KILLER多肽在制备治疗肿瘤药剂中的应用.pdf

本发明属于生物医药领域，涉及KILLER多肽在制备治疗肿瘤药剂中的应用。KILLER基因编码产物是细胞表面的TRAIL受体同时又是转录调节因子p53下游的靶基因。KILLER过度表达可以非常有效地诱导肿瘤细胞凋亡。减毒鼠伤寒沙门氏菌可作为载体介导KILLEF在肿瘤细胞中表达并杀伤肿瘤细胞。开发以携带KILLER的沙门氏菌为口服基因治疗新药不仅解决了蛋白质多肽药物的非注射给药途径的难题更重要的是将会为肿瘤治疗提供一种安全，有效，特异及经济的方法。

权利要求书
1.  KILLER多肽在制备治疗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，所述的治疗肿瘤药剂为肿瘤靶向基因治疗药物。

2.  一种如权利要求1所述的应用，其特征在于，将含有效应用量的KILLER多肽和药学上的载体或者赋形剂组成治疗肿瘤药剂。

3.  一种如权利要求1所述的应用，其特征在于，将KILLER基因开放阅读框序列转化入减毒的病毒，提取阳性克隆；然后将含有效应用量的阳性克隆和药学上的载体或者赋形剂组成所述治疗肿瘤药剂。

4.  一种如权利要求1所述的应用，其特征在于，KILLER基因开放阅读框序列进行修饰，再转化入减毒的病毒载体并提取经过修饰的阳性克隆；最后将含有效应用量的阳性克隆和药学上的载体或者赋形剂组成所述治疗肿瘤药剂。

5.  一种如权利要求1所述的应用，其特征在于，将KILLER基因开放阅读框序列与真核表达载体连接，然后进行修饰并转化减毒的病毒，再分离纯化得到阳性克隆；最后将含有效治疗量的阳性克隆和药学上的载体或者赋形剂组成所述治疗肿瘤药剂。

6.  一种如权利要求1所述的应用，  其特征在于，将KILLER基因开放阅读框序列与真核表达载体连接，然后将重组质粒转化原核宿主LB5000，从LB5000中提取质粒转化减毒的病毒，再分离纯化得到阳性克隆；最后将含有效治疗量的上述克隆和药学上的载体或者赋形剂组成所述治疗肿瘤药剂。

7.  如权利要求2-6所述的任意一种应用，其特征在于，所述的减毒的病毒是减毒鼠伤寒沙门氏菌。

8.  如权利要求2-6所述的任意一种应用，其特征在于，所述的减毒的病毒是减毒鼠伤寒沙门氏菌终宿主SL3261。

9.  一种如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的有效应用量是1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。

10.  一种如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗肿瘤药剂为口服药剂。

说明书KILLER多肽在制备治疗肿瘤药剂中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及KILLER多肽在制备治疗肿瘤药剂中的应用。
背景技术
肿瘤疾病现已上升为世界第2号″杀手″，其死亡人数仅次于心血管病。几年来，国内外医学界对于肿瘤疾病的发病机理在细胞基础上又有了新的认识。基于对肿瘤发病机制的进一步理解，人们利用各种途径来研制和开发能够特异，有效地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性的药物。目前，对于癌症的治疗仍以化疗及放疗为首选，两者虽对肿瘤的治疗取得了相当的疗效，但由于缺乏对肿瘤细胞的特异性因而具有较大的毒副作用以及某些肿瘤细胞对化疗和放疗处理的不敏感，因此在很大程度上限制了它们在临床中的应用。近年来，为了开发出能特异性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒负作用的药物，人们对癌症的发病机制从细胞，分子水平上的研究予以高度重视和巨额投资。
抑癌基因KILLER的编码产物是细胞表面的TRAIL受体同时它又是转录调控因子p53的下游靶基因，可通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞在体外，体内的生长，因而被认为是一个肿瘤基因治疗的新点。
减毒鼠伤寒沙门氏菌被证实它不仅可以特异地在肿瘤细胞中高度集聚增殖并抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长，同时也可作为工程菌运输载体来表达外源基因且具有良好的肿瘤细胞靶向性，因而，减毒伤寒沙门氏菌介导的肿瘤基因治疗将会为癌症的治疗开辟一条新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供KILLER多肽在制备治疗肿瘤药剂中的应用，包括介导的肿瘤靶向基因治疗技术。
本发明提供了KILLER多肽在制备治疗肿瘤药剂中的应用，所述的治疗肿瘤药剂为肿瘤靶向基因治疗药物。主要是基于减毒鼠伤寒沙门氏菌可以特异地在肿瘤细胞中高度集聚增殖并可作为工程菌运输载体来表达KILLER基因，所以通过口服给药后，减毒鼠伤寒沙门氏菌可由肠道通过不同途径到达肿瘤部位进而持续表达KILLER，从而提高药物的肿瘤靶向性和效率。
本发明中，KILLER基因开放阅读框序列是从人肾cDNA表达文库筛选得到，cDNA序列的长度为1323bp，利用基因工程技术表达该蛋白，相应的多肽分子量为55KD。
在本发明中，术语“KILLER基因开放阅读框序列”包括KILLER基因或者其简并序列的开放阅读框序列(其全长核苷酸序列见NCBINM003842)。该简并序列是指，KILLER基因序列(开放阅读框)中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与KILLER基因序列的ORF核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出KILLER蛋白的序列。该术语还包括其表达产物具有抗肿瘤活性并且其序列具有如KILLER基因序列的核苷酸分子的变异形式。这些变异形式不影响其表达产物的抗肿瘤活性，包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
本发明的KILLER具有可以有效地诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
本发明中，将KILLER克隆入真核载体中然后转染人结肠癌(HCT116)细胞，48小时后收集细胞，流式细胞仪检测结果提示KILLER过度表达可以较好的诱导细胞凋亡(图1)。
本发明中，用Western blot和PCR的方法来检测减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的KILLER在肿瘤细胞中的表达，结果提示与空白对照菌株比较，KILLER可在肿瘤细胞中表达，其蛋白产物为55KD。表达KILLER的减毒鼠伤寒沙门氏菌感染人肿瘤细胞后，可诱导明显的肿瘤细胞凋亡；随着感染时间的增加，更多的肿瘤细胞发生凋亡。本发明的表达KILLER的减毒鼠伤寒沙门氏菌可以用于诱导人结肠癌细胞、人胰腺癌细胞、肝癌细胞、人宫颈癌细胞、人非小细胞肺癌细胞、骨肉瘤细胞、人急性T淋巴细胞性白血病细胞和人急性早幼粒白血病细胞等肿瘤细胞的凋亡
表达KILLER的减毒鼠伤寒沙门氏菌可以抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长：用表达KILLER的减毒鼠伤寒沙门氏菌经口服喂食荷瘤小鼠，与空白对照菌株比较，可以明显地抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长荷瘤小鼠的生长周期。
本发明KILLER多肽、KILLER基因及其类似物等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的KILLER多肽为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的KILLER多肽可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的KILLER多肽还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的KILLER多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明中，将含有效应用量的KILLER多肽(其对应的全长核苷酸序列见NCBI NM003842)和药学上的载体或者赋形剂即组成治疗肿瘤药剂。
较好的，本发明将KILLER基因开放阅读框序列转化入减毒的病毒，提取阳性克隆；然后将含有效应用量的阳性克隆和药学上的载体或者赋形剂组成所述治疗肿瘤药剂。
进一步而言，本发明将KILLER基因开放阅读框序列进行修饰，再转化入减毒的病毒载体并提取经过修饰的阳性克隆；最后将含有效应用量的阳性克隆和药学上的载体或者赋形剂组成所述治疗肿瘤药剂。
更好的，本发明将KILLER基因开放阅读框序列与真核表达载体连接，然后进行修饰并转化减毒的病毒，再分离纯化得到阳性克隆；最后将含有效治疗量的阳性克隆和药学上的载体或者赋形剂组成所述治疗肿瘤药剂。
具体而言，本发明将KILLER基因开放阅读框序列与真核表达载体连接，然后将重组质粒转化原核宿主LB5000，从LB5000中提取质粒转化减毒的病毒，再分离纯化得到阳性克隆；最后将含有效治疗量的上述克隆和药学上的载体或者赋形剂组成所述治疗肿瘤药剂。
本发明中，所述的减毒的病毒是减毒鼠伤寒沙门氏菌。
本发明中，所述的减毒的病毒是减毒鼠伤寒沙门氏菌终宿主SL3261。
本发明中，所述的有效应用量是1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。
本发明中，所述的治疗肿瘤药剂为口服药剂。
由于减毒鼠伤寒沙门氏菌可以特异地在肿瘤细胞中高度集聚增殖同时它是兼性厌氧菌可在肿瘤组织的缺氧区生长。所以通过口服给药后，减毒鼠伤寒沙门氏菌可由肠道通过不同途径到达肿瘤部位进而持续表达KILLER，从而提高药物的肿瘤靶向性和效率。
常规化疗与放疗方法由于它们的毒副作用以及某些肿瘤细胞对化疗和放疗处理的不敏感，因此在很大程度上限制了它们在临床中的应用。本发明提供的这种蛋白质KILLER对肿瘤细胞有极高的杀伤作用。因此，是一个非常具有开发前景的抗癌药物。基因工程药物的新剂型和新型给药系统的研制是医药领域寻求创新的一个方向。由于基因工程药物大多是多肽类药物，一般只有注射给药一种途径，这对于长期给药的病人而言极不方便。蛋白多肽药物的鼻腔给药、肺部给药、口服给药等将成为注射给药的替代途径；基因给药则需解决靶向性等一系列十分复杂的技术难题。减毒鼠伤寒沙门氏菌被证实它不仅可以特异地在肿瘤细胞中高度集聚增殖并抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长，同时也可作为工程菌运输载体来表达外源基因且具有良好的肿瘤细胞靶向性，因而，减毒伤寒沙门氏菌介导的肿瘤基因治疗将会为癌症的治疗开辟一条新的途径。以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体将KILLER特异地导入肿瘤细胞进而抑制肿瘤细胞的生长的技术在国内外均属首创。开发以携带KILLER的沙门氏菌为口服基因治疗新药不仅解决了蛋白质多肽药物的非注射给药途径的难题更重要的是将会为肿瘤治疗提供一种安全，有效，特异及经济的方法。
具体实施方式
实施例1 KILLER诱导人结肠癌细胞HCT116细胞凋亡
KILLER基因的获得：用PCR从人肾cDNA表达文库扩增出KILLER的全长cDNA片段，长度为1182bp；经过测序确认后克隆入真核表达载体中。
人结肠癌细胞HCT116由ATCC提供。细胞株使用GIBCO公司Macoy’s5A完全培养基(含10％小牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)培养。用表达KILLER的质粒转染肿瘤细胞48小时，收集细胞后进行PI染色，利用流式细胞仪来检测细胞凋亡。
结果显示，本发明的KILLER对促进人结肠癌(HCT116)凋亡细胞数量增加。
实施例2表达KILLER的减毒鼠伤寒沙门氏菌可诱导肿瘤细胞发生凋亡
用无抗性完全培养基培养肿瘤细胞，用250MOI(病毒颗粒数与受试细胞数的比例)的表达KILLER及阴性对照减毒鼠伤寒沙门氏菌感染细胞3小时，随后用含有抗生素及100μg/ml G418的完全培养基来培养细胞。在不同的时间点来分别感染细胞，检测表达KILLER的减毒鼠伤寒沙门氏菌对肿瘤细胞凋亡的诱导。
结果显示，表达KILLER的减毒鼠伤寒沙门氏菌可诱导肿瘤细胞发生凋亡。
实施例3表达KILLER的减毒鼠伤寒沙门氏菌可抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长
用表达KILLER及阴性对照减毒鼠伤寒沙门氏菌经口服喂食荷瘤小鼠，在不同的时间点来分别检测表达KILLER的减毒鼠伤寒沙门氏菌对肿瘤细胞在小鼠体内的生长及对小鼠生长周期的影响。
结果显示，表达KILLER的减毒鼠伤寒沙门氏菌可抑制肿瘤细胞在荷瘤小鼠体内的生长并延长荷瘤小鼠的生长周期。