说明书包含活性化合物的颗粒的稳定化
发明领域
本发明涉及包括含酶混合物的颗粒，其中所述混合物添加到颗粒形成过程中时具有大于7的pH。本发明还涉及用于制造这种颗粒的方法。
发明背景
本领域中已知通过将活性化合物掺入干燥的固体粒子(particles)或颗粒(granules)中，借以保护活性化合物免于失活，和/或保护环境免于活性化合物的影响。本领域中还已知通过将稳定剂掺入到含有活性化合物的微粒中，借以保护活性化合物免于由环境中的攻击性物质导致的失活。
EP 206,417公开了包含酶核心和碱性缓冲盐包覆层的酶颗粒组合物。
日本待审查专利申请(kokai)No.62-79298公开了防止含酶颗粒状产品的酶活性降低的措施，在其描述的酶组合物中，含酶的核心部分用含有pH7-11的碱性缓冲盐的保护层包覆。
EP 415652和EP 290223公开了含有被包覆的酶的漂白组合物，其中该包覆层可包含pH在11以上的碱性化合物，例如硅酸钠。
发明概述
本发明的一个目的是提供储存稳定性增加的含酶颗粒。
一个令人惊奇的发现是，通过将添加到颗粒形成过程中的酶混合物的pH调节到大于7，有可能提高含酶颗粒的储存稳定性。
因此，本发明在第一个方面提供了用于制备酶颗粒的方法，其包括如下步骤：
a)制备包含酶的水成液，其中该水成液的pH大于7；
b)将步骤a)的水成液添加到制粒设备；
c)在制粒设备中制备粒子。
本发明还涉及可通过上述处理获得的颗粒及所述颗粒的用途。
发明详述
定义
本发明中的术语“％RH”应理解为空气的相对湿度。100％RH是在固定温度下被水气饱和的空气，因此％RH反映了空气的百分比湿气饱和度(percent moisture saturation)。
术语化合物或物质的“恒定湿度”(constant humidity)(在本发明的内容中有时缩写为CH)可以理解为在具有给定温度的密闭空间内，与和所述化合物的固相接触的所述化合物的饱和水溶液平衡的大气的％RH。这个定义与《化学和物理学手册》(“Handbook of chemistry and physics”，CRC Press，Inc.，Cleveland，USA，58th edition，p E46，1977-1978)一致。因此某化合物的CH20℃＝50％的意思是，在20℃条件下，50％湿度的空气与该化合物的饱和水溶液平衡。因此，术语“恒定湿度”是化合物吸湿性质的度量标准。
本发明中，术语含酶混合物的“pH”可以理解为将水性含酶混合物添加到制粒过程/制粒设备之前，在室温测得的该含酶混合物的pH。
本发明中术语“含酶混合物”(enzyme comprising mixture)与术语“水性含酶混合物”(aqueous enzyme comprising mixture)覆盖相同的范围，应理解为包含酶的水成液。所述混合物除了酶之外，还可以包含其他的组分。
本发明内容中的“酶基质”(enzyme matrix)理解为颗粒中包含酶的基质。与“含酶混合物”的区别是，“酶基质”是“含酶混合物”存在于制成的颗粒，即制备酶颗粒之后获得的颗粒中时的干燥形式。
本发明内容中使用的术语“酶浓缩液”(enzyme concentrate)应理解为经过处理提高了酶浓度的发酵滤出液。
引言
颗粒中包含的酶的稳定性在储存时受到周围环境，即可降低稳定性的化学或物理因素的影响。特别地，湿度是对含酶颗粒的稳定性而言的重要因素；尤其是高湿度会对稳定性造成负面影响。
通常，将酶制粒中使用的酶浓缩液的pH调节到小于6，因为公认在略微酸性的环境中可以改善微生物稳定性。
我们惊奇地发现，通过提高在酶颗粒配制过程中使用的含酶水成液的pH可以显著提高含酶颗粒的储存稳定性。发现提高pH不会对酶造成危害。由于提高含酶液体在酶颗粒形成期间的pH，储存之后颗粒的残余酶活性显著提高。
我们进一步发现，通过添加附加的湿气屏障(moisture barrier)，例如盐包覆层(salt coating)，我们更进一步地提高了储存稳定性，并获得了更高的残余酶活性。这种显著的改善在更高的相对湿度下也可以见到。
本发明的颗粒
本发明涉及包含核心和包覆层的颗粒，其中所述核心含有酶，该酶以含酶的水性混合物的形式添加到颗粒形成过程中，并且其中所述混合物的pH大于7。
本发明的颗粒含有由水性含酶混合物制备的酶基质，该水性含酶混合物包括酶和任选的其他制粒材料。该颗粒还可包含至少一种包覆层，尤其是盐包覆层。酶基质存在于颗粒的核心，其或者被施加到无活性的核心微粒上或者本身作为核心。在本发明的一个特定的实施方案中，酶层被施加于无活性核心。
本发明的颗粒与用已知的pH小于7，例如小于6的水性含酶混合物制备的颗粒相比，储存稳定性得到改善。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明涉及包含核心和包覆层的颗粒，其中所述核心包含酶，该酶以含酶水性混合物的形式添加到制粒过程中，其中所述含酶混合物的pH大于7，并且，与用pH小于7的含酶水性混合物制备的颗粒相比，该颗粒储存时的酶稳定性得到改善。在更具体的实施方案中，本发明涉及含有核心和包覆层的颗粒，其中所述核心包含在制粒过程中以含酶水性混合物的形式添加的酶。
本发明的颗粒储存时的残余酶活性得到提高：在密封罐内于40℃储存13周后，测得超过5％，例如超过10％，甚至超过20％的增加。在具体的实施方案中，在密封罐内40℃条件下储存13周后的颗粒的残余酶稳定性增加了超过50％。
在本发明进一步的实施方案中，在密封罐内于40℃储存13周后，含酶核心粒子的残余酶活性为至少5％，例如至少10％，至少15％，至少20％，甚至至少30％。
在本发明的具体实施方案中，在密封罐内于40℃储存13周后，本发明颗粒的残余酶活性为至少50％，例如至少60％，至少70％，至少80％，甚至至少90％。
含酶混合物
含酶混合物、含酶液体包含在液体，例如水中的酶和任选的其它制粒材料。
在本发明特殊的实施方案中，含酶混合物是酶浓缩液。在本发明另一个实施方案中，含酶混合物是与其它制粒材料混合的酶浓缩液。
含酶混合物在制粒过程之前被调节到pH大于7，例如大于8，甚至大于9，例如大于10。在本发明具体的实施方案中，含酶混合物的pH为7-13。在本发明更加具体的实施方案中，含酶混合物的pH为8-12。在本发明更加具体的实施方案中，含酶混合物的pH为9-12。在本发明更加具体的实施方案中，含酶混合物的pH为9-11。在本发明最具体的实施方案中，含酶混合物的pH为10-11。在本发明一个具体的实施方案中，含酶混合物的pH小于12，例如小于11。
含酶混合物的碱性pH可以通过向混合物中添加碱性化合物例如氢氧化钠而获得。
除了酶之外，含酶混合物可以用为混合物材料提供期望的功能性质的任何方法或者任何材料构建，例如该混合物可以由这样的材料构成，其允许酶在被导入水性介质时容易地释放。在一个优选实施方案中，核心粒子由无活性核心构建而成，其中含酶混合物吸收(absorb)到和/或被施加到该无活性核心表面上。
另一个具体的实施方案中，如所谓的T颗粒中那样制备核心，其中混合酶和制粒材料形成包含酶的颗粒，其中酶遍布于核心中，如在US4,106,991中描述的，例如实施例1。任何常规的方法和非酶材料都可以用于制备核心。已知的常规核心和材料的实例典型地在下列文献中说明：US4,106,991，EP 170360，EP 304332，EP 304331，EP 458849，EP 458845，WO97/39116，WO 92/12645，WO 89/08695，WO 89/08694，WO 87/07292，WO91/06638，WO 92/13030，WO 93/07260，WO 93/07263，WO 96/38527，WO96/16151，WO 97/23606，US 5,324,649，US 4,689,297，EP 206417，EP 193829，DE 4344215，DE 4322229 A，DD 263790，JP 61162185 A，JP 58179492。
碱性化合物
任何在添加到含酶混合物中时可提供大于7的pH的化合物都可以用于调节含酶混合物的pH。合适的化合物可以是碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾或碱性缓冲盐。
合适的缓冲盐可以是碳酸氢钾、碳酸钾、焦磷酸四钾、三聚磷酸钾、碳酸氢钠和碳酸钠。也可以使用其他合适的盐。
酶
本发明内容中的酶可以是任何酶或不同酶的组合。因此，当指称“酶”时，一般可以理解为包含一种酶或多种酶的组合。
应当理解，术语“酶”的含义也包括酶的变体(例如通过重组技术生产的)。所述酶变体的实例在如下文献中有公开，例如EP 251,446(Genencor)，WO 91/00345(Novo Nordisk)，EP 525,610(Solvay)and WO 94/02618(Gist-Brocades NV)。
酶可以根据NC-IUBMB，1992的《酶命名法》(Enzyme Nomenclature)手册加以分类，另见互联网上ENZYME站点http：//www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是酶命名法相关信息的库。它主要是根据国际生物化学和分子生物学联合会(International Union of Biochemistry and Molecular Biology，IUB-MB)命名委员会的推荐(Academic Press，Inc.，1992)，并且它描述了各类具有EC(酶学委员会)编号的、已被定性的酶(Bairoch A.The ENZYMEdatabase，2000，Nucleic Acids Res 28：304-305)。IUB-MB酶命名法是基于其底物特异性，偶尔是基于其分子机制；这种分类不反映这些酶的结构特征。
数年前提出了另一种分类方法，即将某些糖基水解酶，例如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和α-半乳糖苷酶归类为基于氨基酸序列相似性的家族。它们目前分成90个不同的家族：见CAZy(ModO)互联网地址(Coutinho，P.M.& Henrissat，B.(1999)Carbohydrate-Active Enzymes server)，URL：http：//afmb.cnrs-mrs.fr/～cazy/CAZY/index.html(相应论文：Coutinho，P.M.& Henrissat，B.(1999)Carbohydrate-active enzymes：an integrated databaseapproach.该文收集于“Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering”；H.J.Gilbert，G.Davies，B.Henrissat and B.Svensson eds.，The Royal Society ofChemistry，Cambridge，pp.3-12；Coutinho，P.M.& Henrissat，B.(1999)Themodular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes：anintegrated database approach.该文收集于“Genetics，Biochemistry and Ecologyof Cellulose Degradation”.；K.Ohmiya，K.Hayashi，K.Sakka，Y.Kobayashi，S.Karita and T.Kimura eds.，Uni Publishers Co.，Tokyo，pp.15-23).
可以掺入本发明颗粒中的酶的类型包括氧化还原酶(EC 1.-.-.-)、转移酶(EC 2.-.-.-)、水解酶(EC 3.-.-.-)、裂合酶(EC 4.-.-.-)、异构酶(EC 5.-.-.-)和连接酶(EC 6.-.-.-)。
已发现，本发明特别适用于氧化还原酶。
本发明中优选的氧化还原酶是过氧化物酶(EC 1.11.1)、漆酶(EC 1.10.3.2)和葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)。商业上可获得的氧化还原酶(EC 1.-.-.-)实例有GluzymeTM(可从Novozymes A/S获得的酶)。其他的氧化还原酶可以从其他供应者获得。优选的转移酶是归于任一如下亚类中的转移酶：
a.转移一碳基团的转移酶(EC 2.1)；
b.转移醛或酮残基的转移酶(EC 2.2)；酰基转移酶(EC 2.3)；
c.糖基转移酶(EC 2.4)；
d.转移除甲基之外的烷基或芳基的转移酶(EC 2.5)；和
e.转移含氮基团的转移酶(EC 2.6)。
本发明中一种最优选类型的转移酶是谷氨酰胺转移酶(蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶；EC 2.3.2.13)。
合适谷氨酰胺转移酶进一步的实例在WO 96/06931(Novo Nordisk A/S)中有说明。
本发明已被证实尤其可用于水解酶，例如植酸酶。
本发明内容中优选的水解酶是羧酸酯水解酶(EC 3.1.1.-)，例如脂肪酶(EC 3.1.1.3)；植酸酶(EC 3.1.3.-)，例如3-植酸酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC3.1.3.26)；糖苷酶(EC 3.2，其属于本文称作“糖酶”的类群)，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；肽酶(EC 3.4，也称作蛋白酶)；和其他羰基水解酶。商业可获得的植酸酶的实例包括Bio-FeedTM植酸酶(Novozymes)，RonozymeTM P(DSM Nutritional Products)，NatuphosTM(BASF)，FinaseTM(AB Enzymes)，和PhyzymeTM产品系列(Danisco)。其它合适的植酸酶包括在WO 98/28408，WO00/43503，和WO 03/066847中说明的植酸酶。
已经发现，本发明特别适用于糖酶，例如淀粉酶。
在本发明的内容中，术语“糖酶”不仅指能够降解碳水化合物链，特别是五元和六元环结构的碳水化合物链(例如淀粉或纤维素)的酶(也就是糖苷酶，EC 3.2)，还包括能够使碳水化合物异构化的酶，所述碳水化合物例如六元环结构如D-葡萄糖，和五元环结构，如D-果糖。
重要的糖酶包括如下(括号内是EC编号)：
α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)，葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)，内切-1，4-β-葡聚糖酶(纤维酶，EC 3.2.1.4)，内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)，内切-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)，葡聚糖酶(EC 3.2.1.11)，几丁质酶(EC 3.2.1.14)，多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)，溶菌酶(EC3.2.1.17)，β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)，淀粉-1，6-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.33)，木聚糖1，4-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)，葡聚糖内切-1，3-β-D-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.39)，α-糊精内切-1，6-α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.41)，蔗糖α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.48)，葡聚糖内切-1，3-α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.59)，葡聚糖1，4-β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.74)，葡聚糖内切-1，6-β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.75)，半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)，阿聚糖内切-1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.99)，乳糖酶(EC 3.2.1.108)，壳聚糖酶(EC 3.2.1.132)和木糖异构酶(EC 5.3.1.5)。
商业可获得的蛋白酶(肽酶)的实例包括KannaseTM，EverlaseTM，EsperaseTM，AlcalaseTM，NeutraseTM，DurazymTM，SavinaseTM，OvozymeTM，PyraseTM，Pancreatic Trypsin NOVO(PTN)，Bio-FeedTM Pro和Clear-LensTMPro(均可从Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark获得)。其他优选的蛋白酶包括在WO 01/58275和WO 01/58276中说明的蛋白酶。
其他商业可获得的蛋白酶包括Ronozyme TM Pro，MaxataseTM，MaxacalTM，MaxapemTM，OpticleanTM，PropeaseTM，PurafectTM and Purafect OxTM(可以从Genencor International Inc.，Gist-Brocades，BASF或DSM Nutritional Products获得)。
商业可获得的脂肪酶的实例包括LipexTM，LipoprimeTM，LipopanTM，LipolaseTM，LipolaseTM Ultra，LipozymeTM，PalataseTM，ResinaseTM，NovozymTM435和LecitaseTM(均可从Novozymes A/S获得)。
其他商业可获得的脂肪酶包括LumafastTM(来自Genencor InternationalInc.的门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)脂肪酶)；LipomaxTM(来自Gist-Brocades/Genencor Int.Inc.的产碱假单胞菌(Ps.pseudoalcaligenes)脂肪酶；和来自Solvay enzymes的一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)脂肪酶)。更多的脂肪酶可以从其他供应商获得。
商业上可获得的糖酶实例包括Alpha-GalTM，Bio-FeedTM Alpha，Bio-FeedTM Beta，Bio-FeedTM Plus，Bio-FeedTM Wheat，Bio-FeedTM Z，NovozymeTM 188，CarezymeTM，CelluclastTM，CellusoftTM，CelluzymeTM，CeremylTM，CitrozymTM，DenimaxTM，DezymeTM，DextrozymeTM，DuramylTM，EnergexTM，FinizymTM，FungamylTM，GamanaseTM，GlucanexTM，LactozymTM，LiquezymeTM，MaltogenaseTM，NatalaseTM，PentopanTM，PectinexTM，PromozymeTM，PulpzymeTM，NovamylTM，TermamylTM，AMGTM(Amyloglucosidase Novo)，MaltogenaseTM，SweetzymeTM和AquazymTM(均可从Novozymes A/S获得)。进一步的糖酶可以从其他供应商获得，例如RoxazymeTM和RonozymeTM产品系列(DSM Nutritional Products)，AvizymeTM，PorzymeTM和GrindazymeTM产品系列(Danisco，Finnfeeds)，和NatugrainTM(BASF)，PurastarTM和PurastarTM OxAm(Genencor)。
其他商业可获得的酶包括MannawayTM，PectawayTM，StainzymeTM和RenozymeTM。
已经证实，本发明特别适用于显示有漆酶活性的酶的配制。
显示漆酶活性的化合物可以是由国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会颁布的酶分类EC 1.10.3.2包含的任何漆酶，或者由其衍生的并显示有漆酶活性的任何片段，或者显示有类似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。
优选的显示漆酶活性的漆酶和/或化合物是源自微生物的酶。这些酶可以源自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。
合适真菌来源的实例包括源自于如下菌株的漆酶：曲霉属(Aspergillus)，脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)，柄孢壳属(Podospora)，葡萄孢属(Botrytis)，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属(Lentinus)，侧耳属(Pleurotus)，栓菌属(Trametes)，例如，T.villosa和T.versicolor，丝核菌属(Rhizoctonia)，例如，立枯丝核菌(R.solani)，鬼伞属(Coprinus)，例如，灰盖鬼伞(C.cinereus)，毛头鬼伞(C.comatus)，费赖斯鬼伞(C.friesii)，和褶纹鬼伞(C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)，例如，P.condelleana，斑褶菇属(Panaeolus)，例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus)，毁丝霉属(Myceliophthora)，例如，M.thermophila，柱顶孢属(Schytalidium)，例如，S.thermophilum，多孔菌属(Polyporus)，例如，P.pinsitus，射脉菌属(Phlebia)，例如，射脉菌(P.radita)(WO 92/01046)，或拟革盖菌属(Coriolus)，例如，C.hirsutus(JP 2-238885)。
合适的细菌来源的实例包括源自于芽孢杆菌菌株的漆酶。
在本发明的具体实施方案中，漆酶源自于鬼伞属，毁丝霉属，多孔菌属，柱顶孢属或丝核菌属。在更特殊的实施方案中，漆酶源自于灰盖鬼伞，Myceliophthora thermophila，Polyporus pinsitus，Scytalidium thermophilum或立枯丝核菌。
漆酶或与漆酶有关的酶还可以是通过如下方法产生的酶，该方法包括用重组DNA载体转化宿主细胞，该重组DNA载体携带有编码所述漆酶的DNA序列和编码允许编码漆酶的DNA序列表达的功能的DNA序列，在允许漆酶表达条件下在培养基中培养宿主细胞，和从培养物中回收漆酶。
在本发明特殊实施方案中，酶选自下组：源自于鬼伞属，毁丝霉属，多孔菌属，柱顶孢属和丝核菌属的漆酶。特别地，在WO 95/33836，WO96/00290，WO 95/33837和WO 95/07988中分别提到了源自于毁丝霉属，多孔菌属，柱顶孢属和丝核菌属的漆酶，本文引用它们的内容作为参考。
确定漆酶活性(LACU)
漆酶的活性(特别适用于多孔菌漆酶)可以由在有氧条件下丁香醛连氮的氧化加以确定。用光度计在530nm测量所产生的紫色。分析条件是19mM丁香醛连氮，23mM乙酸盐缓冲液，pH5.5，30℃，1min反应时间。
1漆酶单位(LACU)是在这些条件下每分钟催化1.0mmol丁香醛连氮的转化的酶量。
确定漆酶活性(LAMU)
漆酶的活性可以通过有氧条件下丁香醛连氮的氧化来确定。在530nm测量所产生的紫色。分析条件是19mM丁香醛连氮，23mM Tris/马来酸盐缓冲液，pH7.5，30℃，1min反应时间。
1漆酶单位(LAMU)是在这些条件下每分钟催化转化1.0mmol丁香醛连氮的酶量。
惰性核心(inert cores)
惰性核心与无活性核心相同，指在添加到本发明过程中时基本上没有酶的核心颗粒。惰性核心可以是载体核(carrier nuclei)、安慰剂核(placebonuclei)或上面可以形成含酶混合物层的种子(seed)。惰性核心可以包含无机盐、糖、糖醇、有机小分子如有机酸或盐、矿物质如黏土或硅酸盐、或上述各项中两个或多个的组合。
在颗粒制备期间，酶可以吸附到核心上面/内部。
在本发明具体的实施方案中，可以通过将含酶混合物施加到惰性核心上面来制备核心颗粒。
附加制粒材料
颗粒中可以掺入的附加制粒材料可以是粘合剂、多糖、合成聚合物、蜡、增强剂(enhancing agents)、填充物(fillers)、纤维材料、酶稳定剂、助溶剂(solubilising agent)、交联剂、悬浮剂、粘度调节剂、轻质球(lightspheres)、氯清除剂、增塑剂、色素、盐、润滑剂(例如表面活性剂或抗静电剂)和芳香剂(fragrances)。
附加制粒材料可以在将混合物添加到颗粒形成过程之前添加到含酶混合物中，或者可以将它们单独添加到过程中。
粘合剂(binders)
合适的粘合剂是具有高熔点或者根本没有熔点、且为非蜡状(non-waxy)性质的粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、糊精、聚乙烯醇、纤维素衍生物如羟丙基纤维素、甲基纤维素或CMC。合适的粘合剂是碳水化合物粘合剂，例如糊精如Glucidex 21D和Avedex W80。
多糖
本发明的多糖可以是未经修饰的天然存在的多糖或经过修饰的天然存在的多糖。
合适的多糖包括纤维素、果胶、糊精和淀粉。淀粉在水中可溶或不溶。
在本发明具体的实施方案中，多糖是淀粉。在本发明的具体实施方案中，多糖是不溶性淀粉。
从多种植物来源的天然存在的淀粉可适用于本发明(或者作为淀粉本身，或者作为修饰淀粉的出发点)，重要的淀粉包括来源于下列植物的淀粉：稻(rice)、玉米(com)、小麦(wheat)、马铃薯(potato)、燕麦(oat)、木薯(cassava)、西谷椰子属(sago palm)、yuca、大麦(barley)、甘薯(sweet potato)、高粱(sorghum)、薯蓣(yams)、黑麦(rye)、粟(millet)、荞麦(buckwheat)、竹芋(arrowroot)、芋头(taro)、箭叶黄体芋(tannia)，并且可以是例如面粉形式。
其中，木薯淀粉是本发明中优选的淀粉；在这一点上需要指出，木薯和木薯淀粉已知有多种同义名，包括tapioca、manioc、mandioca和manihot。
如本发明内容所采用的，术语“变性淀粉”(modified starch)是指经历了某种至少部分的化学修饰、酶修饰和/或物理或物理化学修饰，并且一般显示与“亲本”淀粉不同的性质的天然淀粉。
合成聚合物：
合成聚合物可以从如下选择：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、多磺酸盐(polysulfonate)、聚羧酸酯(polycarboxylate)及其共聚物，特别是水溶聚合物或共聚物。
蜡
本发明中的“蜡”(wax)应理解为熔点为25-150℃，具体为30-100℃，更具体为35-85℃，最具体为40-75℃的聚合物材料。蜡优选地在室温25℃条件下呈固态。下限优选使得石蜡开始熔化的温度与颗粒或含有颗粒的组合物通常储存的温度，即20-30℃之间有合理的距离。
对于某些颗粒，例如去污剂工业中使用的颗粒，蜡的一个优选特征是，蜡应是水溶性的或者水可分散性的，特别是在中性和碱性溶液中，从而在将本发明的包覆微粒被导入水溶液时，也就是用水稀释它时，石蜡应当崩解(disintegrate)和/或溶解，使掺入微粒中的活性物(active)得以快速释放和溶解到水溶液中。水溶性蜡的实例有聚乙二醇(PEG’s)。可分散在水溶液中的水不溶性蜡有甘油三酯(triglycerides)和油(oils)。对于某些颗粒，优选地，包覆层含有一些不溶性蜡，例如饲料颗粒(feed granules)。
本发明的蜡组合物可以包括任何化学合成的蜡。它还可以同等合适地包括从自然来源分离的蜡或其衍生物。因此，本发明的蜡组合物可以包括从下面非限制性的蜡的列表中选择的蜡。
-聚乙二醇，PEG.具有不同分子尺寸的不同PEG可以从商业上获得，其中分子尺寸小的PEG熔点也低。合适的PEG的实例有PEG 1500，PEG2000，PEG 3000，PEG 4000，PEG 6000，PEG 8000，PEG 9000等，例如来自BASF(Pluriol E系列)或来自Clariant或Ineos。还可以使用聚乙二醇的衍生物。
-聚丙烯(polypropylens)(例如来自BASF的聚丙二醇(polypropylenglycol)Pluriol P系列)或聚乙烯(polyethylens)或其混合物。还可以使用聚丙烯和聚乙烯的衍生物。
-在室温呈固体的非离子表面活性剂，例如具有高乙氧基水平的乙氧基化脂肪醇，如来自BASF的Lutensol AT系列，每分子具有不同量环氧乙烷(ehtyleneoxide)的C16-C18脂肪醇，例如Lutensol AT11，AT13，AT25，AT50，AT80，其中数字表示环氧乙烷基团的平均数目。或者，环氧乙烷、环氧丙烷的聚合物或其共聚物是有用的，如用于嵌段共聚物，例如得自于BASF的Pluronic PE 6800中。乙氧基化脂肪醇的衍生物。
-从自然来源中分离的蜡，例如巴西棕榈蜡(Carnauba wax)(熔点为80-88℃)，小烛树蜡(Candelilla wax)(熔点为68-70℃)和蜂蜡。其他的天然蜡或其衍生物有来源于动物或植物的蜡，例如海洋来源的蜡。氢化植物油或动物脂(tallow)。这类蜡的实例有氢化牛脂(ox tallow)、氢化棕榈油、氢化棉籽油(cotton seeds)和/或氢化豆油，其中本文使用的术语“氢化”理解为不饱和碳水化合物链，例如甘油三酯中不饱和碳水化合物链的饱和化，其中碳＝碳双键被转变成碳-碳单键。氢化棕榈油可以从例如HobumOele und Fette GmbH-Germany或Deutche Cargill GmbH-Germany商购。
-脂肪酸醇(fatty acid alcohols)，例如来自Condea ChemieGMBH-Germany的线性长链脂肪酸醇NAFOL 1822(C18，20，22)，熔点为55-60℃。脂肪酸醇衍生物。
-单甘油酯和/或二甘油酯，例如硬脂酸甘油酯(glyceryl stearate)，是有用的蜡，其中硬脂酸甘油酯中的硬脂酸(stearate)是硬脂酸(stearic acid)和棕榈酸的混合物。这类的实例有来自Danisco Ingredients，Denmark的Dimodan PM。
-脂肪酸，例如氢化的线性长链脂肪酸和脂肪酸衍生物。
-石蜡(paraffines)，也就是固体碳氢化合物。
-微晶蜡(micro-crystalline wax)。
在其它的实施方案中，可用于本发明的蜡可见于如下文献中：C.M.McTaggart et.al.，Int.J.Pharm.19，139(1984)或Flanders et.al.，Drug Dev.Ind.Pharm.13，1001(1987)，本文引入其内容作为参考。
在本发明一个具体的实施方案中，本发明的蜡是两种或多种蜡的混合物。
在本发明一个具体的实施方案中，蜡从下组中选择：PEG、乙氧基化脂肪醇、脂肪酸、脂肪酸醇和甘油酯。
在本发明的另一个具体的实施方案中，蜡选自合成蜡。在一个更加具体的实施方案中，本发明的蜡是PEG或非离子表面活性剂。在本发明一个最具体的实施方案中，所述蜡是PEG。
发酵液(fermentation broth)
根据本发明的发酵液包含生物质(biomass)，例如微生物细胞和/或其细胞碎片。
在一个优选的实施方案中，发酵液包含至少10％的来源于发酵的生物质，更优选至少50％，更优选至少75％，最优选至少90％或至少95％的源自于发酵的生物质。在另一个优选实施方案中，发酵液含有0-31％w/w干物质，优选0-20％w/w，更优选0-15％w/w，例如10-15％w/w干物质，0％干物质被排除在所述范围之外。生物质可以占到干物质的90％w/w，优选地占到75％w/w，更优选地占到干物质的50％w/w，而酶可以占到干物质的50％w/w，优选地占到25％w/w，更优选地占到干物质的10％w/w。
发酵液可以通过过滤纯化以获得发酵滤液。
增强剂
一些酶，如漆酶，往往底物特异性不够宽，从而在不引入增强剂的条件下无法实际使用；增强剂提高底物的可得性(availability)，通过例如氧化底物。
增强剂特别适用于与漆酶组合使用以除去气味，例如口臭导致的气味。在具体的实施方案中，颗粒包含漆酶和增强剂。
增强剂可以从如下组中选择：脂肪族(aliphatic)、脂环族(cyclo-aliphatic)、含有＞N-OH部分的杂环或芳香化合物。在本发明的优选实施方案中，增强剂是具有通式I的化合物：
其中R1，R2，R3，R4从如下组中独立选出：氢、卤素、羟基、甲酰基、羧基及其盐和酯、氨基、硝基、C1-12-烷基，C1-6-烷氧基，羰基(C1-12-烷基)，芳基，特别是苯基、磺基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、膦酰基、膦酰氧基(phosphonooxy)及其盐和酯，其中R1，R2，R3，R4可以被R5取代，其中R5代表氢、卤素、羟基、甲酰基、羧基及其盐和酯、氨基、硝基、C1-12-烷基、C1-6-烷氧基、羰基(C1-12-烷基)、芳基，特别是苯基、磺基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、膦酰基、膦酰氧基，及其盐和酯；
[X]表示从下组选出的基团：(-N＝N-)，(-N＝CR6-)m，(-CR6＝N-)m，(-CR7＝CR8-)m，(-CR6＝N-NR7-)，(-N＝N-CHR6-)，(-N＝CR6-NR7-)，(-N＝CR6-CHR7-)，(-CR6＝N-CHR7-)，(-CR6＝CR7-NR8-)，和(-CR6＝CR7-CHR8-)，其中R6，R7，和R8彼此独立并选自下组：H，OH，NH2，COOH，SO3H，C1-6-烷基，NO2，CN，Cl，Br，F，CH2OCH3，OCH3，和COOCH3；并且m是1或2。
术语“C1-n-羟基”，其中n可以是2-12，其在本文中代表具有1到指定数目的碳原子的枝化(branched)或直链羟基。典型的C1-6-羟基包括，但不仅限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基等。
在本发明的一个优选实施方案中，增强剂是具有通式II的化合物：
其中R1，R2，R3，R4从如下组中独立选出：氢、卤素、羟基、甲酰基、羧基及其盐和酯、氨基、硝基、C1-12-烷基、C1-6-烷氧基、羰基(C1-12-烷基)、芳基，特别是苯基、磺基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、膦酰基、膦酰氧基，及其盐和酯，其中R1，R2，R3，R4可以用R5取代，其中R5代表氢、卤素、羟基、甲酰基、羧基及其盐和酯、氨基、硝基、C1-12-烷基、C1-6-烷氧基、羰基(C1-12-烷基)、芳基，特别是苯基、磺基、氨基磺酰基、氨基甲酰基、膦酰基、膦酰氧基，及其盐和酯。
增强剂还可以是式I或II的盐或酯。
其它优选的增强剂是杂环化合物的含氧衍生物(oxoderivatives)和N-羟基衍生物，和杂环化合物的含氧衍生物和甲酰衍生物的肟，所述杂环化合物包括五元含氮杂环，特别是吡咯(pyrrol)、吡唑和咪唑及它们对应的氢化物(例如吡咯烷)以及三唑，例如1，2，4-三唑；六元含氮杂环，特别是单、二和三氮杂环己烷(mono-，di-and triazinanes)(例如哌啶和哌嗪)；吗啉和它们对应的不饱和物(例如吡啶和嘧啶)；和含有上述杂环作为亚结构的稠杂环，例如吲哚、苯并噻唑、喹啉和苯并氮杂(benzoazepine)。
上述各类化合物中优选的增强剂的实例有吡啶醛肟；N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxypyrrolidinediones)例如N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(N-hydroxyphthalimide)；3，4-二氢-3-羟基苯并[1，2，3]三嗪-4-酮；(3，4-dihydro-3-hydroxybenzo[1，2，3]triazine-4-one)；甲肟三聚体(formaloximetrimer)(N，N’，N”-三羟基-1，3，5-六氢三嗪)(N，N’，N”-trihydroxy-1，3，5-triazinane)；和紫尿酸(1，3-二氮杂环己烷-2，4，5，6-四酮-5-肟)(1，3-diazinane-2，4，5，6-tetrone-5-oxime)。
可用于本发明的更进一步的增强剂包括芳香化合物的含氧衍生物和甲酰衍生物的肟，例如苯醌二肟(benzoquinone dioxime)和水杨醛肟(2-羟基苯甲醛肟(2-hydroxybenzaldehyde oxime))和N-羟基酰胺(N-hydroxyamides)和N-羟基酰苯胺(N-hydroxyanilides)，例如N-羟基乙酰苯胺(N-hydroxyacetanilide)。
优选的增强剂从如下组中选择：1-羟基苯并三唑；1-羟基苯并三唑水合物；1-羟基苯并三唑钠盐；1-羟基苯并三唑钾盐；1-羟基苯并三唑锂盐；1-羟基苯并三唑铵盐；1-羟基苯并三唑钙盐；1-羟基苯并三唑镁盐；和1-羟基苯并三唑-6-磺酸。
特别优选的增强剂是1-羟基苯并三唑。
对所有上述N-羟基化合物的规定在任何相关情况下均可理解为包含互变异构形式，例如N-氧化物(N-oxides)。
另一种优选的增强剂基团包含-CO-NOH-基团，并具有通式III：
其中A是：
B与A相同，或者B是H或C1-12-烷基，所述烷基可以含有羟基、酯基或醚基(例如，其中醚氧直接与A-N(OH)C＝O-连接，因此包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，R2，R3，R4，R5和R6彼此独立，为H，OH，NH2，COOH，SO3H，C1-8-烷基，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F，CF3，NOH-CO-苯基，CO-NOH-苯基，C1-6-CO-NOH-A，CO-NOH-A，COR12，苯基-CO-NOH-A，OR7，NR8R9，COOR10，或NOH-CO-R11，其中R7，R8，R9，R10，R11和R12是C1-12-烷基或酰基。
A的R2，R3，R4，R5和R6优选是H，OH，NH2，COOH，SO3H，C1-3-烷基，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F，CF3，NOH-CO-苯基，CO-NOH-苯基，COR12，OR7，NR8R9，COOR10，或NOH-CO-R11，其中R7，R8和R9是C1-3-烷基或酰基，R10，R11和R12是C1-3-烷基；更优选地，A的R2，R3，R4，R5和R6是H，OH，NH2，COOH，SO3H，CH3，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F，CF3，CO-NOH-苯基，COCH3，OR7，NR8R9，或COOCH3，其中R7，R8和R9是CH3或COCH3；更优选地，A的R2，R3，R4，R5和R6是H，OH，COOH，SO3H，CH3，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F，CO-NOH-苯基，OCH3，COCH3，或COOCH3；特别地，A的R2，R3，R4，R5和R6是H，OH，COOH，SO3H，CH3，NO2，CN，Cl，Br，CO-NOH-苯基或OCH3。
B的R2，R3，R4，R5和R6优选地是H，OH，NH2，COOH，SO3H，C1-3-烷基，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F，CF3，NOH-CO-苯基，CO-NOH-苯基，COR12，OR7，NR8R9，COOR10，或NOH-CO-R11，其中R7，R8和R9是C1-3-烷基或酰基，R10，R11和R12是C1-3-烷基；更优选地，B的R2，R3，R4，R5和R6是H，OH，NH2，COOH，SO3H，CH3，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F，CF3，CO-NOH-苯基，COCH3，OR7，NR8R9，或COOCH3，其中R7，R8和R9是CH3或COCH3；更优选地，B的R2，R3，R4，R5和R6是H，OH，COOH，SO3H，CH3，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F，CO-NOH-苯基，OCH3，COCH3，或COOCH3；特别地，B的R2，R3，R4，R5和R6是H，OH，COOH，SO3H，CH3，NO2，CN，Cl，Br，CO-NOH-苯基或OCH3。
B优选地是H或C1-3-烷基，所述烷基可以含有羟基、酯基或醚基；优选地，所述烷基可以含有酯基或醚基；更优选地，所述所述烷基可以含有醚基。
在一个实施方案中，A和B彼此独立为：
或者B是H或C1-3-烷基，所述烷基可以含有羟基、酯基或醚基(例如，其中醚氧直接与A-N(OH)C＝O-连接，因此包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，R2，R3，R4，R5和R6彼此独立，为H，OH，NH2，COOH，SO3H，C1-3-烷基，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F，CF3，NOH-CO-苯基，CO-NOH-苯基，COR12，OR7，NR8R9，COOR10或NOH-CO-R11，其中R7，R8和R9是C1-3-烷基或酰基，且R10，R11和R12是C1-3-烷基。
在另一个实施方案中，A和B彼此独立为：
或者B是H或C1-3-烷基，所述烷基可以含有羟基或醚基(例如，其中醚氧直接与A-N(OH)C＝O-连接，因此包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，R2，R3，R4，R5和R6彼此独立，为H，OH，NH2，COOH，SO3H，CH3，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F，CF3，CO-NOH-苯基，COCH3，OR7，NR8R9或COOCH3，其中R7，R8和R9是CH3或COCH3。
在另一个实施方案中，A和B彼此独立为：
或者B是H或C1-3-烷基，所述烷基可以含有羟基或醚基(例如，其中醚氧直接与A-N(OH)C＝O-连接，因此包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，R2，R3，R4，R5和R6彼此独立，为H，OH，COOH，SO3H，CH3，酰基，NO2，CN，Cl，Br，F，CO-NOH-苯基，OCH3，COCH3，或COOCH3。
在另一个实施方案中，A和B彼此独立为：
或者B是C1-3-烷基，所述烷基可以含有醚基(例如，其中醚氧直接与A-N(OH)C＝O-连接，因此包括N-羟基氨基甲酸酯衍生物)，R2，R3，R4，R5和R6彼此独立为H，OH，COOH，SO3H，CH3，NO2，CN，Cl，Br，CO-NOH-苯基或OCH3。
本文所用的术语“C1-n-烷基”，其中n可以是2-12，代表具有1到指定数目个碳原子的枝化或直链烷基。典型的C1-6-烷基包括，但不仅限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基等。
本文使用的术语“酰基”是指包含通过羰基连接的C1-6-烷基的单价取代基；例如乙酰、丙酰、丁酰、异丁酰、新戊酰、戊酰等。
在一个实施方案中，A的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少一个是H，优选地，A的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少两个是H，更优选地，A的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少三个是H，最优选地，A的取代基R2，R3，R4，R5和R6中的至少四个是H，特别地，A的R2，R3，R4，R5和R6都是H。
在另一个实施方案中，B的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少一个是H，优选地，B的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少两个是H，更优选地，B的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少三个是H，最优选地，B的取代基R2，R3，R4，R5和R6中至少四个是H，特别地，B的取代基R2，R3，R4，R5和R6都是H。
在根据本发明的具体实施方案中，增强剂从如下组中选择：
4-硝基苯甲酸-N-羟基酰苯胺(4-nitrobenzoic acid-N-hydroxyanilide)；
4-甲氧苯甲酸-N-羟基酰苯胺(4-methoxybenzoic acid-N-hydroxyanilide)；
N，N′-二羟基-N，N′-二苯基对苯二甲酰胺(N，N′-dihydroxy-N，N′-diphenylterephthalamide)；
癸酸-N-羟基酰苯胺(decanoic acid-N-hydroxyanilide)；
N-羟基-4-氰乙酰苯胺(N-hydroxy-4-cyanoacetanilide)；
N-羟基-4-乙酰乙酰苯胺(N-hydroxy-4-acetylacetanilide)；
N-羟基-4-羟基乙酰苯胺(N-hydroxy-4-hydroxyacetanilide)；
N-羟基-3-(N’-羟乙酰胺)乙酰苯胺(N-hydroxy-3-(N’-hydroxyacetamide)acetanilide)；
4-氰基苯甲酸-N-羟基酰苯胺(4-cyanobenzoic acid-N-hydroxyanilide)；
N-羟基-4-硝基乙酰苯胺(N-hydroxy-4-nitroacetanilide)；
N-羟基乙酰苯胺(N-hydroxyacetanilide)；
N-羟基-N-苯基-氨基甲酸异丙酯(N-hydroxy-N-phenyl-carbamic acidisopropyl ester)；
N-羟基-N-苯基-氨基甲酸甲酯(N-hydroxy-N-phenyl-carbamic acidmethyl ester)；
N-羟基-N-苯基-氨基甲酸苯基酯(N-hydroxy-N-phenyl-carbamic acidphenyl ester)；
N-羟基-N-苯基-氨基甲酸乙酯(N-hydroxy-N-phenyl-carbamic acid ethylester)；及
N-羟基-N-(4-氰基苯基)-氨基甲酸甲酯(N-hydroxy-N-(4-cyanophenyl)-carbamic acid methyl ester)。
另一组优选的增强剂是具有通式IV的酚化合物(丁香酸烷基酯(alkylsyringates))：
其中所述表达式中的字母A表示如下基团，例如-D，-CH＝CH-D，-CH＝CH-CH＝CH-D，-CH＝N-D，-N＝N-D，或-N＝CH-D，其中D从如下组中选择：-CO-E，-SO2-E，-N-XY，和-N+-XYZ，其中E可以是-H，-OH，-R，或-OR，X、Y和Z可以相同或者不同，并且从-H和-R中选择；R是C1-C16烷基，优选C1-C8烷基，该烷基可以是饱和的或不饱和的，枝化或非枝化的，并且任选用羧基，磺基或氨基基团取代；B和C可以相同或不同，并从CmH2m+1中选择，其中m＝1，2，3，4或5。
在上面提到的通式IV中，A可以位于羟基的间位，而不是如图所示的对位。
在本发明具体的实施方案中，增强剂从具有通式V的组中选择：
其中A是如下的基团，例如-H，-OH，-CH3，-OCH3，-O(CH2)nCH3，其中n＝1，2，3，4，5，6，7或8。
另一组优选的增强剂是具有通式VI的化合物：
该通式中A代表单键或者下组中的一员：(-CH2-)，(-CH＝CH-)，(-NR11-)，(-CH＝N-)，(-N＝N-)，(-CH＝N-N＝CH-)，或(＞C＝O)；
并且在该通式中，取代基团R1-R11可以相同或不同，并且独立代表如下的任何基团：氢、卤素、羟基、甲酰基、乙酰基、羧基及其酯和盐、氨基甲酰基、磺基及其酯和盐、氨磺酰基、甲氧基、硝基、氨基、苯基、C1-8-烷基；
所述氨基甲酰基、氨磺酰基、苯基和氨基还可以不被或被取代基R12取代一次或两次；所述C1-8-烷基可以是饱和或不饱和的，枝化的或非枝化的，并还可以不被或被一个或更多的取代基R12取代；
所述取代基R12代表任一如下基团：氢、卤素、羟基、甲酰基、乙酰基、羧基及其酯和盐、氨基甲酰基、磺基及其酯和盐、氨磺酰基、甲氧基、硝基、氨基、苯基或C1-8-烷基；其中氨基甲酰基、氨磺酰基和氨基还可以不被或被羟基或甲基取代一次或两次；
且该通式中R5和R6可以一起形成基团-B-，其中B代表单键或者下组中的一员：(-CH2-)，(-CH＝CH-)，(-CH＝N-)；或者B代表硫或氧。
在本发明具体的实施方案中，增强剂从具有通式VII的组中选择：
该通式中X代表单键、氧或硫；
并且该通式中，取代基团R1-R9可以相同或不同，并且独立地代表任一如下的基团：氢、卤素、羟基、甲酰基、乙酰基、羧基及其酯和盐、氨基甲酰基、磺基及其酯和盐、氨磺酰基、甲氧基、硝基、氨基、苯基或C1-8-烷基；
所述氨基甲酰基、氨磺酰基、苯基和氨基还可以不被或被取代基团R10取代一次或两次；并且其中C1-8-烷基可以是饱和或不饱和的，枝化的或非枝化的，并还可以不被或被一个或更多取代基团R10取代；
其中取代基团R10代表任何如下基团：氢、卤素、羟基、甲酰基、乙酰基、羧基及其酯和盐、氨基甲酰基、磺基及其酯和盐、氨磺酰基、甲氧基、硝基、氨基、苯基或C1-8-烷基；其中氨基甲酰基、氨磺酰基和氨基还可以不被或被羟基或甲基取代一次或两次。
填充物
合适的填充物是水溶的和/或不溶的无机盐，例如精细研磨的碱性硫酸盐、碱性碳酸盐和/或碱性氯化物、粘土、例如高岭土(例如SPESWHITETM，English China Clay)、膨润土、滑石、沸石、白垩、碳酸钙和/或硅酸盐。
典型的填充物是硫酸二钠和木素磺化钙(calcium lignosulphonate)。其他的填充物是二氧化硅、石膏、高岭土、滑石、硅酸铝镁和纤维素纤维。
纤维材料
合适的纤维材料是纯的或不纯的纤维状纤维素，例如锯末(sawdust)、纯纤维状纤维素(pure fibrous cellulose)、棉花(cotton)和其他形式的纯或不纯纤维状纤维素。此外，可以使用基于纤维状纤维素的填充物辅料。市场上可以获得多种品牌的纤维状纤维素，例如CepoTM和ArbocellTM。优选的纤维状纤维素是ArbocelTM BFC200。同样可以如EP 304331 B1所述地使用合成纤维，并且典型的纤维可以用聚乙烯、聚丙烯、聚酯，特别是尼龙、聚甲酸乙烯酯(polyvinylformat)、聚(甲基)丙烯酸化合物制成。
酶稳定剂或酶保护剂
酶稳定剂或保护剂可以属于多种类别：碱性或中性材料、还原剂、抗氧化剂和/或第一过渡系金属离子的盐。这些中的每一种均可与相同或不同类别的其它保护剂联用。碱性保护剂的实例有碱金属硅酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐，其可通过主动地中和例如氧化剂提供化学清除(chemical scavenging)作用。还原性保护剂的实例有亚硫酸盐(sulfite)、硫代亚硫酸盐(thiosulfite)或硫代硫酸盐(thiosulfate)，而抗氧化剂的实例有甲硫氨酸、丁羟甲苯(BHT)或丁羟茴醚(BHA)。最优选的剂有硫代硫酸盐，例如硫代硫酸钠。此外，酶稳定剂可以是硼酸盐、硼砂、甲酸盐(formates)、二羧酸和三羧酸和所谓的可逆酶抑制剂(reversible enzyme inhibitors)，例如具有巯基的有机化合物或烷基化或芳基化硼酸。
交联剂：
交联剂例如酶相容性表面活性剂，如乙氧基化醇(ethoxylated alcohols)，特别是具有10-80个乙氧基的乙氧基化醇。
助溶剂：
当被包覆的微粒是清洁剂制剂的组分时，颗粒的溶解性特别关键。本领域技术人员已知，通过多种方法，许多剂可提高制剂的溶解度，本领域已知的典型的剂可在国家药典(National Pharmacopeia’s)中查到。
轻质球：
轻质球(light spheres)是具有低真密度的小微粒。通常，它们是中空(hallow)的球状微粒，其中含有空气或气体。这类材料一般通过使固体材料膨胀来制备。这些轻质球可以是无机性质或者是有机性质，例如可从PQ公司获得的PM系列(塑性中空球)。轻质球还能够由诸如淀粉或其衍生物等多糖制备。可从GranTek Inc.获得的Biodac是由纤维素(造纸业的废物)制成的非中空轻质材料的实例。这些材料可以包含在本发明的颗粒内，或者单独地，或者作为不同轻质材料的混合物。
悬浮剂：
颗粒中可以掺入悬浮剂、调理剂(mediators)(用于在例如清洗应用中当微粒溶解时提高漂白作用)和/或溶剂。
粘度调节剂(viscosity regulating agents)：
颗粒中可以存在粘度调节剂。
增塑剂(plasticizers)：
可用于本发明中的颗粒中的增塑剂包括，例如：多元醇(polyols)，如糖(sugars)、糖醇、甘油、甘油三甲醇丙烷(glycerol trimethylol propane)、新戊二醇、三乙醇胺、单、二和三甘醇或分子量小于1000的聚乙二醇(PEG)；尿素、邻苯二甲酸酯，如邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二甲酯；硫氰酸酯(或盐)(thiocyanates)、非离子表面活性剂，如乙氧基化醇和乙氧基化磷酸酯(或盐)(ethoxylated phosphates)；和水。
色素(pigments)：
合适的色素包括，但不限于，细碎的增白剂，如二氧化钛或高岭土、彩色色素(colored pigments)、水溶着色剂(colorants)、以及一种或多种色素和水溶着色剂的组合。
盐：
盐可以是无机盐，例如硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯化物、碳酸盐或简单有机酸(小于10个碳原子，例如6个或更少碳原子)的盐，例如柠檬酸盐、丙二酸盐或醋酸盐。这些盐中的阳离子实例有碱金属或碱土金属离子，尽管铵离子或第一过渡系金属离子也可以，例如钠、钾、镁、钙、锌或铝。阴离子的实例包括氯、溴、碘、硫酸根、亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫代硫酸根、磷酸根、磷酸二氢根、磷酸氢根、次磷酸根、焦磷酸二氢根(dihydrogen pyrophosphate)、四硼酸根、硼酸根、碳酸根、碳酸氢根、正硅酸根、柠檬酸根、苹果酸根、马来酸根、丙二酸根、琥珀酸根、乳酸根、甲酸根、醋酸根、丁酸根、丙酸根、苯甲酸根、酒石酸根、抗坏血酸根或葡萄糖酸根。特别地，可以使用碱金属或碱土金属的硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯化物或碳酸盐，或者简单有机酸例如柠檬酸、丙二酸或醋酸的盐。具体的实例包括NaH2PO4，Na2HPO4，Na3PO4，(NH4)H2PO4，K2HPO4，KH2PO4，Na2SO4，K2SO4，KHSO4，ZnSO4，MgSO4，CuSO4，Mg(NO3)2，(NH4)2SO4、硼酸钠、醋酸镁和柠檬酸钠。
所述盐还可以是水合盐，也就是，带有结晶化结合水的晶体盐水合物，例如WO 99/32595描述的。水合盐的实例包括七水硫酸镁(MgSO4(7H2O))、七水硫酸锌(ZnSO4(7H2O))、五水硫酸铜(CuSO4(5H2O))、七水磷酸氢二钠(Na2HPO4(7H2O))、六水硝酸镁(Mg(NO3)2(6H2O))、十水硼酸钠、二水柠檬酸钠和四水醋酸镁。
润滑剂(lubricant)：
在本发明中使用的术语“润滑剂”是指任何可减小表面摩擦、润滑颗粒表面、降低静电积累趋势和/或降低颗粒脆性的剂。润滑剂还可发挥相关作用通过减少包覆层中粘合剂的黏性(tackiness)改善包覆过程。因此，润滑剂可用作抗结块剂(anti-agglomeration agents)和润湿剂(wetting agents)。合适润滑剂的实例有低级聚乙二醇(PEGs)、乙氧基化脂肪醇和矿物油、植物油和动物油。润滑剂尤其是矿物油或非离子表面活性剂，更具体地，润滑剂不可与其他包覆材料溶混。
盐包覆层(salt coating)
酶颗粒对高相对湿度非常敏感，因此颗粒需要更加改进的手段以获得这种条件下可接受的储存稳定性。我们发现，通过用盐包覆层包覆颗粒，可以进一步提高酶的稳定性，尤其是高湿度下的稳定性。特别地，已经发现，WO 00/01793中说明的盐包覆层适于用作本发明的包覆层。
本发明合适的盐在上文其它制粒材料一节中有说明。
本发明特别合适的盐是Na2HPO4(CH20℃＝95％)，Na3PO4(CH25℃＝92％)，(NH4)H2PO4(CH20℃＝93.1％)，KH2PO4(CH20℃＝92％)，Na2SO4(CH20℃＝93％)，K2SO4(CH25℃＝99％)，KHSO4(CH20℃＝86％)，ZnSO4(CH20℃＝90％)和柠檬酸钠(CH25℃＝86％)。在本发明的一个具体的实施方案中，所述盐选自Na2HPO4、Na3PO4、(NH4)H2PO4、KH2PO4、Na2SO4、K2SO4、KHSO4、ZnSO4和柠檬酸钠。
包覆层包括至少60％w/w，例如65％w/w或70％w/w的盐，其优选地可以是至少75％w/w，例如至少80％w/w，至少85％w/w，例如至少90％w/w或至少95％w/w。
在本发明具体的实施方案中，盐包覆层包含超过50％的盐，例如超过70％的盐，例如超过90％，例如100％的盐。
在本发明具体的实施方案中，盐包覆层的施加量超过酶核心的50％w/w，例如超过酶核心的100％w/w，甚至例如超过酶核心的200％w/w。
附加包覆层
本发明的颗粒可以包含一个、两个或多个附加包覆层。
在本发明的具体实施方案中，颗粒包含至少两个包覆层。
附加包覆层可以施加到颗粒上，提供附加的特性或性质。因此，例如，附加包覆层可以实现一种或多种如下效果：
(i)减少颗粒的粉尘(dust)形成趋势；
(ii)保护颗粒中的活性化合物对抗环境中的敌对化合物；
(iii)在将颗粒引入到液体介质(例如酸介质)中时以期望的速度溶解；
(iv)为颗粒提供更好的物理强度。
任何具有期望性质的附加常规包覆层均可施加，常规包覆层材料和包覆方法在例如下列文献中有说明：US 4,106,991，EP 170360，EP 304332，EP304331，EP 458849，EP 458845，WO 97/39116，WO 92/12645，WO 89/08695，WO 89/08694，WO 87/07292，WO 91/06638，WO 92/13030，WO 93/07260，WO93/07263，WO 96/38527，WO 96/16151，WO 97/23606，US 5,324,649，US4,689,297，EP 206417，EP 193829，DE 4344215，DE 4322229 A，DD 263790，JP61162185 A，JP 58179492或PCT/DK/01/00628。
在本发明的具体实施方案中，附加包覆层是根据US 4,106,991或EP0,569,468的蜡包覆层，本文引用其内容作为参考。对于合适的蜡，见上文的“蜡”一节。在本发明具体的实施方案中，附加包覆层可以包含PEG和/或棕榈油。
附加包覆层材料：
包覆层可以包含附加包覆层材料，例如粘合剂、填充剂、纤维材料、酶稳定剂、助溶剂、悬浮剂、粘度调节剂、轻质球、增塑剂、盐、润滑剂和芳香剂，如在上文“附加制粒材料”一节提到的。进一步的包覆层成分可以是色素。
颗粒制备
本发明也涉及本发明颗粒的制造。本发明的一个具体实施方案是用于制备酶颗粒的方法，包括如下步骤：
a)制备pH大于7的含酶水性混合物；
b)将步骤a)中的混合物添加到形成粒子的过程中，从而提供含酶的核心粒子；
c)用至少一个包覆层包覆步骤b)的核心粒子。
在本发明的一个实施方案中上述的步骤c)是在流化床装置中进行。在本发明的一个更具体的实施方案中，将步骤c)的含酶混合物施加到惰性核心微粒上。
本发明的另一个具体实施方案包括用于制备酶颗粒的方法，包括如下步骤：
a)制备含酶水成液，其中水成液的pH大于7；
b)将步骤a)中的水成液添加到制粒设备；
c)在制粒设备中制备粒子。
在进一步的实施方案中，将含酶混合物的pH调节到大于8。在更进一步的实施方案中，将含酶混合物的pH调节到9-11。
在本发明具体的实施方案中，制备含酶水成液，并添加到制粒设备中，然后在制粒设备中将水成液的pH调节到大于7。
在本发明具体的实施方案中，用包覆层包覆在制粒设备中制备的含酶粒子。
在具体的实施方案中，包覆层是盐包覆层。在进一步的实施方案中，盐包覆层中的盐在20℃下具有大于60％的恒定湿度。进一步，盐包覆层中盐从如下组中选择：NaH2PO4，Na2HPO4，Na3PO4，(NH4)H2PO4，K2HPO4，KH2PO4，Na2SO4，K2SO4，KHSO4，ZnSO4，MgSO4，CuSO4，Mg(NO3)2，(NH4)2SO4，NaCl，硼酸钠、醋酸镁和柠檬酸钠。
在具体的实施方案中，酶从如下组中选择：氧化还原酶、糖酶(cabohydrase)和水解酶。进一步地，氧化还原酶是漆酶。更进一步地，漆酶得自于如下组：鬼伞属，毁丝霉属，多孔菌属，柱顶孢属和丝核菌属。
在本发明具体的实施方案中，酶颗粒的制备在制粒设备中发生。制粒设备是其中可以形成任何含酶粒子的设备。
在本发明具体的实施方案中，制粒设备从如下组中选择：流化床设备(fluid bed apparatuses)、喷雾干燥设备(spray-dring apparatuses)、流化床喷雾干燥设备(fluid bed spray-dring apparatuses)、挤出设备(extruder)、碾压机(roller compactors)和混合设备(mixer apparatus)。
酶颗粒可以包含核心和包覆层，其中核心包含酶基质。在具体的实施方案中，核心粒子通过将含酶混合物施加到惰性核心粒子上制备。
用于制备核心和包覆层的方法可在Handbook of Powder Technology；Particle size enlargement by C.E.Capes；volume 1，1980 Elsevier中查到；制备方法包括已知的进料和颗粒形成技术，即：
a)喷雾干燥产品，其中液态含酶溶液在喷雾干燥塔中雾化形成小液滴，它们在干燥塔中下降的途中干燥形成含酶微粒(particulate)材料。通过这种方法可以产生极小的粒子(Michael S.Showell(editor)；Powdered detergents；Surfactant Science Series；1998；vol.71；page 140-142；Marcel Dekker)。
b)分层产品(layered products)，其中含酶混合物围绕预成型的无活性核心粒子包覆成层，其中含酶混合物被雾化，通常在含有流态化的预成型核心粒子的流化床装置内被雾化，并且含酶混合物附着到核心粒子上并干燥，在核心粒子的表面上形成一层干燥的酶层。如果可以发现具有期望尺寸的有用核心粒子，则通过这种方式能够获得具有期望尺寸的粒子。这类产品在例如中WO 97/23606有说明。
c)吸收的核心颗粒，其中含酶混合物不是围绕核心包覆成层，而是吸收到核心的表面上和/或里面。这种过程在WO 97/39116有说明。
d)挤出或粒化(pelletize)产品，其中含酶糊料(paste)被挤压成团粒(pellets)，或者在压力下通过一个小开口被挤出并切割成粒子，随后干燥。这种粒子通常具有相当大的尺寸，因为开有挤出口的材料(通常是具有钻孔的平板)限制了通过挤出开口可允许的压力降。此外，当使用小开口时，非常高的挤出压力会增加活性化合物糊料的产热，这对于活性化合物是有害的(Michael S.Showell(editor)；Powdered detergents；Surfactant ScienceSeries；1998；vol.71；page 140-142；Marcel Dekker)。
e)喷射造粒产品(Prilled products)，其中酶粉悬浮在熔融的蜡中，然后将悬浮物喷射到冷却室内，例如通过旋转盘喷雾器(rotating disk atomizer)，液滴在冷却室中迅速凝固(Michael S.Showell(编辑)；Powdered detergents；Surfactant Science Series；1998；vol.71；page 140-142；Marcel Dekker)。在所获得的产品中，活性化合物均匀地遍布惰性材料，而不是集中分布在其表面。此外，US 4,016,040和US 4,713,245是与之有关的文献。
f)混合器制粒产品，其中将酶液添加到由常规制粒组分构成的干粉组合物中。液体和粉以合适的比例混合，随着液体的水分被干粉吸收，干粉的组分开始粘着和结块，生成粒子，并形成包含活性化合物的颗粒(granulates)。这种过程在US 4,106,991(NOVO NORDISK)和相关文献EP 170360 B1(NOVO NORDISK)，EP 304332 B1(NOVO NORDISK)，EP304331(NOVO NORDISK)，WO 90/09440(NOVO NORDISK)和WO90/09428(NOVO NORDISK)中有说明。在本过程的具体产品中，可以使用多种高剪切混合器作为制粒机，将由作为活性化合物的酶、填充物和粘合剂等组成的颗粒与纤维素纤维混合，以强化粒子，得到所谓的T颗粒(T-granulate)。经过强化的粒子更加结实(robust)，释放的酶粉尘更少。
g)尺寸减小，其中通过粉碎(milling)或压碎(crushing)含有活性材料的较大粒子、团粒、片、压块(briquette)等形成核心。将粉碎或压碎的产品过筛，获得期望的核心粒子部分。过大或过小的颗粒可以重新进行循环。尺寸减小在(Martin Rhodes(编辑)；Principles of Powder Technology；1990；Chapter 10；John Wiley & Sons)中有说明。
h)流化床制粒。流化床制粒涉及将微粒悬浮在空气流内，并通过喷嘴将酶液喷射到流态化粒子上。被喷雾液滴击中的粒子被润湿并变成黏性。黏性的粒子与其它粒子碰撞，并与之粘着形成颗粒。
i)可以对核心进行干燥，例如在流化床干燥器内。本领域的技术人员可以使用在酶工业中用于干燥颗粒的其它已知方法。干燥优选地在25-90℃的产品温度条件下发生。对于某些酶，含酶核心在用盐包覆之前具有低的含水量是重要的。如果在除去多余的水之前，用盐包覆对水敏感的活性化合物，则该盐将被捕捉到核心内部，对酶的活性产生负面影响。干燥之后，核心优选地含有0.1-10％w/w的水。
盐包覆层的制备
可以通过在流化床内喷雾到核心颗粒上而将盐包覆层施加到含酶核心颗粒上，还可以在真空混合器(vacuum mixer)、糖衣(drageé)型包覆机(盘-筒包覆机(pan-drum coaters))、用于包覆种子的设备、包含旋转底部的设备(eks.Roto Glatt，CF制粒机(Freund)，TORBED处理器(Gauda))中，或者例如Omnitex(Nara)等旋转流化床处理器中施加盐包覆层。
在施加了盐层之后，可以任选地对颗粒进行干燥。包覆了盐的颗粒的干燥可以用本领域技术人员可以获得的任何干燥方法实现，例如喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、流化床干燥、盘筒包覆(pan drum coating)和微波干燥。包覆有盐的颗粒的干燥还可以和包含使用流化床、流化床喷雾干燥器(FSD)或多级干燥器(MSD)的制粒方法组合。
附加包覆层的制备
可以适当地采用本领域已知的常规的包覆层和用于施加包覆层的方法，例如在丹麦专利申请2002 00473，WO 89/08694，WO 89/08695，270 608 B1和/或WO 00/01793中说明的。常规包覆层材料的其他实例可以在如下文献中查到：US 4,106,991，EP 170360，EP 304332，EP 304331，EP 458849，EP 458845，WO 97/39116，WO 92/12645A，WO 89/08695，WO 89/08694，WO 87/07292，WO 91/06638，WO 92/13030，WO 93/07260，WO 93/07263，WO 96/38527，WO96/16151，WO 97/23606，WO 01/25412，WO 02/20746，WO 02/28369，US5879920，US 5,324,649，US 4,689,297，US 6,348,442，EP 206417，EP 193829，DE4344215，DE 4322229 A，DE 263790，JP 61162185 A和/或JP 58179492。
包覆层的制备可以使用与上文所述相同的方法。
所得的颗粒可以在例如MarumeriserTM中进行圆整(rounding off)(例如圆球化)(spheronisation)，或者压实(compaction)。
包含本发明颗粒的组合物
本发明还涉及包含本发明颗粒的组合物。该组合物可以是任何组合物，但尤其合适的组合物是个人护理品(personal care)组合物、清洁组合物、纺织品处理组合物如漂白剂(bleaching)、药物组合物、皮革处理组合物、纸浆或纸张处理组合物、食品和饮料组合物和动物饲料组合物。
清洁组合物包括去污剂和抗微生物组合物。纺织品处理组合物包括用于诸如粗斜纹棉布(denim)等纺织品的酶促漂白和/或石磨洗涤(stonewashing)的组合物。食品和饮料组合物包括在酒、油脂(oils and fats)、柑橘和果汁产品、淀粉和糖产品、酒精(alcohols)和/或酿造产品、大豆产品和焙烤面粉或生面团的生产工业中使用的酶组合物。本发明特别适用于包含在如下物品中：猫砂(cat litter)组合物、尿布、漱口剂组合物、口香糖和咀嚼薄荷糖(chewing mint)，用于去除气味。本发明特别适用于除去由口臭导致的气味。
本发明还涵盖使用本发明的颗粒用于气味清除、纺织品处理、皮革处理、纸浆处理、纸张处理、食品、饮料、硬表面和人或动物机体的用途。颗粒还可以用于治疗人或动物机体的药物。在本发明具体的实施方案中，本发明的颗粒或组合物用于除去来自液体肥料的气味。
本发明进一步涉及用于除去气味的方法，包括用包含本发明颗粒的组合物刷牙。还涉及用于除去气味的方法，包括将包含本发明颗粒的组合物添加到猫盘(cat tray)中。还进一步涉及用于除去气味的方法，包括给人换用包含本发明颗粒的尿布。在具体的实施方案中，还涉及用于除去口腔气味的方法，包括将薄荷糖、口香糖或漱口剂放到口腔里。
实施例
实施例1
用如下的方法制造毁丝霉漆酶颗粒。用Hüttlin HKC-5-TJ型流化床(fluidbed)将含有20％干物质、pH5.5、活性为5275 LAMU/g的0.525kg浓缩液喷射到3.5kg氯化钠核心上(平均尺寸315μm，跨距(span)0.94)，以使酶在核心上成层并干燥。Hüttlin床的参数为：
空气入口温度：70℃
产品温度：56℃
空气体积：450m3/h
雾化空气：1.5bar
微气候空气(microclima air)：0.65bar
得到活性为777LAMU/g的颗粒。不另外进行包覆，测试颗粒自身的储存稳定性，条件为在密封罐内25℃储存26周；40℃储存13周；及在暴露于40℃和60％相对湿度的敞开罐内储存4周。储存测试的结果如表1所示。
表1 ％残余活性
4周 8周 13周 26周
25℃密封罐 23 13
40℃密封罐 8 3 2
40℃/60％RH ＜1
实施例2
如实施例1所述地制备一系列颗粒，只是在喷雾之前，用1N NaOH将浓缩液的pH调节成7-10。如实施例1所述地检测颗粒的储存稳定性，表2A-B列出了实施例2的密封罐结果，显示将浓缩液pH调高到10可以显著提高密封罐内的储存稳定性。在40℃/60％RH的潮湿条件下，所有的残余活性均低于1％，表明还需要湿气屏障。
表2A： ％残余活性25℃密封罐
13周 26周
pH5.5 23 13
pH7 50 38
pH8 73 42
pH9 74 58
pH10 81 78
表2B： ％残余活性40℃密封罐
4周 8周 13周
pH5.5 8 3 2
pH7 26 13 8
pH8 29 18 15
pH9 33 22 16
pH10 76 45 34
实施例3
如实施例1所述地制备一系列颗粒，只是在喷雾之前将浓缩液的pH调节到pH10，pH10.5和pH11，并用GEA精密包覆机(GEA Precision Coater)流化床施加酶和最终的盐层。对由pH10.5浓缩液制成的颗粒进一步施加50％(以装载了酶的核心的％计算)的氯化钠包覆层。该包覆层是从所述盐的24％的水基溶液施加的。如实施例1所述地检测颗粒的储存稳定性，表3A-C列出了实施例3的密封罐结果，显示在更高的pH和补充盐包覆层的条件下，温度和湿度稳定性均得到提高。
表3A： ％残余活性25℃密封罐
13周 26周
pH10 88 79
pH10.5 94 82
pH11 93 91
pH10.5 50％NaCl包覆层 101 95
表3B： ％残余活性40℃密封罐
4周 8周 13周
pH10 82 66 54
pH10.5 82 59 45
pH11 83 72 47
pH10.5 50％NaCl包覆层 89 79 94
表3C： ％残余40℃/60％RH
4周
pH10 ＜1
pH10.5 ＜1
pH11 2
pH10.5+50％NaCl包覆层 82
实施例4
如实施例1所述地制备一系列装载有漆酶的核心，其中在喷雾之前将浓缩液调节到pH10.5；并进一步如实施例3所述地包覆盐，不同之处在于核心是硫酸钠，包覆层也是硫酸钠。包覆层的施加量为装载酶的核心的50％，100％和200％。水基包覆层溶液对硫酸钠为26％，对糊精Avedex W80为1.3％。包覆层溶液的温度保持为40-45℃，以避免形成芒硝。这一系列的稳定性数据如表4A-C所示。
表4A： ％残余活性25℃密封罐
包覆层 13周 26周
50％硫酸钠 97 91
100％硫酸钠 99 86
200％硫酸钠 91 89
表4B： ％残余活性40℃密封罐
包覆层 4周 8周 13周
50％硫酸钠 96 76 73
100％硫酸钠 83 76 75
200％硫酸钠 89 68 69
表4C： ％残余活性40℃/60％RH 8周后的吸水量 (water uptake)
包覆层 4周 8周
50％硫酸钠 96 91 0.076％
100％硫酸钠 91 90 0.101％
200％硫酸钠 82 85 0.087％
实施例5
漆酶颗粒的制备如下所述。
在50升Ldige混合器内，将3.5kg活性为5630LAMU/g，pH为5.5的液体漆酶浓缩液喷雾并吸收到15kg的木薯(Cassava)核心(粒度为600-700μm)上，如(Cassava patent)(木薯专利)所述。吸收后，在常规流化床内对装载有酶的湿颗粒进行干燥。
随后在5升Ldige混合器内，以如US 4,106,991所述的方式，用a)80gPEG 4000和b)240g高岭土包覆2kg装载有酶的干燥颗粒。
测试包覆颗粒本身的储存稳定性：在密封罐内25℃测试26周，40℃测试13周，在暴露于40℃和60％相对湿度的敞开罐内测试4周。储存测试结果如表5所示。
表5％残余活性
4周 8周13周 26周
25℃密封罐66 57
40℃密封罐48 4234
40℃/60％RH4
实施例6
如实施例5所述地制备一系列颗粒，只是在吸收前用1N NaOH将浓缩液的pH调节成7-10，在5升Ldige混合器中，用0.60kg经过调节的漆酶浓缩液向2.0kg木薯核心喷雾。如实施例5所述地施加高岭土/PEG4000包覆层。如实施例1所述地检测颗粒的储存稳定性，实施例6的密封罐结果如表VI A-B所示，显示将浓缩液pH调节到10，储存稳定性获得了显著提高。在40℃/60％RH的潮湿条件下，所有的残余活性均低于1％或稍高于1％，表明还需要湿气屏障。
表6A： ％残余活性25℃密封罐
13周 26周
pH7 62 60
pH8 70 64
pH9 76 65
pH10 83 74
表6B： ％残余活性40℃密封罐
4周 8周 13周
pH7 58 45 43
pH8 58 47 50
pH9 62 55 55
pH10 73 60 64
实施例7
如实施例5所述地制备一系列漆酶颗粒，只是在吸收之前将浓缩液的pH调节成pH10，pH10.5和pH11。向由pH10.5的浓缩液制成的装载酶的核心施加50％和100％的硫酸钠包覆层(以装载了酶核心的％计算)，取代所述的高岭土/PEG包覆层。如实施例4所述地使用Hüttlin流化床从硫酸钠溶液施加包覆层，参数为：装载酶的核心3kg，空气入口温度80℃，产品温度50℃，空气体积500m3/h。如实施例所述地检测颗粒的储存稳定性，实施例7的密封罐数据如表VII A-C所示，显示在更高pH和具有补充盐包覆层的情况下，温度和湿度稳定性均提高。
表7A： ％残余活性25℃密封罐
13周 26周
pH10 90 86
pH10.5 96 83
pH11 84 77
pH10.5 50％Na2SO4包覆层 90 77
pH10.5 100％Na2SO4包覆层 104 101
表7B： ％残余活性40℃密封罐
4周 8周 13周
pH10 83 81 86
pH10.5 79 63 51
pH11 83 59 43
pH10.5 50％Na2SO4包覆层 82 61 53
pH10.5 100％Na2SO4包覆层 101 97
表7C： ％残余活性40℃/60％RH
4周
pH10 23
pH10.5 43
pH11 42
pH10.5+50％Na2SO4包覆层 41
pH10.5+100％Na2SO4包覆层 66