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1、(10)申请公布号 CN 102796803 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102796803 A *CN102796803A* (21)申请号 201210302966.1 (22)申请日 2012.08.24 C12Q 1/46(2006.01) C12Q 1/44(2006.01) C12Q 1/42(2006.01) C12Q 1/26(2006.01) C12Q 1/48(2006.01) (71)申请人 赖智勇 地址 200438 上海市杨浦区殷行路 850 弄 167 号 401 室 (72)发明人 赖智勇 (74)专利代理机构 上海申汇专利代理有限公司 3。
2、1001 代理人 吴宝根 (54) 发明名称 一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本 底色干扰的方法及其应用 (57) 摘要 本发明公开一种在果蔬农药残留快速检测中 排除果蔬本底色干扰的方法及该方法在果蔬农药 残留快速检测中的应用， 所述的在果蔬农药残留 快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法即在酶抑 制反应后将有色的果蔬样液排走， 使之不进入快 速检测中的显色反应体系， 从而排除果蔬本底色 对最终检测结果的干扰。所述的在果蔬农药残留 快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在果蔬农 药残留快速检测中的应用， 由于酶抑制反应、 酶催 化底物水解反应全部都在同一个封闭的反应器内 进行， 因此环境因素变化带。
3、来的影响也控制在最 低限度， 使得检测结果相对更准确。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 5 页 1/2 页 2 1. 一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法， 其特征在于具体包括 如下步骤 ： （1） 、 将待测果蔬样品溶液推入固定化有农药快速检测所用酶的反应器内， 于该农药快 速检测所用酶的最适温度范围内进行酶抑制反应 ； 所述的农药快速检测所用酶为胆碱酯酶、 非胆碱酯酶的 B- 酯酶、 酪氨酸酶、 碱性磷酸 酶、 酸性磷酸酶或乙酰乳酸合酶 ； 其中所述的胆碱酯酶。
4、为乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶 ； 所述的固定化有农药快速检测所用酶的反应器， 该反应器可以实现液体自由进出反应 器， 而固定化的农药快速检测所用酶不能流出反应器 ； （2） 、 将足量的缓冲液持续推入该固定化有农药快速检测所用酶的反应器， 将步骤 （1） 进行酶抑制反应后的果蔬样品溶液持续带出固定化有农药快速检测所用酶的反应器至废 液池， 直至待测果蔬样品溶液颜色全部带走为止。 2. 如权利要求 1 所述的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法， 其特征在于所述的固定化有农药快速检测所用酶的反应器中的农药快速检测所用酶在反 应器中的固定化方法如下 ： 采用离子交换吸附将农药快速检。
5、测所用酶固定在 40-60 目的大孔径弱酸性离子交换 树脂颗粒上， 然后装载于反应器内 ； 或采用碳二亚胺法将农药快速检测所用酶直接固定在活化后的反应器内表面上。 3. 如权利要求 1 所述的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法， 其特征在于所述的待测果蔬样品溶液的制备过程如下 ： 切碎的果蔬按料液质量体积比 1 ： 1-1 ： 5 加入 pH 与农药快速检测所用酶相适应的磷酸 盐缓冲液混合， 在室温下搅拌， 过滤后获得的滤液即为待测果蔬样品溶液。 4.如权利要求1、 2或3所述的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的 方法在果蔬农药残留快速检测中的应用。 5.如权利。
6、要求1、 2或3所述的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的 方法在果蔬农药残留快速检测中的应用， 其特征在于具体包括如下步骤 ： （1） 、 将待测果蔬样品溶液推入固定化有农药快速检测所用酶的反应器内， 于农药快速 检测所用酶的最适温度范围内进行酶抑制反应 ； （2） 、 将足量的磷酸盐缓冲液持续推入该固定化有农药快速检测所用酶的反应器， 并持 续将步骤 （1） 酶抑制反应后的样品溶液带出固定化有农药快速检测所用酶的反应器至废液 池， 直至待测果蔬样品溶液颜色全部带走为止 ； （3） 、 步骤 （2） 待测果蔬样品溶液颜色全部带走后将底物推入固定化有农药快速检测所 用酶的反应器中，。
7、 于农药快速检测所用酶的最适温度范围内进行酶催化水解反应 ； （4） 、 步骤 （3） 酶催化水解反应完成后推入磷酸盐缓冲液， 将固定化有农药快速检测所 用酶的反应器中酶催化水解反应产生的产物全部带出至显色池中， 加入显色剂与其进行显 色反应后， 测定吸光度值 A3 ； （5） 、 将等比例的磷酸盐缓冲液和显色液推入显色池混合， 作为空白对照， 测得吸光度 值 A1 ； （6） 、 用等量的磷酸盐缓冲液代替待测果蔬样品溶液作为对照样液， 重复上述步骤 （1） 权 利 要 求 书 CN 102796803 A 2 2/2 页 3 至步骤 （4） ， 测定显色池中的显色反应后所得的对照样液的吸光度。
8、值 A2 ； （7） 、 通过上述的测定结果， 计算农药快速检测所用酶的抑制率 , 并根据国标 GBT5009.199-2003 进行判断农药超标或符合标准 ； 抑制率 =(A2-A1)-(A3-A1)/(A2-A1)*100% ； 其中， A1 为空白对照的吸光度值 ； A2 为对照样液的吸光度值 ； A3 为待测果蔬样品溶液最终经显色反应后的吸光度值。 权 利 要 求 书 CN 102796803 A 3 1/5 页 4 一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方 法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法及其在 果蔬农药残留快速。
9、检测中的应用， 属农药残留快速检测领域。 背景技术 0002 使用酶抑制法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留已经有 50 余年的历史， 其基 本原理是根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯 酶的活性。根据这一毒理学原理， 目前果蔬中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检 测主要采用胆碱酯酶作为检测用酶， 并同时采用光度法来检测该酶被抑制的程度， 从而判 断出样品中农药残留的高低。 0003 然而， 果蔬样品本身通常带有颜色， 即本底色， 为保证样品中可能含有的微量农药 残留尽可能地被萃取出来， 在提取样品溶液过程中一般要经过切碎、 搅打等混合操作， 因此 果蔬样液中。
10、也会有颜色。虽然目前在光度法快速检测农药残留时， 已扣除了样液颜色引起 的吸光度值， 但由于果蔬样液颜色较深时， 可能会超过光度计的有效测量极限， 即便未超极 限， 本底过高也会给检测带来严重干扰， 导致检测结果准确度差或根本无法检测。 发明内容 0004 本发明的目的之一为了解决上述的技术问题而提供一种在果蔬农药残留快速检 测中排除果蔬本底色干扰的方法及其在果蔬中农药残留量快速检测的应用， 该排除果蔬本 底色干扰的方法应用后， 对果蔬中农药残留量检测的准确性高， 并且检测结果不受果蔬本 底色的干扰。 0005 本发明的技术方案 一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法， 具体操作。
11、步骤如下 ： （1） 、 将待测果蔬样品溶液推入固定化有农药快速检测所用酶的反应器内， 于该农药快 速检测所用酶的最适温度范围内进行酶抑制反应 ； 所述的农药快速检测所用酶为胆碱酯酶、 非胆碱酯酶的 B- 酯酶、 酪氨酸酶、 碱性磷酸 酶、 酸性磷酸酶或乙酰乳酸合酶 ； 其中所述的胆碱酯酶可为乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶 ； 其中农药快速检测所用酶在反应器中的固定化方法可以采用物理吸附、 包埋、 共价结 合、 交联或两种以上固定化方法的结合使用， 如 ： 吸附 + 交联、 吸附 + 包埋等 ； 本发明的实施 例中仅以物理吸附中的离子交换吸附或共价结合中碳二亚胺法进行举例， 但并不限于其他 的固定。
12、化方法在本发明中的应用 ； （2） 、 步骤 （1） 中酶抑制反应完成后将足量的缓冲液持续推入该固定化有农药快速检测 所用酶的反应器， 将经酶抑制反应后的果蔬样品溶液持续带出固定化有农药快速检测所用 酶的反应器至废液池， 直至待测果蔬样品溶液颜色全部被带走为止， 从而实现了排除果蔬 说 明 书 CN 102796803 A 4 2/5 页 5 农药残留快速检测中果蔬本底色的干扰。 0006 上述的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在果蔬农药 残留快速检测中的应用， 具体包括如下步骤 ： （1） 、 将待测果蔬样品溶液推入固定化有农药快速检测所用酶的反应器内， 于农药快速 检测。
13、所用酶的最适温度范围内的某个恒定温度下进行酶抑制反应 ； 所述的固定化有农药快速检测所用酶的反应器， 该反应器可以实现液体自由进出反应 器， 而固定化的农药快速检测所用酶不能流出反应器 ； 所述的农药快速检测所用酶为胆碱酯酶、 非胆碱酯酶的 B- 酯酶、 酪氨酸酶、 碱性磷酸 酶、 酸性磷酸酶或乙酰乳酸合酶 ； 其中所述的胆碱酯酶可为乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶 ； 所述的待测果蔬样品溶液的制备过程如下 ： 切碎的果蔬按料液质量体积比 1 ： 1-5 加入磷酸盐缓冲液混合， 在室 温下搅拌， 经过 滤后获得的滤液即为待测果蔬样品溶液 ； （2） 、 步骤 （1） 酶抑制反应后将足量的磷酸盐缓冲液。
14、持续推入该固定化有农药快速检测 所用酶的反应器， 将经酶抑制反应后的果蔬样品溶液带出固定化有农药快速检测所用酶的 反应器至废液池， 直至待测果蔬样品溶液颜色全部被带走为止， 而固定化的农药快速检测 所用酶留在反应器中 ； （3） 、 步骤 （2） 果蔬样品溶液颜色全部被带走后， 将底物推入固定化有农药快速检测所 用酶的反应器中， 于农药快速检测所用酶的最适温度范围内进行酶催化水解反应 ； （4） 、 步骤 （3） 酶催化水解反应完成后推入适量磷酸盐缓冲液， 将固定化有农药快速检 测所用酶的反应器中酶催化水解反应产生的产物全部带出至显色池中， 加入显色剂与其进 行显色反应后， 测定吸光度值 A3。
15、 ； （5） 、 将等比例的磷酸盐缓冲液和显色液推入显色池混合， 作为空白对照， 测得吸光度 值 A1 ； 待测果蔬样品溶液和对照样液都使用该吸光度值作为空白对照吸光度 ； （6） 、 用等量的磷酸盐缓冲液代替待测果蔬样品溶液作为对照样液， 重复上述步骤 （1） 至步骤 （4） ， 测定显色池中的显色反应后所得的对照样液的吸光度值 A2 ； （7） 、 通过上述的测定结果， 计算农药快速检测所用酶的抑制率 , 并根据国标 GBT5009.199-2003 进行判断农药超标或符合标准 抑制率 =(A2-A1)-(A3-A1)/(A2-A1)*100% ； 其中， A1 为空白对照的吸光度值 ； 。
16、A2 为对照样液的吸光度值 ； A3 为待测果蔬样品溶液最终经显色反应后的吸光度值。 0007 另外， 本发明仅以农药快速检测所用的乙酰胆碱酯酶为例， 应用本发明的在果蔬 农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在果蔬农药残留量快速检测方面进行应 用。但并不限制其他适用于农药快速检测所用的非胆碱酯酶的 B- 酯酶、 酪氨酸酶、 碱性磷 酸酶、 酸性磷酸酶或乙酰乳酸合酶等酶应用本发明的在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬 本底色干扰的方法在果蔬农药残留量快速检测方面的应用， 只是在使用其他适用于农药快 速检测所用的非胆碱酯酶的 B- 酯酶、 酪氨酸酶、 碱性磷酸酶、 酸性磷酸酶或乙酰乳酸合酶 说 。
17、明 书 CN 102796803 A 5 3/5 页 6 等酶时， 对于其作用的底物及显色所用的显色液， 缓冲液等都要根据所用的酶进行相应的 调整， 但整个机理是一致的。 0008 本发明的有益技术效果 本发明的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法， 由于是将果蔬 残留农用检测所用的酶进行固定化后再进行酶抑制反应， 并且在酶抑制反应后用足量的缓 冲液持续推入该固定化有农药快速检测所用酶的反应器， 将酶抑制反应后的样品溶液带出 固定化有农药快速检测所用酶的反应器， 因此使得样品溶液本底色即随之被带走， 并进一 步的到达了避免果蔬本身颜色对农药残留量快速检测过程中后续检测结果的影响。
18、。 0009 进一步， 本发明的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在 果蔬农药残留快速检测中， 由于通过酶抑制反应后， 将待测的果蔬样液排空， 使样液脱离与 底物的水解反应及显色反应产物的接触， 因此由于含有残留农药的待测样品溶液颜色物质 与最终反应产物完全被物理隔离， 可完全排除待测果蔬样液本身颜色对检测结果的干扰。 0010 进一步， 本发明的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法在 果蔬中农药残留量快速检测中的应用， 由于酶抑制反应、 酶催化底物水解反应全部都在同 一个封闭的反应器内进行， 因此环境因素变化带来的影响也控制在最低限度， 使得检测结 果相对更。
19、准确。 具体实施方式 0011 下面通过实施例， 对本发明进一步详细描述， 但不用来限制本发明的范围。 0012 所述方法如无特别说明， 均为常规方法。 所述材料如无特别说明， 均能从公开商业 途径购买得到。 0013 本发明的各实施例中所用的试剂的配制如下 ： 1、 pH8.0 的磷酸盐缓冲溶液 ： 按每升计算， 分别取 11.9g 无水磷酸氢二钾与 3.2g 磷酸 二氢钾， 用蒸馏水溶解后并定容至 1000mL 即可 ； 2、 显色剂溶液 ： 分别取 160mg 二硫代二硝基苯甲酸 （DTNB）和 15.6mg 碳酸氢钠， 用 20mL， pH8.0 的磷酸盐缓冲溶液溶解， 4冰箱中保存 。
20、； 3、 底物溶液 ： 取 25.0mg 硫代乙酰胆碱， 加 3.0mL 蒸馏水溶解， 摇匀后置 4冰箱中保存 备用， 保存期不超过两周 ； 4、 乙酰胆碱酯酶溶液 ： 根据酶的活性情况， 用 pH8.0 的磷酸盐缓冲溶液溶解， 3min 的吸 光度变化值应控制在 0.3 以上。摇匀后置 4冰箱中保存备用， 保存期不超过四天。 具体实施方式 0014 下面通过具体实施例对本发明进一步阐述， 但并不限制本发明。 0015 实施例 1 一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法， 下面仅以本底色较深的 生菜举例进行说明， 具体操作步骤如下 ： （1） 、 将 5ml 待测生菜样品溶液推入。
21、固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器内， 于 35下进行 15min 的酶抑制反应 ； 所述的固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器中酶在反应器中的固定化过程如下 ： 采用离子 说 明 书 CN 102796803 A 6 4/5 页 7 交换吸附将乙酰胆碱酯酶固定在 40-60 目的大孔径阳离子交换树脂颗粒 D113 （安徽皖东树 脂科技有限公司） 上， 然后装载于反应器内 ； 或采用碳二亚胺法将乙酰胆碱酯酶直接固定在 活化后的反应器内表面上 ； 所述的反应器为直径为 6mm, 高度为 30mm 的圆柱体， 两端装有带有滤网的塞子 ； 所述的待测生菜样品溶液的制备过程如下 ： 将生菜样品 （经气相色谱检测没有。
22、有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的生菜） 切成1cm左 右见方碎片， 用精确度为 0.01g 电子台秤称取样品 2.0g， 加入 10.0mLpH8.0 磷酸缓冲溶液， 振荡搅拌 1 2min， 静置 3 5min， 经四层纱布或棉花过滤后， 获得待测生菜样品溶液 ； （2） 、 将足量的 pH8.0 磷酸盐缓冲液持续推入该固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器， 将酶 抑制反应后的生菜样品溶液带出反应器至废液池， 生菜样品溶液的颜色也随之被带走， 从 而到达了生菜农药残留快速检测中排除生菜本底色干扰的效果。 0016 应用实施例 1 将实施例 1 所述的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法。
23、应用 于生菜农药残留快速检测中， 具体包括如下步骤 ： （1） 、 将5ml待测生菜样品溶液推入装有0.5g固定化乙酰胆碱酯酶的圆柱体反应器内， 于 35下进行 15min 的酶抑制反应 ； 所述的固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器中酶在反应器中的固定化过程如下 ： 采用离子 交换吸附将乙酰胆碱酯酶固定在 40-60 目的大孔径阳离子交换树脂颗粒上， 然后装载于反 应器内 ； 所述的待测生菜样品溶液的制备过程如下 ： 将生菜样品 （经气相色谱检测没有有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的生菜） 切成1cm左 右见方碎片， 用精确度为 0.01g 电子台秤称取样品 2.0g， 加入 10.0mLpH8.0 磷。
24、酸缓冲溶液， 振荡搅拌 1 2min， 静置 3 5min， 过滤， 获得待测生菜样品溶液 ； （2） 、 将足量的 pH8.0 磷酸盐缓冲液持续推入该固定化有胆碱酯酶的反应器， 将经酶抑 制反应后的待测生菜样品溶液带出反应器至废液池， 直至待测生菜样品溶液的颜色也随之 全部被带走 ； （3） 、 步骤 （2） 待测生菜样品溶液的颜色被全部带走后将 0.1mL 的硫代乙酰胆碱底物溶 液推入固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器中， 控制温度为 35停留 3min， 乙酰胆碱酯酶催化 硫代乙酰胆碱底物发生水解反应 ； （4） 、 步骤 （3） 乙酰胆碱酯酶催化底物水解反应结束后， 将 3ml 的 pH8.。
25、0 的磷酸盐缓冲 液持续推入到固定化有乙酰胆碱酯酶的反应器中， 步骤 （3） 固定化的乙酰胆碱酯酶催化底 物发生水解反应产生的底物的水解产物则被磷酸盐缓冲液带出固定化有乙酰胆碱酯酶的 反应器并进入到显色池中 ； 同时将 0.1mL 二硫代二硝基苯甲酸 （DTNB） 显色液推入到显色池中与上述的乙酰胆碱 酯酶催化底物发生水解反应产生的底物的水解产物进行显色反应， 待显色反应 3min 后， 于 412nm 处用 722s 分光光度计 （上海悦丰仪器仪表有限公司） 测定吸光度值 A3 为 0.855 ； （5） 、 将 3ml 的 pH8.0 的磷酸盐缓冲液和 0.1ml 的二硫代二硝基苯甲酸 （。
26、DTNB） 显色液 溶液分别推入显色池混合， 作为空白对照， 于 412nm 处测得吸光度值 A1 为 0.060 ； （6） 、 用 5ml 的 pH8.0 的磷酸盐缓冲液代替待测生菜样品溶液作为对照样液， 重复上述 说 明 书 CN 102796803 A 7 5/5 页 8 步骤 （1） 至步骤 （4） ， 于412nm处测定显色池中的显色反应后所得的对照样液的吸光度值A2 为 0.874 ； （7） 、 通过上述的步骤 （4） 、（5） 及步骤 （6） 的测定结果， 进行计算待测生菜样品对乙酰 胆碱酯酶的抑制率 , 并根据国标 GBT5009.199-2003 进行判断农药超标或符合标。
27、准 ； 抑制率 =(A2-A1)-(A3-A1)/(A2-A1)*100%=（0.874-0.855） /(0.874-0.060) *100%=2.33% ； 根据 GBT5009.199-2003 标准判断， 该待测生菜样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残 留未超标， 与气相色谱的阴性结果吻合。 0017 由此可见， 本发明的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法 在生菜农药残留快速检测中应用后， 由于有效地排除了待测生菜样品溶液本身颜色干扰， 因此可以快速地得到更准确的结果。 0018 对照实施例 1 采用国家标准 GB/T5009.199-2003 快速检验方法， 对生菜农药。
28、残留快速检测， 步骤如 下 ： 待测生菜样品溶液的制备同实施例 2 ； 取 2.5mL 待测生菜样品溶液放入试管中， 加入 0.lmL 乙酰胆碱酯酶液、 0.1mL DTNB 显色剂， 摇匀后于 37放置 15min， 之后加入 0.lmL 硫代乙酰胆碱底物摇匀， 在 412nm 下 记录初始吸光度 A1 为 1.076， 反应 3min 时的吸光度 A2 为 1.439， 由于本底过高， 其吸 光度变化仅为 0.363 ； 用 2.5mL 缓冲溶液替代样液获得对照溶液反应 3min 的吸光度变 化为 0.865=0.930-0.065， 因此计算抑制率 =（0.865-0.363)/0.86。
29、5=58.03%， 根据 GB/ T5009.199-2003 标准判断， 抑制率 50%， 该样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留超标， 这与气相色谱的阴性检测结果不吻合， 此为假阳性。 0019 通过上述的实施例 2 的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色 干扰的方法在生菜农药残留快速检测中应用后与气相色谱检测及采用国家标准 GB/ T5009.199-2003 快速检验方法进行检测的结果对比分析可知， 本发明的一种在果蔬农药残 留快速检测中排除本底色干扰的方法应用于生菜农药残留快速检测中， 由于其排除了生菜 样品本身颜色的干扰， 从而使得测定结果更精确。 0020 另外， 本发明的一种在果蔬农药残留快速检测中排除果蔬本底色干扰的方法仅给 出了在生菜农药残留快速检测中的应用， 但并不限于此， 本发明可以适用于其他果蔬样品， 特别是具有本底色的果蔬样品， 且特别是本底色较深的果蔬样品中农药残留量的快速检 测。 0021 以上所述仅是本发明的实施方式的举例， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术 人员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和变型， 这些改进和变 型也应视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102796803 A 8 。