新颖的链球菌抗原.pdf

所揭示的为链球菌蛋白质以及编码该蛋白质的多核苷酸。该蛋白质具抗原性，因此为一有用的疫苗组份，可用以预防或治疗受链球菌感染的动物。另外也揭示了生产蛋白质抗原的重组方法与检测链球菌感染的诊断分析。

权利要求书
1.  一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与SEQ ID NO：4、58、60、62、63、67和68中的任何一种的同一性至少为95％，其中当对个体给药时，所述多肽引起抗链球菌免疫反应。

2.  权利要求1的多核苷酸，其中所述多肽能够诱导与具有SEQ IDNO：4、58、60、62、63、67和68中的任何一种氨基酸序列的多肽具结合特异性的抗体的产生。

3.  一分离的多核苷酸，其与权利要求1所述的多核苷酸互补。

4.  一分离的多核苷酸，其与权利要求2所述的多核苷酸互补。

5.  如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述的核苷酸为DNA。

6.  如权利要求2所述的多核苷酸，其中所述的核苷酸为DNA。

7.  如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述的核苷酸为RNA。

8.  如权利要求2所述的多核苷酸，其中所述的核苷酸为RNA。

9.  一载体，其包含可操作连接到表达控制区域的权利要求1所述的多核苷酸。

10.  一载体，其包含可操作连接到表达控制区域的权利要求2所述的多核苷酸。

11.  一宿主细胞，其是被权利要求9所述的载体转染的。

12.  一宿主细胞，其是被权利要求10所述的载体转染的。

13.  一种制造多肽的方法，其包括在适于表达该多肽的条件下，培养权利要求11所述的宿主细胞。

14.  一种制造多肽的方法，其包括在适于表达该多肽的条件下，培养权利要求12所述的宿主细胞。

15.  一分离的多肽，其与SEQ ID NO：4、58、60、62、63、67和68中的任何一种的同一性至少为95％，其中当对个体给药时，所述多肽引起抗链球菌免疫反应。

16.  一分离的多肽，其具有选自SEQ ID NO：4、58、60、62、63、67和68的氨基酸序列，其中当对个体给药时，所述多肽引起抗链球菌免疫反应。

17.  如权利要求16所述的分离的多肽，其中SEQ ID NO：4N端的甲硫氨酸残基已被删除。

18.  如权利要求16所述的多肽，其中SEQ ID NO：4的分泌性氨基酸序列已被删除。

19.  一嵌合型多肽，其包含两个或更多个选自SEQ ID NO：4、58、60、62、63、67和68的多肽；条件是所述的两个或更多个多肽相连接以形成嵌合型多肽。

20.  一嵌合型多肽，其包含具有SEQ ID NO：58、60、62、67、和68氨基酸序列的多肽，条件是这些多肽相连接以形成嵌合型多肽。

21.  通式(I)所示的嵌合型多肽，其中嵌合型多肽具有通式(I)：
A-(B)m-(C)n-D    (I)
其中，
m为0或1；
n为0或1；
A选自SEQ ID NO：4、58、60、62、63、67和68；
B选自SEQ ID NO：4、58、60、62、63、67和68；
C选自SEQ ID NO：4、58、60、62、63、67和68；和
D选自SEQ ID NO：4、58、60、62、63、67和68。

22.  权利要求21的嵌合型多肽，其中所述嵌合型多肽具有通式(I)：
A-(B)m-(C)n-D    (I)
其中，
m为0或1；
n为0或1；
A选自SEQ ID NO：58、60、62、67和68；
B选自SEQ ID NO：58、60、62、67和68；
C选自SEQ ID NO：58、60、62、67和68；和
D选自SEQ ID NO：58、60、62、67和68。

23.  一种疫苗组合物，其包含如权利要求15-22中任一项所述的多肽，以及可药用的载体、稀释剂或佐剂。

24.  权利要求23的疫苗组合物在制备药物中的应用，所述药物用于在易受肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)感染的个体中治疗或预防处理肺炎链球菌感染，其中对所述个体施用治疗或预防量的所述的药物。

25.  权利要求24的疫苗组合物的应用，其中肺炎链球菌感染是脑膜炎，中耳炎，细菌血症或肺炎感染。

26.  如权利要求24所述的应用，其中该个体为哺乳类动物。

27.  如权利要求24所述的应用，其中该个体为人类。

28.  权利要求23的疫苗组合物，其包括权利要求15-22中任一项所述的多肽，以及可药用的佐剂。

29.  权利要求15-22任一项所述的多肽，其中所述多肽与糖类稠合。

说明书新颖的链球菌抗原
本申请为申请号200510003749.2、发明名称“新颖的链球菌抗原”的专利申请的分案申请，后者为国际申请PCT/CA99/01218于2001年6月22日进入中国国家阶段、申请号998149047、发明名称“新颖的链球菌抗原”的分案申请。
发明领域
本发明涉及抗原，具体地讲，涉及可用作疫苗组合物的用以治疗和/或预防的致病性肺炎链球菌蛋白质抗原。
发明背景
肺炎链球菌(S.Pneumoniae)对于人类，特别是婴儿、老年人与免疫力较弱者而言，是一重要的致病菌。它通常可由罹患诸如细菌血症、败血病、肺炎与脑膜炎这类高罹病率且高死亡率的侵害疾病的病人身上分离出来。即使以适当的抗生素治疗，肺炎链球菌的感染仍不免造成许多死亡。虽然抗微生物药物已经能减低肺炎链球菌感染所造成的总死亡率，但是具耐药性的肺炎链球菌的出现，却成为现今世界上主要的问题。有效的肺炎链球菌疫苗可显著影响与肺炎链球菌疾病相伴随的罹病与死亡率。这些疫苗也能够用来避免婴儿与小孩的中耳炎。
肺炎链球菌疫苗的发展方向，集中于由肺炎链球菌荚膜多糖体所诱发产生的免疫反应。基于抗原性差异所鉴定出的肺炎链球菌荚膜的血清类型已超过80多种。现今所利用的肺炎链球菌疫苗，包含了23种最常引起疾病的荚膜多糖体，但是其缺点主要还在于有一些荚膜多糖体的致免疫性极差，血清类型的多样性以及血清类型随着时间、地理区域与年龄层的不同而在分布上有差异。特别是，目前正在研发用以保护小孩对抗所有其他血清型肺炎链球菌组份的现有疫苗与荚膜结合疫苗，仍未成功。虽然可改进荚膜多糖体的致免疫性，但是血清类型的特异性仍然是开发多糖体疫苗上的一大限制。利用具抗原性且具保守致免疫性的肺炎链球菌蛋白质抗原，无论是单独或是与另外成份组合，皆有可能产生蛋白质肺炎链球菌疫苗。
在1998年5月7日所公开的WO98/18930，题为“肺炎链球菌的抗原与疫苗”(StreptOCOCCUS Pneumoniae antigens and vaccines)的PCT专利中描述了许多具抗原性的特定多肽，但是对于这些多肽的生物活性却无相关报告。
因此，目前亟需以链球菌抗原当作疫苗的组份，用以预防和/或治疗链球菌感染。
发明概述
依据上述观点，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选白含有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81与83的序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物问的同一性至少有70％。
本发明的其它方面提供了载体，其包含可操作连接至表达控制区的本发明的多核苷酸，还提供了用所述载体转染的宿主细胞以及制备多肽的方法，该方法包括在适于表达该基因的条件下培养所述宿主细胞。
在另一方面，提供了由本发明多核苷酸所编码的新颖多肽。
图1为BVH-3基因的DNA序列；SEQ ID NO：1。
图2为BVH-3蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：2。
图3为BVH-11基因的DNA序列；SEQ ID NO：3。
图4为BVH-11蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：4。
图5为BVH-28基因的DNA序列；SEQ ID NO：5。
图6为BVH-28蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：6。
图7为BVH-3A基因的DNA序列，其相当于BVH-3基因5’末端；SEQ ID NO：7。
图8为BVH-3A蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：8。
图9为BVH-3B基因的DNA序列，其相当于BVH-3基因3’末端：SEQ ID NO：9。
图10为BVH-3B蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：10。
图11为利用MacVector序列分析软件(6.5版)，以Clustal W程序比较按WU2、RX1、JNR.7/87、SP64、P4241与A66各肺炎链球菌株的BVH-3基因的读码框所预期的氨基酸序列。在比较列下，为一致性的状况行，其中*与·分别代表相同与相似的氨基酸残基。
图12为利用MacVector序列分析软件(6.5版)，以Clustal W程序比较按WU2、RX1、JNR.7/87、SP64、P4241、A66与SP63各肺炎链球菌株BVH-11基因的读码框所预期的氨基酸序列。在比较列下，为一致性的状况行，其中*与·分别代表相同与相似的氨基酸残基。
图13为不同肺炎链球菌株BVH-11蛋白质的预期氨基酸序列比较。并利用MacVector序列分析软件(6.5版)，以Clustal W程序分析出的其同一性(I)与相似性(S)。
图14为包含完整BVH-3基因的DNA序列(读码框(ORF)为核苷酸第1777至4896个)；SEQ ID NO：11。
图15为包含完整BVH-11基因的DNA序列(读码框为核苷酸第45至2567个)；SEQ ID NO：12。
图16为包含完整BVH-11-2基因的DNA序列(读码框为核苷酸第114至2630个)；SEQ ID NO：13。
图17为BVH-11-2蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：14。
图18为SP63的BVH-3基因的DNA序列；SEQ ID NO：15。
图19为SP63的BVH-3蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：16。
图20为BVH-3M蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：55。
图21为BVH-3AD蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：56。
图22为L-BVH-3-AD蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：57。
图23为NEW 12蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：58。
图24为BVH-3C蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：59。
图25为BVH-11M蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：60。
图26为BvH-11A蛋白质的氨基酸序列：SEQ ID NO：61。
图27为BvH-11B(亦称为NEW13)蛋白质的氨基酸序列；SEQID NO：62。
图28为BVH-11C蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：63。
图29为NEW1蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：64。
图30为NEW2蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：65。
图31为NEW3蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：66。
图32为NEW4蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：67。
图33为NEW5蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：68。
图34为NEW6蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：69。
图35为NEW7蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：70。
图36为NEW8蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：71。
图37为NEW9蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：72。
图38为BVH-11-2M蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：73。
图39为NEW10蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：74。
图40为NEW11蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：75。
图41为NEW12基因的DNA序列；SEQ ID NO：76。
图42为NEW14蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：77。
图43为NEW15蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：78。
图44为NEW16蛋白质的氨基酸序列：SEQ ID NO：79。
图45为GBS的BVH-71基因的DNA序列；SEQ ID NO：80。
图46为GBS的BVH-71蛋白质的氨基酸序列：SEQ ID NO：81。
图47为GAS的BVH-71基因的DNA序列；SEQ ID NO：82。
图48为GAS的BVH-71蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID NO：83。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选自含有SEQ ID NO：2、4、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83的序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选自含有SEQ ID NO：2、4、6、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物问的同一性至少有95％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选白含有SEQ ID NO：2、4、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选白含有SEQ ID NO：2、4、10、14、16、55至75、77至79、81、83所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物问的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选自含有SEQ ID NO：2、4、8、10、14、16、55至75、77至79所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选自含有SEQ ID NO：2、8、10、16、55、56、57、58、59、64、65、66、78所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选白含有SEQ ID NO：2、8、10、16、55、56、57、59、64、65、66、78所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选自含有SEQ ID NO：4、14、58、60、61、62、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选自含有SEQ ID NO：4、14、60、61、62、63、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选自含有SEQ ID NO：2、4、10、14、16、55至75、77至79所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选白含有SEQ ID NO：10、55至75、77、78、79所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选白含有SEQ ID NO：55至75、77、78、79所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选自含有SEQ ID NO：2、4、6、8、10所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选白含有SEQ ID NO：2、4、10、14、16所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与选白含有SEQ ID NO：2、4、14、16所示序列的第二多肽或其片段、相似物或衍生物间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：2或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：4或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽问的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：10或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽问的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：14或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：16或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：58或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：60或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：62或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：64或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽问的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：67或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：68或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：69或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：72或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：74或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽间的同一性至少有70％。
根据本发明的一方面，本发明提供一分离的多核苷酸，其所编码的多肽与含有SEQ ID NO：77或其片段、相似物或衍生物序列的第二多肽间的同一性至少有70％。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于选自SEQID NO：2、4、6、8、10，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于选自SEQID NO：2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于选自SEQID NO：2、4、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于选白SEQID NO：2、4、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于选白SEQID NO：2、4、8、1 0、14、1 6、55至75、77至79，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于选自SEQID NO：2、4、10、14、16、55至75、77至79，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于选白SEQID NO：2、4、10、14、16，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：2或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：4或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：10或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：14或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：16或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：10、55至75、77、78、79，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：10、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：58或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：62或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：64或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：67或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：68或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：74或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明涉及多肽，其特征在于至少包含SEQ ID NO：77或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
在具体实施方案中，本发明还涉及嵌合型多肽，其包含本申请中所描述的一个或数个多肽或其片段、相似物或衍生物。
在具体实施方案中，本发明还涉及嵌合型多肽，其包含本申请的附图中所定义的一个或数个多肽或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，本说明还涉及嵌合型多肽，其包含两个或数个选白SEQ ID NO：2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83的多肽或其片段、相似物或衍生物；前提是将多肽或其片段、相似物或衍生物相粘接以形成嵌合型多肽。
在一具体实施方案中，嵌合型多肽将包括两个或数个选白SEQ IDNO：10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77或其片段、相似物或衍生物的多肽；前提是将多肽或其片段、相似物或衍生物相粘接以形成嵌合型多肽。
在一具体实施方案中，嵌合型多肽将包括两个或数个选白SEQ IDNO：10、58、60、62、64、67、68、74、77或其片段、相似物或衍生物的多肽；前提是将多肽或其片段、相似物或衍生物相粘接以形成嵌合型多肽。
在一具体实施方案中，嵌合型多肽将包括两个或数个选自SEQ IDNO：10、62、64、67、68、74、77或其片段、相似物或衍生物的多肽；前提是将多肽或其片段、相似物或衍生物相粘接以形成嵌合型多肽。
在一具体实施方案中，嵌合型多肽将包括2至5个多肽。
在一具体实施方案中，嵌合型多肽将包括2至4个多肽。
在一具体实施方案中，嵌合型多肽将包括2至3个多肽。
在一具体实施方案中，嵌合型多肽将包括2个多肽。
在一具体实施方案中，提供通式(I)所示的嵌合型多肽：
A-(B)m-(C)n-D    (I)
其中，
m为O或1；
n为0或1；
A选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物；
B选白SEQ ID NO：2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物；
C选白SEQ ID NO：2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物；
D选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81、83，或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，
A选自SEQ ID NO：10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77，或其片段、相似物或衍生物；
B选自SEQ ID NO：10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77，或其片段、相似物或衍生物；
C选白SEQ ID NO：10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77，或其片段、相似物或衍生物；
D选白SEQ ID NO：10、58、60、62、64、67、68、69、72、74、77，或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，
A选白SEQ ID NO：10、58、60、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物；
B选自SEQ ID NO：10、58、60、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物；
C选白SEQ ID NO：10、58、60、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物；
D选白SEQ ID NO：10、58、60、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物。
在一实施方案中，本发明的嵌合型多肽包括以单独或结合形式出现的下列具体化实施方案的多肽序列。
在一具体实施方案中，A为SEQ ID NO：10、58、60、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，A为SEQ ID NO：10或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，A为SEQ ID NO：58或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，A为SEQ ID NO：62或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，A为SEQ ID NO：64或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，A为SEQ ID NO：67或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，A为SEQ ID NO：68或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，A为SEQ ID NO：74或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，A为SEQ ID NO：77或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，B为SEQ ID NO：10、58、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，B为SEQ ID NO：10或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，B为SEQ ID NO：58或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，B为SEQ ID NO：62或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，B为SEQ ID NO：64或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，B为SEQ ID NO：67或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，B为SEQ ID NO：68或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，B为SEQ ID NO：74或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，B为SEQ ID NO：77或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，C为SEQ ID NO：10、58、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，C为SEQ ID NO：10或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，C为SEQ ID NO：58或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，C为SEQ ID NO：62或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，C为SEQ ID NO：64或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，C为SEQ ID NO：67或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，C为SEQ ID NO：68或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，C为SEQ ID NO：74或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，C为SEQ ID NO：77或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，D为SEQ ID NO：10、58、62、64、67、68、74、77，或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，D为SEQ ID NO：10或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，D为SEQ ID NO：58或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，D为SEQ ID NO：62或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，D为SEQ ID NO：64或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，D为SEQ ID NO：67或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，D为SEQ ID NO：68或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，D为SEQ ID NO：74或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，D为SEQ ID NO：77或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，m为0。
在一具体实施方案中，n为0。
在一具体实施方案中，m与n都为0。
在一具体实施方案中，m与n都为0，A为SEQ ID NO：64或其片段、相似物或衍生物，而B为SEQ ID NO：62或其片段、相似物或衍生物。
在一具体实施方案中，m与n都为0，A为SEQ ID NO：62或其片段、相似物或衍生物，而B为SEQ ID NO：64或其片段、相似物或衍生物。
根据本发明，所有编码多肽的嵌合型多肽与多核苷酸，皆在本发明的范围内。
在一具体实施方案中，根据本发明的多肽或嵌合型多肽具抗原性。
在一具体实施方案中，根据本发明的多肽或嵌合型多肽能够引发个体的免疫反应。
在具体实施方案中，本发明还涉及能够产生对本发明中所定义的多肽或嵌合型多肽具结合特异性的抗体的多肽。
“具结合特异性”的抗体表示抗体能够辨识特定的多肽并与其结合，但对于样本例如天然地包含所选肽的生物样本中的其他分子则基本上不识别并结合。利用酶联免疫吸附法(ELISA)，可以测定出将所选的多肽当作抗原时的特异性结合能力。
除非另外定义，此处所使用技术上或科学上的术语与本发明领域普通技术人员一般所了解的意义相同。所有的出版物、专利申请、专利与其他本文所提的参考文献，将全部引入本文做参考。如有冲突，将以本说明书(包括定义)为准。此外，使用的实验材料、方法与实施例只为叙述说明，因此并不受其限制。
本发明所使用多肽的“片段”、“衍生物”或“相似物”包括那些经由一个或数个被保守或非保守氨基酸残基(最好是保守的)替换的多肽，且其以为天然或非天然的氨基酸。在一具体实施方案中，本发明多肽的衍生物和相似物与那些于附图中说明的序列或其片段有约70％的同一性。换句话说，有70％的残基是相同的。在一具体实施方案中，多肽的同源性将高于75％。在一具体实施方案中，多肽的同源性将高于80％。在一具体实施方案中，多肽的同源性将高于85％。在一具体实施方案中，多肽的同源性将高于90％。在一具体实施方案中，多肽的同源性将高于95％。在一具体实施方案中，多肽的同源性将高于99％。在一具体实施方案中，本发明多肽的衍生物或相似物中氨基酸残基的替换、修饰与删除将少于20个，最好少于10个。优选的替换是本领域中已知为保守的，例如：替换的残基拥有如疏水性、分子大小、电荷与官能团等相同的物理和化学性质。
根据本发明，多肽同时包括多肽与嵌合型多肽。
也包括已经与其他化合物融合而已改变生物与药理学性质的多肽，例如：与聚乙二醇融合以增长半衰期；与前导或分泌序列融合以方便纯化；还有前原(prepro)序列和与原(pro)序列以及(多)糖类融合。
再者，在一些氨基酸区域为多态性的情况下，更有需要改变一个或数个特别的氨基酸，使其更有效地模仿不同链球菌株上不同的抗原表位。
此外，本发明的多肽可经由末端氨基的酰化(例如，乙酰化或硫基乙酸酰胺化)与末端羧基酰胺化(例如：利用氨或甲胺)予以修饰，提供稳定性与增强疏水性，以便连结或结合至支持物或其他分子上。
同时本发明也包括多肽片段、相似物或衍生物的相同或相异多肽多聚体。这些聚合物形式包括例如一个或数个多肽由例如亲和素/生物素、戊二醛或二甲基过亚胺酯(dimethylsuperimidate)等交联物交联的形式。这些聚合形式也包含两个或数个由重组DNA技术制造的多顺反子mRNA所产生的串联或反向邻接的序列。较好的是，本发明多肽的片段、衍生物或相似物将包括至少一个具抗原性的区域：例如至少一个抗原表位。
为了形成抗原性聚合物(例如合成的多聚体)，多肽可利用有双卤代乙酰基、硝基芳香卤化物等对硫基具特异性的试剂。因此，不同肽的两个巯基间的连结可能只有一个键，或是具有两个，通常至少四个，但不超过16个，且通常不超过14个碳原子的连接基团。
在一特别的具体化实施方案中，本发明的片段、相似物或衍生物皆不含甲硫氨酸起始残基。较好的是多肽不含引导或分泌序列(信号序列)。本发明多肽的信号部分可利用已建立的分子生物学技术加以确认。通常目的多肽可以从链球菌培养物中分离出来，然后测序以确认其成熟蛋白的起始残基，进而确定成熟多肽的序列。
依据另一方面，本发明提供了疫苗组合物，其至少包含本发明中的一个或数个链球菌多肽和与之混合的可药用的载体稀释剂或佐剂。适当的佐剂包括油，例如：弗式完全佐剂或不完全佐剂；盐类，例如：AlK(SO4)2，AlNa(SO4)2，AlNH4(SO4)2，二氧化硅，高龄土；碳多核苷酸，例如：聚IC(poly IC)与聚AU(poly AU)。较好的佐剂包括奎尔A(QuilA)与铝水凝胶(Alhydrogel)。本发明的疫苗可利用注射、快速输液、鼻咽吸收、皮肤吸收或颊部或口腔等非肠胃方式来施用。可药用的载体也包括破伤风类毒素。
本发明的疫苗组合物是用以治疗或预防链球菌的感染和/或如P.R.Murry(主编)，E.J.Baron，M.A.Pfaller，F.C.Tenover和R.H.Yolken等人于Manual of Clinical Microbiology，ASM Press，Washington，D.C.第6版，1995一书中第1482页所述受链球菌感染所造成的疾病与症状(此篇已并入本文做参考)。在一具体实施方案中，本发明的疫苗组合物被用以治疗与预防脑膜炎、中耳炎、细菌血症与肺炎。在一具体实施方案中，本发明的疫苗组合物被用以治疗与预防链球菌的感染和/或受链球菌，特别是肺炎链球菌、A群链球菌(化脓链球菌)[Grouup Astrepococcus(pyogenes)]、B群链球菌(GBS或无乳链球菌)[Grouup Bstrepococcus(GBS或agalactiae)]、异常泌乳菌(dysgalactiae)、乳头菌(uberis)、土壤丝菌(nocardia)以及金黄色葡萄球菌(streptococcus aureus)感染后的疾病与症状。在一具体实施方案中，链球菌的感染是肺炎链球菌。
在一特别的具体化实施例中，疫苗被施用于处于受链球菌感染危险中的个体上，例如婴儿、老年人与免疫力较弱者。
本申请书所使用的“个体”，包括哺乳类。在一具体实施方案中，此哺乳类为人类。
疫苗组合物较好的单位剂量约为0.001至100μg/kg(抗原/体重)，再较好的是0.01至10μg/kg，最好的是O.1至1μg/kg，免疫接种之间有一至六周的间隔，施用一至三次。
依据另一方面，本发明提供多核苷酸编码的多肽，其特征为选白SEQ ID NO：2、4、6、8、10、14、16、55至75、77至79、81与83，或其片段、相似物或衍生物的氨基酸序列。
在一具体化实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、12、13、15、76、80、82中所列出者，其可能包含了编码本发明多肽的读码框。必须要了解的是，在图示中所列的多核苷酸序列可以因简并密码而改变，但仍能编码本发明中的多肽。而本发明更提供了能与上述多核苷酸序列(或其互补序列)杂交的多核苷酸，序列间的同一性为50％。在一具体实施方案中，序列间的同一性为70％。在一具体实施方案中，序列间的同一性为75％。在一具体实施方案中，序列问的同一性为80％。在一具体实施方案中，序列间的同一性为85％。在一具体实施方案中，序列间的同一性为90％。在另一具体实施方案中，多核苷酸是可在严格的条件下杂交的，其同一性至少有95％。在一具体实施方案中，同一性超过97％。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：1、3、7、9、11、12、13、15、76、80、82中所列编码本发明多肽的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：1、3、9、11、12、13、15、76、80、82中所列编码本发明多肽且包含读码框的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：1、3、9、11、12、13、15、76中所列编码本发明多肽且包含读码框的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：1、3、7、9、11、12、13、15、76中所列编码本发明多肽且包含读码框的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：1、7、9、11、15、76中所列编码本发明多肽且包含读码框的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：1、9、11、15、76中所列编码本发明多肽且包含读码框的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：1、7、9、11中所列编码本发明多肽且包含读码框的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：1中所列编码本发明多肽的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：7中所列编码本发明多肽的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：9中所列编码本发明多肽的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：11中所列编码本发明多肽的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：15中所列编码本发明多肽的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：3、12、13、76中所列编码本发明多肽的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：3中所列编码本发明多肽的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：12中所列编码本发明多肽的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：13中所列编码本发明多肽的多核苷酸。
在另一具体实施方案中，多核苷酸为SEQ ID NO：76中所列编码本发明多肽的多核苷酸。
就如同本领域技术人员所容易了解的，多核苷酸包括DNA与RNA。
本发明亦包括与本申请书所述多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一方面，本发明编码多肽的多核苷酸或其片段、相似物或衍生物，可在DNA免疫方法中使用。换句话说，它们可以被掺入能够复制与表达的载体中，再经由注射，使其在活体中表达抗原性的多肽：例如：将多核苷酸插入在真核细胞中始有作用的CMV启动子所控制的载体中，而此载体最好是以肌肉注射为之。
依据另一方面，本发明提供一生产本发明多肽的方法，其系以重组技术在宿主细胞内表达编码该多肽的多核苷酸，并将多肽产物回收。同时，亦可依据所建立的化学合成技术生产多肽，例如：在液相或固相下合成寡肽，并将之粘接以生产完整的多肽(区段接合)。
一般取得与评估多核苷酸与多肽的方法，如下列参考资料中所述：Sambrook et al，分子克隆：实验室手册(Molecular cloning：A LaboratoryManual)第二版，纽约冷泉港，1989；目前分子生物学中的规程(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Ausubel F.M.等人编辑，John Wileyand Sons.Inc.New York；从分子克隆到基因工程的PCR克隆规程(PCR Cloning Protocols.from Molecular Cloning t0 GeneticEngineering)，White B.A.编辑，Humana Press，Totowa，New Jersey，1997，490页；蛋白质的纯化、原理和实践(Protein Purification，Principles andPractices)，Scopes R.K.，Springer Verlag，New York，第3版，1993，380页：目前免疫学规程(Current Protocols in Immunology)，Coligan J.E.等人编辑.，John Wiley & sons Inc.，New York，上述皆列入本文做参考。
为了重组生产，以可编码出该多肽的载体来感染宿主细胞，再将之培养于利于活化启动子的改良培养液中，筛选转化株或扩增该基因。那些能在宿主细胞中有活性并能复制的适当载体包括染色体、非染色体与合成的DNA序列，例如：细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母菌质粒以及衍生自质粒与噬菌体DNA组合的载体。利用限制酶可将多核苷酸插入载体上的适当位置，也就是说其能够被连接至包含启动子、核糖体结合位(共有区或席恩达格诺氏[Shine-Dalgarno]序列)和一可有可无的操纵子(调控元件)的表达控制区域上。我们可依据已建立的分子生物原理(Sambrook et al，分子克隆：实验室手册，第二版，纽约冷泉港，1989；目前分子生物学中的规程，Ausubel F.M.等人编辑.，John Wiley and Sons，Inc.New York)，来选择表达控制区域上的个别构成部分以适合某一宿主细胞与载体。适当的启动子包括但不限于LTR或SV40启动子、大肠杆菌的lac、tac或trp启动子以及噬菌体的lambda PL启动子。载体最好也包含一复制起点以及筛选标记，例如：氨苄西林抗性基因。适当的细菌载体包括pET、pQE70、pQE60、pQE-9、pbs、pD10 phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、Pkk223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，而真核细胞的载体有pBlueBacIII、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG与pSVL。宿主细胞可为细菌的大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌属(Streptomyces)；真菌的黑霉菌(Aspergillus niger)、小巢状麦菌(Aspergillus nidulins)；酵母菌的酵母菌属(Saccharomyces)与真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)与COS。
多肽在培养表达之后，通常利用离心来收集细胞，以物理或化学方法将细胞打破(假使表达的多肽并未分泌至培养液中)后，保留粗萃取液以分离出所欲求的多肽。之后依照多肽的性质利用已建立的技术来纯化培养液或溶胞产物中的多肽；例如：利用硫酸铵或酒精沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水相互作用层析法、羟基磷灰石层析法以及外源凝集素层析法，之后再以HPLC作最后纯化。
多肽可以在有或无引导序列或分泌序列的方式下表达。前述的引导序列可以利用翻译后加工将之除去(见美国专利案号4,431,739、4,425,437与4,338,397)或以化学方式将之除去，以纯化所表达的多肽。
根据另一方面，本发明的链球菌多肽可用来诊断链球菌的感染，特别是肺炎链球菌感染的诊断试验。有许多诊断方法可以利用，例如检测生物样本中的链球菌体；其可利用以下的方法：
a)从病人取得生物样本；
b)将能与本发明链球菌多肽反应的抗体或其片段与生物样本一同培养，以形成混合物；然后
c)检测混合物中特异结合的抗体或片段，其表示有链球菌的存在。
在另一方式中，则可检测生物样本中含有或可能含有特异对抗链球菌抗原的抗体，其方法如下：
a)从病人取得生物样本；
b)将本发明的一个或数个链球菌多肽或其片段与生物样本一同培养，以形成混合物；然后
c)检测混合物中特异结合的抗原或片段，其表示有对链球菌具特异性的抗体的存在。
本领域技术人员知晓此诊断试验将有许多的形式，其包括免疫性试验，如酶免疫吸附法(ELISA)、放线免疫分析法或是胶乳凝集法，其本质上皆在确认抗体对于生物体中存在的蛋白质是否有特异性。
本发明中编码多肽的DNA序列亦可被设计为DNA探针，用以检测怀疑有链球菌的生物样本。本发明的检测方法包括：
a)从病人取得生物样本；
b)将一个或数个含编码本发明多肽DNA序列或其片段的DNA探针与生物样本一同培养，以形成混合物；然后
c)检测混合物中特异结合的DNA探针，其表示有链球菌的存在。
本发明的DNA探针亦可用于检测循环的链球菌，例如在样本中的肺炎链球菌核酸；又例如可用聚合酶链反应来诊断链球菌的感染。探针可以传统的技术合成，也可以在固相上固定化，或是标记上可检测的标记。本申请书中较好的DNA探针，乃一与本发明肺炎链球菌多肽的核苷酸至少有6个连续互补核苷酸的寡聚分子。
另一检测患者中链球菌的诊断方法包括：
a)以可检测的标记物标记能与本发明多肽或其片段反应的抗体；
b)将标记的抗体或标记的片段施给到患者；然后
c)检测患者中特异结合的已标记抗体或已标记片段，其表示有链球菌的存在。
本发明的另一方面，乃将发明的多肽当做免疫原来生产特异性的抗体，并将之用以诊断，特别是治疗链球菌的感染。利用适当的筛选方法，可确定出适当的抗体；例如在一试验模式中，计算某一抗体对抗链球菌感染的被动保护能力。本发明实施例中所述的老鼠模式就是一个例子。抗体可能是一完整的抗体分子或只是与抗原结合的抗体分子片段，而且可能属于不同的免疫球蛋白类型。抗体或其片段可能来自于动物，特别是来自哺乳类动物，尤其是来自小鼠、大鼠或是人类。它可能是一天然的抗体或其片段，需要的话，还可为重组的抗体或抗体片段。  “重组抗体”与“重组抗体片段”分别代表着由分子生物技术所制造出的抗体与抗体片段。抗体或抗体片段可为多克隆的或是较好的单克隆的。它对肺炎链球菌多肽上许多的抗原表位具特异性，但最好只对其一具特异性。
并不限制范围，本发明还涉及被称为BVH-3、BVH-11、BVH-11-2、BVH-28与BVH-71的新抗原。本发明还涉及截短的多肽，其包括被称为BvH-3、BVH-11、BVH-11-2、BVH-28与BVH-71新抗原的片段。本发明还涉及嵌合型多肽，其包括被称为BVH-3、BVH-11、BVH-11-2、BvH-28与BVH-71新抗原的片段。以下即为总结本发明抗原间关系的参照表：
家族核苷酸SEQ ID NO：多肽SEQ ID NO：BVH-3BVH-31.112BVH-3A78BVH-3B910BVH-3 SP631516BVH-3M55BVH-3AD56L-BVH-3AD57New127658BVH-3C59New164New265New366New1578BVH-11 BVH-11-13.124BVH-11-21314BVH-11M60BVH-11A61BVH-11B亦称为NEW1362BVH-11C63New467New568New669New770New871New972
    家族    核苷酸SEQ ID NO：    多肽SEQ ID NO：    BVH-11-2M    73    New10    74    New1    75    New12    76    58    New14    77    New16    79    BVH-28    BVH-28    5    6    BVH-71    GBS    80    81    GAS    82    83
实施例1
本实施例系说明肺炎链球菌的基因克隆。
以含有添加的Bgl II(AGATCT)与Xba I限制位点(TCTAGA)碱基延伸区的寡聚核苷酸，在血清类型6的SP64肺炎链球菌株的基因组上，以PCR(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2400 Perkin Elmer，San Jose，CA)来扩增肺炎链球菌BVH-3(SEQ ID NO：1)基因与肺炎链球菌BVH-28(SEQ ID NO：5)基因的编码区域。然后利用QIAgen(Chatworth，CA的QIAquick凝胶萃取试剂盒从琼脂凝胶上将PCR产物回收。以Bgl II与Xba I限制酶(Pharmacia Canada Inc，BaiedUrfe，Canada)切后，以酚：氯仿加以萃取，而后再以酒精沉淀。另外将Superlinker载体pSL301(Invitrogen，San Diego，CA)，以Bgl II与XbaI限制酶切后，以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝胶萃取试剂盒从琼脂凝胶上回收。将Bgl II与Xba I限制酶切过的基因组DNA片段与Bgl II与Xba I限制酶切过的pSL301载体粘接。粘接后的产物再根据Simanis的方法(Hanahan，D.DNA Cloning，1985，D.M.Glover(ed)，pp.109-135)转化至DH5a大肠杆菌[f80 lacZ DM15 endAl recAlhsdR 17(rK-mK+)supE44 thi-11-gyrA96 relAl D(lacZYA-argF)U169](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。以QIAgen的试剂盒来纯化含有BVH-3或BVH-28基因的pSL301重组质粒(rpSL301)，再以核苷酸测序(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit，ABI，Foster City，CA)来确定插入的DNA。以Bgl II(AGATCT)与Xho I(CTCGAG)限制酶切重组质粒pSL301(rpSL301)，再以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝胶萃取试剂盒纯化Bgl II-Xho I DNA片段。利用BamHl(GGATCC)与Xho I限制酶切含有硫氧还蛋白-His·Tag序列的pET-32c(+)表达载体(Novagen，Madison，WT)后，再以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝胶萃取试剂盒萃取，而后将Bgl II-Xho I的DNA片段粘接至BamH I-Xho I的pET-32c(+)载体上，使产生硫氧还蛋白-His·Tag-BVH-3或硫氧还蛋白-His·Tag-BVH-28融合蛋白的编码序列。将粘接的产物根据Simanis的方法(Hanahan，D.DNA Cloning，1985，D.M.Glover(ed)，pp.109-135)转化至DH5a大肠杆菌[f80 lacZDM15 endAl recAl hsdR17(rK-mK+)supE44 thi-11-gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick试剂盒回收重组pET-32(+)质粒，再以DNA测序(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit，ABI，Foster City，CA)来确认硫氧还蛋白-His·Tag与DNA插入片段融合处的序列。
实施例2
本实施例系克隆肺炎链球菌蛋白质基因至CMV质粒pCMV-GH的说明。
将肺炎链球菌蛋白质的DNA编码区域插入pCMV-GH质粒(Tanget al.，Nature，1992，356：152)上受巨细胞病毒启动子(CMV)转录控制的人类生长激素(hGH)基因下游的位置。具CMV启动子的载体只有在置入真核细胞中才有作用，在大肠杆菌中是没有的，而此载体亦含有氨苄西林抗性基因。
利用Bgl II(AGATCT)与Xba I(TCTAGA)限制酶，从rpSL301(见实施例1)取得BVH-3(SEQ ID NO：1)与BVH-28(SEQ ID NO：5)基因的编码区域。再以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝胶萃取试剂盒纯化所消化的产物。之后将含有人类生长激素基因用以产生融合蛋白的pCMV-GH载体(Laboratory of Dr.Stephen A.Johnston，Department of Biochemistry，The University of Texas，Dallas，Texas)以Bgl II与Xba I切过后，利用QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝胶萃取试剂盒将之从琼脂糖凝胶中纯化。再将此Bgl II-Xba IDAN片段与Bgl II-Xba I pCMV-GH载体相粘接，产生一受CMV启动子控制的hGH-BVH-3或hGH-BVH-28融合蛋白。将此粘接的产物根据Simanis的方法(Hanahan，D.DNA C1oning，1985，D.M.Glover(ed)，pp.109-135)转化至DH5a大肠杆菌[f80 lacZ DM15 endAl recA1 hsdR17(rK-mK+)supE44 thi-11- gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。以QIAgen(Chatworth，CA)试剂盒回收pCMV重组质粒。
以含有添加的Bgl II(AGATCT)与Hind III限制位点(AAGCTT)碱基延伸区的寡聚核苷酸，在血清类型6的SP64肺炎链球菌株的基因组上，以PCR(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2400 PerkinElmer，San Jose，CA)来扩增肺炎链球菌BVH-11(SEQ ID NO：3)基因的编码区域。然后利用QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝胶萃取试剂盒从琼脂凝胶上将PCR产物回收。以限制酶(Pharmacia Canada Inc，Baie dUrfe，Canada)切后，以酚：氯仿加以萃取，而后再以酒精沉淀。另外将pCMV-GH载体(Laboratory of Dr.Stephen A.Johnston，Department of Biochemistry，The University of Texas，Dallas，Texas)以Bgl II与Hind III限制酶切后，以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick凝胶萃取试剂盒从琼脂凝胶上回收。将Bgl II-Hind III DNA片段与BglII-Hind III限制酶切过的pCMV-GH载体粘接，产生一受CMV启动子控制的hGH-BVH-11融合蛋白。粘接后的产物再根据Simanis的方法(Hanahan，D.DNA Cloning，1985，D.M.Glover(ed)，pp.109-135)转化至DH15a大肠杆菌[f80，lacZ DM15 endA1 recA1 hsdR17(rK-mK+)supE44thi-11-gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。以QIAgen的试剂盒纯化pCMV重组质粒，再以核苷酸测序来确认插入的DNA。
实施例3
本实施例系说明利用DNA对肺炎链球菌抗原引发免疫反应。
在一组8只雌性BALB/c老鼠(Chareles River，St-Constant，Quebec，Canada)中，通过肌肉注射50μl含有100μg能够编码BVH-3、BVH-11或BVH-28基因的pCMV-GH重组质粒与50μg能够表达粒性白细胞-巨噬细胞群落诱导因子(GM-CSF)的pCMV-GH-GM-CSF质粒(Laboratory of Dr.Stephen A.Johnston，Department of Biochemistry，The University of Texas，Dallas，Texas)，每2至3周注射一次，共三次而进行免疫；而在对照老鼠则注射100μg的pCMV-GH质粒与50μgpCMV-GH-GM-CSF质粒。在每次免疫前与第三次注射后的第7天从眼穴采取血液样本，再以硫氧还蛋白-His·Tag-肺炎链球菌融合蛋白当作包被蛋白，利用ELISA测定反应所生的抗体。利用编码BVH-3、BVH-11或BVH-28肺炎链球菌蛋白的pCMV-GH重组质粒做DNA免疫，其将诱发产生对抗各自重组蛋白的抗体。交互的抗体效价，乃定义为吸光值高于背景值0.1时血清稀释的最高倍数，其值超过4×103。
实施例4
本实施例系说明肺炎链球菌重组蛋白的生产与纯化。
以电穿孔(Gene Pulser II装置，BIO-RAD实验室，Mississauga，Canada)的方式，分别将含有相当于SEQ ID NO：1、3或5的BVH-3、BVH-11或BVH-28基因的pET重组质粒，转化至AD494(DE3)(Dara-leu7697 DlacX74 DphoA PvuII phoR DmalF3 F’[lac+(lacIq)]pro)trxB∷Kan)(Novagen，Madison，WI)大肠杆菌中；在此株菌中，控制着融合蛋白表达的T7启动子，为T7 RNA聚合酶(出现在1DE3原噬菌体上)所辨识，而此聚合酶的基因又在lac启动子控制下，lac启动子受异丙基-B-d-硫吡喃半乳糖苷(IPTG)所诱导。将此AD494(DE3)/rpET转化体在37℃,250转/秒下，培养于每毫升含有100gg氨苄西林(Sigma-Aldrich Canada Ltd.，Oakville，Canada)的LB培养液(蛋白胨10g/L，酵母菌提取物5g/L，氯化钠10g/L)中，直至波长600nm的吸光值达到0.6。而后在加入终浓度为1mM异丙基-p-d-硫吡喃半乳糖苷的情况下再培养2小时，以诱导硫氧还蛋白-His·Tag-BVH-3、硫氧还蛋白-His·Tag-BVH-11或硫氧还蛋白-His·Tag-BVH-28融合蛋白的生成。以离心方式沉淀100ml培养液的细胞，并将之冷冻在-70℃。
利用His·Tag序列(6个连续组氨酸残基)会与固定在组织胺酸结合金属螯合树脂上双价离子(Ni2+)结合的特性，以亲和层析法纯化由异丙基-p-d-硫吡喃半乳糖苷诱导AD494(DE3)/rpET所生成可溶性细胞质部分的融合蛋白。简言之，将由100ml异丙基-p-d-硫吡喃半乳糖苷诱导所得的沉淀细胞悬浮于磷酸缓冲溶液(PBS)：500mM氯化钠，pH 7.1中，超声波震荡破碎后，在20,000xg下离心20分钟以除去其他破碎片。将悬浮液过滤(膜孔径为0.22pm)后，置入1毫升的HiTrap(Pharmacia Biotech，Baie dUrfe，Canada)预注可马上使用的柱中。之后以1M的咪唑-500mM氯化钠磷酸盐缓冲溶液，pH 7.1，将硫氧还蛋白-His·Tag-链球菌融合蛋白洗脱下来。接下来利用透析法用PBS并于4℃下除去样品中的盐类与咪唑。并以MicroBCA fPierce，Rockford，Illinois)来估算从可溶性部分所获得的融合蛋白的量。
实施例5
本实施例说明利用免疫接种保护老鼠对抗致死肺炎链球菌的感染。
在一组8只雌性BALB/c老鼠(Chareles River)中，皮下注射25μg亲和法纯化的硫氧还蛋白-His·Tag-BVH-3融合蛋白与15μg奎尔A佐剂(Cedarlane Laboratories Ltd，Hornby，Canada)，以3周的间隔共注射三次进行免疫；而在对照组，则只以磷酸盐缓冲溶液中的奎尔A佐剂注射。在每次免疫前与免疫后第1、22、43天和第三次注射后的第7天(第50天)从眼穴采取血液样本。一星期之后以约106 CFU3型肺炎链球菌株WU2对老鼠激发免疫反应。将利用于激发免疫反应的肺炎链球菌接种在巧克力琼脂平板上，以确定CFU与激发剂量。在14天的时间内与第14天记录死亡率，并将存活的老鼠牺牲采血，检验是否有肺炎链球菌的存在，存活记录如表1。
以标准的免疫分析法来分析激发免疫前血清是否有对抗肺炎链球菌抗体的出现；ELISA与印迹分析分析法的结果皆显示，以大肠杆菌所生产的肺炎链球菌重组蛋白免疫后，引发了能够对抗重组与天然肺炎链球菌蛋白的抗体。
表1
BVH-3重组蛋白所介导的保护作用
    免疫原    存活老鼠数目：死亡老鼠数目攻    击后14天    平均存活天数    BVH-3    8∶0    >14    无    0∶8    1
用BVH-3重组蛋白免疫过的老鼠，在感染之后全数存活；但是只供以佐剂的对照组却无一存活。两组老鼠的存活率有着极大的差异性(P×0.0001，指数排列试验[log rank test]对存活曲线的非参数分析；P＝0.0002，费休氏精确试验[Fisher’s exact test])在激发免疫反应后14天，所有存活老鼠的血液细菌培养皆为阴性。
实施例6
本实施例描述从不同肺炎链球菌株克隆BVH-3与BVH-儿基因以及这些基因的分子保守性。
以跨越BVH-3与BVH-11基因不同区域的DNA探针，分析不同链球菌株的染色体DNA后，发现有一个BVH-3基因拷贝与二个BVH-11基因拷贝。这二个BVH-11基因拷贝并不相同，此处称之为BVH-11(SEQ ID NO：12；读码框从第45至2567位核苷酸)与BVH-11-2(SEQ ID NO：13；读码框从第114至2630位核苷酸)。
BVH-3与BVH-11编码区域的第一个氨基酸具引导序列的特征，其亦称为信号肽(Signal peptide)。在序列中亦发现了脂蛋白修饰/加工位置的一致性信号肽酶切位L-X-X-C。SP64肺炎链球菌BVH-3、BVH-11与BVH-11-2的成熟蛋白质分别有1019、821与819个氨基酸。利用PCR(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR系统2400 Perkin E1mer，San Jose，CA)从6或7个的SP64肺炎链球菌株的基因组DNA上，扩增肺炎链球菌基因上编码成熟的BVH-3，称为BVH-3M(核苷酸第1837至4896；SEQ ID NO：11)、BVH-1lM(核苷酸第102至2567；SEQID NO：12)、BVH-11-2M(核苷酸171至2630；SEQ ID NO：13)等区域。第6血清型的SP64肺炎链球菌株与第9血清型的SP63临床分离肺炎链球菌株由laboratoire de la santépublique du Québec，Sainte-Anne-de-Bellevue提供；第4血清型的JNR.7/87肺炎链球菌株由Andrew Camilli，Tufts University School of Medicine，Boston提供；从第2血清型的D39肺炎链球菌株衍生的无荚膜Rx1菌株与第3血清型的A66与WU2肺炎链球菌株由David E.Briles(University of Alabama，Birmingham)所提供；而第3血清型的P4241临床分离肺炎链球菌株则由centre de recherche en infectiologie du centre hospitalier de l’universiteLava1，Sainte-Foy所提供。用于PCR以扩增BVH-3、BVH-11与BVH-11-2基因的寡核苷酸引物对，分别为皆具有限制位点的OCRR479-OCRR480、HAMJ160-OCRR488与HAMJ160-HAMJ186，例外的是从SP64菌株扩增BVH-11基因所使用的引物，其为HAMJ487与OCRR488。引物序列如下表所示(表2)。利用QIAgen(Chatworth，CA、)的QIAquick凝胶萃取试剂盒于琼脂凝胶上将PCR产物回收，再以Bgl II-Xba I或Bgl II-Hind III(Pharmacia Canada Inc，Baie dUrfe，Canada)限制酶切，切后的产物再以QIAgen(Chatworth，CA)的QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。将PCR产物与Bg1 II-Xba I或BglII-Hind III的pSL301载体相粘接。粘接的产物再根据Simanis的方法(Hanahan，D.DNA C1oning，1985，D.M.Glover(ed)，pp.109-135)转化至DH5a大肠杆菌[φ80 lacZ ΔM15 endAl recal hsdR17(rK-mK+)supE44thi-1λgyrA96 relAl Δ(lacZYA-argF)U169](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。而后以QIAgen的试剂盒纯化含有BVH-3、BVH-11或BVH-11-2基因的pSL301重组质粒(rpSL301)，再以核苷酸测序(Taq Dye DeoxyTerminator Cycle Sequencing试剂盒，ABI，Foster City，CA)来确认插入的DNA。图11与图12分别描述从BVH-3与BVH-11推衍氨基酸序列所建立的共有序列。比较所有菌株的BVH-3蛋白质序列，发现同一性为99％至100％，但第9血清型的SP63菌株的BVH.3(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)除外，其缺少对应于SP64菌株的BVH-3’蛋白的第244至420氨基酸残基的一连串共177个氨基酸。分析其他第9血清型的菌株，发现4个BVH-3分子的中有3个有相同的缺失序列，因而认为此3个菌株应属第9血清型肺炎链球菌克隆的成员。
比较7个肺炎链球菌株的13个BVH-11核苷酸序列后，发现其序列非常类似。利用电脑(MacVecctor，Clustal W 1.4)以多数排列对照方式分析BVH-11预期的蛋白质序列，发现这些序列在一长834个氨基酸的序列上有75％相同，而有82％的同源性。在配对排列时，同一性则有80％至100％(图13)。此序列在整个结构中呈现出相当高的相似度。这些蛋白质一级序列的改变几乎都在蛋白质C端最后的125个氨基酸，而这些区域将建构成一个功能部位(domain)。仔细地检视此功能部位后显示了两群序列，图13的前9个序列属于一群，但后4个却属于另一群。比较(MacVecctor，Clustal W1.4)13个蛋白质功能部位的序列后，发现有39％相同。当比较属于同一群的序列时，同一性将提高至92％。
实施例7
本实施例说明BVH-3基因与BVH-11基因部分的同源性。
用由BVH-3与BVH-11基因所得的DNA探针做分子分析，显示BVH-3与BVH-11二者是相关的。在斑点印迹杂交研究中，DNA探针不是由BVH-3组成就是由BVH-11组成，但都能与BVH-3与BVH-11基因二者杂交，显示BVH-3与BVH-11拥有同源序列。经比较读码框与蛋白质的序列后，发现其分别有43％与33％相同。仔细检视后发现，相当于BVH-3上第1至225氨基酸与BVH-11上第1至228氨基酸的区域，在DNA与蛋白质水平上分别有73％与75％的相同。相反，在相当于BVH-3上第226至1039氨基酸与BVH-11上第229至840氨基酸的3’端区域，在DNA与蛋白质水平上分别只有34％与22％的相同。因此，BVH-3与BVH-11基因的5’端包含高度保守的序列，其他部分则具有较高的歧异度。这些结果认为BVH-3与BVH-11可能凭借保守区域中的序列，而有相似的功能，但是对于BVH-3与BVH-11特定的功能则可能由歧异部分来调节。
实施例8
本实施例叙述利用聚合酶链反应来克隆截短的BVH-3、BVH-11与BVH-11-2基因，以及BVH-3与BVH-11截短分子的表达。
利用成对的寡核苷酸，以PCR来扩增从SP64肺炎链球菌株得到的跨越BVH-3(SEQ ID NO：1与11)、BVH-11(SEQ ID NO：3与12)与BVH-11-2(SEQ ID NO：13)等基因的片段。每个引物的5’端皆有限制位点，以使扩增后的产物能够以符合读框(in-frame)的方式插入经消化的质粒的载体(表2与表3)。PCR扩增的产物以限制内切酶切过后，粘接于直链化的pSL301(见实施例1)、pCMV-GH(见实施例2)或pET(Novagen，Madison，WI)等已被酶作用产生了匹配黏性末端的表达载体。以限制酶切pSL301与pCMV-GH重组质粒，使能以符合读框的方式插入pET表达载体。将所得克隆先在DH5α大肠杆菌中稳定下来，然后再引入BL21(λDE3)或AD494(λDE3)的大肠杆菌中以表达截短BVH-3或BVH-11分子。以核苷酸测序来确认每一建构的质粒。重组蛋白表达时，N端与硫氧还蛋白或His-tag融合或是在C端与His·Tag融合。以超声波震荡破碎异丙基-β-d-硫吡喃半乳糖苷所诱导的大肠杆菌培养液后离心取得上清液部分，利用His结合金属螯合树脂(QIAgen，Chatsworth，CA)纯化表达的重组蛋白。产生的基因产物如表3所列。对应于N端区域包括信号序列的基因产物，称之为脂化蛋白质或脂蛋白(L-protein)。对应于缺乏信号序列的N末端区域的基因产物，称之为无信号序列的蛋白质(w/o ss)
表2
PCR所使用的引物
  引物  SEQ.ID.  NO.  序列5’-3’  核苷酸  位置  限制  位点  OCRR 479  17  cagtagatctgtgcctatgcactaaac  SEQ ID 1：61-78  BglII  OCRR 480  18  gatctctagactactgctattccttacgctatg  SEQ ID 11：4909-4887  Xbal  OCRR 497  19  atcactcgagcattacctggataatcctgt  SEQ ID 1：1525-1506  XhoI  OCRR 498  20  ctgctaagcttatgaaagatttagat  SEQ ID 1：1534-1548  HindIII  OCRR 499  21  gatactcgagctgctattccttac  SEQ ID 11：4906-4893  XhoI  HAMJ 172  22  gaatctcgagttaagctgctgctaattc  SEQ ID 1：675-661  XhoI  HAMJ 247  23  gacgctcgagcgctatgaaatcagataaattc  SEQ ID 1：3117-3096  XhoI  HAMJ 248  24  gacgctcgagggcattacctggataatcctgttcatg  SEQ ID 1：1527-1501  XhoI  HAMJ 249  25  cagtagatctcttcatcatttattgaaaagagg  SEQ ID 11：1749-1771  BglII  HAMJ 278  26  ttatttcttccatatggacttgacagaagagcaaattaag  SEQ ID 1：1414-1437  NdeI  HAMJ 279  27  cgccaagcttcgctatgaaatcagataaattc  SEQ ID 1：3117-3096  HindIII  HAMJ 280  28  cgccaagcttttccacaatataagtcgattgatt  SEQ ID 1：2400-2377  HindIII  HAMJ 281  29  ttatttcttccatatggaagtacctatcttggaaaaagaa  SEQ ID 1：2398-2421  NdeI  HAMJ 300  30  ttatttcttccatatggtgcctatgcactaaaccagc  SEQ ID 1：62-82  NdeI  HAMJ 313  31  ataagaatgcggccgcttccacaatataagtcgattgatt  SEQ ID 1：2400-2377  NotI  OCRR 487  32  cagtagatctgtgcttatgaactaggtttgc  SEQ ID 3：58-79  BglII  OCRR 488  33  gatcaagcttgctgctacctttacttactctc  SEQ ID 12：2577-2556  HindIII  HAMJ 171  34  ctgagatatccgttatcgttcaaacc  SEQ ID 3：1060-1075  EcoRV  HAMJ 251  35  ctgcaagcttttaaaggggaataatacg  SEQ ID 3：1059-1045  HindIII  HAMJ 264  36  cagtagatctgcagaagccttcctatctg  SEQ ID 3：682-700  BglII  HAMJ 282  37  tcgccaagcttcgttatcgttcaaaccattggg  SEQ ID 3：1060-1081  HindIII
  HAMJ 283  38  ataagaatgcggccgccttactctcctttaataaagceaat  agtt  SEQ ID 3：2520-2492  NdeI  HAMJ 284  39  catgccatggacattgatagtctcttgaaacagc  SEQ ID 3：856-880  NcoI HAMJ 285  40  cgccaagcttcttactctcctttaataaagccaatag  SEQ ID 3：2520-2494  HindIII  HAMJ 286  41  cgacaagcttaacatggtcgctagcgttacc  SEQ ID 3：2139-2119  HindIII  HAMJ 287  42  cataccatgggcctttatgaggcacctaag  SEQ ID 3：2014-2034  NcoI  HAMJ 288  43  cgacaagcttaagtaaatcttcagcctctctcag  SEQ ID 3：2376-2353  HindIII  HAMJ 289  44  gataccatggctagcgaccatgttcaaagaa  SEQ ID 3：2125-2146  NcoI  HAMJ 290  45  cgccaagcttatcatccactaacttgactttatcac  SEQ ID 3：1533-1508  HindIII  HAMJ 291  46  cataccatggatattcttgccttcttagctccg  SEQ ID 3：1531-1554   NcoI  HAMJ 301  47  catgccatggtgcttatgaactaggtttgc  SEQ ID 3：59-79  NcoI  HAMJ 302  48  cgccaagctttagcgttaccaaaaccattatc  SEQ ID 3：2128-2107  HindIII  HAMJ 160  49  gtattagatctgttcctatgaacttggtcgtcacca  SEQ ID 13：172-196  BglII  HAMJ 186  50  cgCCtctagactactgtataggagccgg  SEQ ID 13：2460-2443  XbaI  HAMJ 292  51  catgccatggaaaacatttcaagccttttacgtg  SEQ ID 11：754-778  NcoI HAMJ 293  52  cgacaagcttctgtataggagccggttgactttc  SEQ ID 11：2457-2434  HindIII  HAMJ 294  53  catgCCatggttcgtaaaaataaggcagaccaag  SEQ ID 11：2038-2062  NcoI  HAMJ 297  54  catgccatggaagcctattggaatgggaag  SEQ ID 11：622-642  NcoI
表3  从肺炎链球菌SP64产生的截短的BVH-3和BVH-1l基因产物
    PCR-引物对    蛋白质名称    鉴定(编码的氨基酸)    SEQ.ID.N0.    克隆载体    OCRR479-OCRR480    BVH-3M    BVH-3 w/o ss(21-1039)    55    pSL301  OCRR479-OCRR497    BVH-3AD    BVH-3 N’端w/o ss(21-509)    56    pSL301    HAMJ248-HAMJ249    L-BVH-3AD    BVH-3 N’端(1-509)    57    pET-21(+)    OCRR498-OCRR499    BVH-3B    BVH-3C’端(512-1039)    10    pSL301    OCRR479-HAMJ172    BVH-3C    BVH-3 N’端 w/o ss(21-225)    59    pET-32 c(+)  OCRR487-OCRR488    BVH-11M    BVH-11 w/o ss(20-840)    60    pCMV-GH  HAMJ251-OCRR487    BVH-11A    BVH-11 N’端w/o ss(20-353)    61    pET-32 c(+)    HAMJ171-OCRR488    BVH-1lB    BVH-11C’端(354-840)    62    pET-32 a(+)    HAMJ264-OCRR488    BVH-11C    BVH-11C’端(228-840)    63    pET-32a(+)    HAMJ278-HAMJ279    NEW1    BVH-3C’端(472-1039)    64    pET-21b(+)    HAMJ278-HAMJ280    NEW2    BVH-3C’端(472-800)    65    pET-21b(+)    HAMJ281-HAMJ279    NEW3    BVH-3C’端(800-1039)    66    pET-21b(+)    HAMJ284-HAMJ285    NEW4    BVH-11C’端(286-840)    67    pET-2ld(+)    HAMJ284-HAMJ286    NEW5    BVH-11中间(286-713)    68    pET-21d(+)
    HAMJ287-HAMJ288    NEW6    BVH-11中间(672-792)    69    pET-21d(+)    HAMJ285-HAMJ289    NEW7    BVH-11中间(709-840)    70    pET-21d(+)    HAMJ284-HAMJ290    NEW8    BVH-11中间(286-511)    71    pET-21d(+)    HAMJ286-HAMJ291    NEW9    BVH-11中间(511-713)    72    pET-21d(+)    HAMJ160-HAMJ186    BVH-11-2M    BVH-11-2 w/o ss(20-838)    73    pSL301   HAMJ292-HAMJ293    NEW10    BVH-11-2C’端(271-838)    74    pET-21d(+)    HAMJ293-HAMJ294    NEW11    BVH-11-2C’端(699-838)    75    pET-21d(+)    HAMJ282-HAMJ283    BVH-11B    BVH-11C’端(354-840)    62    pET-21b(+)    HAMJ286-HAMJ297    NEW14    BVH-11-2中间(227-699)    77    pET-21d(+)    HAMJ3 00-HAMJ313    NEW15    BVH-3 N’端 w/o ss(21-800)    78    pET-21b(+)    HAMJ301-HAMJ302    NEW16    BVH-11N’端 w/o ss(20-709)    79    pET-21d(+)
实施例9
本实施例叙述单克隆抗体的分离，并利用该抗体找出BVH-3、BVH-11与BVH-11-2蛋白质抗原表位的特征。
在雌性BALB/c老鼠(Charels River)中，通过皮下注射SP64肺炎链球菌BVH-3、BVH-11与BVH-11-2基因的产物与15μg奎尔A佐剂(Cedarlane Laboratories Ltd，Hornby，Canada)而进行免疫。在第一组老鼠(融合实验1)，于第1与第14天用25μg亲和纯化的硫氧还蛋白-His·Tag-BVH-3M融合蛋白进行免疫；在第二组老鼠(融合实验2)则以3的间隔用亲和纯化的25μg，硫氧还蛋白-His·Tag-BVH-llM进行三次免疫。第三组老鼠(融合实验3)则在第1和5第15天用亲和纯化的硫氧还蛋白-His·Tag-BVH-11-2M融合蛋白进行免疫。第四组老鼠(融合实验4)在第1天以25μg亲和纯化的硫氧还蛋白-His·BVH-11B融合蛋白进行免疫，并在第16与第37天用磷酸盐缓冲溶液中的重组BVH-11B做静脉注射进行加强免疫；在融合前3至4天，将25μg悬浮于磷酸盐缓冲溶液的抗原，分别静脉注射至老鼠中。如先前J.Hame1等(J.Med.Microbi01.，23，pp 163-170[1987])所述，将脾脏细胞与不分泌的SP2/0骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。同时也根据Hame1(同上)等所述，以酶联免疫吸附法对杂交瘤的培养上清液做初步的筛选，该筛选采用以制备的纯化重组蛋白与热杀死的肺炎链球菌悬浮液包被的平板。经酶联免疫吸附法所筛选出对不同抗原有反应的阳性杂交瘤，再利用限制稀释法进行克隆，加以培养，而后将之冷冻保存。
利用酶联免疫吸附法与Western印迹法检验杂交瘤对抗BVH-3与BVH-11基因产物的状况，以确定由单克隆抗体所辨识的抗原表位特征。结果发现有6个单克隆抗体能辨识BVH-3与BVH-11所共有的抗原表位(H3-1-F9、H3-1-D4、H3-1-H12、H11-1-E7、H11-1-H10与H11-1.1-G11)，此些单克隆抗体对该2个蛋白质皆有反应(表4)。
SP64肺炎链球菌的BvH-11与BVH-11-2分子由单克隆抗体(3A1、13C11、10H10、1D8、10G9、10A2、3E8、10D7、2H7与6H7)确定的共有的抗原表位，并不出现在BVH-3上，而此些单克隆抗体对BVH-11与BVH-11-2重组蛋白皆能反应(表5)。
表4
BvH-3免疫反应性单克隆抗体与一系列BVH-3与BVH-11基因产物的
反应状况
    单克隆    抗体    a.与下列物质的免疫反应性    BVH-3M    21-1039    BVH-3A    21.509    BVH.3B    512.1039    BVH-3C    21-225    NEW2    472-800    NEW3    800.1039    BVH-11M    20.840    H3-1-F9    +    +    -    +    -    -    +    H3-1-D4    +    +    -    +    -    -    +    H3-1-H12    +    +    -    +    -    -    +    H3-2-G2    +    +    -    -    -    -    -    H3-3-A1    +    +    -    -    -    -    -    H3-4-D3    +    -    +    -    -    +    -    H11-1-E7    +    +    -    +    -    -    +    H11-1-H10    +    +    -    +    -    -    +    H11-1.1-G11    +    +    -    +    +    -    +
表5
对抗SP64肺炎链球菌BVH-11-2蛋白所生成的单克隆抗体与一系列
BVH-11基因产物的反应状况
单克隆抗体°b.与下列物质的免疫反应性c.BVH-11产物d.BVH-11-2产物BVH.11M20.840NEW8286-511NEW9511.713BVH-11B354-840BVH-11-220.838NEW10271-838NEW1l699.838NEW14227-6993A1+++++-+13C11++++++-+10H10++++++-+1D8++-+++-+10G9+--+++-+10A2+--+++-+3E8+--+++-+10D7+--+++-+2H7+---+---6H7+---+---3A4----+++-14H6----+++-7G2----++-+13H10----+--+7E8----+---7H6----+---
a表中所列的单克隆抗体并不与BVH-3重组分子反应。
从单克隆抗体(表4与表5)免疫反应研究所获的结果与各个基因所对应的蛋白质序列相吻合。事实上与BVH-3及BVH-11分子交互反应的单克隆抗体，能辨别对应于保守区域的BVH-3C蛋白质；对BVH-11与BVH-11-2特异的单克隆抗体，则能与这些分子上不同部分的抗原表位反应。从与单克隆抗体的反应情况即可分辨BVH-3与BVH-11以及BVH-11与BVH-11-2。
实施例10
本实施例说明在肺炎链球菌中同时表达BVH-3与BVH-11基因。
利用Western印迹法可以检测BVH-3与BVH-11基因是否在肺炎链球菌中表达。在37℃，5％二氧化碳下，将SP63与SP64肺炎链球菌株，过夜培养于巧克力琼脂平板上，再将细菌悬浮于磷酸盐缓冲溶液中后，于56℃下作用20分钟，以热杀死菌体。为了制备抗原，以含有SDS与2-疏基乙醇的样本缓冲液处理悬浮的肺炎链球菌株，于100℃下反应5分钟。根据Laemmli[Nature,227，pp.680-685(1970)的方法，利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将肺炎链球菌蛋白抗原分离解析。电泳之后再根据Towbin[Proc.Nat1.Acad.Sci.USA，76，pp.4350-4354(1979)]的方法将蛋白质以电泳的方式转渍至硝酸纤维素纸上，再以老鼠抗血清与单克隆抗体探测。利用间接的酶联免疫分析法，亦即利用缀合的抗鼠免疫球蛋白与显色基质来检测与抗体反应的抗原。当以对抗重组BVH-3所生成的抗血清与SP64肺炎链球菌抗原试验后，产生了二个大约127kDa与99kDa表观分子量的反应带。再以H3-1-F9、H3-1-D4、H3-1-H12、H11-1-E7、H11-1-H10与H11-1.1-G11等单克隆抗体分别当作免疫探针测试后，带亦同样出现在相当分子量的位置。相反的是，对BVH-3分子特异的单克隆抗体只检测127kDa的带，而对BVH-11分子特异的单克隆抗体只检测99kDa的带，因此证实了127kDa与99kDa的带分别为BVH-3与BVH-11。这些研究证明了BVH-3与BVH-11蛋白质同时出现在肺炎链球菌中；此外，这些结果也支持我们先前所观察的，亦即BVH-3与BVH-11拥有其两个蛋白质所共同的抗原表位以及其他蛋白质所没有的抗原表位。
在SP64肺炎链球菌中成熟的BVH-3、BVH-11与BVH-11-2蛋白质分别有1019、821与419个氨基酸，其预估的分子量为112.5kDa、92.4kDa与91.7kDa。虽然从序列所估算的分子量与在SDS-PAGE上所计算的分子量有出入，BVH-3仍然能以其较大的分子量与BVH-11做区别。此外，SP63肺炎链球菌的BVH-3分子在SDS-PAGE上表观分子量为112kDa，有别于SP64菌株的BVH-3的127kDa分子量。这些数据亦支持SP63肺炎链球菌株的BVH-3有着177个氨基酸残基的缺失。
实施例11
本实施例描述接种BVH-3或BVH-11基因重组产物对受感染老鼠所给予的保护。
在一组7或8只雌性BALB/c老鼠(Charels River)中，以亲和纯化的硫氧还蛋白-His·Tag-BVH-3M融合蛋白或是亲和法纯化的硫氧还蛋白-Hix·Tag-BVH-11M融合蛋白或在对照组中以磷酸盐缓冲溶液中的奎尔A佐剂做皮下免疫注射，每3周注射一次，共三次；在第三次免疫注射后的第12至14天，再以WU2肺炎链球菌珠做静脉内攻击反应或是以P4241菌株做鼻内攻击。将用于攻击反应的肺炎链球菌接种在巧克力琼脂平板上，以确定CFU与攻击剂量，攻击剂量约为106CFU。在攻击后的14天内和第14天记录死亡率，并将存活的老鼠牺牲采血，检验是否有肺炎链球菌的存在。存活记录如表6与表7所示。
表6
BVH-3M与BVH-11M重组蛋白在感染致命性WU2肺炎链球菌下所提供的保护状况
    实验    免疫原    存活：死亡a    平均存活天数    1    BVH-3M    无    8∶0    0∶8    >14    1    2    BVH-11M    无    8∶0    0∶8    >14    1
a在攻击后第14天时存活老鼠数目：死亡的老鼠数目。
表7
BVH-3M与BVH-11M重组蛋白在感染致命性P4241肺炎链球菌下所提供的保护状况
    实验    免疫原    存活：死亡d    平均死亡天数    1    BVH-3M    无    6∶1    1∶7    >14    4.5    2    BVH-3M    BVH-11M    无    8∶0    8∶0    0∶8    >14    >14    4
d在攻击后第14天时存活老鼠数目：死亡的老鼠数目。
以BVH-3M或BVH-llM蛋白质免疫的老鼠在WU2感染后，全部存活；但是在对照组只用佐剂的老鼠却无一存活。以BVH-3M或BVH-11M蛋白质免疫的老鼠在P4214感染后，除有一只外全部存活；但是在只注射佐剂的对照组老鼠却只有一只存活。在攻击后第14天，所有存活老鼠的细菌血液培养皆为阴性。这些结果清楚地显示，BVH-3M与BVH-11M在老鼠中诱发了保护性的抗肺炎链球菌的免疫反应。而这些蛋白质在所分离出肺炎链球菌中具有相当高保守性的事实，更强调了以BVH-3与BVH-11当作普遍疫苗候选者的潜在能力。事实上，第6血清型的SP64肺炎链球菌的BVH-3与BVH-11蛋白质能针对不同荚膜血清类型的感染诱发保护作用。
在理想情况下，一个能够对抗肺炎链球菌疾病并产生保护作用的疫苗，通常也能对抗脑膜炎、中耳炎、细菌血症与败血症。BVH-3与BVH-11对于致命的系统性与肺炎性感染模式能够产生保护作用。因此认为，在人类中基于BVH-3与BVH-11蛋白质的疫苗，应能减低所有肺炎链球菌所引起的广泛一系列疾病的发生率。
表6与表7的数据，清楚地说明了BVH-3与BVH-11皆为肺炎链球菌中有关诱发保护作用的分子。但是目前仍不知道，不为BVH-3与BVH-11所共有的特异序列是否亦能调节保护作用。在一组雌性BALB/c老鼠(Charels River)中，皮下免疫注射亲和纯化的硫氧还蛋白-His·Tag-BVH-3AD、-BVH-3B或-BVH-3C融合蛋白与15μg奎尔A佐剂(Cedarlane Laboratories Ltd，Hornby，Canada)，每3周注射一次，共三次。对照组老鼠则只用磷酸缓冲溶液中的奎尔A佐剂或存于佐剂中的硫氧还蛋白-His·Tag或硫氧还蛋白-His·Tag-融合蛋白(His-thio)进行免疫。
为确知NEW4、NEW5、NEW6、NEW7、NEW8、NEW9、NEW10、NEW11、NEW14与BVH-11B等截短蛋白质的保护能力，在一组雌性BALB/c老鼠(Charels River)中，皮下免疫注射25此亲和纯化的硫氧还蛋白-His·Tag-融合蛋白与15μg奎尔A佐剂，每3周注射一次，共2次；在最后一次免疫后的第10至14天，再以致命的肺炎链球菌对老鼠进行攻击反应。我们的结果指出，由BVH-3分子第512至1039氨基酸组成的BVH-3B截短蛋白，能引发对抗使老鼠致命的WU2与P4241菌株的保护作用。同样地，分别含有BVH-11分子第354至840、286至840与286至713氨基酸的BVH-11b、NEW4与NEW5截短蛋白，对于用WU2进行静脉内攻击和用P4241菌株进行鼻内攻击，皆能引发保护作用。此外，以BVH-11-2分子第272至838与227至699位氨基酸组成的NEW10与NEW14免疫，亦能对抗肺炎链球菌株所造成的死亡。这些结果显示，分别在SP64肺炎链球菌BVH-11与BVH-11-2蛋白序上的第286至713与272至699这428个氨基酸的区域，含有具保护性的抗原表位；13个BVH-11蛋白序列中的这个区域，同一性为91％，同源性为94％。
表8
以BVH-3与BVH-11基因产物接种老鼠后所引发保护作用效果的评估
  以WU2攻击  以P4241攻击  实验  免疫原  存活:死亡a  平均存活天数  存活:死亡  平均存活天数  1b    无  NEW4  NEW5  NEW7  BVH.11M  0∶8  8∶0  8∶0  0∶8  8∶0  1.5  >14  >14  2  >14  1∶7  8∶0  8∶0  0∶8  8∶0  4.5  >14  >14  5  >14  2b  无  NEW5  NEW8  NEW9  BVH-11M  0∶8  8∶0  0∶8  3∶5  8∶0  1  >14  1.5  3.5  >14  0∶8  8∶0  0∶8  2∶6  8∶0  4  >14  5.5  7  >14  3b  无  NEW6  NEW10  NEW11  BVH-11M  0∶8  0∶8  8∶0  0∶8  8∶0  1  1  >14  1.5  >14  0∶8  4∶4  8∶0  1∶7  8∶0  4  10.5c  >14  6  >14  4b  无  BVH-11B  NEW14  0∶8  7∶1  8∶0  2  >14  >14  0∶8  8∶0  8∶0  4  >14  >14  5  His-Thio  BVH.3AD  BVH.3B  0∶8  1∶7  5∶3  2  2.5  >14  6  His-Thio  BVH-3C  0∶8  0∶8  1  1
a攻击反应后第14天时，老鼠存活数目：死亡数目。
b以WU2攻击的剂量为105CFU。
c活过14天的老鼠以存活14天计算以确定平均值。
实施例12
本实施例描述编码嵌合型多肽基因的克隆与表达。所述多肽乃BVH-3羧基末端区域融合至BVH-11羧基末端的C’端所形成的多肽，用嵌合型多肽免疫接种后，可观察到额外的保护作用。
从上述的研究可以清楚知道，BVH-3与BVH-11乃同时出现在肺炎链球菌上但血清学上有区别的分子。老鼠的免疫研究结果表明，此2个蛋白质皆为不错的疫苗候选者。这些蛋白质对肺炎链球菌，不管其为任何类型，皆能提供对抗其的保护作用；即使这两个蛋白质有共同的抗原表位与序列，它们有着不同的特性，也可能起着不同的生物功能。因此，免疫接种此2个蛋白质，将比分别进行单一免疫提供一较高的保护作用。可以探究几种方法以证实此论点，即将全长或截短的BVH-3与BVH-11以组合或结合的方式施用。于此我们将描述称做NEW12(分别为SEQ ID NO：76与58)的BVH-3-BVH-ll融合基因与蛋白质的遗传工程，以及将NEW12蛋白当作疫苗的可能性。
分别以设计的寡核苷酸对，利用PCR扩增分别横跨SP64肺炎链球菌BVH-3与BVH-11基因3’端第1414至3117(SEQ ID NO：1)与第1060至2520位核苷酸(SEQ ID NO：3)的BVH-3和BVH.11基因片段；所使用的HAMJ278与HAMJ279以及HAMJ282与HAMJ283引物对，其在5’端有一限制内切酶的切位，使得PCR扩增的基因产物得以符合读框方式克隆至经消化的pET21b(+)质粒载体上(表2)。以限制酶将PCR扩增产物切过后，与受同样限制酶作用的直链化pET21b(+)质粒相粘接，再以测序来确认所建构的质粒。将含有Nde I-Hind IIIBVH-3 PCR产物的pET216(+)重组质粒用限制酶Hind III与Not I酶作用直链化后，使其能以符合读框方式克隆pET21b(+)重组载体上含有BVH-11基因的Hind III-Not I DNA片段。在未引入BL21(λDE3)大肠杆菌以表达嵌合型肺炎链球菌蛋白质前，先将所得克隆稳定培养于DH5α大肠杆菌中。这个称做NEW12的嵌合型重组多肽，表达为在C端融合了His-tag。将异丙基-β-d-硫吡喃半乳糖苷诱导大肠杆菌的培养液超声波震荡破碎后，将其离心所得的上清液的部分利用结合His的组织胺金属螯合树脂(QIAgen，Chatsworth，CA)纯化所表达的NEW12重组蛋白。
根据上述相同的步骤，其有可能同时表达NEW1与NEW4、NEW1与NEW5、NEW1与NEW10或NEW1与NEW14以建构其他的嵌合型多肽；亦可利用NEW1的上游部分或NEW4、NEW5、NEW10、BVH-11b或NEW14的下游部分来建构。也有可能同时表达2个以上的BVH-3、BVH-11或BVH-11-2基因的片段以建构其他的嵌合型多肽。
在一组8只的雌性BALB/c老鼠(Charels River)中，皮下免疫注射25μg亲和纯化的His·Tag-NEW1、-BVH-11b或-NEW12融合蛋白与15μg奎尔A佐剂，每3周注射一次，共2次。在最后一次免疫后的第10至14天，再以致命的肺炎链球菌对老鼠进行攻击。如前所述，分别含有BVH-3蛋白的第472至1039氨基酸与BVH-11蛋白的第354至840氨基酸的NEW1与BVH-11B分子，即为蛋白质上皆能引发保护性免疫反应的部分。为确认嵌合型多肽是否能够如其各自多肽那样有效地促进保护作用，攻击反应剂量将加以调整，使NEW1与BVH-11B分子不产生预期的保护作用。有趣的是，NEW12嵌合型蛋白能够引发保护作用对抗使老鼠致命的WU2与P4241。当以NEW12免疫时，8只老鼠中有7只在攻击后10天仍能存活，但是以NEW1、BVH-11b与BVH-3M或只有佐剂免疫时，32只老鼠中有28只在攻击后5天死亡。因此，以NEW12免疫接种的老鼠，能够对WU2的攻击反应提供一较高的保护。这些结果显示，以嵌合型多肽或可能是BVH-3与BVH-11基因产物的组合来免疫，将比单独施予BVH-3或BVH-11抗原，更能够提供一额外的保护。
表9
以NEW12嵌合型分子接种老鼠所引发保护作用效果的评估
以WU2攻击以P4241攻击免疫原存活：死亡a平均存活天数存活：死亡平均存活天数无NEW1BVH.11bNEW12BVH-3M0∶82∶61∶76∶21∶7123.5>1430∶81∶78∶07∶18∶058>14>14>14
实施例13
本实施例说明肺炎链球菌以外的链球菌种间与BVH-3与BVH-11相关序列的鉴定。
如先前所示，BVH-3、BVH-11与BVH-11-2间为相关蛋白的同一家族且拥有共同序列的蛋白质，从这些基因的保守区域的核苷酸序列做同源性搜寻，同时以FASTA软件比对GenBank与EMBL中的序列。其中同源性最高者为称做B群链球菌或GBS的无乳链球菌属中一段长为2.469kb的基因，其能编码一92kDa但未知其功能的蛋白质(SEQ IDNO：81)；此基因被称为BVH-71。在一称做A群链球菌或GAS的化脓链球菌属中，亦鉴定出其与GBS有99.2％的同一性与99.5％的相似性的蛋白(SEQ ID NO：83)。BVH-71基因(SEQ ID NO：80与82)5’端的第1至71 7核苷酸，与BVH-3(第1至675核苷酸)以及BVH-11(第1至684核苷酸)基因保守区域同一性分别为58％与60％。GBS和GAS BVH-71开放读码框翻译序列的头239个氨基酸与BVH-3与BVH-11的头225与228氨基酸，其同一性分别为51％与54％。除了结构上的相似性外，BVH-3、BVH-11与BVH-71等链球菌蛋白质也拥有共同的抗原表位。在以GAS或GBS完整细胞的Western印迹法中，利用H11-1.1-G11单克隆抗体对BVH-3与BVH-11保守区域反应，其在97kDa处出现条带。同样地，在Western印迹分析法中也检测到GAS与GBS的BVH-71重组蛋白。
这些结果显示，BVH-71、BVH-3与BVH-11蛋白质问可能拥有相似的功能，我们的结果也认为BVH-71蛋白质可用来当作抗链球菌的蛋白质疫苗成分。在另一具体实施方案中，BVH-71蛋白质可用来当作抗GAS或抗GBS的蛋白质疫苗成分。