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1、(10)申请公布号 CN 102758001 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102758001 A *CN102758001A* (21)申请号 201210209199.X (22)申请日 2012.06.22 C12Q 1/25(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) (71)申请人 东华大学 地址 201620 上海市松江区人民北路 2999 号 (72)发明人 徐冰洁 薛罡 刘亚男 高品 刘振鸿 桂梦瑶 王鹏 金舒怡 张丹丹 毛菲菲 梅述芳 何梦琦 侍宽 李珊珊 刘畅 程镜润 曾昊 顾熙磊 (74)专利代理机构 上海申汇专利代理有限公司 31001。
2、 代理人 翁若莹 (54) 发明名称 一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活 性测定方法 (57) 摘要 本发明提供了一种碘普罗胺降解菌产生的碘 普罗胺酶的活性测定方法， 包括如下操作步骤 ： a. 标准曲线制作， b. 样品的采集与制备， c. 样品 浓缩， d. 样品培养， e. 终止酶反应， f. 吸光度分 析。本发明的方法补充了 PPCPs 研究过程中酶测 定方法的缺失， 它的检测结果稳定， 具有较高的实 用价值， 同时可用作其他降解菌酶活性的测定， 利 于推广应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请。
3、 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法， 其特征在于， 具体步骤 为 ： 步骤 a. 标准曲线制作 ： 准确称量 0.3g 碘普罗胺标准品加入 100mL 蒸馏水中， 配成 3g/ L的碘普罗胺溶液， 逐级稀释到3、 6、 9、 12、 15、 18、 24mg/L， 在242nm波长下测其吸光度， 绘制 标准曲线 ； 步骤 b. 样品的采集与制备 ： 配制含有 30mg/L 碘普罗胺、 1g/L 可溶性淀粉的 100mL 无 机盐培养基， 将本实验室分离得到的假单胞菌以 10wt的接种量接种到所述的无机盐培养 基中， 将其。
4、置于30摇床中在180r/min条件下避光振荡培养， 1d后菌种生长量达到较为活 跃的对数期， 所得菌液即可作为待测样品 ； 步骤 c. 样品浓缩 ： 将上步所得的待测样品取 40mL 装入 50mL 离心管内， 以 8000rpm 的 速度离心 30min， 弃去上清液， 加入 4mL pH7.1 的 Tris-HCl 缓冲液清洗菌体， 再以 8000rpm 的速度离心30min， 弃去上清液， 重复清洗一次， 以2030mL Tris-HCl缓冲液混匀沉淀物， 放入超声波细胞破碎机中冰浴破碎 30min， 功率 300W， 工作 2s， 休息 1s， 所获溶液即为粗酶 液 ； 步骤 d. 。
5、样品培养 ： 向 6 只 10mL 具塞试管中分别加入 3mL pH7.1 的 Tris-HCl 缓冲液、 1mL 15mg/L 的碘普罗胺溶液以及 1mL 粗酶液， 混合均匀后将 3 只试管作为样品管置于 30 恒温水浴锅培养 2 小时， 另外 3 只作为空白对照管在 80 90水浴放置 10min 灭活 ； 步骤 e. 终止酶反应 ： 将样品管在 80 90水浴中放置 10min 灭活， 将样品管和空白 对照管分别倒入 10mL 离心管中， 以 12000rpm 离心 20min ； 步骤f.吸光度分析 ： 将步骤e中离心后的上清液倒入1cm石英比色皿中， 使用紫外-可 见光分光光度计在 。
6、242nm 波长下测定吸光度， 计算空白对照管与样品管的吸光度之差， 比 对碘普罗胺标准曲线， 计算碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性， 取三组数据的平均 值。碘普罗胺酶的活性单位定义为每分钟降解 1mol 碘普罗胺所需要的酶量。 2. 根据权利要求 1 所述的一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法， 其 特征在于， 所述的步骤 b 中的无机盐培养基包括以下组份 ： K2HPO4 0.435g、 KH2PO4 0.17g、 NH4Cl 0.21g、 CaCl22H2O 0.003g、 FeSO47H2O 0.001g、 MgSO4 0.02g、 MnSO4 0.005g、 蒸馏 水。
7、 100mL， 调节 pH 值为 6.8 7.2。 权 利 要 求 书 CN 102758001 A 2 1/3 页 3 一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法 技术领域 0001 本发明涉及一株碘普罗胺降解菌株假单胞菌(Pseudomonas sp.)的碘普罗胺 酶活性测定方法。 背景技术 0002 碘普罗胺是碘化造影剂的一种， 用于血管造影、 肾动脉造影、 尿路造影、 CT 的对比 增强检查、 体腔显示。该类物质具有极强的生化稳定性， 人体注射后， 80的药物都不经新 陈代谢而随尿液直接排出， 同一些未处理而直接丢弃的过期或者失效的碘普罗胺直接排入 城市污水管网。 城市污水处理厂。
8、从成本和运营便捷性上考虑， 一般采用生物法， 但是由于碘 普罗胺结构复杂， 且被研发出来的时间不长， 普通活性污泥通常会以结构更加简单、 存在时 间较长的污染物作为初级基质进行代谢， 导致碘普罗胺的去除率极低， 最终又进入水体， 对 环境系统造成潜在影响， 因此成为目前国际上研究较多的痕量污染物药品及个人护理 用品 (PPCPs) 之一。 0003 目前， 国内外对于 PPCPs 的降解与去除研究仍旧属于黑箱模型范畴， 通常考虑的 是外因条件变化所导致的不同去除率， 然而如何更加有效地从根源上了解最佳去除模式还 需更深入的研究。假单胞菌 (Pseudomonas sp.) 对于碘普罗胺的去除率。
9、最高可达 99， 从 环境中去除碘普罗胺不仅要考虑降解效率， 更要考察菌体对于目标污染物的代谢过程， 该 细菌对目标污染物的去除实质上是其胞内酶的代谢作用， 因此研究其酶活性所受环境生态 因子的影响是迈出进入灰箱模型的第一步， 其中酶活性的测定方法为之后的所有实验奠定 了研究基石。 发明内容 0004 本发明的目的在于建立一种检测结果稳定且便捷的碘普罗胺降解菌酶活性测定 方法， 为 PPCPs 的基础研究做前期准备。 0005 为了达到上述目的， 本发明提供了一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性 测定方法， 其特征在于， 具体步骤为 ： 0006 步骤a.标准曲线制作 ： 准确称量0.3g。
10、碘普罗胺标准品加入100mL蒸馏水中， 配成 3g/L 的碘普罗胺溶液， 逐级稀释到 3、 6、 9、 12、 15、 18、 24mg/L， 在 242nm 波长下测其吸光度， 绘制标准曲线 ； 0007 步骤b.样品的采集与制备 ： 配制含有30mg/L碘普罗胺、 1g/L可溶性淀粉的100mL 无机盐培养基， 将本实验室分离得到的假单胞菌 (Pseudomonas sp.) 以 10wt的接种量接 种到所述的无机盐培养基中， 将其置于30摇床中在180r/min条件下避光振荡培养， 1d后 菌种生长量达到较为活跃的对数期， 所得菌液即可作为待测样品 ； 0008 步骤c.样品浓缩 ： 将。
11、上步所得的待测样品取40mL装入50mL离心管内， 以8000rpm 的速度离心30min， 弃去上清液， 加入4mL pH7.1的Tris-HCl缓冲液清洗菌体， 再以8000rpm 的速度离心30min， 弃去上清液， 重复清洗一次， 以2030mL Tris-HCl缓冲液混匀沉淀物， 说 明 书 CN 102758001 A 3 2/3 页 4 放入超声波细胞破碎机中冰浴破碎 30min， 功率 300W， 工作 2s， 休息 1s， 所获溶液即为粗酶 液 ； 0009 步骤 d. 样品培养 ： 向 6 只 10mL 具塞试管中分别加入 3mLpH7.1 的 Tris-HCl 缓冲 液、。
12、 1mL15mg/L 的碘普罗胺溶液以及 1mL 粗酶液， 混合均匀后将 3 只试管作为样品管置于 30恒温水浴锅培养 2 小时， 另外 3 只作为空白对照管在 80 90水浴放置 10min 灭活 ； 0010 步骤 e. 终止酶反应 ： 将样品管在 80 90水浴中放置 10min 灭活， 将样品管和 空白对照管分别倒入 10mL 离心管中， 以 12000rpm 离心 20min ； 0011 步骤 f. 吸光度分析 ： 将步骤 e 中离心后的上清液倒入 1cm 石英比色皿中， 使用紫 外 - 可见光分光光度计在 242nm 波长下测定吸光度， 计算空白对照管与样品管的吸光度之 差， 比。
13、对碘普罗胺标准曲线， 计算碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性， 取三组数据的 平均值。碘普罗胺酶的活性单位定义为每分钟降解 1mol 碘普罗胺所需要的酶量。 0012 优选地， 所述的步骤 b 中的无机盐培养基包括以下组份 ： K2HPO4 0.435g、 KH2PO40.17g、 NH4Cl 0.21g、 CaCl22H2O 0.003g、 FeSO47H2O 0.001g、 MgSO4 0.02g、 MnSO4 0.005g、 蒸馏水 100mL， 调节 pH 值为 6.8 7.2。 0013 本发明的碘普罗胺酶活性测定方法解决了 PPCPs 领域降解菌酶活性测定方法的 空白， 为此领域。
14、进一步研究奠定了技术上的基础， 该方法选择通过底物即碘普罗胺浓度的 减少量考察酶活性， 并将停止酶反应的水浴温度控制在 80 90， 避免碘普罗胺因高温分 解导致最终结果偏大的问题， 与此同时， 选择将空白样中同时添加酶液并高温灭活， 可避免 对照组因离心不够完全而出现吸光度偏高， 两组对比样不在同一水平比较的情况。本方法 检测简便、 效果稳定， 具有极高的实用价值， 利于推广应用。 具体实施方式 0014 下面结合实施例来具体说明本发明。 0015 实施例 0016 碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法， 具体步骤为 ： 0017 a. 标准曲线制作 ： 准确称量 0.3g 碘普罗胺。
15、标准品加入 100mL 蒸馏水中， 配成 3g/ L的碘普罗胺溶液， 逐级稀释到3、 6、 9、 12、 15、 18、 24mg/L， 在242nm波长下测其吸光度， 绘制 标准曲线， 得出标线为 y 0.0427x+0.0062， R2 0.9985， 其中， y 为吸光度， x 为碘普罗胺 浓度 (mg/L)。 0018 b. 样品的采集与制备 ： 配制含有 30mg/L 碘普罗胺、 1g/L 可溶性淀粉的 100mL 无 机 盐 培 养 基 (K2HPO4 0.435g、 KH2PO4 0.17g、 NH4Cl 0.21g、 CaCl22H2O 0.003g、 FeSO47H2O0.0。
16、01g、 MgSO4 0.02g、 MnSO4 0.005g、 蒸馏水 100mL、 pH 6.8 7.2。)， 将本 实验室分离得到的假单胞菌 (Pseudomonas sp.) 以 10wt的接种量接种到所述的无机盐 培养基中， 将其置于30摇床中在180r/min条件下避光振荡培养， 1d后菌种生长量达到较 为活跃的对数期， 所得菌液即可作为待测样品 ； 0019 c. 样品浓缩 ： 将上步待测样品取 40mL 装入 50mL 离心管内， 以 8000rpm 的速度离 心 30min， 弃去上清液， 加入 4mL pH7.1 的 Tris-HCl 缓冲液清洗菌体， 以 8000rpm 的。
17、速度离 心 30min， 弃去上清液， 重复清洗一次， 以 25mL Tris-HCl 缓冲液混匀沉淀物， 放入超声波细 胞破碎机中冰浴破碎 30min， 功率 300W， 工作 2s， 休息 1s， 所获溶液即为粗酶液 ； 说 明 书 CN 102758001 A 4 3/3 页 5 0020 d. 样品培养 ： 向六只 10mL 具塞试管中分别加入 3mL pH7.1 的 Tris-HCl 缓冲液、 1mL15mg/L 的碘普罗胺溶液以及 1mL 粗酶液， 混合均匀后将三只试管作为样品管置于 30 恒温水浴锅培养 2 小时， 以便碘普罗胺按酶充分与底物反应， 另外三只作为空白对照管在 80。
18、水浴中放置 10min 灭活 ； 0021 e. 终止酶反应 ： 将样品管在 80水浴中放置 10min 灭活， 将样品管和空白对照管 分别倒入 10mL 离心管中， 以 12000rpm 离心 20min ； 0022 f.吸光度分析 ： 将步骤e中离心后的上清液倒入1cm石英比色皿中， 使用紫外-可 见光分光光度计在 242nm 波长下测定吸光度， 计算空白对照管与样品管的吸光度之差， 比 对碘普罗胺标准曲线， 计算碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性， 取三组数据的平 均值。碘普罗胺酶的活性单位定义为每分钟降解 1mol 碘普罗胺所需要的酶量 (1U 1mol/min)。酶活力计算公式为 ： 0023 0024 其中， A空白为空白对照管的吸光度 ； A非空白为样品管的吸光度 ； k 为碘普罗胺标准曲 线斜率。 0025 根据本实施例所得的实验数据如表 1 所示， 可见其检测结果稳定， 便于推广。 0026 表 1 实施例所得实验数据 0027 说 明 书 CN 102758001 A 5 。