核盘菌凝集素SSL-6蛋白及其编码基因与应用技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种核盘菌凝集素SSL-6蛋白及其
编码基因与在抗油菜菌核病方面的应用。
背景技术
油菜是重要的经济作物。来自油菜的菜籽油是人类最主要的食用油来源之一，是
我国粮油安全保障的重要一环，为我国重要的战略物质之一。目前，我国的食用油将近60％
依赖进口。制约我国油菜产量与品质提高的重要限制因素之一是核盘菌对田间油菜的危
害。菌核病是由腐生型真菌核盘菌寄生引起的一种世界范围性严重病害，是我国油菜最主
要病害，严重影响油菜的品质和产量。一般年份菌核病发病率为10％-30％，严重的时候可
以达到80％以上(费维新,李强生,吴新杰.中国油料作物学报,2002,3:47-49)。
目前，如何防治油菜抗菌核病主要有如下途径：农药与生物防治、选育抗(耐)菌核
病材料、基因工程方法。通过这些途径，取得了一些成绩，筛选到一些抗(耐)病性比较好的
材料，但是生产中菌核病危害严重的问题依然存在(刘正立,刘春林.甘蓝型油菜抗菌核病
研究进展.中国农学通报,2015,31(15):114-123)。
基因工程途径解决菌核病危害的问题，应该是一条可行的途径，可是现有的思路
与转基因实践并未获得显著提高抗菌核病的油菜材料。为此，与以往基因工程的策略不同，
本发明人改变思路，采用“以毒攻毒”的思想，克隆核盘菌中推测为凝集素SSL-6的基因，并
构建该基因的过表达质粒；然后将核盘菌凝集素SSL-6蛋白基因转入甘蓝型油菜中，以期获
得具有抗菌核病的油菜种质资源。本发明通过基因工程的方法，首次发现核盘菌凝集素
SSL-6蛋白及其编码基因，该基因可显著提高油菜对核盘菌的抗性。
发明内容
本发明的目的是，针对上述现有技术的不足，提供一种来源于油菜病原菌核盘菌
的核盘菌凝集素SSL-6蛋白及其编码基因，同时提供该基因在油菜抗核盘菌中的应用。
为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种核盘菌凝集素SSL-6蛋白，来源
于油菜致病菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)，是下述氨基酸残基序
列之一：
1)序列表中的SEQ ID No:1；
2)将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一至五个氨基酸残基的取代
和/或缺失和/或添加且对提高油菜抗菌核病作用的蛋白质。
编码本发明核盘菌凝集素SSL-6蛋白的基因(SSL-6)，是下述核苷酸序列之一：
1)序列表中的SEQ ID No:2的核苷酸序列；
2)编码序列表中的SEQ ID No:1蛋白质序列的DNA；
3)与序列表中的SEQ ID No:2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同
功能蛋白质的核苷酸序列；
4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序
列。
上述高严谨条件为：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交
并洗膜。
序列表中的SEQ ID No:2由936个碱基组成，其编码框为自5’端第1-933位碱基，编
码具有序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列的蛋白质。
本发明还包括含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增
该基因中任一片段的引物对。
本发明还提供上述的核盘菌凝集素SSL-6蛋白基因在调控油菜抗菌核病中的应
用。
本发明还提供将编码上述核盘菌凝集素SSL-6蛋白的基因转入油菜中，经培育得
到转基因油菜，该转基因油菜的抗菌核病能力得到提高，从而得到抗核盘菌侵染的高抗菌
核病的油菜种质资源。
本发明的为核盘菌凝集素SSL-6蛋白基因的过表达转基因油菜对菌核病抗性显著
提高。本发明为油菜提高油菜抗菌核病提供了一个优质基因。本发明的蛋白质及其编码基
因具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
附图说明
图1是核盘菌菌核在PDA培养基上培养5天的生长情况图。
其中：5d表示生长到第5天时的菌丝分别情况，S3表示紧靠培养皿壁的发育中的新
菌核。
图2是从发育中的核盘菌菌核中分离出的总RNA电泳图。
其中：M为指示DNA片段大小的DNA分子标记，1、2为核盘菌菌核样品；该两个样品来
源的RNA都有明显5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA三条带，说明RNA质量可靠，能用于下一步
反转录合成cDNA。
图3是核盘菌凝集素SSL-6蛋白基因全长CDS的PCR扩增产物电泳图。
其中，M为DNA片段分子量大小的100bp plus Ladder DNA标记，1为扩增产物。
图4是构建的SSL-6基因过表达质粒的菌落PCR验证电泳图。
其中：M为指示DNA片段大小的DNA分子标记，1为空白对照，2-8为单菌落。
图5是构建的SSL-6基因过表达质粒的酶切验证电泳图。
其中：M为指示DNA片段大小的DNA分子标记，1为未经酶切的表达质粒，2为经NcoI
和XbaI双酶切的表达质粒。
图6是转pFGC5941-SSL-6CDS质粒的油菜抗性苗的转基因PCR检测电泳图。
其中：M为DNA片段分子量大小的100bp plus Ladder DNA标记，1-5、7、8和11为过
表达转基因植株；6、9、10为非转基因植株；12为空白对照，13为阳性对照。
图7是转基因植株中目标基因表达的RT-PCR检测图。
其中：1-8为转基因植株，9为空白对照；BnaACTIN2为油菜看家基因的表达情况，作
为表达量的相对参照；SSL-6为转基因植株中SSL-6基因的相对表达量。
图8是核盘菌接种油菜的抗性试验图。
其中：A为转基因植株，B为受体植株；从菌斑大小可以看出转SSL-6基因的植株抗
菌核病能力显著提高。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。所用引物和测序工作由上海
生工生物科技有限公司完成。
实施例1.核盘菌总RNA分离与凝集素SSL-6蛋白基因全长CDS的克隆
一、核盘菌总RNA分离与第一互补链cDNA的合成
在超净工作台上，将核盘菌菌株SS-3(由湖南农业大学作物代谢调控实验室提供)
的菌核用75％的乙醇消毒5min，用灭菌蒸馏水冲洗3次，灭菌后的菌核接种到带PDA固体培
养基的培养皿中央；接种后培养皿放置在培养箱中，25℃暗培养5天。暗培养第5天，沿着培
养皿壁会有新的菌核形成(图1)。从接种后培养第5天的培养皿中，取发育中的菌核约100mg
放入1.5mL离心管中，盖紧管盖，迅速转移至液氮中速冻；往离心管中加入700μL REB(RNA
extraction buffer(REB)组成：1M Tris-HCl(pH＝8)40mL，0.5M EDTA(pH＝8)10mL，LiCl
3.4g，SDS 2g，H2O定容至200mL)，并用电动研磨棒快速研磨；研磨充分后，加入700μL水饱和
酚，剧烈振荡，12000×g，4℃离心10min；取上清液至1.5mL离心管中，并加入600μL氯仿，充
分振荡，12000×g，4℃离心10min；取上清液至另一个1.5mL离心管中，加入200μL的冷乙醇
和40μL 3M的NaAc，-20℃静置20min以上；12000×g，4℃离心10min后弃上清液，加入700μL
的75％乙醇(DEPC处理水配制)，洗涤沉淀；11000×g，4℃离心5min后弃上清液，将带有总
RNA沉淀的离心管放入生物安全柜中吹干，至沉淀为半透明状，然后加入40μL无RNA酶水
(RNase-free水)溶解RNA 5min左右；整个操作要带口罩及一次性手套。
取RNA溶液5μL与1×loading buffer(6×loading buffer：30mM EDTA,36％(v/v)
甘油,0.05％(w/v)溴酚蓝)混合，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，见图2。结果显示：第二
泳道的28S rRNA的亮度大约是18S rRNA的2倍，而且5S的条带较弱，未见DNA残留，表明提取
的核盘菌RNA质量较好，纯度较高，可用于下一步反转录合成cDNA。提取的总RNA溶液经
DNAase酶消化后，利用Thermo Scientific公司商业化的Revertaid First Strand cDNA
Synthesis Kit试剂盒合成cDNA(具体步骤按照试剂盒说明书操作)，反转录成的cDNA用于
下一步SSL-6基因全长CDS的克隆的PCR模板。
二、核盘菌SSL-6基因全长CDS克隆
从NCBI网站上查找核盘菌凝集素目标基因的参考序列为XM_001584918，根据参考
的CDS全长序列，使用Primer Premier 5软件设计SSL-6基因全长CDS的PCR引物对，引物序
列分别为正向引物SSL-6CDSF：5’－TCTAGAATGTCTCTTCTTACCACGGAGCTTG－3’(SEQ ID No:
3，下划线表示为XbaI酶切位点)和反向引物SSL-6CDSR：5’－
CCATGGTCATGCGGGGATGACAGTAGTACC－3’(SEQ ID No:4，下划线表示为NcoI酶切位点)。以前
述反转录成的cDNA为模板，高保真PCR扩增SSL-6基因的全长CDS序列。50μl PCR反应体系包
含：模板2μl，高保真酶Phusion High-fidelity DNA Polymerase(Invitrogen)1μl，10×缓
冲液5μl，2.5uM dNTP 8μl，20μM的正向和反向引物各1μl，水32μl。反应条件为：94℃预变性
2分钟；94℃变性30秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟，共30个循环。反应结束后，将PCR产物
进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3，扩增得到一条936bp大小的DNA片段，与预期的
目标片段大小相符。将扩增片段回收并纯化后，将其克隆到载体pEASY-Blunt Cloning(购
自全式金公司)中，得到含有目的片段的重组质粒pEASY-SSL-6CDS，经转化、筛选后测序，结
果见SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，其由936个碱基组成，其编码框为自5’端第1-936位碱
基(最后三个碱基为终止密码子TGA)，编码具有SEQ ID No:1的氨基酸残基序列的蛋白质,
为311个氨基酸残基，编码的蛋白命名为SSL-6。
实施例2.SSL-6基因过表达质粒的构建
选择测序正确的pEASY-SSL-6CDS重组质粒，与pFGC5941质粒分别同时用Fast
Digest Enzyme NcoI和XbaI(Fermetans)两种质粒进行双酶切，酶切温度37℃，酶切时间为
30-40min，反应体系40μL(1μg质粒DNA，2μL 10×FastDigest Green Buffer，0.5μL
FastDigest NcoI，0.5μL FastDigest XbaI，加水至40μL)，具体按照Fermetans公司试剂盒
说明进行；酶切产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，切下目的条带，用胶回收试剂盒纯
化回收，将回收的两个目标DNA片段通过T4连接酶连接，连接产物通过热激法转化大肠杆菌
(Esherichia coli)DH5α，转化细胞在液体LB培养基中，37℃、200rpm的条件下复苏1h；将经
过恢复培养的细胞均匀涂于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养皿上，37℃培养16h。挑取
LB固体培养基上的单菌落，以引物35SF：5'-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3'(SEQ ID No.5)和
SSL-6CDSR(SEQ ID No.4)进行菌落PCR鉴定，见图4，显示PCR扩增产物电泳带在1000bp与
900bp之间，结果与预期的片段大小一致。选择PCR检测正确的单菌落扩大培养，提取质粒，
以Fast Digest Enzyme NcoI和XbaI进行双酶切验证，见图5，双酶切片段弱大于1000bp，与
预期的片段大小一致。PCR鉴定和双酶切鉴定两种结果都说明过表达质粒pFGC5941-SSL-
6CDS构建成功。
实施例3.甘蓝型油菜转化及分子鉴定与转基因油菜抗菌核病检测
一、甘蓝型油菜转化
一)外植体的准备
选取甘蓝型油菜易感病品种“98C40”完整饱满的种子约100颗，置于150mL三角瓶
中。向装有种子的三角瓶中加入20-30mL 75％乙醇，振荡消毒30s，弃去酒精；再加入20mL
0.1％HgCl2和1滴TWEEN-20的消毒液，剧烈摇晃至起泡，静置20min，弃去消毒液，用无菌水
反复冲洗3-5遍以洗净泡沫；加入50mL经高温灭菌的无菌水浸泡种子，浸泡时间为1h；倒掉
无菌水，把种子均匀铺在1/2MS固体培养基上，22℃暗培养4-5d。待油菜幼苗长到4-5cm后将
其转移到光照条件下生长6-8h，使幼苗子叶转绿。子叶柄作为转化的外植体。
二)农杆菌的准备
幼苗生长到1-2cm时，开始准备菌液。将分别带有pFGC5941-SSL-6CDS质粒的农杆
菌LBA4404菌株在含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL链霉素和100mg/mL利福平的YEB固体培养基
上划线，28℃恒温培养3d。挑取单菌落于10mL含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL链霉素和100mg/
mL利福平的YEB液体培养基中，28℃、200rpm扩大培养16-18h。吸取1mL菌液加入到50mL含
50mg/mL卡那霉素、50mg/mL链霉素和100mg/mL利福平的YEB液体培养基中，扩大培养至菌液
OD600达到0.4-0.8。
三)子叶柄的农杆菌转化与抗性苗筛选
将油菜幼苗子叶柄从生长点以上的分支处切下，转移到BM液中。将扩大后的农杆
菌菌液从三角瓶转移至50mL离心管，6000rpm/min离心10min，去上清后于离心管中加入
25mL BM液，振荡使农杆菌重悬；再加入10μLβ-巯基乙醇和20μL乙酰丁香酮，摇匀后作为工
作液倒入已灭菌的平皿中。将切好的子叶柄转到该工作液中浸泡10min。浸泡后，将子叶柄
转移到已灭菌的吸水纸上。用镊子翻动子叶柄使子叶柄表面残留工作液被吸水纸吸干。最
后将子叶柄均匀铺放在共培培养基(1升MS+1mg 6-苄氨基嘌呤+30g蔗糖+1.6g植物凝胶)
上，22℃，暗共培养36h。共培完成后，将外植体转移到筛选培养基(1升MS+2mg 6-苄氨基嘌
呤+20mg草铵膦+500mg头孢霉素+30g蔗糖+1.6g植物凝胶)中。22℃，长日照培养；每10-14d
更换一次筛选培养基。
当外植体分化出若干簇抗性不定芽后，将不定芽切开分离后放入生根培养基(1升
1/2MS+20mg草铵膦+10g蔗糖+1.6g植物凝胶)上继续培养。分化苗长出足够的根系后，将其
从生根培养基中取出，并用无菌水将根上残留的培养基清洗干净。然后将分化苗移入蛭石
中，炼苗10天。炼苗之后转入土壤中，共获得草铵膦抗性苗11株。抗性苗用于下一步PCR转基
因检测鉴定。
四)抗性苗转基因鉴定与SSL-6基因表达检测
用CTAB方法从转pFGC5941-SSL-6CDS质粒的抗性苗叶组织中提取总DNA，以总DNA
作为模板，35SF(SEQ ID No.5)和SSL-6CDSR(SEQ ID No.4)为引物，进行PCR检测(扩增片段
为1925bp)，检测结果显示与质粒为阳性对照扩增片段大小一致的有8株，说明总共获得了8
株SSL-6基因过表达转基因植株(见图6)。用Trizol(Invitrogen)法提取8株转基因植株叶
片中的总RNA，利用Thermo Scientific公司商业化的Revertaid First Strand cDNA
Synthesis Kit试剂盒合成cDNA(具体步骤按照试剂盒说明书操作)。以cDNA为模板，SSL-
6CDSF(SEQ ID No.3)和SSL-6CDSR(SEQ ID No.4)为引物，用半定量RT-PCR方法扩增目标片
段，以BnaACTIN2基因作为内参。结果显示8株转基因植株中，有7株植株有SSL-6表达，但是
表达程度不同，又高有底(见图7)。选SSL-6基因表达量最高的转基因植株做抗菌核病鉴定。
二、转基因油菜抗菌核病检测
所用核盘菌的菌株为能侵染油菜的菌株SS-3(由湖南农业大学作物代谢调控实验
室提供)。取其饱满、无裂无霉变的SS-3的菌核颗粒，用75％乙醇浸泡5min，无菌水冲洗3～4
次，灭菌后接种到带PDA培养基的培养皿中央，放置在培养箱中，25℃暗培养2-3天。接种用
植株为生长到有4片真叶的转基因植株与易感病98C40受体植株。在PDA培养基上生长大约3
天，核盘菌菌丝已经触及平皿边缘，用直径为1厘米的打孔器沿着圆形培养皿边缘采集菌
块；将菌块上带有菌丝的面覆盖到油菜叶片上，使菌丝与叶片表面直接接触；将接种了核盘
菌菌丝的植株转入28℃，湿度大于90％的光照培养箱中。放置5-7天后，观察接种核盘菌菌
丝的叶片上形成的菌斑大小。结果见图8，显示，转基因植株接种叶片上的菌斑明显小于易
感菌核病品种98C40受体植株叶片上的病斑，说明SSL-6基因能显著提高油菜抗菌核病的能
力。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南农业大学
<120> 核盘菌凝集素SSL-6蛋白及其编码基因与应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 311
<212> PRT
<213> 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum)
<400> 1
Met Ser Leu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Cys Thr Ser Ala Pro Asp Gln
1 5 10 15
Val Leu His Leu Phe Phe Gln Asp Gly Gln Asn Ile Leu Glu Ala Arg
20 25 30
Ser Pro Asp Gly Gly Asn Val Trp Thr Thr Gln Asp Thr Ile Ile Ala
35 40 45
Lys Asp Gly Asp Tyr Asn Gly Ser Ser Met Thr Cys Tyr Tyr Val Asp
50 55 60 65
Lys Asp Ala Asn Phe Asp Asn Gln Pro Ser Ile His Leu Leu Tyr Met
70 75 80
Asn Lys Asp Lys Gln Leu Thr Glu Lys Val Lys Arg Met Lys Gly Asp
85 90 95
Asn Pro Ile Trp Glu Asp Ala Lys Val Pro Asp Glu Val Arg Lys Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Tyr Ser Lys Leu Thr Ser Gly Ser Phe Asn Gln Gly Thr
115 120 125
Gly Trp Asn Pro Asn Gly Ser Gln Trp Ala Tyr Phe Ser Ala Ser Lys
130 135 140 145
Asp Gly Lys Met Gly Ile Val Glu Ile Arg Arg Thr Pro Lys Asp Pro
150 155 160
Trp His Thr Glu Thr Ile Leu Glu Glu Lys Trp Gly Asp Glu Leu Pro
165 170 175
Gly Thr Ala Leu Ala Cys Val Ile Gly Asn Gly Lys Ile Arg Val Phe
180 185 190
Leu Gln His His Asp Tyr Ser Ile Ile Leu Tyr Glu Asn Gln Asn Asn
195 200 205
Thr Trp His Asp Arg Gly Thr Phe Ile Pro Lys Asp Lys Val Gln Ala
210 215 220 225
Thr Thr Pro Leu Ala Cys Thr Met Thr Lys Asp Gly Ser Val His Leu
230 235 240
Phe Tyr Val Ser Lys Ser Asn Lys Ile Ile His Cys Thr Asp Gly Lys
245 250 255
Lys Glu Glu Glu Leu Ile Asn Phe Phe Pro Gly Ser Lys Leu Gly Ala
260 265 270
Thr Ser Val Glu Asn Lys Ile Thr Leu Phe Phe Arg Asn Leu Asn Pro
275 280 285
Val Asn Glu Val Gly Thr Leu Glu Asn Glu Asn Gly Ser Trp Lys His
290 295 300 305
Gly Thr Thr Val Ile Pro Ala
310
<210> 2
<211> 936
<212> DNA
<213> 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum)
<400> 2
atgtctcttc ttaccacgga gcttgcttgc acttctgccc ccgatcaagt cttgcatctt 60
ttcttccaag acggccaaaa cattctcgaa gcgcgatctc cagatggcgg caatgtttgg 120
actactcaag atactatcat tgctaaagat ggagattaca atggctcttc tatgacatgc 180
tactatgtag acaaagacgc aaatttcgat aaccagccct caattcatct cctctacatg 240
aacaaggata agcaattgac ggagaaagtc aagcgcatga agggagacaa tccaatttgg 300
gaggacgcta aggtcccaga cgaagtcagg aaaggaccag agcaatattc gaagttgacc 360
agcggctcat tcaaccaagg cactggttgg aacccgaatg gttcacaatg ggcatacttt 420
tcagcctcca aggatggcaa gatgggcatc gtcgaaattc gacgcactcc aaaagatcca 480
tggcatacag agactattct cgaagaaaag tggggtgatg aactccctgg aaccgctcta 540
gcctgtgtaa ttgggaatgg aaagatcagg gtgttcctcc agcaccatga ctacagcatc 600
atactctacg aaaatcaaaa caacacatgg catgaccgag gcaccttcat tccgaaagac 660
aaggttcaag ccacaacacc gcttgcttgc accatgacca aggacggaag cgtccatctc 720
ttctacgtct caaagtctaa caagattatt cattgcaccg atggcaagaa agaggaagaa 780
ttgatcaatt tcttcccagg ctcgaagttg ggcgctactt cagttgagaa caagatcacc 840
ttgttcttca gaaacttgaa ccctgtcaat gaagttggca cgcttgagaa tgagaatggc 900
tcctggaagc atggtactac tgtcatcccc gcatga 936
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tctagaatgt ctcttcttac cacggagctt g 31
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ccatggtcat gcggggatga cagtagtacc 30
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ctatccttcg caagaccctt c 21