小白菊内酯衍生物的合成方法及其应用.pdf

本发明涉及小白菊内酯衍生物的合成方法。以小白菊内酯和含氮化合物为反应原料，乙醇钠为催化剂，在一定的溶剂和温度下反应，即可得到本发明小白菊内酯衍生物，衍生物经酸化后可得到其盐，大大提高了其水溶性。经修饰后的小白菊内酯衍生物盐可用于制成注射用制剂，更好的发挥其对肿瘤的治疗作用。

权利要求书
1.   一种小白菊内酯衍生物的合成方法，结构式为(I)，

其中R可以为二甲基氨基(式II)、哌啶基(式III)或吡啶基(式IV)中的任何一种，

其特征在于包括如下步骤：
(1)、称取原料小白菊内酯和R，其中R的摩尔数至少为小白菊内酯的2倍，另称取催化剂乙醇钠适量，三者混合，将其溶解于适量的无水乙醇中，室温搅拌反应24小时；
(2)反应后的溶剂系统蒸干乙醇，残留物采用硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱，TLC、HPLC检测洗脱液，收集含小白菊内酯衍生物的流份，即得。

2.   如权利要求1所述的方法，其中所述的原料R可以是二甲基氨、哌啶、吡啶中的任何一种。

3.   如权利要求1所述的方法，其中R的摩尔数与小白菊内酯的摩尔数之比优选为4～6∶1。

4.   一种含有治疗有效量的如权利要求1所述方法制备得到的小白菊内酯衍生物的盐的冻干粉针注射制剂。

5.   如权利要求4所述的冻干注射制剂，其中所述的小白菊内酯衍生物的盐主要是指其盐酸盐。

6.   一种制备如权利要求4所述的冻干粉针制剂工艺，其特征在于：小白菊内酯衍生物盐酸盐10～20份，甘露醇100～200份，以注射用水溶解，盐酸或氢氧化钠调pH为5～7，加入0.05％～0.1％的活性炭，40～60℃搅拌30min，过0.22um的微孔滤膜，再通过截留分子量为8000的滤膜超滤，分装，冻干即得。

说明书小白菊内酯衍生物的合成方法及其应用
技术领域
本发明属于化学药合成领域，具体涉及由小白菊内酯合成氮代小白菊内酯衍生物，经化学修饰后的小白菊内酯极性增加，更适宜制成注射用制剂。
背景技术
小白菊内酯为一倍半萜内酯类化合物，分子中含有一α-亚甲基-γ-内酯基团。对小白菊内酯的研究颇多，欧美用小白菊治疗偏头疼和关节疼痛，其主要成分为小白菊内酯，近年来对小白菊内酯的研究发现，小白菊内酯还具有抗肿瘤活性，如可抑制结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、白血病癌细胞的生长。
小白菊内酯为一类低极性成分，具有很强的脂溶性，在水中溶解度很小，这大大的限制了小白菊在制药上的广泛应用。近年来也有研究修饰小白菊内酯的结构以增强其水溶性。美国专利US2005272716A1公开了一种修饰小白菊内酯的方法。在修饰结构中所使用的催化剂为三乙胺，但三乙胺为一类极危险的溶剂，一级易燃液体，在空气中的爆炸极限为1.2％～8.0％，溶剂有毒，蒸气或液体能刺激皮肤和粘膜，吸入蒸气后能使呼吸器官、血液循环系统、中枢神经系统、肝脏及其它粘膜组织等机体失常，生产现场最高容许浓度为25ppm，大大的限制了在工业上的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合工业化生产的小白菊内酯修饰路线。
本发明中在用含氮化合物修饰小白菊内酯的结构过程中，采用的是乙醇钠为催化剂，乙醇钠无毒，安全性高，能适合工业化生产。
本发明在用乙醇钠作为催化剂来修饰小白菊内酯结构时，对最终产品的得率与美国专利US2005272716A1做了对比，发现其最终产品得率也在85％以上，和对比文献所公开的得率相当，但却解决了工业实用性的问题，而且反应条件只需在室温搅拌下即可进行，操作简便，对合成仪器、场地设施要求不高，普通条件下即可进行，这大大降低了生产成本。
本发明中所用的原料为从广玉兰叶中提取分离得到的小白菊内酯，提取方法在中国专利申请200710099763.6中已经公开。
本发明中所用的原料还有选自二甲基氨、哌啶或吡啶中的任一种。
本发明中所用的催化剂为乙醇钠。
本发明中经修饰得到的小白菊内酯衍生物为其氮代衍生物，结构式如下

氮代小白菊内酯衍生物结构
其中R(N源供体)可以为二甲基氨基、二乙基氨基、哌啶基、吡啶基中的任一种，优选二甲基氨基、哌啶基、吡啶基，更优选哌啶基。
本发明N源供体摩尔数的量至少为小白菊内酯的两倍，优选4～6倍。
实现本发明的工艺为：

R1、R2同为甲基时即为11，13-二氢-13-二甲基氨基小白菊内酯，同为乙基时即为11，13-二氢-13-二乙基氨基小白菊内酯。
11，13-二氢-13-哌啶基-小白菊内酯的合成工艺路线：

反应产物中因存在未反应完全的原料，因此要得到纯品小白菊内酯衍生物，必须经过进一步精制过程，可将反应结束后的溶剂蒸干，残留物采用硅胶柱层析精制，用氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，TLC或HPLC检测，收集含小白菊内酯衍生物的流份，既得得到纯品小白菊内酯衍生物，含量为98％以上。
经修饰后的小白菊内酯衍生物，因与N原子相连，成一定程度的碱性，当与酸反应后可制成衍生物盐，大大提高了其在水中的溶解度，能制成供注射用的药物，提高了药物在机体内的生物利用度。
本发明的小白菊衍生物的盐，主要是指无机盐，优选其盐酸盐。
其盐酸盐可以通过如下反应式得到：

反应过程中，小白菊内酯衍生物盐酸盐慢慢析出白色结晶，分离白色结晶，既得水溶性小白菊内酯衍生物盐酸盐。
经修饰后的小白菊内酯衍生物盐酸盐，因其水溶性大大增加，可用于制成注射用制剂，如注射液，冻干粉针剂，极大的提高了生物利用度，能更好的起到治疗或辅助治疗肿瘤、抗白血病的作用。
具体实施例
本发明中所用的小白菊内酯原料均为星昊医药股份有限公司自制，纯度为98％以上。所列举的实施例不是为了限制本发明，而是为了更好的说明本发明，其它工艺类此但原料或用量不同，不会引起实质性差异的，也在本发明之内。
实施例1
11，13-二氢-13-二甲基氨基小白菊内酯的制备
小白菊内酯200mg(0.8mmol)，二甲基氨180mg(4mmol)，乙醇钠476mg(7mmol)，加入到80mL乙醇中，室温搅拌24小时，使其充分反应完全，减压蒸发溶剂，残留物经硅胶柱层析，氯仿-甲醇50∶1-1∶1梯度洗脱，TLC或HPLC检测，收集含11，13-二氢-13-二甲基氨基小白菊内酯的流份，最终得216mg产物(得率92％)，化合物纯度98.51％。化合物熔点：142.8-1143.7℃；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ5.24(1H，d)，3.82(1H，t)，2.76(2H，m)，2.64(1H，dd)，2.53-2.29(3H，m)，2.27(6H，s)，2.20-1.95(5H，m)，1.68(3H，s)，1.35(3H，s)，1.30-1.16(1H，m)；
13C-NMR(500MHz，CDCl3)：δ175.9，134.8，124.2，82.1，66.8，61.9，58.1，47.9，46.5，46.1，40.8，36.2，30.3，24.5，17.8，16.8；EI-MS：M/Z293(M+)；UV(MeOH)λmax(logε)：210nm末端吸收峰(4.03)；IR v max：1776，1462，1377，1136，982cm-1.
实施例2
11，13-二氢-13-哌啶基小白菊内酯的制备
小白菊内酯200mg(0.8mmol)，哌啶272mg(3.2mmol)，乙醇钠476mg(7mmol)，加入到80mL乙醇中，室温搅拌24小时，使其充分反应完全，减压蒸发溶剂，残留物经硅胶柱层析，氯仿-甲醇50∶1-1∶1梯度洗脱，TLC或HPLC检测，收集含11，13-二氢-13-哌啶基小白菊内酯的流份，最终得233mg产物(得率87％)，化合物纯度99.26％。
实施例3
11，13-二氢-13-吡啶基小白菊内酯的制备
小白菊内酯200mg(0.8mmol)，吡啶0.53mL(4.8mmol)，乙醇钠476mg(7mmol)，加入到80mL乙醇中，室温搅拌24小时，使其充分反应完全，减压蒸发溶剂，残留物经硅胶柱层析，氯仿-甲醇50∶1-1∶1梯度洗脱，TLC或HPLC检测，收集含11，13-二氢-13-吡啶基小白菊内酯的流份，最终得213mg产物(得率81％)，化合物纯度98.37％。
实施例4
11，13-二氢-13-哌啶基小白菊内酯盐酸盐的制备
11，13-二氢-13-哌啶基小白菊内酯(10mg)溶于4mL乙醚中，浓盐酸乙醚液(1M)，缓慢加入到上述乙醚溶液中，至溶液中充满盐酸蒸气，补充加入乙醚溶剂6mL，搅拌，使溶液变为澄清，将澄清溶液至4℃冰箱中放置24小时，析出白色结晶，过滤，滤取结晶，得11，13-二氢-13-哌啶基小白菊内酯盐酸盐2.3mg(得率21％)。
实施例5
11，13-二氢-13-哌啶基小白菊内酯盐酸盐冻干粉针剂的制备
11，13-二氢-13-哌啶基小白菊内酯盐酸盐    2.0g
甘露醇                                   16g
活性炭                                   0.15g
注射用水适量
将11，13-二氢-13-哌啶基小白菊内酯盐酸盐、甘露醇用蒸馏水溶解，盐酸或NaOH调pH为5.0~7.0，加入活性炭，50℃搅拌30min，过0.22um的微孔滤膜，再通过截留分子量为8000的超滤膜，以注射用水补充溶剂至300mL，分装，3mL/支，冻干，既得。本品每支含11，13-二氢-13-哌啶基小白菊内酯盐酸盐20mg。
实施例6
11，13-二氢-13-二甲基氨基小白菊内酯盐酸盐冻干粉针剂的制备
11，13-二氢-13-二甲基氨基小白菊内酯盐酸盐    1.5g
甘露醇                                       16.5g
活性炭                                       0.15g
注射用水适量
将11，13-二氢-13二甲基氨基-小白菊内酯盐酸盐、甘露醇用蒸馏水溶解，盐酸或NaOH调pH为5.0~7.0，加入活性炭，50℃搅拌30min，过0.22um的微孔滤膜，再通过截留分子量为8000的超滤膜，以注射用水补充溶剂至300mL，分装，3mL/支，冻干，既得。本品每支含11，13-二氢-13二甲基氨基-小白菊内酯盐酸盐15mg。
实施例7
11，13-二氢-13-吡啶基小白菊内酯盐酸盐冻干粉针剂的制备
11，13-二氢-13-吡啶基小白菊内酯盐酸盐    1.0g
甘露醇                                   17g
活性炭                                   0.15g
注射用水适量
将11，13-二氢-13-吡啶基小白菊内酯盐酸盐、甘露醇用蒸馏水溶解，盐酸或NaOH调pH为5.0~7.0，加入活性炭，50℃搅拌30min，过0.22um的微孔滤膜，再通过截留分子量为8000的超滤膜，以注射用水补充溶剂至300mL，分装，3mL/支，冻干，既得。本品每支含11，13-二氢-13吡啶基-小白菊内酯盐酸盐10mg。
实施例8
药理实施例
(1)、体外药理作用
细胞株：白血病细胞株K562、鼻咽癌细胞KB、卵巢癌细胞SKOV3、肝癌细胞BEL-7402、结肠癌细胞(HT-29)、宫颈癌细胞Hela、前列腺癌细胞PC-3。
将处于对数生长期的的白血病细胞珠K562、鼻咽癌细胞、卵巢癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞株和LAK细胞(对照组)用CM-1640培养基配成2×105/ml细胞悬液，加入96孔圆底细胞培养板内，每孔0.2ml，再分别加入11，13-二氢-13-哌啶基小白菊内酯盐酸盐(先以PBS溶解)，使其浓度为：0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/ml，每一测试浓度5孔，置37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养72小时，用MTT法在酶联检测仪570nm波长测得吸光(A)值。计算出本发明提取物对各细胞株的抑制率。结果见表1
表1不同浓度本发明提取物对肿瘤细胞和LAK细胞的增值抑制率(％)

与LAK细胞相比：*P＜0.01
从上表结果可知，本发明提取物在0.5～10μg/ml时，除鼠骨髓细胞瘤、人宫颈癌细胞不产生抑制作用外，其余均有一定的抑制作用，其中以2μg/ml浓度时最为适宜，再往上梯增浓度对癌细胞的抑制作用贡献不明显，无显著意义。对LAK细胞毒性实验表明，在0.5～4μg/ml时对LAK细胞不产生抑制作用，在0.5.0～2.0μg/ml时还有一定的增值作用。
(2)体内抗肿瘤实验
癌细胞株：结肠癌细胞株(HT-29)
试液：PBS标准液
取BALB/C小鼠40只，随机分成4组，分别为对照组，荷HT29癌细胞组三组(分别注射本发明提取物高、中、低剂量组)、对照组接种HT29结肠癌细胞株同时腹腔每天注射0.4mlPBS标准液，第给药治疗组于接种HT29细胞悬液后即分别腹腔注射本发明提取物5、10、15mg/kg.d-1，于接种后第14天解剖存活小鼠，并摘取肿瘤，计算肿瘤体积V=π6ab2]]>(a最大长径，b为最大短径)，并计算抑瘤率，抑瘤率计算公式为结果见表2
表2本发明提取物对小鼠体内移植HT29细胞株的抑瘤作用

与对照组相比：*P＜0.01
从表2可知，在荷瘤裸鼠体内，本发明提取物对结肠癌具有抑制肿瘤生长的作用，给药2周后，治疗组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组(P＜0.01)，对肿瘤的抑制成剂量依赖关系，本发明高剂量组对荷结肠癌细胞瘤的抑制率别为77.60％。