
KY-277 + 1 1.2
KY-280 + 1.1 1
KY-281 + 0.5 1.5
KY-284 + 1 1.6
KY-285 + 1 1.5
KY-286 + 2 2
KY-288 + 1.7 2
KY-289 + 2.2 1.7
KY-290 + 1.2 1.3
KY-291 + 1.4 2
KY-293 + 1.9 2.7
KY-294 + 1 2.2
KY-301 + 1 1
KY-307 + .8 2
KY-308 + .9 1.2
KY-345 + 5 6.7
KY-346 + 4.4 6.2
表3
CPE HSV-1 HSV-2
化合物 10,20μg/ml IC50(μg/ml) IC50(μg/ml)
KY-352 + 3.4 4.1
KY-357 + 4 3.3
KY-359 + 5.75 4.2
KY-376 + 2.7 1
KY-395 - N 9
Y-4 + 5.5 6.4
Y-14 + 2.5 3.5
Y-20 + 5 3.2
Y-34 + 2.5 2
Y-66 + N N
1N表示在试验的最大浓度未见抑制CPE，或者预测的IC50未见有效的抑制作用。
如实施例6所述，用表3中的化合物进一步以蚀斑减少试验检查其抗HSV的活性。在培养过夜后使Vero细胞与0.625～10μg/mlKY化合物序列稀释液以及HSV-1或HSV-2病毒接触2小时。在洗涤以便除去药物和细胞外病毒之后，将细胞进一步培养2天，然后染色并计算蚀斑形成。将生成的蚀斑除以受感染而未处理的全部蚀斑测得百分抑制率。由抑制蚀斑的浓度作用曲线（用对照百分率表示可以测出产生50%蚀斑减少所需化合物的浓度（IC50）。在表3右边栏中列出了由HSV-1和HSV-2感染的IC50值。
参考表1所示化合物结构，下面的R基团可以被认为提供低的活性（在10～20μg/ml剂量下未见能保护细胞免遭细胞致病作用）：KY-48、KY-49和KY-110中亚甲基桥键中大的侧链;KY-143中OH的R3基团，KY-147和KY-148中R2位上带有非极性烷基的磺酰胺;KY-158和KY-175中R2位上带有非极性烷基的亚磺酸酯或磺酸酯;KY-395中三甲胺桥键与R1位上甲醚取代基的组合。KY-193的“GC”符号意指形成了一些巨大细胞，这表明有部分抑制作用。
下面查看在10～20μg/ml剂量下具有完全抑制细胞致病作用（CPE）的化合物，以下R基团被认为是较好的基团。
R1位置含有OH，包括OH与=O基团的组合;烷基和芳基酯，包括所述酯与=O的组合;烷基醚，包括所述醚与=O的组合。
在R2位置上合适的基团有磺酸或磺酸盐，亚磺酸及其盐，带有极性胺基（如NH2、NHOH、N-苷类（KY-352）和氨基酸类）的磺酰胺。
R3位置上，较好的基团为氢或溴。
合适的桥键基团是取代和未取代的亚甲基，其中R基团不是大的烷基，较好的是羧酸基团。
进一步地选择R基团的指导原则是：2个HSV试验中至少1个其ED50值≤1μg/ml的化合物应有以下1个R基团，其特征在于：
化合物的R1基团为低级烷基醚或酯，或含有末端羧酸基团通常是最具有活性的，尤其是在化合物的其他R1位上有=O基团组合。
R2基团是磺酸或磺酸盐或带有末端羧酸的磺酰胺。该特征表明R2位的酸基团有利于增加活性。
R4桥键为亚甲基或带有羧酸基团的亚甲基。
实施例7所述病毒抑制试验中，评定在经选择的药物浓度最高至10μg/ml时所选择的萘亚单元化合物抑制HSV-1和HSV-2病毒得量的能力。简单地说，是使培养的赫拉细胞株与连续稀释的KY化合物和病毒接触，使其生长24小时，然后冷冻/解冻3次，以便分离病毒颗粒。使Vero细胞感染，按实施例6所述检查连续稀释的病毒溶胞产物的蚀斑数目。以药物浓度为函数，将病毒得量的下降制图，图29A和29B分别为化合物KY-1和KY-2的曲线图取决于药物和病毒，与剂量有关的病毒得量的下降在约3～5个数量级之间。抑制病毒得量的程度通常是HSV-1大于HSV-2。用几个其他的KY化合物可观察到类似的结果。
B.抑制HSV活性：克力克斯（n）芳烃类化合物
用以上表2所列的几个克力克斯（n）芳烃类化合物进行类似的抗HSV活性的研究，结果见表4。由表4的第2栏可以看出，在10～20μg/ml浓度所有试验的化合物能抑制CPE。在蚀斑减少试验中受试化合物对HSV-1和HSV-2的抑制作用列在该表右边的栏目中（IC50以μg/ml表示）。
表4
CPE HSV-1 HSV-2
化合物 10,20μg/ml IC50IC50
(μg/ml) (μg/ml)
Y-1 + 7 7.2
KY-226 + 1.6 3
KY-49 + 5 10
KY-225 + 1.8 1.8
KY-77 + 8 11
Y-48 + 1.5 1
KY-268 + 4.4 1.5
KY-269 + 2.4 2.3
KY-271 + 4.2 2.4
观察到的苯亚单元化合物的最高活性与萘亚单元化合物的最高活性相差不大，例如差约1～3μg/ml IC50值。
最有活性的化合物Y-226（n=8）、Y-48（n=6）和Y-225（n=4）均有部分氧化的R1OH/=O基团，各个部分氧化的化合物与其相关的非氧化同类物相比实质上有更高的活性。
部分氧化的n=3化合物KY-268与其n=4、6和8的同类物相比活性稍微低些。在非氧化的化合物中，n=8化合物Y-1与其相应的n=4和n=6化合物相比活性稍微高些。
在R1位上加入乙酰基，部分氧化的化合物的活性几乎没有产生什么改变，这与萘亚单元化合物得到的结果是一致的，在R1位上加入烷基酯得到的活性与部分氧化的类似物不相上下。
作为在苯亚单元化合物中选择最优化合物活性的一般指导原则，通常应用以上讨论相同的规则。因此，当R2基团以带负电荷基团（如磺酸）终接时，那么预计有最高的活性。更一般说来，本发明设想将以R2基团为磺酸、膦酸或羧酸基团（包括所述酸的酯或酰胺，它们在体内通过水解可解离为相应的酸）终接的极性取代基的克力克斯（n）芳烃类化合物用于治疗包膜病毒感染。对用于抑制由性传播的包膜病毒的感染，本发明设想应用其R2基团为以磺酸衍生物、亚磺酸衍生物、膦酸衍生物或羧酸衍生物基团终接的带负电荷取代基的大环化合物。
所述化合物还包括在体内通过水解可解离为酸基团的带负电荷的酯或酰胺。各种磺酸、膦酸和羧酸的酯和酰胺已表明在体内经水解解离成相应的酸（Svensson，1988，1991;Stella;Bundgaard），所述酯和酰胺包括低级烷基的酯和酰胺。制备该类型的各种实例化合物的方法已在上述部分Ⅱ中叙述。
如以上部分ⅡB和ⅡC所述，具有末端酸基（或可解离为末端酸基的基团）克力克斯（n）芳烃类化合物可以在其他环位置和桥位置上进行取代。一个较好的实施方案是R1取代基为OH基团，或者如果该化合物是部分氧化的，那么R1取代基为OH与=OH基团的组合。
C.抗-HSV化合物的比较
将KY-1对耐药株HSV-1和HSV-2的抑制作用与几个用于治疗HSV感染的抗病毒剂进行比较。受试验化合物是核苷类似物无环鸟苷（ACV）、ganciclovir（DHPG）、鏻甲酸（PFA）和磷酰基甲氧基乙基腺嘌呤（PMEA）。按上述方法测定病毒得量的抑制：在野生型或耐药株HSV-1或HSV-2和经选择的抗病毒化合物的连接稀释液存在下感染赫拉细胞，并如以上所述用连续稀释的赫拉细胞溶胞产物感染Vero细胞。抑制作用的详细叙述参见实施例8。
表5列出了ID90浓度（该浓度抑制90%病毒得量）。KOS（HSV-1）和333（HSV-2）是野生型病毒;KOS（PMEA）和KOS（PFA）′是具有DNA多聚酶突变的耐药HSV-1株。333（DHPG）株是具有胸苷酶突变的耐药HSV-2株。除了作为耐药株HSV-1抑制剂的DHPG和作为耐药株HSV-2抑制剂的PMEA以外，当用需要抑制病毒得量的药物浓度进行测量时，与野生型株HSV-1或HSV-2相比，所有核苷类似物对耐药株的活性至少约低20倍。相反，对耐药株HSV-1和HSV-2，芳基大环化合物显示出与抗野生型株实质上同样有效的活性。
表5
试验的药物(ID90)#
株/药 KY-1 ACV DHPG PFA PMEA
病毒 物选择 突变位点 (ug/ml) (uM) (uM) (uM) (uM)
HSV-1 KOS None 1.9 14 2 180 100
KOS(PMEA)' DNA pol 2.6 380 NT 3000 >2000
KOS(PFA)' DNA pol 4.3 100 1 >1000 >1000
HSV-2 333 None 3.2 ≈10 2 150 155
333(DHPG) TK 3.7 >100 215 NT 120
表5的数据表明，在抗野生型病毒有效的类似的药物浓度下，芳基大环化合物抗耐药株HSV是有效的，相反，除了作为HSV-1株抑制剂的DHPG以外，2个耐药株均对ACV、DHPG、PFA和PMEA显示出显著的抗性，这已由抑制病毒需要数倍高的ID90药物浓度得到证实。
D.抑制RSV和流感A病毒感染性
用表1具有代表性的大环化合物试验经流感A病毒（A/台湾株）或RSV病毒感染后在培养的MDCK或HEp2细胞中抑制细胞致病作用。在抑制流感A病毒感染性的方法中，用该病毒感染MDCK细胞，并使该细胞在培养基中生长，直至明显可见到细胞致病作用。在没有感染的情况下，细胞形成均匀的单层成纤维细胞样的细胞层。用病毒感染，细胞致病作用的特征在于观察到细胞凝集。如实施例9和11所述，对于各个受试化合物，将0.1、1、10、25和100μg/ml的药物浓度的在病毒感染时加到培养的细胞中。24小时后，根据在一定的视野区域内总的细胞颗粒凝集细胞的百分比，测定细胞凝集百分率。以药物浓度为函数，用抑制凝集绘图，以便测定相对于对照（未用药物处理）测定的凝集细胞百分比中减低50%的有效剂量。测得的ED50值见下面表6。
用类似的方法测定在HEp2细胞中抑制RSV细胞致病作用（细胞凝集）的ED50，其结果见表6。详细叙述参见实施例9。
表6
ED50(μg/ml)
化合物 流感A RSV
(台湾)
KY-1 >188 0.19
KY-3 6 0.75
KY-42 94 1.50
KY-47 94 >250
KY-85 >250 1
KY-97 5 0.5
KY-110 >250 4
KY-123 31.3 1
KY-151 >94 1.5
KY-193 5.0 0.8
KY-194 7.9 0.5
一般来讲，与流感A/台湾病毒相比，RSV对于化合物的抑制作用明显地更敏感。在R2位上具有极性胺的磺酰胺（SO2NH2），以及有经选择的桥键基团的，具有最高的IAV活性。除化合物KY-47之外，所有的化合物均具有较高的抗RSV活性。
E.抑制HIV感染性：萘亚单元化合物
按实施例12所述，用表1具有代表性的大环化合物试验其抑制两个HTLV-Ⅲ株（HTLV-ⅢB和RF-Ⅱ株）之一感染的细胞的细胞致病作用。简单地说是，用HTLV-Ⅲ8或RF-ⅡHIV株长期感染的细胞在序列稀释的经选择的KY化合物存在下进行培养，然后再与指示剂细胞一起共同培养。合胞生成的情况在显微镜下观察记录。对两个HIV株产生完全抑制合胞生成的有效浓度（μg/ml）（ED100）列于表7。“N”是指未用此化合物进行该病毒试验。
表7
抑制合胞体形成
HIV-HXB HIV-RF-II
化合物 ED100ED100
KY-1 8 N
KY-3 16 N
KY-42 8 N
KY-48 250 N
KY-85 32 N
KY-97 32 N
KY-110 63 N
KY-121 16 16
KY-123 16 16
KY-129 16 8
KY-143 250 125
KY-147 250 250
KY-148 250 N
KY-151 32 125
KY-158 500 7500
KY-171 125 250
KY-175 63 250
KY-176 125 250
KY-193 63 500
KY-194 63 125
KY-270 16 32
KY-272 63 250
KY-276 16 32
KY-277 16 32
KY-280 16 32
KY-281 16 32
KY-284 16 32
KY-285 16 32
KY-286 16 32
KY-288 8 16
KY-289 16 32
KY-290 16 32
KY-291 16 32
KY-293 16 63
KY-294 16 16
KY-301 8 8
KY-307 8 32
KY-308 8 32
KY-345 63 125
KY-346 16 32
表7
抑制合胞体形成
HIV-HXB HIV-RF-II
化合物 ED100ED100
KY-352 32 125
KY-357 32 63
KY-359 32 63
KY-376 8 16
KY-395
Y-4 8 125
Y-14 16 32
Y-20 4 16
Y-34 N N
Y-66 N N
从上述结果可以看出，在对上述两株病毒的抗病毒活性之间有普遍的关系，即对HTLV-ⅢB株最有效的化合物对RF-11株也最有效。
参考表1中化合物的结构，下面的R基团被认为可提供次合适的活性（对两株病毒的ED50值≥63μg/ml）：KY-48中亚甲基桥键的大支链;KY-110中桥键的甲基酮基，KY-143中R3羟基;KY-147和KY-148中R2位置上带有非极性烷基的磺酰胺;KY-158和KY-175中R2位置上具有非极性烷基的亚磺酸酯或磺酸酯;KY-272中R1位置上甲基酯与乙酰基桥键的组合。上述特点实质上与抗HSV病毒感染降低活性的因素是相同的，即表明在10～20μg/ml剂量下对CPE无抑制作用。
同样，上述提供高抗HSV活性的因素通常与赋予抗HIV感染性最高活性的因素是相同的。这些因素包括：R1位上的基团是OH，包括OH和=O基团的组合（部分氧化）;烷基和芳基酯，包括该酯与=O的组合;烷基醚，包括该醚与=O的组合。
R2位上较好的基团是磺酸或磺酸盐、亚磺酸和其盐以及带有极性胺基（如NH2、NHOH、N-苷类（KY-352）和氨基酸）和磺酸的磺酰胺。尤其是磺酸、磺酸盐和具有末端羧基的磺酰胺具有很高的活性。
R3位上合适的基团是氢，而带有OH和Br则赋予降低的活性。
桥键最好是取代和未取代的亚甲基，如果桥键为＞CHR或≥CHR，那么R基团不应是大的烷基。
选择R基进一步指导原则是，化合物对两个HSV试验中至少1个的ED50值≤1μg/ml，该化合物有1个下述基团，该基团的特征在于：
R1基团是低级烷基醚或酯，或者含有一末端羧基的化合物，通常有最大的活性，特别是在化合物的其他R1位上有与=O基团组合。
R2基团为磺酸或磺酸盐或带有末端羧酸的磺酰胺。该特点表明R2位的酸基有利于增加活性。
R4桥键为亚甲基或带有羧酸基团的亚甲基。
上述较好的R基团提供指导选择R1～R4位上的R基团，以便优选化合物的效果。
F.抑制HIV感染性：克力克斯（n）芳烃化合物
如实施例12和以上部分所述，用表2具有代表性的化合物试验抑制以两种HTLV-Ⅲ株（HTLV-ⅢB和RF-Ⅱ）中一种感染的细胞中的细胞致病作用。对HIV的HXB和RS-11株测得的IC50值列于下面表8，单位为μg/ml。
表8
HIV-HXB HIV-RF-11
化合物 IC50IC50
Y-1 16 N
KY-226 16 250
Y-49 N N
KY-225 32 125
Y-77 N N
Y-48 N N
KY-268 32 32
KY-269 32 32
KY-271 32 63
令人感兴趣的是，Y-1化合物和KY-226（相应的部分氧化的同类似物）抗HXB株具有相类似的活性，可是KY-226抗HSV病毒具有明显更高的活性。所有其他受试的化合物均有部分氧化的R1=O基团，并且所有的化合物均有类似的活性。
Ⅳ.关于包膜病毒的特性
本部分研究抑制包膜病毒方法的特性。下面A部分的叙述表明，用于该方法的大环化合物通过有选择地结合病毒包膜蛋白至少部分地起作用，并且该结合阻止病毒附着在可感染的细胞上，因此抑制病毒感染性。所述研究在美国专利申请系列号647，720（申请日期1991，1，29）（目前美国专利5，196，452）中有详细叙述，下面B部分研究了大环化合物对非包膜病毒的抑制作用。
A.病毒感染抑制的机理
第一方面，阻止HSV结合到可感染的细胞上的大环化合物的能力的研究详见实施例14。简单地说，使Vero细胞与放射性同位素标记的HSV-1或HSV-2在没有KY化合物的情况下，或者在10μg/ml KY-1化合物存在的情况下接触，在接触病毒之后最多至4小时测定病毒的结合。图30表示在4小时培养期病毒（放射性同位素标记的）与细胞结合的曲线图。在没有药物存在的情况下，在2小时中结合的病毒数量稳定地增加，在2-4小时稍微增加。相反，在有药物存在的情况下，病毒与细胞的结合以1/2小时为峰顶，估计可能在该时间内有效的阻止病毒与细胞的结合达到了平衡。
第二方面，在用HSV-1感染细胞之前、感染期间或感染之后研究给药化合物的作用，详细叙述参见实施例15。在上述研究中，使细胞与一系列增加的KY-2化合物浓度中一个浓度化合物进行接触，通过在感染24小时后考察蚀斑的数目测定感染的程度。细胞感染之前（实心方格）、感染期间（实心园）和感染后（空心方格）用药物处理后蚀斑形成减少的情况以对照组的百分比表示，参见图31。在与病毒接触期间细胞用药物处理时十分明显地看出病毒抑制作用，这表明病毒抑制作用出现在病毒与可感染细胞结合并进入可感染细胞的期间。
第三方面，使纯化的HSV-1病毒混悬液与KY-1或其钠盐或对照溶液一起培养1小时，然后序列地稀释至药物浓度为101～10-4μg/ml，详细叙述参见实施例16。加入序列稀释的病毒混悬液，进行蚀斑记数，测定一式两份，参见表9。表中的符号“×”表示蚀斑太多以至于不能计数。本研究的结果表明，KY化合物对HSV感染的抑制作用是由于（至少部分由于）药物与HSV颗粒的结合。此外，在最终药物浓度为10-2～10-4μg/ml（该浓度比抑制Vero细胞培养中HSV所需的浓度低得多）的情况下可看出完全的病毒抑制作用。因此可以结论，药物结合/病毒失活事实上是不可逆的，即高倍稀释效果是不可逆的。
表9
KY 序列10倍稀释后的蚀斑数
化合物 最初病毒加入
量(PFU/细胞) 1 101102103104105
对照 0.3 XX XX XX 50,41 9,4 0,0
(仅有培养基) 3 XX XX XX XX 38,49 8,4
KY 1 0.3 3,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
(10μg/ml) 3 2,2 2,1 17,16 5,2 0,0 0,0
KY 217 0.3 2,8 3,3 0,0 0,0 0,0 0,0
(10μg/ml) 3 X,X X,X 6,0 5,0 0,0 0,0
第四方面，检查放射性同位素标记的KY-1化合物与HSV-1和HSV-2病毒蛋白的结合（实施例17）。在化合物结合之后，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分级分离病毒蛋白，并且凝胶谱图通过自动放射照像术显迹。图32A中，图中A带和B带是在有巯基乙醇存在（A带）和没有巯基乙醇存在（B带）下HSV-1蛋白的自动放射照像谱带，图中C带和D带是HSV-2蛋白类似的谱图。如图所示，右边的谱带含分子量标示。如从SDS-PAGE测定的一样，HSV-1中结合的药物的主要谱带有分子量为45、66和约130千道尔顿。在HSV-2中结合的药物的主要谱带有类似的分子量。图32B中所示KY结合的主要谱带相当于HSV糖蛋白gD、gB和gC的分子量。
B.对非包膜病毒的作用
对KY化合物抑制由鼻病毒和腺病毒5与7（它们为非包膜病毒）所致的细胞感染的能力同样地进行了研究。在KY-1（浓度为1～100μg）存在下用鼻病毒感染Vero细胞（105），在病毒感染24小时后，检查细胞的细胞致病作用，显示病毒感染。在受试药物KY的任一浓度进行考察，结果表明细胞凝集没有减少。
在KY-1（其浓度范围也为1～100μg）存在下用腺病毒感染Vero细胞，病毒感染24小时后，检查细胞的细胞致病作用。在KY-1药物的任一浓度进行考察，结果表明细胞凝集没有减少。
总的来说，广泛范围的大环化合物对被研究的几种包膜病毒中的每种包膜病毒的细胞感染均是有效的抑制剂。特别是有关HSV病毒进行了结合试验的研究，结果表明，本发明化合物的抗病毒活性取决于与病毒包膜成分的结合，与病毒包膜成分的结合反过来又抑制了病毒附着于可感染的细胞。本发明化合物抑制非包膜病毒的感染明显地无效，这与上述机理是一致的。
Ⅴ.大环化合物与抗病毒的核苷类似物的组合对病毒的抑制
本发明还包括含有以上所述类型的大环化合物与抗病毒的核苷类似物的组合物。于病毒复制或转录阶段，核苷类似物能有效地抑制病毒的复制。
用于本发明中与大环化合物组合的核苷类似物有：
（1）焦磷酸类似物，如磷甲酸（PFA）、膦乙酸（PAA）、甲基二膦酸（MDP）、羰基二膦酸（COMDP）、膦酰基乙醛酸（COPAA），以及其各种卤素和/或甲基取代的衍生物，它们是病毒核酸聚合酶的抑制剂。尤其是所述化合物已知可抑制疱疹病毒（Blackburn Sidwell）和流感病毒（Sidwell）感染，并可抑制逆转录病毒（如人HIV）中逆转录酶的活性。
（2）修饰的碱基类似物，如IUDR，三氟胸苷、AraA和叠氮胸苷（AZT）、二脱氧肌苷（DDI）、D4T、二脱氧胞苷（DDC）和三氮唑核苷。三氟胸苷、IUDR和AraA主要抗疱疹病毒是有效的（Nicolson，1984a，1984b）。三氮唑核苷抗几种RNA和DNA病毒是有效的（Sidwell），AZT与其他的二脱氧核苷类似物（如DDI）一样抗HIV是有效的（Fischl）。
（3）修饰的糖类似物，如5′-氨基-2′，5′-二脱氧5′-碘尿苷的N-酰基衍生物，5′-氨基-5′-脱氧胸苷和2′脱氧-5-乙基尿苷的磺酰胺衍生物，以及N-酰基衍生物、5′-硫酸和5′-氨基磺酸核苷类似物如核杀菌素、腺苷5′氨基磺酸和三氮唑核苷，它们主要作用是抑制蛋白合成（Martin）。
（4）磷酸类似物，包括无环核苷磷酸类，如无环鸟苷和gangiclovir，以及它们的电子等排的磷酸类似物。在核苷三磷酸类似物细胞内合成中所述化合物可作为病毒胸苷激酶的病毒选择性底物（Galbraith）。其次，核苷三磷酸类似物可作为病毒DNA聚合酶的选择性底物，由于所述类似物不具有链延长所必需的双功能性，因此它们可以起链终止剂的作用（Allen）。所述化合物表明具有抗以下病毒的作用：疱疹病毒（Collins），包括HSV-1和HSV-2，水痘带状疱疹（VZV）和细胞肥大病毒（CMV）（Smith）。
该类化合物还包括核苷的膦酰基甲基醚及它们的无环类似物，如N-（3-羟基-2-膦酰基甲氧基丙基）-（HPMP-）和N-（2-膦酰基甲氧基乙基）（PME-）杂环碱基衍生物。所述化合物特定地抗疱疹病毒、腺病毒、细胞肥大病毒（DeClercq）、痘病毒、痘苗病毒和逆转录病毒。
在实施例18中表明了所述两类组合物抑制包膜病毒所致病毒感染的能力，如以上所述，实施例18检查了用序列稀释的HSV-1或HSV-2颗粒感染Vero细胞之后的病毒得量。
图34A表示当感染的细胞单独与增加浓度的大环化合物Y-1（实心园点）、单独与增加浓度的浓度的无环鸟苷（空心园圈）、与增加浓度的无环鸟苷+25μg/mlY-1化合物（实心方格）、以及与增加浓度的无环鸟苷+50μg/ml Y-1化合物（实心椭圆）接触时HSV-1病毒得量的下降。单独应用两种药物中任何一种，病毒得量的最大减少略小于3个对数（数量级）。
以两个Y-1化合物的浓度试验组合物的作用。在Y-1化合物较低的浓度（25μg/ml）下，两种化合物构成的组合物抑制病毒得量超过7个对数，即高于两个药物单独应用得到的抑制作用总和的10倍。在Y-1化合物较高的浓度下，与大环化合物和无环鸟苷单独应用所得作用的总和相比，两种化合物构成的组合物抑制作用要高几个数量级。如图34B所示，给药组合的化合物以抑制HSV-2病毒得量，得到了类似的结果。
上述两种化合物可配制成例如片剂、凝胶剂、软膏剂、或注射剂形式，优选配制成凝胶形式，大环化合物与核苷类似物优选的重量比例为10∶1～1∶1。图34A和图34B的病毒得量曲线表明，当大环化合物与核苷约5∶1比例构成组合物给药时，抑制作用明显地增加。组合物中的大环化合物最好选择抗靶病毒（如以上所述的疱疹病毒、呼吸道合胞病毒或逆转录病毒）具有合适活性的。同样，核苷类似物最好选择抗靶病毒具有活性的（Martin）。
合并药用组合物的一个好处是实质上仅需要用较低剂量的两个类型化合物就可以达到选择性病毒抑制作用，这样就减少了组合物中药物的副作用，其特点还在于它具有更高的抗病毒活性。
Ⅵ.应用组合物治疗病毒感染
本发明的治疗方法是将本发明所述的克力克斯（n）芳烃类化合物给药于由包膜病毒感染个体的感染部位。本发明的组合物包括新的克力克斯（n）芳烃类化合物以及适用于该化合物口服、局部给药或非经胃肠道给药的药物载体。组合物可以单独地含有克力克斯（n）芳烃类化合物，或者还组合有抗病毒的核苷类似物。
组合物的剂量形式应是药学上有效的，即可有效抑制宿主细胞的病毒感染。如以上所述，化合物剂量在1～50μg/ml范围内通常可有效抑制细胞的病毒感染。因此，对于许多用途来说，有效剂量最好是在感染部位可产生上述范围的化合物浓度。对于局部给药，组合物含有1～5%或1-5%以上的克力克斯（n）芳烃是合适的。
如以上部分所述，在含有克力克斯（n）芳烃和核苷类似物的组合物中，组合物剂量实质上可比一个或两个化合物的剂量更低。
给药组合物需考虑的一个问题，尤其是当药物非经胃肠道给药或口服时，该问题是指全身的副作用。进行的支持本发明的研究表明，克力克斯（n）芳烃化合物（特别是其磺酸化合物）在口服或静脉内给药之后显示抗凝血作用。从所述研究中人们得到的一个结论是：给药聚阳离子化合物如硫酸鱼精蛋白（静脉内给药），可以有效地阻止血流中克力克斯（n）芳烃的抗凝血作用。将给药鱼精蛋白的时间调节至相应于克力克斯（n）芳烃的最高血药浓度期间。按常用的方法，鱼精蛋白的剂量相当于约每100单位肝素抗凝血剂用约1mg，静脉内给药，同时静脉内给药克力克斯（n）芳烃，或者中口服大环化合物1～2小时后静脉内给药一剂鱼精蛋白。通常推荐将鱼精蛋白缓慢输注（即10分钟不超过50mg总量）的方法。
因此在同时给药克力克斯（n）芳烃化合物的情况下，可以调节同时输注的速度，这样以致于硫酸鱼精蛋白的输注速度不超过50mg/10分钟。因此当给药本发明化合物吸收到血液中时，本发明的组合物可以包括鱼精蛋白，其用量为可有效减低大环化合物的抗凝血作用。如果本发明可减低大环化合物的抗凝血作用。如果本发明组合物还含有核苷类似物和更低剂量大环化合物，由于大环化合物是低剂量的，那么鱼精蛋白用量可以减少或者取消。
A.可注射的组合物
关于静脉内给药的组合物其效果和药代动力学已经研究。简要地说，用于本方法中所述类型的大环化合物表明：当静脉内给药时，（a）从血液中比较缓慢地消除（t1/2=约5-8小时），（b）主要以游离态存在，及（c）在血液中保持抑制病毒（如HSV-1、HSV-2，RSV和HIV）感染的活性。
可注射的组合物包括克力克斯（n）芳烃在合适的注射用溶液中，如无菌生理盐水溶液。另外该溶液可含有核苷类似物和/或鱼精蛋白。
B.局部组合物：治疗生殖器疱疹损伤
为抑制皮肤和粘膜的病毒感染，最好将组合物配制成软膏剂。应用局部组合物治疗生殖器疱疹损伤在以下研究中叙述，该研究在实施例13中详细介绍。简要地说，用HSV-2使雌性豚鼠经阴道内感染，然后按实施例13的方法接种HSV-2以后的6小时或48小时之后每天局部治疗3次。动物组包括对照动物组（病毒感染后未治疗）、安慰剂组（载体治疗）、载体中的KY-1组或无环鸟苷组。得到阴道分泌物化验标本，按标准的CPE试验评定病毒活性。最初感染过程中（21天）生殖器损伤的严重程度按0-5+级记录。
接种HSV-2的3～4天后，外生殖器皮肤上出现泡状损伤。7-8天损伤发展成溃疡阶段，15～21天逐渐愈合。按损伤发展严重程度，用KY-1制剂局部治疗的效果列在表10中。在感染6小时后用安慰剂的治疗组日记录的损伤AUC显著增加（P＜0.05）;但是与未治疗的对照组比较，平均最高损伤记分没有差异。与安慰剂比较，在感染后6小时用5%KY-1治疗，按测定的AUC值和平均最高损伤记分均表明损伤程度明显减少（P＜0.001），在感染后6小时用1%KY-1治疗，AUC明显减少（P＜0.01），但平均最高损伤记分无显著差异。
表10
损伤记分
治疗 曲线下面积 P值 平均最高损伤记分 P值
对照 37.0 --- 3.6 ---
安慰剂 +6h 47.0 <0.05 3.9 NS
安慰剂 +48h 42.8 NS 3.6 NS
KY 5% +6hr 3.8 <0.001 0.8 <0.001
KY 5% +48h 45.7 NS 3.7 NS
KY 1% +6h 30.8 <0.01 2.9 NS
KY 1% +48h 46.6 NS 4.3 NS
ACV 5% +6h 2.7 <0.001 0.6 <0.001
ACV 5% +48h 45.8 NS 3.8 NS
用任一配方均未观察到皮肤刺激的迹象。在整个治疗过程中，生殖器外观保持正常;未观察到发红或肿胀。在整个研究工作中豚鼠也保持外观正常和健康。
在用上述豚鼠生殖器模型的另一研究中，用HSV-2使动物感染，然后用KY-1或Y-1局部治疗，药物浓度为2%或5%。按实施例13所述，动物在感染后6或24小时开始治疗。对动物治疗并每天记录感染的严重程度，共19天。用KY-1和Y-1局部治疗感染的效果列于表11中，并与用5%无环鸟苷（ACV）治疗感染进行比较。
在本研究中用安慰剂（仅有载体）治疗感染的效果明显差于未治疗组。接种后6小时给药2%或6%Y-1进行药物治疗，与安慰剂治疗组相比有损伤的动物数目减少，平均损伤记分降低和最高损伤记分降低。而且，接种24小时后用6%KY-1或Y-1或2%KY-1配方进行治疗，带有损伤的动物数目减少，并且损伤严重程度降低。
表11
局部使用KY-1和Y-1对HSV-
2生殖器损伤的作用
% 损伤记分
治疗组 时间 N 动物损伤 (AUC) 平均峰值
未用药 - 9 66.7 9.1 1.3
安慰剂 6h 10 100 29.0 3.0
Y-1(2%) 6h 9 66.7 16.9 1.8
Y-1(6%) 6h 10 30 8.1 1.2
安慰剂 24h 10 100 22.3 2.7
Y-1(2%) 24h 10 60 22.0 2.3
Y-1(6%) 24h 10 40 14.7 1.8
KY-1(2%) 24h 10 70 16.2 2.2
KY-1(6%) 24h 10 50 17.5 1.7
ACV(5%) 24h 8 37.5 11.7 1.5
C.局部组合物：治疗眼部感染
在另一实施方案中，为了使化合物适于眼睛给药，如眼角膜表面给药局部组合物包括克力克斯（n）芳烃化合物的软膏剂或合适的溶液剂。组合物还包括对靶病毒感染有效的核苷化合物。
在实施例10所述治疗方法中，在用HSV-1感染兔角膜之前，施用逐次变化局部剂量的化合物Y-1。应用临床上用的裂隙灯活组织显微镜评定测得的上皮疾病（图33A）、结膜炎（图33B）、虹膜炎（图33C）和基质炎（图33D）的严重程度。
感染7天后，安慰剂治疗的动物组中观察到上皮疾病严重程度达到顶点（图33A）。通过本研究还得到结膜炎、虹膜炎和基质炎的参数（图33B-D）。
在所有4个眼睛感染的评价结果中，药物治疗比安慰剂治疗产生的严重感染要更少，在减少HSV-1引起的眼科疾病感染发展方面，各种浓度的Y-1均有效。用各种浓度Y-1治疗，在统计学上互相有差异。
浓度为12.5μg/50μl局部治疗是最有效的眼疾疗法。感染后6天上皮疾病程度减轻，感染后7天稍微回弹。与其他2个Y-1剂量治疗比较，该浓度在降低由HSV-1引起的眼疾的发展是有效的，并且仅与轻微的结膜炎、虹膜炎和基质炎参数有关。较高的浓度（18.75μg/50μl）对降低由HSV-1引起的角膜上皮疾病的发展也是有效的。但是，该浓度的Y-1对角膜上皮表面和对结膜炎、虹膜炎和基质炎稍微有毒性。该毒性由感染6和7天后所有疾病的参数值均增加而得到证明。
从接种后0、3、5和7天的泪膜和感染后7天形成的上皮刮出物（试验品）得到病毒的滴度。如实施例10所述，通过蚀斑减少和多元回归分析测定病毒的滴定。在泪膜研究中，在给药局部剂量Y-1的所有动物中考察到病毒滴度显著降低，虽然在最高剂量（12.5和18.7μg/50μl）时未见差异，但这种降低看来与剂量有关。在7天后所刮取的刮出物中观察到病毒滴度减少与剂量有关。
根据上述研究，得到有效剂量/范围。在本研究中化合物的最佳浓度为12.5μg/50μl。
D.口服组合物
所进行的支持本发明的研究表明，口服给药（如管饲法）后约0.5小时，应用的本发明类型大环化合物在血浆中是存在的，同时在约2-4小时达到峰值。在静脉内给药后血液中有效药物浓度的时间约为4～18小时。当静脉内给药本化合物时，药物有较短的分布体积半衰期，这影响药物分布到体器官外腔隙，较短的分布体积半衰期对具有抗凝血副作用的药物通常是有益的，因为化合物在血流中的浓度可以较精确地进行测定。
Ⅶ.用作抑制经性传播的包膜病毒感染的局部用组合物
本发明的一个方法是将含有如以上所述的大环化合物用于可能发生性接触的身体某一区域或几个区域。所述区域可以包括肛门-生殖器区域和口的皮肤表面，以及阴道、直肠、口和咽喉的粘膜组织。所进行的支持本发明的研究表明，以上所述的大环化合物适合于在皮肤和粘膜上局部给药，即本发明化合物不会产生刺激作用如肿胀或发红。
局部用的组合物可以包括适合用于局部给药的药学上适用的载体。因此，本发明组合物可以为例如混悬液剂、溶剂剂、软膏剂、洗剂、性交润滑剂、乳膏剂、泡沫剂，气雾剂、喷雾剂、栓剂、植入剂、吸入剂，片剂、胶囊剂、干粉剂、糖浆剂、香脂剂或锭剂。制备上述组合物的方法在制药工业上是熟知的。除了含有大分子化合物，本发明组合物还可以包括以上部分V中讨论的抗病毒的核苷类似物。
在一个较好的实施方案中，本发明的组合物为滑润的凝胶剂（性交润滑剂），它包括润滑的凝胶载体，并且本发明的大环化合物溶于该载体中。在性交接触中，凝胶载体部分地使磨伤减至最低程度，因此可以减少包膜病毒进入损伤组织然后进入血液的可能性。如以上部分IVA所述，本发明的大环化合物可有效地紧密结合至包膜病毒，因此可以抑制病毒附着于可感染的细胞。这样，在发生感染以前凝胶剂中的大环化合物就可以阻止包膜病毒颗粒。
组合物的剂量形式是药学上有效的，即该剂量可以有效地抑制经性传播的包膜病毒的感染。如以上所述，在1～75μg/ml范围的化合物剂量通常可有效地抑制病毒感染细胞。因此，对许多用途来讲，有效剂量最好是在感染部位能产生上述范围化合物浓度的剂量。对局部用药，组合物含有1～10%大环化合物是合适的。除含有本发明大环化合物之外还含有抗病毒核苷类似物（如部分V所述）的组合物中，组合物中化合物的剂量实质上一个化合物可以是更低的，或者二个化合物的剂量均更低。
A.局部用组合物：防止生殖器疱疹病毒感染
在实施例19中详细研究了作为润滑凝胶剂组合物一部分的化合物Y-1抑制HSV-1和HSV-2感染细胞的细胞致病作用的能力。凝胶制剂由商业上买到的润滑剂凝胶（K-Y Jelly，Johnson& Johnson）和经选择剂量的Y-1化合物构成。在本研究中，使细胞与HSV-1或HSV-2接触，同时与最终药物浓度为40μg/ml的Y-1凝胶组合物接触。接种24小时后，检查细胞的细胞致病作用（即环细胞形成）。
结果列于表12。符号“+”表示该浓度的Y-1化合物抑制细胞致病作用（CPE）是有效的。符号“-”表示观察到了细胞致病作用。
表12
组合物 Y-1 HSV-1 HSV-2
浓度 (KOS) (333)
5% Y-1 的 5ug/ml - -
K-Y 凝胶剂 10ug/ml +/- +/-
20ug/ml + +
40ug/ml + +
10% Y-1 的 5ug/ml - -
K-Y 凝胶剂 10ug/ml +/- +/-
20ug/ml + +
40ug/ml + +
20% Y-1 的 5ug/ml - -
K-Y 凝胶剂 10ug/ml +/- +/-
20ug/ml + +
40ug/ml + +
Y-1 单独 5ug/ml - -
10ug/ml +/- +/-
20ug/ml + +
40ug/ml + +
上述结果表明，在药物浓度为约20μg/ml或20μg/ml以上，含有化合物Y-1的凝胶剂组合物可以明显有效地抑制细胞感染。
B.抑制HIV感染
在另一研究中，试验了含有不同剂量的Y-1化合物的润滑凝胶组合物抑制下述病毒感染的细胞的细胞致病作用（实施例20），所用的病毒有两种HTLV-Ⅲ株中的一种，即HTLV-ⅢB和RF-Ⅱ。简单地说，在稀释的含有经选择的Y-1化合物凝胶组合物存在下，将用HTLV-ⅢB或RF-Ⅱ慢性感染的细胞进行培养，然后再与指示剂细胞一起共同培养。在显微镜观察下以合胞形成的程度进行记分。
表13所示结果如下，其中“-”表示没有细胞融合（或完全阻止融合），4+表示具有与未处理的对照物不能区别的细胞融合程度。
表13
Y-1 20% Y-1 10% Y-1 5% Y-1
ug/ml 的 K-Y 的 K-Y 的 K-Y
凝胶剂 凝胶剂 凝胶剂
500 - - -
250 - - -
125 - - -
63 +/- +/- +/-
32 4+ 4+ 4+
16 4+ 4+ 4+
8 4+ 4+ 4+
6 4+ 4+ 4+
4 4+ 4+ 4+
如以上所示，细胞与浓度大于约63μg/ml的Y-1化合物接触，产生抑制HIV引起的细胞融合。该结果表明，凝胶组合物中含有的Y-1化合物可有效地抑制由试验的HTLV病毒株引起的细胞感染。
Ⅷ.避孕器具
另一方面，本发明还包括与以上所述类型大环化合物并用的物理障碍类型器具，用于抑制由性传播的包膜病毒的感染。在一个实施方案中，该器具包括物理障碍类型器具（例如避孕器具），并用润滑剂组合物涂在该器具上，所述润滑剂组合物是含有本发明的大环化合物和润滑剂凝胶载体。
在一实施方案中，所述部件为阴茎套，其中润滑剂组合物涂在该阴茎套的外表面上。避孕器具还可以是一种阴茎套，其中含有大环化合物的组合物涂在该阴茎套的内层表面，目的在于与射入阴茎套的精液混合。阴茎套可以是用于男性的常规类型的（即置于男性的阴茎上），或者可以是插入类型的，例如可以是女性用的。其中该避孕器具包括如在异性间性交开始之前插入阴道的避孕器具。
所述器具还可以是子宫颈帽、隔膜或避孕海绵，可将其置于子宫颈附近，因此，子宫颈帽或隔膜可以用例如含有本发明大环化合物的凝胶剂或乳膏剂涂层或注入。同样，避孕海绵可以用含有本发明大环化合物的溶液剂、乳膏剂等浸透。
在评价本发明的大环化合物与胶乳阴茎套的并存性研究中，将20%W/W Y-1化合物的K-Y凝胶混合物施于几种牌号的胶乳阴茎套内部。50ml园锥状离心管插入了各个阴茎套以模仿竖直的阴茎，然后各阴茎套的开口端用透析环封口。再将封口的阴茎套置于37℃双蒸馏水中保持24小时。
透析之后，水用HPLC法分析以确定是否有Y-1化合物存在。在该灵敏性试验（5μg/ml）中，对于任一阴茎套均未检出Y-1化合物，这表明大环化合物未通过胶乳阴茎套渗出。因此，为了防止在性交时病毒感染的传播，本发明的大环化合物与胶乳避孕器具共存是适用的。
下面的实施例详细叙述上制备本发明大环化合物的方法以及在防治感染中的应用，下面的实施例目的在于详细地叙述而不是限制本发明的范围。
原料
所有的化学试验均由Aldrich Chemical Co.或其他商业公司购得。
实施例1
制备萘大环化合物。
A.KY-1（R1=OH，R2=SO3Na，R3=H，R4=＞CH2）
向50ml（41mM）铬变酸二钠溶液中加入15ml 37%甲醛，得到最后的摩尔比为5∶1甲醛∶铬变酸。混合物在密塞的烧瓶中于室温搅拌1周。所得到的70ml暗红色溶液在真空下过滤，滤液经浓缩后加入200ml乙腈使析出沉淀。过滤收集析出的产物并在真空下干燥。KY-1的产率为95%。该化合物有以下特征：
熔点（M.P.）＞300℃;
HPLC（CH3CN/MeOH/H2O/TFA）：14′48″单宽峰;
（IR/KBr）=3425（OH），1638（Ar），11811044（SO3）cm-1
UV（H2O）：238.0，358.5nm
分子量：经质谱分析为1505（M+1）;
1H NMR（CD3OD），化学位移（γ）：5.20(CH2)，8.01(ArH)ppm;
C13NMR（D2O），化学位移（γ）：27.19，120.18121.69，122.06，122.67，133.30，142.97，154.42和181ppm。
元素分析：（C22H10O16S4Na4）2×6H2O或（C22H11O16S4Na4）2×5H2O
测定值：C 33.17,H 2.54，Na 11.93;
计算值：C 32.75,H 2.23,Na 11.41;
C 33.16,H 2.13,Na 11.56。
B.KY-3（R1=OH，R2=SO2NH2，R3=H，R4=-CH2-）
KY-1（2mM）用5ml氯磺酸处理，混合物于50℃搅拌半小时。将得到的混合物加入20g碎冰中以析出产物，过滤收集并用乙醚洗涤。
粗产物溶于100ml25%氨水溶液中，并于室温反应2小时。混合物在真空下浓缩，残余的油状物溶于少量水中并过滤。向滤液中加入乙腈析出产物，过滤收集并用乙腈洗涤。该化合物有以下特征：
熔点（M.P.）＞300℃;
质谱：1452（M-7NH2）;
HPLC（CH3CN/MeOH/H2O/TFA）：11′46″单峰;
（IR/KBr）=3430（OH），3187，1686（NH2）,1637（Ar），1211,1110,1044（SO3）cm-1
UV（H2O）∶246nm;
1H NMR（D2O），化学位移（γ）：5.15(CH2)，7.5-8.2(ArH)ppm;
元素分析：（C44H40O26S10N12Na4)·16H2O
测定值：C 28.62,H 3.93,N 8.82，
S 17.17，Na 5.44;
计算值：C 28.51,H 3.89,N 9.07
S 17.28，Na 4.97。
C.KY-42（R1=OH，R2=SO3Na，R3=H，R4=＞CHCOOH）
将铬变酸二钠（10mM）置于50ml水中，在室温与二羟乙酸（10.0mM）的5ml水溶液和10ml37%盐酸混合。混合物煮沸8小时，溶液的颜色变成暗红色。将得到的溶液加入50ml水中并过滤。浓缩滤液并加入乙醇，以析出KY-42产物。产率为87%。该化合物有以下特征：
熔点（M.P.）＞300℃;
质谱：1623（M-3H2O）;
HPLC（CH3CN/MeOH/H2O/TFA）：10′36″单峰;
（IR/KBr）=3452（OH），1801，1719（Co），1638（Ar），1206，1050（SO3）cm-1
UV（H2O）：238.0，351.5，520nm;
1H NMR（D2O），化学位移（γ）∶7.10（CHCO2H），8.00（ArH）ppm;
C13NMR（D2O），化学位移（γ）∶116.04，
118.90,120.94,121.27,122.30,124.30,124.68,
126.60,128.37,136.48,136.71,140.50,143.93,
144.26,145.75,152.01,154.33,156.01,156.67;
元素分析：（C48H4O40S8Na8）4·4H2O
测定值：C 32.74，H2.50;
计算值：C 32.58，H2.71。
D.KY-123（R1=OH，R2=SO2Na，R3=H，R4=＞CH2）
KY-1（2mM）用5ml氯磺酸处理，混合物于50℃搅拌半小时。得到的混合物加入50g碎冰中以析出产物，过滤收集产物，然后用乙醚洗涤。粗制的磺酰氯产物用亚硫酸钠（20mM）的4ml水溶液处理。分次将少量50%氢氧化钠加入反应混合物中，使反应混合物保持弱碱性维持2天。除去溶剂后，加入乙醇以析出产物，加入50%硫酸酸化产物，随后加入乙醇以便析出硫酸钠。将乙醇相与乙醚（1∶2，V/V）混合析出所需产物。产物的产率为39%。
E.KY-147（R1=OH，R2=SO2NHCH3，R3=H，R4=＞CH2）
通过使铬变酸（二钠盐）与磺酰氯在DMF存在下反应生成N-甲基铬变酸酰氯。该反应在搅拌下于80℃进行4小时。在真空下除去溶剂和过量的亚硫酰氯，加入乙醚以析出铬变酸酰氯，然后通过过滤收集，并用乙醚洗涤。将粗产物加入20ml甲胺中并搅拌2小时。从所得的物质中除去全部溶剂，残余物溶于200ml冷甲醇中并过滤。向滤液中加入乙腈以析出铬变酸甲基磺酰胺。产率为56%。
将铬变酸甲基磺酰胺（2mM）置于3ml水中，并与1ml37%甲醛在室温反应1周。加入乙腈以析出产物，过滤收集产物并用乙腈洗涤。产率为85%。
F.KY-151（R1=OCH3，R2=SO3Na，R3=H，R4=＞CH2）
将KY-1（50mM）溶于80ml 0.2M氢氧化钠水溶液中并于50℃加热，缓慢地于1小时内加入硫酸二甲酯（0.2M）。连续再搅拌混合物2小时后在室温下放置2天。向所得的物质中加入100ml饱和氯化钠溶液并过滤。沉淀依次用乙醇、乙腈和乙醚洗涤。将干燥的物质溶于100ml甲醇中并过滤。浓缩滤液并加入乙醚，以析出铬变酸的二甲醚二钠。
G.KY-158（R1=OH，R2=SO2CH3，R3=H，R4=＞CH2）
由实施例1A得到的KY-1首先用亚硫酰氯处理，得到铬变酸磺酰氯。该化合物在碳酸氢钠存在下用过量的亚硫酸钠还原，得到相应的环化铬变酸的磺酸钠盐（R2=SO2Na）。该磺酸盐在碳酸氢钠存在下用硫酸二甲酯按实施例1A所述的方法处理。产物的产率为约21%。
H.KY-175（R1=OH，R2=SO3CH3，R3=H，R4=＞CH2）
铬变酸首先用亚硫酰氯处理，得到铬变酸磺酰氯。然后该化合物在钠盐存在下用甲醇钠的甲醇溶液处理。该产物按实施例1A所述方法处理，得到大环化合物。产物的产率为约29%。
I.KY-285（R1=OCOCH3，R2=SO3Na，R3=H，R4=＞CH2）
由实施例1A得到的KY-1（0.66mmol）溶于含0.1g氢氧化钠的3ml水中。向其中加1g乙酰氯（13mmol），在搅拌下反应液于室温反应过夜。除去溶剂，加入25ml乙醇，析出产物。将粗产物溶于甲醇中并过滤。将滤液析出沉淀，得到87%产率。
J.KY-346（R1=OH，R2=SO3Na，R3=H，R4＝-CH2-N（CH3）CH2）
在搅拌下将铬变酸二钠盐于50℃溶于80ml水中（浓度为50mM），直至溶液变为澄清，然后在相同温度向上述溶液中加入六亚甲基四胺（50mM），并再连续搅拌2小时。在此期间该混合物的颜色转变为暗兰色。混合物在室温搅拌2天。将所得的暗兰色溶液过滤，滤液经浓缩并装入烧瓶蒸发，随后用200ml甲醇处理，析出产物KY-346，KY-346的产率为85%。该化合物有以下特征：
M.P.＞300℃;
HPLC（CH3CN/MeOH/H2O/TFA）：13′07″单峰;
（IR/KBr）=3425（OH），1626（Ar），1197，1052（SO3）cm-1
UV（H2O）：232.0，377.5nm
元素分析：（C13H11O8NS2Na2）4×12H2O
测定值：C 33.17，H 3.13，N 2.75;
计算值：C 33.98，H 3.59，N 2.96。
分子量：经凝胶过滤为1668。
实施例2
制备克力克斯（n）芳烃化合物
A.Y-49（R1=OH，R2=SO3H，R4=-CH2-，n=4）
在室温，将10g4-叔丁基克力克斯（4）芳烃用200ml浓硫酸处理半小时，然后置于75～85℃油浴上反应4小时。当没有不溶于水的物质被捡出时，反应被完成。将所得的油状物滴入500g碎冰中，溶液用减压过滤。从滤液中除去水，向残余物中加入500ml乙腈，放置4小时以析出粗产物，然后过滤收集并用乙腈、乙酸乙酯和乙醚洗涤。产量为8g（73%）。用甲醇-乙醚或甲醇-乙腈系统将粗产物重结晶，得到纯产物。在重结晶过程中也可形成单晶化合物。
用类似方法合成Y-77（R1=OH，R3=SO3H，R4=-CH2-，n=6）和Y-1（R1=OH，R3=SO3H，R4=-CH2-，n=8）。
B.KY-225（R1=-OH，＝O，R2=SO3H，R4=＞CH2，≥CH，n=4）
在室温，将1g4-叔丁基克力克斯（4）芳烃与10ml95～98%硫酸反应半小时，然后在160℃反应5分钟。所得的混合物冷却后，将其缓慢地倒入100ml碎冰中并过滤。溶液经蒸发，向残余物中加入300ml乙腈，析出大量沉淀，过滤收集沉淀物，并用乙腈洗涤。将粗产物溶于20ml甲醇中，加入乙醚析出产物。产率为84%。
用类似方法合成Y-48（R1=-OH或=O，R3=SO2H，R4=-CH2-，n=6）和Y-226（R1=-OH或＝O，R2＝SO3H，R4＝-CH2-，n＝8）。
C.Y-1的O-乙酰化物（R1=-OCOCH3，R2=SO3H，R4=＞CH2，n=8）
将0.75gY-1于30ml无水乙酐中搅拌过夜。连续反应直至原料溶于溶剂中。冷至室温后，过滤悬浮液。固体用乙腈洗涤2次并真空干燥。该物质再洗涤并重结晶。
13CNMR（D20，δ）∶173.9,151.6,144.1,135.6.130.1,34.2和22.4.
D.Y-78（R1=-OH，R2=SO2NH2，R4=＞CH2，n=8）
在氮气氛下，1g Y-1与20ml氯磺酸一起于60-70℃加热1小时。冷至室温后将油状物倒入冰水中，过滤沉淀物。用冷水洗涤沉淀物后，将沉淀物加到50ml含5.7g甘氨酸和2.1g氢氧化钠的溶液中，于室温搅拌2小时。粗产物溶于100ml25%氨水溶液中，并于室温反应2小时。混合物在真空下浓缩，残余的油状物溶于少量水中并过滤。向滤液中加入乙腈，析出产物，过滤收集并用乙腈洗涤。
E.Y-1的甘氨酰磺酰胺（R1=-OH，R2=SO2NHCH2CO2H，R4=＞CH2，n=8）
在氮气氛下，1g Y-1和20ml氯磺酸于60-70℃加热1小时。冷至室温后，将油状物倒入冰水中，并过滤沉淀物。用冷水洗涤沉淀物后，将沉淀物加到50ml含5.7g甘氨酸和2.1g氢氧化钠的溶液中，于室温搅拌2小时。从生成的物质中除去全部溶剂后，残余物溶于200ml冷甲醇中并过滤。向滤液中加入乙腈以便析出产物。
F.乙酰基桥连的Y-49（R1=-OH，R2=SO3H，R4=-CHCO2H-，n=4）
于100℃，将4.3g对羟基苯磺酸与9g二羟乙酸在30ml18%浓盐酸中的溶液反应2小时。反应产物在减压下干燥后，加入50ml甲醇，滤除不溶的杂质。向滤液中加入乙醚，析出产物，然后过滤收集并真空干燥。
G.Y-49的甲苯磺酸酯（R1=-SO3C6H4CH3，R2=SO3H，R4=＞CHCO2H，n=4）
在氮气氛下，向1.06g无水碳酸钠、10ml二甲基甲酰胺和0.75g Y-49的悬浮液中加入1.9g甲苯磺酰氯。回流过夜后，所得的混合物冷至室温并过滤。滤液用乙醚稀释以析出粗产物。用乙腈/乙醚溶剂重结晶，得到产物。
H.Y-49的羧酸衍生物（R1=-CO2H，R2=SO3H，R4=＞CHCO2H，n=4）
在氮气氛下，向用冰冷却的1.25g2，6-二叔丁基-4-甲基吡啶和0.65g 4-叔丁基克力克斯[4]芳烃的10ml无水二氯甲烷溶液中加入1.0ml三氟甲磺酸酐，于室温下搅拌过夜后，混合物用10ml戊烷稀释并过滤。滤液依次用冰冷却的1N氢氧化钠水溶液、冰冷却的1N盐酸水溶液和饱和氯化钠水溶液萃取，以无水硫酸钠干燥，通过硅胶垫过滤并真空浓缩。残余物溶于10ml无水二异丙基乙胺、0.5ml三甲基氰硅烷和20mg四-（三苯膦）钯的混合物中，在氮气氛下回流过夜后再冷至室温，加入50ml乙醚，并将得到的悬浮液过滤。滤液经真空浓缩和硅胶层析（己烷/乙酸乙酯洗脱）后，氰化物中间体和10ml浓硫酸于80℃加热3小时，用10ml水稀释并回流过夜。冷至室温后，将得到的混合物加入到0.5g活性炭和50g冰中。过滤后，得到的滤液在真空下浓缩至约15ml体积，并将得到的固体过滤。固体溶于最少量甲醇中，通过加入乙醚析出沉淀。最后经C18反相层析（甲醇/水洗脱）纯化，得到产物。
I.Y-1的甲基醚（R1=-OMe，R2=SO3Na，R4＞CH2，n=8）
447mg Y-1、1.53ml 6N氢氧化钠水溶液和9ml硫酸二甲酯的混合物于60℃加热20小时。将得到的混合物滴入搅拌着的100ml无水乙醇中。形成的悬浮液离心20分钟（9000rpm），然后除去上清液。再次将得到的固体溶于6ml水中，得到的溶液如上述用乙醇处理，离心并除去上清液。残余的固体经冷冻干燥得到420mg产物。
13CNMR（D20，δ）∶161.2，140.9，137.6，129.5，63.6，和33.5.
J.XXⅥ.（R1=-OH，R2=H，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4）
按Gutsche，Levine和Sujeeth，1985所述方法，用4-叔丁基克力克斯（4）芳烃（XXⅤ;图13）制备克力克斯（4）芳烃XXⅥ。将5.0g（6.75mmol）XXⅥ在250ml甲苯中的热溶液置于500ml带机械搅拌器和气体入口管的三颈园底烧瓶中。溶液冷至50-55℃，用5.0g（37mmol）无水三氯化铝处理，并在惰性气体下于50-55℃搅拌2小时。混合物置于冰浴中冷却，并和125ml 1N盐酸一起搅拌30分钟，分离有机相并洗涤、干燥和蒸发，得到黄色残余物。该残余物与500ml乙醚一起研磨，不溶物用CHCl3-CH3OH重结晶，得1.9g（66%）XXⅥ，为米色微晶体，m.p.313-318℃。
K.XXⅧ.（R1=-OH，R2=COOH，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4）
按Yilmaz和Vural所述方法制备克力克斯（4）芳烃XXⅧ。将已知的1.3g对乙酰基克力克斯（4）芳烃（XXⅦ）（Yilmaz and Vural，1991;No et al.，1986）溶于50ml2N氢氧化钠水溶液中。加入8g碘和20g碘化钾在40ml水中的溶液，并将混合物搅拌。溶液于水浴上温热1小时，滤除碘仿，向滤液中加入20g亚硫酸氢钠。然后向滤液中加入浓盐酸，得到淡黄色沉淀，再滤出沉淀，用水洗涤并干燥。将粗产物溶于10%亚硫酸氢钠水溶液，并用活性炭处理。过滤后，溶液用1N盐酸酸化。过滤收集析出的产物，用蒸馏水洗涤直至无氯离子，于真空干燥器中干燥，得1.04g（79%）XXⅧ。m.p.320℃（分解）。
L.XXⅪ.（R1=-OH，R2=-CH2COOH，R3=R5＝H，R4=-CH2-，n=4）
按Gutsche和Nam，1989所述方法，用对（二甲氨基）甲基-克力克斯（4）芳烃（XXⅨ）制备克力克斯（4）芳烃衍生物XXⅪ。
向15.9g（39.5mmol）克力克斯（4）芳烃（XXⅥ）的360mlTHF的溶液中加入45ml乙酸、22.5g（0.2mol）40%二甲胺水溶液和116.2g（0.2mol）37%甲醛水溶液。反应混合物于室温搅拌24小时，在真空下除去溶剂，并将残余物溶于250ml水中。水溶液用200ml乙醚萃取2次，用10%碳酸钾溶液中和，用抽滤器过滤沉淀。产物在真空下干燥，然后用氯仿重结晶，得到19.1g（78%）对（二甲氨基）甲基-克力克斯（4）芳烃XXⅨ，为白色针状物。
向16.3g对（二甲氨基）甲基-克力克斯（4）芳烃的220ml DMSO溶液中缓慢地加入9.57ml（0.15mol）甲基碘。反应混合物于室温搅拌30分钟后，加入15g（0.3mol）NaCN，在氮气氛下混合物于80℃加热2小时，然后冷却溶液，用1L冰水处理，用2N盐酸酸化，过滤并空气干燥。粗产物用CH3CN重结晶，得到12.8g（88%）对氰甲基克力克斯（4）芳烃XXX，为淡黄色固体。
向25ml DMSO和5ml浓盐酸溶液中加入0.5mmol对氰甲基-克力克斯（4）芳烃并回流过夜，在室温用100ml水稀释后，过滤收集沉淀，用甲醇重结晶得到纯的XXⅪ。
M.XXXⅢ（R1=-OH，R2=-CH2CH2COOH，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4）
按Gutsche和Nam，1989所述方法，制备克力克斯（4）芳烃衍生物XXXⅢ。
向3.26g（5mmol）（二甲氨基）甲基-克力克斯（4）芳烃（XXⅨ;实施例L）的80ml DMSO的溶液中加入1.90ml（30mmol）甲基碘。混合物搅拌30分钟后，加入由1.20gNa，7.28g丙二酸二乙酯和28mlEtOH制备的二乙基丙二酸钠，反应混合物在氮气氛下于80℃加热2小时，然后冷却溶液，并倒入200ml冰水中，用2N盐酸酸化，并按常用的方法处理，得到5.50g（99%）对（二乙基丙二酰）甲基-克力克斯（4）芳烃XXⅫ粗产物。将粗产物溶于100ml DMSO和30ml浓盐酸，并在氮气氛下于120℃加热10小时进行水解和脱羧作用。然后冷却混合物，并倒入500ml冰水中，搅拌10分钟并过滤，沉淀用丙酮-乙酸乙酯重结晶，得到2.24g（69%）XXXⅢ，为无色结晶。m.p.224℃。
N.XXXⅥ（R1=-OH，R2=-PO3H，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4）
采用Arduini等和Hirao等的方法制备XXXⅥ衍生物。
将克力克斯（4）芳烃（XXⅥ）和Hg（OCOCF3）2于三氯甲烷中回流，得到几乎定量产率的四-（Hg-OCOCF3）克力克斯芳烃衍生物。接着蒸发三氯甲烷，通过克力克斯芳烃衍生物与碘在三氯甲烷中反应进行金属碘交换，得到对-碘-克力克斯（4）芳烃XXXⅣ，为棕色化合物，产率为40%。
在氮气氛下，将HPO（OEt）2（10mmol）、三乙胺（10mmol）、Pd（PPh3）4（0.3mmol）和对-碘-克力克斯（4）芳烃（1.0mmol）的浓缩的甲苯溶液于100℃搅拌3天。在室温用50ml乙醚稀释后，将反应混合物过滤，然后在高真空下（100℃，气压＜0.1mmHg）浓缩。所得的浓缩液经硅胶层析纯化，得到纯的膦酸二酯（XXXⅤ），然后于5ml6N盐酸中回流过夜，得到膦酸产物。除去溶剂（100℃，气压＜0.1mmHg）后，固体用甲醇重结晶，得到纯的XXXⅥ。
O.XXXⅨ.（R1=-OH，R2=-CH2PO3H，R3＝R5＝H，R4=-CH2-，n=4）
按Almi等所述的方法通过对氯甲基-克力克斯（4）芳烃制备克力克斯（4）芳烃衍生物XLⅣ。
向于-10℃冷却的1.0g（2.4mmol）克力克斯（4）芳烃（XXⅥ）和14.4g（81mmol）氯甲基-正辛基醚的100ml三氯甲烷的溶液中滴加4.7ml（40.3mmol）四氯化锡，约15分钟内加完。然后移去冷却浴，反应混合物在室温保持到至全部克力克斯芳烃起始物质进行了反应（约50分钟后），用薄层层析（己烷∶乙酸乙酯=4∶3）鉴定。然后缓慢地加入水，分离两相。有机层用蒸馏水洗涤2次，然后经硫酸钠干燥。随后除去硫酸钠，蒸发溶剂，得到残余物，再用正己烷洗涤并过滤，得到1.23g（80%）产物对氯甲基-克力克斯（4）芳烃XXXⅦ。
1g（1.6mmol）衍生物XXXⅦ于20ml亚磷酸三乙酯中回流6小时，蒸馏除去过量的亚磷酸三乙酯，所得的固体残余物（膦酸二酯XXXⅧ）在真空下干燥8小时。加入60ml20%盐酸溶液，将得到的反应混合物回流20小时，随后蒸发除去溶剂，所得的沉淀经过滤，第1次用甲醇洗涤，随后用三氯甲烷洗涤，并在真空下干燥，得到1.11g（80%）XXXⅨ，为白色固体。m.p.360℃。
P.XLⅣ.（R1=-OTs，R2=-CH2CH2Br，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4）
按Gutsche，Levine和Sujeeth，1985;Gutsche，Dhawan等，1983所述的方法制备对-2-溴乙基-克力克斯（4）芳烃衍生物XLIV。
（a）向2.14g克力克斯（4）芳烃（XXⅥ）的100mlTHF和10ml DMF的溶液中加入2.0g氢化钠，随后加入28g烯丙基溴。将混合物回流1小时，然后蒸发除去THF，残余物在水和三氯甲烷之间进行分配。三氯甲烷萃取液用水洗涤，干燥和蒸发，残余物用95%乙醇重结晶，得到2.18g（74%）O-烯丙基-克力克斯（4）芳烃XL，为无色针状物。
（b）在惰性气体中将1.66g（2.84mmol）O-烯丙基克力克斯（4）芳烃的25ml N，N-二乙基苯胺溶液加热回流2小时。将溶液冷却，倒入250ml冰-水中，与250ml浓盐酸一起搅拌，并过滤，得到粗产物，然后用异丙醇结晶，得到1.22g（74%）对-烯丙基-克力克斯（4）芳烃XLI，为米色针状物，m.p.245～248℃。
（c）2.09g（3.57mmol）对-烯丙基-克力克斯（4）芳烃的100ml无水THF的溶液与1.0g（42mmol）氢化钠反应，随后与4.0g（21mmol）对-甲苯磺酰氯反应，将混合物加热回流1.5小时。蒸发除去溶剂，得到淡棕色油状物，该油状物溶于100ml三氯甲烷中，在冰浴上冷却，并用100ml冰-水处理。有机相经干燥和蒸发，残余物用异丙醇重结晶，得到3.41g（79.5%）甲苯磺酰化的对-烯丙基克力克斯（4）芳烃（XLII）。
（d）3.50g甲苯磺酰化的对-烯丙基-克力克斯（4）芳烃的60ml二氯甲烷和40ml甲醇的溶液于干冰-丙酮浴中冷却，用臭氧处理直至它保持兰色（10-15分钟）。将氮气成泡通入溶液直至兰色消失，加入2g四氢硼钠。溶液于室温搅拌3～4小时，倒入冰冷却的稀盐酸溶液中，用常规方法处理，得到粗产物，为白色树脂状物。用3∶5丙酮-己烷重结晶得到1.51g（43%）微晶对-2-羟乙基-克力克斯（4）芳烃酚氧-甲苯磺酸酯（XLIII）。
（e）由6.5g（25mmol）三苯膦和Br2制备的二溴三苯膦（Schaefer等，1973）的150ml无水乙腈的溶液用步骤（d）产物（由3.25g步骤（c）产物制备）的50ml乙腈的溶液处理。混合物于室温搅拌2小时并过滤，蒸发除去溶剂，得到粘性的橙色油状物。该油状物与250ml95%乙醇一起搅拌8小时，过滤收集得到3.10g（78%）对-2-溴乙基-O-甲苯磺酰基-克力克斯（4）芳烃XLIV，为白色粉状物。
Q.XLVI（R1=-OH，R2=-CH2CH2PO3H，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4）
用对-2-溴乙基衍生物XLIV（实施例P）制备克力克斯（4）芳烃XLVI，其方法为由对-氯甲基-克力克斯（4）芳烃（实施例O）制备XXXIX的改良方法。
在氮气氛下，将纯化的溴化物XLIV（1mmol）于10mlP（OEt）3中回流过夜，在高真空（100℃，0.1mmHg）下除去过量的亚磷酸酯后，在氮气氛下将残余物（亚磷酸二乙酯XLV）加到5ml DMSO和1ml 6N氢氧化钠的混合液中，并于100℃加热过夜，脱去甲苯磺酸酯基团。在高真空（100℃，＜0.1mmHg）下除去DMSO后，残余物用25ml热水稀释，并用浓盐酸酯化，经冷却得到沉淀，然后过滤收集沉淀。固体用甲醇重结晶得到纯化的XLVI。
R.XLVII.（R1=-OH，R2=-CH2SO3H，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4）
在室温向对-氯甲基-克力克斯（4）芳烃（XXⅦ，实施例O;2.5mmol）的10ml 95%乙醇的溶液中加入亚硫酸钠水溶液（2M，11mmol）。回流过夜后，经蒸馏除去溶剂直至析出沉淀。过滤收集沉淀，用冷的氯化钠饱和水溶液洗涤，然后悬浮于最少量的水中，通过由Amberlite IR-120树脂和水填充的柱子。在真空下将含产物的对紫外线呈活性的级份浓缩，残余物用甲醇重结晶，得到纯的XLVII。
S.XLIX.（R1=-OH，R2=-CH2CH2SO3H，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4）
用溴乙基衍生物XLIV（实施例P）制备克力克斯（4）芳烃衍生物XLIX，其方法如下：依次用实施例R的磺化方法得到XLVIII，用实施例Q的水解步骤脱去甲苯磺酰基，用实施例R的Amberlite IR-120步骤得到磺酸XLIX。
T.LII.（R1=-OAc，R2=叔丁基，R3=R5=H，R4=-CH（OH）-，n=4）
按以下方法用已知的克力克斯芳烃LI（Gormer等;1990：R1=-OAc，R2=叔丁基，R3=R5=H，R4=-C（=0）-，n=4）制备克力克斯芳烃LII。
将1.5g（2.3mmol）对-叔丁基-克力克斯（4）芳烃（XXV）在37ml乙酐和0.1ml浓硫酸的溶液中回流。反应混合物加到300ml冰-水中，得到缓慢结晶的油状物。收集结晶固体，用水洗涤数次，并用石油醚干燥，得到O-乙酰基-对-叔丁基-克力克斯（4）芳烃（L），为白色结晶。
向装有冷凝管、搅拌器和加料漏斗的三颈园底烧瓶中加入1.2g（1.5mmol）O-乙酰基-对-叔丁基克力克斯（4）芳烃和70ml乙酐，在20℃和搅拌下，向其中滴加3.5g氧化铬（Ⅳ）在15ml乙酐和5ml乙酸混合液中的溶液，反应物于140℃搅拌8小时，冷却后，反应混合物加入600ml冰-水中并将其静置12小时，收集得到的黄色沉淀，并用水洗涤。用甲醇重结晶得到纯的酮基衍生物LI（O-乙酰基-对-叔丁基-克力克斯（4）芳烃，R4=-C（＝O）-）（Gormer等，1990）。m.p.305℃。
在室温和氮气氛下，将前面步骤得到的酮基衍生物（1mmol）溶于10ml无不乙醇中，并向其中分成若干小份加入四氢硼钠（8mmol）。酮基完成还原反应后（以红外光谱观察167cm-1处的羰基谱线消失来鉴别），滴加1ml乙酸，得到的混合物搅拌1小时。在高真空（＜0.1mmHg）下除去溶剂，所得到的固体与5ml甲醇一起回流20分钟。除去溶剂后，残余物经硅胶层析纯化，得到纯的羟基亚甲基桥键连接的O-乙酰基-对-叔丁基产物LII。
U.LIII.（R1=-OH，R2=R3=R5=H，R4=-CH（Cl）-，n=4）
在氮气氛下，将衍生物LII（实施例T;0.5mmol）于5ml二氯亚砜中回流。SO2的逸出停止后，在高真空（＜0.1mmHg）下蒸馏除去过量的二氯亚砜。向残余物中加入5ml THF，重复蒸馏以除去残余的二氯亚砜，得到氯代衍生物LIII。
V.LVI.（R1=-OH，R2=R3=R5=H，R4=-CH（CO2H）-，n=4）
（a）在氮气氛下，将含有氯代衍生物LIII（1mmol）和氰化钠（1.1mmol）在10ml二甲基亚砜中的反应混合物于80℃加热6小时。然后混合物倒入50ml冰-水中，用3N盐酸酸化，过滤收集得到的沉淀。将滤液加到25ml二甲基亚砜和5ml浓盐酸混合液中并回流过夜。在室温用100ml水稀释，过滤收集得到的沉淀，用三氯甲烷/甲醇重结晶得到LV。
（b）为了脱去对-叔丁基，在氮气氛下将由前面步骤得到的产物分数小份加入到50ml热的（60℃）三氯化铝（10mmol）的甲苯悬浮液中。搅拌过夜后，将混合物冷至0℃，并滴加100ml1N盐酸。加入后分离有机相，并真空浓缩。用三氯甲烷/甲醇重结晶得到纯的LVI。
W.LVII.（R1=-OAc，R2=叔丁基，R3=R5=H，R4=-CH（CH2CH=CH2）-，n=4）
将氯代衍生物LIII（实施例U）溶于最少量的THF中，混合物滴入搅拌的、冷却（-78℃）的含（CH2CH=CH2）2CuLi（0.2M，3mmol）的THF溶液中。然后使悬浮液温热至室温。搅拌过夜后，悬浮液用5ml 3∶1饱和氯化铵和饱和氨溶液的混合液萃取。有机相经无水硫酸钠干燥、过滤并真空浓缩。残余物经硅胶层析纯化，得到O-乙酰基-对-叔丁基烯丙基衍生物LVII。
如果需要，按以下实施例b部分的方法脱去乙酰基和叔丁基。
X.LVIII.（R1=-OH，R2=R3=R5=H，R4=-CH（CH2CO2H）-，n=4）
（a）将克力克斯芳烃（LVII）（1mmol）置于10ml二氯甲烷中，于-78℃进行臭氧化，直至反应混合物变成兰色。然后加入2ml甲酸和1ml过氧化氢，将反应混合物温至室温，同时通氮气洗。混合物回流过夜，然后在真空下除去溶剂，得到LVIIa。
（b）将由前面步骤得到的O-乙酰化产物（0.2mmol）于4ml甲醇和1ml 6N氢氧化钠的混合液中回流过夜，以脱去乙酰基。在真空下除去溶剂后，残余物用10ml水稀释，并酸化至pH2。过滤收集得到的沉淀，用三氯甲烷/己烷重结晶。按实施例V步骤b的方法脱去叔丁基，得到纯的LVIII。
Y.LXII.（R1=-O（CH2）3SO3Na，R2=H，低级烷基，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4）
按Shinkai等，1989，所述的方法制备克力克斯（4）芳烃LXII。
在氮气氛下于50℃将克力克斯（4）芳烃XXVI（1.54mmol）溶于100ml THF中。冷却后加入1.20g氢化钠（30mmol;60%油分散液），搅拌混合物直至氢气逸出停止（约1小时）。然后滴加2.26g丙烷-1，3-砜（18.5mmol），混合物于室温搅拌24小时。加入甲醇以分解残余的氢化钠，然后在减压下蒸发溶剂，残余物溶于500ml热水中。通过离心除去不溶物。然后加入乙酸钠进行盐析，产物沉淀，得到纯化的LXII（产率10%），m.p.＞300℃。
Z.LXIV.（R1=-O（CH2）3SO3Na，R2=SO3Na，R3=R5=H，R4=-CH2-，n=4）
向10ml二甲基亚砜、对-磺酰基-克力克斯（4）芳烃（XV，图8;1mmol）和1ml 6N氢氧化钠的混合物中加入丙烷-1，3-砜（9mmol），得到的反应混合物于60℃加热过夜。在真空（＜0.1mmHg）下除去溶剂后，固体残余物用最少量的水稀释，在搅拌下滴入100ml乙醇中。过滤收集得到的沉淀，再用最少量的水稀释，并再次滴入100ml乙醇中。过滤收集得到的沉淀，用甲醇/CH3CN重结晶，得到纯的LXIV。
实施例3
制备桥接芳基的大环化合物
A.VII.混合的萘基/苯基大环
10g铬变酸二钠的55ml水的溶液用22ml的30ml 37%盐酸处理。向该溶液中加入5gl，2-苯二甲醇的55ml乙酸的溶液，将该反应回流6小时。所得的混合物经过过滤后加入500ml乙腈，以析出粗产物，过滤收集。粗制化合物进一步经LH-20树脂柱层析纯化，用乙醇洗脱。
B.LXXV.萘基-苯基大环（n=2萘基+2苯基）
按Mendoza等提出的方法制备混合的大环LXXV。
在5ml浓盐酸存在下铬变酸（Ⅲ，图3A;10mmol）和2，5-二羟甲基-3-叔丁基酚（LXXII;1mmol）于100℃加热过夜。在高真空（100℃，＜0.1mmHg）下除去溶剂后，残余物溶于最少量的水中，通过Sephadex LH-20和水装填的柱子并洗脱。在2ml浓盐酸和2，5-二羟甲基-3-叔丁基酚（LXXII;0.6mmol）存在下，含2个铬变酸单元和1个酚单元的分离产物（LXXIII;0.6mmol）再于100℃加热过夜。用Sephadex LH-20柱分离产物（LXXIV;0.05mmol），在真空下干燥，然后在氮气氛下于1ml浓硫酸中于80℃加热6小时。用5ml冷水稀释后，用100mg活性炭处理，将所得混合物过滤，在真空（＜0.1mmHg）下除去滤液中大部分水份。残余物溶于热的饱和氯化钠水溶液中。冷至0℃析出沉淀。过滤沉淀，溶于最少量的水中，通过Amberlite IR-120和水装填的柱子并洗脱。将含纯产物的流出液合并，冷冻干燥，得到纯的LXXV（0.03mmol）。
实施例4
增生细胞的细胞毒性
应用一组人体细胞系测定药物的毒性，包括KB（鼻咽癌细胞），HeLaS3（颈上皮癌细胞），PLC（肝癌细胞），HepG2（人体肝癌细胞），HepG2T14（用HBV转染的肝癌细胞），WI38（正常人体肺成纤维细胞），BT549（乳腺癌细胞），SW480（乳腺癌细胞）和A549（肺癌细胞）。
在24孔的多孔培养板的每个孔中加入1ml含5%胎牛血清（FCS）和青霉素/链霉素（P/S）的RPMI-1640培养基，并接种5×104细胞。在接种后的第2天，将表3列出的50个试验化合物中的一个加入细胞中，浓度为1～100μg/ml。3天后除去培养基，细胞用Commassie Blue的40%甲醇和7%乙酸的溶液染色。结果已在上面Ⅱ部分讨论。
实施例5
对HSV病毒活性的抑制作用：细胞致病作用
于37℃在含7%CO2的调湿培养箱中将Vero细胞保存在含5%胎牛血清、100单位青霉素/ml和100μg链霉素/ml的RPMI-1640培养基中。应用病毒株HSV的HSV-1（Kos-1）和HSV-2（333）株。
在96孔微滴板的每个孔中加入0.2ml含5%FCS和0.1%甲基纤维素（15cps）的RPMI-1640培养基，并接种1×105Vero细胞。培育过夜，使细胞进行对数期倍增后，吸去培养基，以100μl相同培养基代替，此培养基含有2%FCS，和50μl对照液或药物溶液，以及50μl HSV-1或HSV-2病毒液，药物的最后浓度为10μg/ml，病毒的含量为大约3个蚀斑形成单位（PFU）/细胞，即6×105PFU/孔。
细胞于37℃培养24小时，在此期间细胞致病作用可清楚地观察到。在没有病毒感染的情况下，细胞形成均匀的单层成纤维细胞。在有病毒感染的情况下，细胞形成园形细胞的悬液，随后细胞凝集，它们的外观很易与正常的成纤维细胞区分。如果未观察到细胞病作用，用10μg/ml重复试验。未接种病毒的平行组细胞作为Vero细胞细胞毒性试验的对照。
上面表1列出了试验化合物的结构式，表3第2列展示了保护细胞免于细胞致病作用（+）的化合物。
实施例6
对HSV病毒活性的抑制作用：蚀斑减少
将Vero细胞按实施例5的方法保存在含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。在24孔培养板中加入1ml含5%FCS和0.1%甲基纤维素（15cps）的RPMI-1640培养基，在其中接种4×105Vero细胞。培育过夜，使细胞进行对数期倍增后，吸出培养基，以100μl相同的培养基代替，该培养基含有2%FCS，其含有50μl对照液或药物溶液，以及含有50μlHSV-1或HSV-2病毒液，药物的最后浓度为0.15、2.5、5、10或20μg/ml，病毒的含量为大约1×103PFU/ml，即50PFU/孔。
于37℃培养2小时后，吸去病毒并除去药物，细胞用PBS洗涤，加入0.5ml含2%FCS和青霉素/链霉素（P/S）的1%甲基纤维素（4K cps）的RPMI-1640培养基。2天后除去培养基。细胞用0.8%结晶紫的50%乙醇溶液染色。将形成的蚀斑计数，并除以对照组中形成的蚀斑以计算抑制的百分比。ED50值表示50%病毒蚀斑被抑制所需药物的浓度，ED50是假定对病毒蚀斑以计算抑制作用线性剂量反应而算出的。计算出的IC50值在上面表3和表4中列出。
实施例7
对HSV病毒活性的抑制作用：病毒得量的抑制
将5ml含5%FCS和P/S的RPMI-1640培养基加入25T烧瓶中，并接种1×106赫拉S3细胞。24小时后，吸出培养基，以6×106PFU HSV-1或HSV-2，和经选择的KY化合物的序列稀释液代替，药物浓度为10、5、2.5、1.25和0.625μg/ml。于37℃在2ml含2%FCS和P/S的RPMI-1640中生长24小时后，细胞于-70℃冷冻直至滴定的时候。为了从细胞中释放出病毒，将细胞冷冻/融化3次，并序列地进行10倍稀释。
在24孔多孔培养板的每个孔中加入1ml含5%FCS、P/S和0.1甲基纤维素（15cps）的RPMI-1640培养基，并接种1×105Vero细胞。第2天除去培养基后，加入100μl10倍序列稀释的病毒，一式二份。于37℃培育2小时后，除去病毒，加入0.5ml甲基纤维素（4K cps）的RPMI-1640（含2%FCS+P/S）培养基。2天后除去培养基。细胞用0.8%结晶紫的50%乙醇溶液染色，将形成的蚀斑计数，由稀释倍数计算滴度。
图29A和29B所示，病毒得量的减少是KY化合物（KY-1和KY-2）浓度的函数。
实施例8
抗耐药病毒HSV-1和HSV-2株的活性
应用以下的HSV-1和HSV-2病毒株：KOS，为野生型HSV-1病毒;KOS（PMEA）和KOS（PFA），均为具有DNA聚合酶突变的耐药HSV-1病毒;333，为野生型HSV-2病毒，以及333（DHPG），为具有胸苷激酶突变的耐药HSV-2病毒。
大体上按实施例7所述的方法，用上述5个HSV株中的每一个检查KY-1、无环鸟苷（ACV）、DHPG、PFA和PMEA对病毒得量的抑制。简要地说，将赫拉S3细胞接种置含培养基的25T烧瓶中，24小时后吸出培养基，以6×106PFU经选择的HSV株病毒和KY-1、ACV、DHGP、PFA和PMEA的序列稀释液代替。于37℃在2ml含2%FCS和青霉素、链霉素（P/S）的RPMI-1640中生长24小时后，细胞于-70℃冷冻直至滴定的时候。为了从细胞中释放出病毒，将细胞冷冻/融化3次，并序列地进行10倍稀释，序列稀释液加到Vero细胞培养物中。于37℃培育2小时后，除去病毒，加入0.5ml甲基纤维素（4Kcps）的RPMI-1640培养基（含2%FCS+P/S）。2天后除去培养基。细胞用0.8%结晶紫的50%乙醇溶液染色。将形成的蚀斑计数，由稀释倍数计算滴度。从药物剂量反应测定IC90浓度值，IC90值表示抑制90%病毒得量所需的各个药物浓度。该值已列在上面表5中。
实施例9
对RSV病毒活性的抑制作用
用以下试验来评定组织培养中KY-和Y-化合物的抗病毒活性：在96孔平底组织培养板（Falcon 307）中，按上述细胞毒性试验中类似的条件进行。在该试验中，将化合物的2%FCS-MEM溶液进行序列稀释，用序列的2倍稀释液一式4份试验化合物（0.05ml/孔）。除了上述一组作为抗病毒和组织对照孔以外，向所有的孔中加入0.05ml含大约100组织培养半数感染剂量（TCID50）的合适病毒。接着向每孔中加入大约3×103HEp2细胞（0.1ml）。每个试验中包括：含抗病毒和不含病毒的对照孔（病毒对照）或含培养基不含病毒或抗病毒的对照孔（组织对照）。然后将免疫抗原性病毒反滴定。所有的试验板置于含5%CO2的培养箱中于35℃培育5～7天。当病毒对照孔显示70%～100%CPE（包括合胞体）时，观察所有的孔。与病毒对照孔中的CPE比较，在测定每组一式4份的最后孔中抗病毒的最终浓度显示＜50%CPE之后，计算半数有效浓度（IC30）。每个试验化合物计算的ED30值列在表5中。
实施例10
抗疱疹单纯病毒（HSV）活性：体内抗眼部培养物的HSV-1病毒的局部活性
用新西兰白兔作实验，至少在接种病毒前2天，训养在实验笼内，使其适应实验笼内的各种装置和条件。在适应期之后，对这些动物作裂隙灯眼部检查，淘汰所有的原来就存在的眼前节缺陷的白兔。然后，给白兔双眼局部接种含有HSV-1病毒McKrae株的最低必需培养基（MEM.Gibco）80μl，病毒量为每毫升105蚀斑形成单位（105pfu/ml）;接种后需按摩眼睛30秒钟，然后将动物放回实验笼中，每笼1只白兔。
接种病毒后（PI）的第4天，用裂隙灯显微镜检查白兔双眼。对眼角膜上皮细胞、虹膜和结膜病变的严重程度，用0+到4+递增的记分作分级记录。检查后将白兔分为4组，每组5只均存在眼角膜、基质和结膜损伤。分组后立即开始作局部治疗试验。治疗分组包括：
第1组：白兔5只，用Y-1作局部治疗，药物浓度为6.25μg/50μl，5次/天，共4天。
第2组：白兔5只，用Y-1作局部治疗，药物浓度为12.5μg/50μl，5次/天，共4天。
第3组：白兔5只，用Y-1作局部治疗，药物浓度为18.75μg/50μl，5次/天，共4天。
第4组：白兔5只，用安慰剂（无菌水）治疗，5次/天，共5天。
对Y-1递增剂量浓度的耐受性研究，是基于其90%有效量（ED90）浓度，该ED90浓度是由病毒得量或病毒的细胞致病作用测定所决定。第1组白兔接受含有6.25μg/50μl（即1/2ED90浓度）Y-1局部滴眼治疗;第2组白兔接受含有12.5μg/50μl（即为ED90浓度）Y-1局部滴眼治疗;第3组白兔接受18.75μg/50μl（即1.5倍ED90浓度）Y-1滴眼治疗。Y-1剂量均配制在50μl容量中（标准的滴眼剂），得到包含上述的浓度。
接种病毒后（PI）第4天，用0-19μg Y-1（在50μl内）开始局部治疗，治疗持续到病毒接种后第7天。从接种病毒后第3天到第7天，每天都要对所有的动物作眼裂隙灯检查，每天记录HSV-1病毒诱发的眼病变程度。
此外，在病毒感染第0天（接种前），第3天，第5天和第7天，对所有动物作眼部取样检查，看是否存在感染的HSV-1病毒。简而言之，用棉拭子轻擦眼下部和上部的结膜囊，取得泪膜，并将此棉拭子在动物鼻穹窿内放置10秒钟。然后分别将此棉拭子在Hank氏缓冲盐水（NBSS，Gibco实验室）中浸洗，按50μl一份病毒-HBSS浸出液，将此病毒在事例的HFF细胞单层上吸附5分钟。此吸附病毒后的单层细胞加入最低必需培养基（MEM;Gibco实验室）使成水合物，37℃培养，每天观察，持续2周，检查是否出现与HSV感染相一致的细胞致病作用（HSV CPE）。对于未出现HSV CPE的培养物作细胞盲（目）传（代），以确证是否是病毒阴性。
接种病毒后第7天活杀动物，取出眼角膜上皮，HSV病毒在HFF单层细胞上培养得到。对眼角膜上皮作共培养，每天用反转的光学显微镜检查，对未出现HSV CPE的培养物作盲传培养，以确证是否是病毒阴性。
用于作单一药剂治疗的3种Y-1浓度的临床效果与用安慰剂的结果相比较，在用Y-1各制剂作局部治疗的过程中和治疗完成之后，对其治愈病毒损伤的效果作相互比较，并与用安慰剂治疗的结果相比较，如图33（A-D）所示。
实施例11
对流感A病毒活性的抑制作用
对KY类化合物抗流感A病毒活性的评价方法同实施例9所述，不同是在体外以流感病毒（台湾A株）感染MDCK细胞（肾细胞系）。
实施例12
对人免疫缺损病毒（HIV）诱发的细胞事例的抑制作用
将人CD4+指示细胞（VB）和慢性感染的H9细胞保存在RPMI-1640培养基中，在含有7%CO2的调湿培养箱内37℃培养，培养基中补加有5%胎牛血清、青霉素100单位/ml和链霉素100μg/ml。所用的HIV病毒株是HTLV-ⅢB和RF-Ⅱ株（从国家卫生研究所（Bethesda，MD）获得）。
为作细胞融合抑制测定，选用的一个KY类化合物（1mg/ml，在PBS中）用一块96孔园底培养板，在1∶2和1∶28之间作序列稀释。然后将此稀释的KY化合物移入另一块96孔平底培养板。再将25μg慢性感染的H9细胞（2×106个细胞/ml）或25μg以HIV病毒RF-Ⅱ株慢性感染的细胞加入每个孔内，37℃培养45分钟，然后每孔加入25μl VB细胞（约5×104个细胞），此细胞和病毒分离体在调湿培养箱内，在含有5%CO2的空气中培养18小时。合胞体形成的情况在相差显微镜下观察记分，并记录使合胞体形成完全抑制的KY化合物的浓度（ED100）。结果见表7。
实施例13
局部给药对生殖器HSV感染的治疗效果
A.病毒和病毒接种
HSV-2病毒MS株用于感染实验动物。雌性Hartley品系豚鼠（Charles River饲养实验室，Kingston，纽约）体重250-300g，用棉拭子擦去阴道内分泌物后1小时，在阴道内接种HSV-2病毒其量为2.0×105蚀斑形成单位。
B.豚鼠的治疗
在第一项研究中，对每组10只豚鼠进行局部治疗，（0.1ml药物用于阴道内，0.1ml药物用于外生殖器皮肤），从接种HSV-2病毒后6小时或48小时开始，每天治疗3次（约每8小时一次），共7天。3组未接种感染的动物也用同样的方式治疗，用于测定有无皮肤刺激作用。
在第二项研究中，每组8-10只动物，在接种病毒后6小时或24小时开始治疗，用2%或6%的KY-1或Y-1的局部治疗制剂，每天治疗3次，（如表8B所示）。KY-1或Y-1制剂的配制方法是，将此化合物溶于1.5%甲基纤维素溶液，使化合物的最后浓度为2%或5%（重量/重量）。对照动物（10只）不给任何治疗或用安慰剂（1.5%甲基纤维素溶液）治疗。
C.样品收集和病毒测定
为了测定药物治疗对阴道内病毒复制的影响，在HSV病毒接种后的第1、3、5、7天和10天，用棉拭子取阴道分泌物，浸入含有2.0ml培养基的小试管内，棉拭子在试管内搅洗后，在-70℃将此培养基冷冻保存，直至用于HSV-2病毒滴定。当全部样品收集完成后，将它们解冻，并作序列稀释，用兔肾细胞以微滴细胞致病作用测定法，测定HSV-2病毒的滴度。
D.效果评价
为了测定药物治疗对外生殖器损伤的形成和扩展的影响，在感染初期的全过程内（19-21天），对外生殖器损伤的严重程度用0-5+分级记分，损伤记分-天数曲线面积和病毒滴度-天数曲线下的面积，和其损伤记分峰值和病毒滴度峰值，在未治疗与用安慰剂治疗动物之间或在用安慰剂治疗与药物治疗动物之间，用Mann-Whitney U极差总和（U range sum）测定进行比较。p值等于或小于0.05表示二者有显著性差异。对此结果参照表10和表11，在本文上述第Ⅳ部分进行了讨论。
动物在接种病毒后，每天对其是否存在损伤以及损伤严重程度进行记分，持续19天（按0-5+分记分）。将损伤记分制作成表，以每天损伤记分对时间（天）曲线下的面积和观察到的操作记分峰值来表示。见表11提供的数据。在试验中，对8只动物给药一个已知的抗病毒剂无环鸟苷（ACV），药物配制成5%的浓度，作为阳性对照。
实施例14
对HSV-1病毒与Vero细胞结合的抑制作用
如实施例5中所述，Vero细胞保存在RPMI-1640培养基中。将细胞培养过夜，进行对数期倍增之后，吸出此培养基，以100μl实验培养基代替，此培养基含有2%胎牛血清（FCS），由50μl对照液或药物溶液，以及50μl H3标记的HSV-1病毒液组成，药物的最后为10μg/ml，病毒的含量为大约3个蚀斑形成单位（PFU）/每个细胞，即6×105PFU/孔。细胞在实验培养基内分别培养5、30、60、120和240分钟后，将细胞从悬液中吸出，用PBS洗2次，测定结合在细胞上的病毒量（cpm3H）。结果见图30，图中病毒结合对照以实心园点表示，药物抑制病毒结合以实心方格表示。
实施例15
药物与病毒接触对HSV抑制的影响
Vero细胞保存在RPMI-1640培养基中（如上所述）。将细胞培养过夜，进行对数期倍增后，吸出此保存培养基，以100μl含有2%胎牛血清的培养基代替，对化合物KY-1作序列稀释，将50μl浓度在0.625μg/ml和10μg/ml之间的药物稀释液加入培养板第一组，并同时加入50μl HSV-1病毒悬液，使每孔含有5×106PFU。细胞在37℃培养2小时，然后用PBS洗涤细胞，并测定病毒蚀斑的数目，同实施例6所述。
在第二组细胞孔内，先将序列稀释的药物加至细胞，然后加入HSV-1病毒，细胞在病毒存在下于37℃培养2小时。洗涤细胞以除去游离的药物之后，加入病毒悬液，每孔含5×106PFU。将此细胞在37℃培养2小时，然后用PBS洗涤细胞后，测定病毒蚀斑数目，方法如实施例6所述。
在第三组细胞孔内，将100μl病毒悬液加至细胞，每孔含5×106PFU，将细胞在37℃培养2小时，然后用PBS洗涤细胞以除去未结合的病毒。对化合物KY-1作序列稀释，将浓度在0.625μg/ml和10μg/ml之间的药物100μl加至细胞。在存在药物的情况下，细胞在37℃培养2小时，然后用PBS洗涤细胞，再如上所述测定病毒蚀斑的数目。
将上述每种药物处理方法中所测定的病毒蚀斑数目，以未作药物处理的对照组病毒蚀斑数目的百分数来表示，作图如图31。实心园点表示细胞同时与药物和病毒接触。实心方格表示在加入病毒之前，细胞和药物一起作预培养，空心方格表示在加入药物之前，细胞和病毒一起作预培养。
实施例16
KY类化合物引起的HSV-1病毒的失活
经纯化的HSV-1病毒悬液培养在含有2%FCS、青霉素和链霉素的RPMI-1640培养基中（Gibco实验室）。将对照溶液，KY-1或KY-217溶液加入等分的病毒悬液中，使药物的最后浓度为10μg/ml，病毒颗粒最后浓度为6×106或6×105PFU/ml。将此悬液在37℃培养1小时，然后按10倍稀释法作序列稀释，使最后药物浓度为10、100、10-1、10-2、10-3，和10-4μg/ml。再将此序列稀释的悬液颗粒加至Vero细胞，培养2小时（同实施例6所述），48小时后测定细胞的病毒蚀斑。在2块培养板上，对每块板上的每个病毒浓度和每个药物浓度，计算细胞病毒蚀斑的数目，见表9所示。
实施例17
KY类化合物与HSV病毒蛋白质的结合
A.化合物KY与HSV病毒蛋白质的结合
上述HSV-1和HSV-2病毒悬液，浓度都大约为5×107PFU/ml，加入5×105cpm14C标记的化合物KY-1（50μg/ml），在37℃培养2小时。将每份病毒悬液分成二等份，以0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）作成溶液，含有或不含有1%巯基乙醇。四个样品溶液在8.5%聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，然后按照标准的程序通过自动放射照术使凝胶显影。四个样品的自动放射显影照片见图32A，对于HSV-1病毒谱带，A带含有巯基乙醇，B带不含巯基乙醇，对于HSV-2病毒谱带，D带含有巯基乙醇，E带不含巯基乙醇，C带为标志蛋白质。
B.结合蛋白质的鉴定
如上所述，HSV-1和HSV-2病毒悬液用SDS作成溶液，并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（SDS-PAGE）使之分级分离，每个样品一式三份作电泳分离，相当于图32B中谱带D、B和C，对每条谱带的二块凝胶用免疫印迹技术进行分析，方法如下：首先使谱带D、B和C的凝胶分别与特异性抗HSV病毒糖蛋白gD、gB、和gC的小鼠单克隆抗体反应。这些单克隆抗体是自Alabama大学S.Chatterjee博士处得到。然后将这些凝胶与碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠抗体一起培育，以便标记每条谱带中的糖蛋白。带有结合抗体的糖蛋白，可按标准的方法进行鉴定，即通过在有氮兰四唑和溴氯吲哚磷酸盐存在时与H2O2反应的方法来鉴定。结果如图32B所示。
实施例18
组合药物对HSV病毒的抑制作用
A.对HSV-1病毒的抑制作用
如实施例7中所述，HSV-1病毒颗粒是获自感染的赫拉细胞，在24孔的多孔培养板上，每个孔培养1×105Vero细胞，每孔加有1ml RPMI-1640培养基，并含有5%FCS、青霉素和链霉素以及0.1%甲基纤维素（15cps）。在第二天，移去培养基后，将按10倍稀释法序列稀释的病毒100μl，一式二份加入细胞孔内，再分别向Vero细胞培养孔中加入（i）仅加入某一特定浓度的GL-288（最多至50μg/ml），（ii）仅加入某一特定浓度的无环鸟苷（最多至50μg/ml）和25μg/ml GL-288;或者（iv）某一特定浓度的无环鸟苷（最多至50μg/ml）和50μg/ml GL-288。
于37℃培养2小时之后，移去病毒，在细胞培养孔内加入0.5ml含有2%FCS和青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基甲基纤维素（4K cps）。二天后，移去此培养基。用0.8%结晶紫的50%乙醇溶液对细胞染色。计数所形成的病毒蚀斑数目，从稀释倍数计算病毒滴度。
如图34A所示，病毒得量的减少，是化合物浓度的函数（随药物浓度增加，病毒得量减少）。
B.对HSV-2病毒的抑制作用
如实施例7中所述，HSV-2病毒颗粒是获自感染的赫拉细胞。同上文A中所述，Vero细胞用只加有GL-288的病毒颗粒序列稀释液感染，或用只加有无环鸟苷的病毒稀释液感染，或者用加入无环鸟苷和GL-288的病毒稀释液感染。于37℃培养2小时之后，移去病毒液，在细胞培养孔中加入0.5ml含有2%FCS和青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基中的甲基纤维素（4K cps）。二天后，移去此培养基，细胞用0.8%结晶紫的50%乙醇溶液染色。计数所形成的病毒蚀斑数目，从稀释倍数计算病毒滴度。
如图34B所示，病毒得量的减少是化合物浓度的函数。
实施例19
对HSV病毒活性的抑制作用：细胞致病作用
Vero细胞保存在加有5%胎牛血清、青霉素100单位/ml、链霉素100μg/ml的RPMI-1640培养基中，在含有7%CO2的调湿培养箱内于37℃培养。试验用HSV病毒是HSV-1（Kos-1）株和HSV-2（333）株。
化合物Y-1局部用制剂的制备是将Y-1溶于K-Y凝胶中（Johnson & Johnson），制成5%、10%、15%、和20%（重量/重量）的药物浓度。然后，将各Y-1制剂在含有2%FCS的RPMI-1640培养基中溶解和稀释。
在一块96孔的微滴培养板上，每个孔加入0.2ml含有5%FCS和0.1%甲基纤维素（15 cps）和RPMI-1640培养基，将1×105Vero细胞置于每个孔中培养。培养过夜，使细胞作对数期倍增之后，吸去培养基，以100μl含有下列成分的RPMI-1640培养基代替：2%FCS、50μl对照液或药物溶液以及50μl病毒HSV-1或HSV-2，药物的最后浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml，病毒的含量大约为3PFU/细胞，即6×105PFU/孔。
细胞在37℃培养24小时，在此时间内，细胞致病作用明显可见。未受病毒感染时，细胞形成均匀的成纤维细胞单层。受病毒感染后，培养细胞变成园形的细胞悬液，随后细胞凝集，其外观很容易与正常的成纤维细胞区分。同时平行作一组未接种病毒的细胞，作为对Vero细胞的细胞毒性对照。单独使用K-Y凝胶未见任何细胞毒性。试验结果如表12所示，表中“+”表示细胞致病作用完全抑制，“-”表示细胞致病作用全未抑制。
实施例20
用K-Y凝胶配制的Y-1制剂对HIV病毒诱发的细胞融合的抑制作用
将人CD4+指示细胞（VB）和慢性感染的H9细胞细胞保存在加有5%胎牛血清、100单位/ml青霉素以及100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，在含有7%CO2的调湿培养箱内于37℃培养。所用的HIV病毒是HTLV-ⅢB和RF-Ⅱ株，从国立卫生研究所（Bethesda，MD）获得。
化合物Y-1局部用制剂的制备是将Y-1溶解于K-Y凝胶（Johnson & Johnson）中，制成5%、10%、15%和20%（重量/重量）的药物浓度。然后，将各Y-1制剂溶于PBS中，使Y-1的最后浓度为1mg/ml。
为了作细胞融合测定，将各Y-1组合物序列稀释液移入一块96孔平底培养板中。再向每个孔加入25μl慢性感染的H9细胞（2×106细胞/ml），或者加入25μl被RF-Ⅱ株HIV病毒慢性感染的细胞，于37℃培养45分钟。然后向每个孔加入25μlVB细胞（约5×104细胞），并且此细胞和病毒分离体在含有5%CO2的湿润空气培养箱内，共存培养18小时。合胞体形成的程度在相差显微镜下观察记分。合胞体形成完全抑制时记“4+”。未见合胞体形成记：“-”。试验结果如表13所示。
尽管本发明已对较好的化合物和应用该化合物抑制病毒的实验方法作了叙述，但可以在不背离本发明的情况下进行各种修正和改变。