一种重组人淀粉样蛋白AΒSUB42/SUB的制备方法及应用.pdf

一种重组人淀粉样蛋白Aβ42的制备方法及应用，属于融合蛋白技术领域。本发明根据人淀粉样蛋白前体蛋白APP的序列和克隆载体pGEX-4T-1多克隆位点，设计人淀粉样蛋白Aβ42的PCR上游引物P1，引入BamHI酶切位点，下游引物P2，引入SalI酶切位点及终止密码子TAG。利用RT-PCR技术，以人SH-SY5Y细胞cDNA为模板进行PCR扩增，产物片断长度为147bp，编码人APP从672到713的Aβ42片段。将Aβ42基因片段序列重组于原核表达载体pGEX-4T-1，构建表达人Aβ42的原核表达质粒pGEX-4T-1/Aβ42。将pGEX-4T-1/Aβ42转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，经诱导表达、分离和酶切，得到纯化的有活性的重组人淀粉样蛋白Aβ42。

权利要求书
1、  一种重组人淀粉样蛋白Aβ42的制备方法，其特征在于步骤为：
步骤一：原核表达质粒pGEX-4T-1/Aβ42的构建
(1)获得cDNA：提取人神经瘤母细胞SH-SY5Y总RNA，以oligo(dT)为引物，反转合成获得SH-SY5Y细胞cDNA；
(2)引物设计及PCR：检索genbank，依据人淀粉样蛋白Aβ42的序列和载体pGEX-4T-1的多克隆位点设计引物：
上游引物P1：5’-CGGGATCCGATGCAGAATTCCGACATGACTCAG-3’，引入BamHI酶切位点；
下游引物P2：5’-ACGCGTCGACCTACGCTATGACAACACCGCCCA-3’，引入SalI酶切位点及终止密码子TAG；
以人SH-SY5Y细胞cDNA为模板进行PCR扩增，产物片断长度为147bp；
(3)将上述(2)所得PCR产物及载体pGEX-4T-1进行BamHI和SalI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳割胶纯化回收酶切产物；将回收的目的片段和载体用T4连接酶连接，连接产物转化入CaCl2处理的新鲜制备的DH5α感受态菌中，混匀后置冰中2分钟，37℃培养1小时，室温离心弃上清，悬浮，平铺于含氨苄青霉素的固体LB培养基中，37℃培养过夜，挑取阳性单菌落克隆；
(4)提取阳性单菌落克隆中的质粒，经测序鉴定为重组的人淀粉样蛋白原核表达质粒pGEX-4T-1/Aβ42；将此重组质粒pGEX-4T-1/Aβ42转入DH5α菌株扩增保种；并提取质粒pGEX-4T-1/Aβ42转入表达菌株E.coli BL21(DE3)中，即成Aβ42的原核表达菌株pGEX-4T-1/Aβ42/BL21；
步骤二：GST-Aβ42融合蛋白的原核表达及纯化
(5)GST-Aβ42融合蛋白的表达：已构建好的pGEX-4T-1/Aβ42/BL21表达菌株37℃培养4h，按1∶100接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，25℃振摇培养至OD600为1.0～1.2，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，诱导表达2小时，40,000×g离心15min，收集菌体；95℃煮沸5min，SDS-PAGE电泳，GST及Aβ42抗体的Western blot分析证实表达菌中有GST-Aβ42融合蛋白表达；
(6)GST-Aβ42融合蛋白的纯化：每2克菌体以15mL pH 7.4、50mM PBS磷酸盐缓冲液重悬，冰上超声裂解，超声条件为：超5s，停20s，共20分钟；12,000×g离心20min，收集上清，挂Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱，经PBS磷酸盐缓冲液充分洗涤后，以10mM还原性谷胱甘肽溶液洗脱GST-Aβ42融合蛋白，收集洗脱液，即得到纯化的GST-Aβ42融合蛋白；
(7)GST-Aβ42融合蛋白的Western bloting鉴定：将上述GlutathioneSepharose 4B亲和层析洗脱样品分别用抗Aβ42及抗GST抗体进行Westernbloting分析，证实该蛋白为GST-Aβ42融合蛋白；
步骤三：Aβ42蛋白的酶切及鉴定
(8)Aβ42蛋白酶切纯化：纯化得到的GST-Aβ42融合蛋白经10U凝血酶/mg融合蛋白，在pH 7.4、50mM PBS磷酸盐缓冲液体系中于23℃反应16小时，再依次经Glutathione Sepharose 4B亲和柱去除酶切下的GST蛋白，苯甲脒柱去除凝血酶，得到纯的Aβ42蛋白；
(9)Aβ42蛋白的Western bloting鉴定：将上述(8)经酶切及双亲和纯化得到的Aβ42蛋白样品分别用抗Aβ42及抗GST抗体进行Western bloting鉴定，结果显示所得蛋白仅能与抗Aβ42抗体反应，而不能与抗GST抗体反应，证实该蛋白为Aβ42蛋白；
(10)Aβ42蛋白聚集分析：利用能与淀粉样结构特异结合的荧光物质硫磺素-T分析Aβ42蛋白在体外聚集的性质，取30μM纯的Aβ42蛋白溶于pH 7.4、50mMPBS磷酸盐缓冲液，取两亇样本分别置于-20、37℃孵育7天，孵育结束，各组取3.6μL孵育液和120μL用pH 6.0、50mM PBS磷酸盐缓冲液新鲜配制的3.0μM硫磺素-T溶液充分混合，在激发光418nm和发射光486nm下测量荧光强度；结果显示：纯化得到的Aβ42蛋白在37℃下形成聚集体。

2、  如权利要求1所述的重组人淀粉样蛋白Aβ42的应用，其特征是用于制备诊断和治疗老年痴呆相关疾病的蛋白药物或相应疫苗中。

说明书一种重组人淀粉样蛋白Aβ42的制备方法及应用
技术领域
一种重组人淀粉样蛋白Aβ42的制备方法及应用，本发明涉及一种重组人淀粉样蛋白原核表达质粒的构建、表达及纯化方法，属于融合蛋白技术领域。
背景技术
阿尔兹海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种常发于老年人群的神经系统慢性致残致死性疾病，专家们预言它将成为本世纪危害人类健康的第一杀手。我国现有六百万痴呆病人，占全世界的四分之一，随着老龄人口的增加，每年有一百万即每分钟有2个新增病例。因此，开展AD研究具有重大的社会和现实意义。
1984年Glenner首先从AD患者脑脊液中成功地分离出一种相对分子质量约为4.2kD的淀粉样肽，，并测定了其序列，由于其基本结构中含大量β片层，故命名为β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)。Aβ是AD特异神经病理特征-老年斑(Senile Plaques，SP)的主要成分。大量遗传学、病理学和生物化学研究表明，Aβ在脑组织中代谢平衡的破坏导致的聚集沉积，即从Aβ单体到可溶性寡聚体，到原纤维、纤维，最后形成SP的过程，是AD发生、发展的中心环节，是导致神经元变性的重要因素，在AD的病理发展过程中起着成因性的作用。
Aβ来源于β-淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)，APP经β-及γ-分泌酶水解生成含有39～43个氨基酸组成的疏水肽段，很容易形成难溶性沉淀，其中主要成分为Aβ42。当其发生聚集时，即可引起蛋白质和脂质等生物大分子的氧化，最终引起神经元的变性。
近年来，抑制Aβ的聚集及降低其毒性效应已成为AD治疗的重要策略。Aβ抗体与Aβ42肽、tau蛋白等联合检测可用于AD的早期辅助诊断。1999年，Schenk等用合成的Aβ42肽免疫APP转基因鼠，开创了Aβ疫苗治疗和预防AD的新途径。
由于Aβ42肽C末端33-42位氨基酸残基具有高度疏水性，以及28-42位残基形成β折叠构像，直接溶解于水溶液中的Aβ42肽溶解后立即聚集，形成不可溶性的沉淀物，目前研究及临床中应用的Aβ通常是采用化学合成的高纯度的多肽，随着合成肽链的增长，合成难度及费用增加，应用受到限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人淀粉样蛋白Aβ42的制备方法及应用，提供能原核表达人淀粉样蛋白Aβ42的原核表达质粒pGEX-4T-1/Aβ42的构建方法，并将表达载体转化入BL21(DE3)菌种，经诱导表达、纯化及酶切等得到有活性的目的蛋白重组人Aβ42蛋白。该蛋白可用于制备诊断和治疗老年痴呆相关疾病的蛋白药物或相应疫苗中。
本发明的技术方案：一种重组人淀粉样蛋白Aβ42的制备方法，步骤为：
步骤一：原核表达质粒pGEX-4T-1/Aβ42的构建
(1)获得cDNA：提取人神经瘤母细胞SH-SY5Y总RNA，以oligo(dT)为引物，反转合成获得SH-SY5Y细胞cDNA；
(2)引物设计及PCR：检索genbank，依据人淀粉样蛋白Aβ42的序列和载体pGEX-4T-1的多克隆位点设计引物：
上游引物P1：5’-CGGGATCCGATGCAGAATTCCGACATGACTCAG-3’，引入BamHI酶切位点；
下游引物P2：5’-ACGCGTCGACCTACGCTATGACAACACCGCCCA-3’，引入SalI酶切位点及终止密码子TAG；
以人SH-SY5Y细胞cDNA为模板进行PCR扩增，产物片断长度为147bp，扩增条件：Pfu DNA聚合酶，94℃30s，60℃30s，72℃1min条件下扩增30个循环；
(3)将上述(2)所得PCR产物及载体pGEX-4T-1进行BamHI和SalI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳割胶纯化回收酶切产物；将回收的目的片段和载体用T4连接酶连接，连接产物转化入CaCl2处理的新鲜制备的DH5α感受态菌中，混匀后置冰中2分钟，37℃培养1小时，室温离心弃上清，悬浮，平铺于含氨苄青霉素的固体LB培养基中，37℃培养过夜，挑取阳性单菌落克隆；
(4)提取阳性单菌落克隆中的质粒，经测序鉴定为重组的人淀粉样蛋白原核表达质粒pGEX-4T-1/Aβ42；将此重组质粒pGEX-4T-1/Aβ42转入DH5α菌株扩增保种；并提取质粒pGEX-4T-1/Aβ42转入表达菌株E.coli BL21(DE3)中，即成Aβ42的原核表达菌株pGEX-4T-1/Aβ42/BL21；
步骤二：GST-Aβ42融合蛋白的原核表达及纯化
(5)GST-Aβ42融合蛋白的表达：已构建好的pGEX-4T-1/Aβ42/BL21表达菌株37℃培养4h，按1∶100接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，25℃振摇培养至OD600为1.0～1.2，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导表达2小时，40,000×g离心15min，收集菌体；95℃煮沸5min，SDS-PAGE电泳，GST及Aβ42抗体的Western blot分析证实表达菌中有GST-Aβ42融合蛋白表达；
(6)GST-Aβ42融合蛋白的纯化：每2克菌体以15mL pH7.4、50mM PBS磷酸盐缓冲液重悬，冰上超声裂解，超声条件为：超5s，停20s，共20分钟；12,000×g离心20min，收集上清，挂Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱，经PBS磷酸盐缓冲液充分洗涤后，以10mM还原性谷胱甘肽溶液洗脱GST-Aβ42融合蛋白，收集洗脱液，即得到纯化的GST-Aβ42融合蛋白；
(7)GST-Aβ42融合蛋白的Western bloting鉴定：将上述GlutathioneSepharose 4B亲和层析洗脱样品分别用抗Aβ42及抗GST抗体进行Westernbloting分析，证实该蛋白为GST-Aβ42融合蛋白；
步骤三：Aβ42蛋白的酶切及鉴定
(8)Aβ42蛋白酶切纯化：纯化得到的GST-Aβ42融合蛋白经10U凝血酶/mg融合蛋白，在pH 7.4、50mM PBS磷酸盐缓冲液体系中于23℃反应16小时，再依次经Glutathione Sepharose 4B亲和柱去除酶切下的GST蛋白，苯甲脒柱去除凝血酶，得到纯的Aβ42蛋白；
(9)Aβ42蛋白的Western bloting鉴定：将上述(8)经酶切及双亲和纯化得到的Aβ42蛋白样品分别用抗Aβ42及抗GST抗体进行Western bloting鉴定，结果显示所得蛋白仅能与抗Aβ42抗体反应，而不能与抗GST抗体反应，证实该蛋白为Aβ42蛋白；
(10)Aβ42蛋白聚集分析：利用能与淀粉样结构特异结合的荧光物质硫磺素-T分析Aβ42蛋白在体外聚集的性质，取30μM纯的Aβ42蛋白溶于pH 7.4、50mMPBS磷酸盐缓冲液，取两个样本分别置于-20、37℃孵育7天，孵育结束，各组取3.6μL孵育液和120μL用pH 6.0、50mM PBS磷酸盐缓冲液新鲜配制的3.0μM硫磺素-T溶液充分混合，在激发光418nm和发射光486nm下测量荧光强度；结果显示：纯化得到的Aβ42蛋白在37℃下形成聚集体。
所述的重组人淀粉样蛋白Aβ42的应用，其用于制备诊断和治疗老年痴呆相关疾病的蛋白药物或相应疫苗中。
本发明的有益效果：本发明根据人淀粉样蛋白前体蛋白APP的序列和克隆载体pGEX-4T-1多克隆位点，设计人淀粉样蛋白Aβ42的PCR上游引物P1，引入BamHI酶切位点，下游引物P2，引入SalI酶切位点及终止密码子TAG。利用RT-PCR技术，以人SH-SY5Y细胞cDNA为模板进行PCR扩增，其目的基因片段为正常人淀粉样前体蛋白APP基因中从1502到1627的126个bp，产物片断长度为147bp，编码人APP从672到713的Aβ42片段。将Aβ42基因片段序列重组于原核表达载体pGEX-4T-1，构建表达人Aβ42的原核表达质粒pGEX-4T-1/Aβ42。其人Aβ42的N-端含GST蛋白标签和6个氨基酸的凝血酶酶切序列。将pGEX-4T-1/Aβ42转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，经诱导表达、纯化和酶切，得到纯化的有活性的重组人淀粉样蛋白Aβ42。
本发明方法Aβ42蛋白产量高，成本低廉，为AD病疫苗治疗和早期诊断提供了一种价廉有效的工具。
附图说明
图1pGEX-4T-1/Aβ42质粒构建框架图。
具体实施方式
实施例1：pGEX-4T-1/Aβ42质粒构建
(1)获得cDNA：提取人神经瘤母细胞SH-SY5Y总RNA，以oligo(dT)为引物，反转合成获得SH-SY5Y细胞cDNA。
(2)引物设计及PCR：检索genbank，依据人Aβ42的序列和载体pGEX-4T-1的多克隆位点设计引物。
上游引物P1：5’-CGGGATCCGATGCAGAATTCCGACATGACTCAG-3’，引入BamHI酶切位点，
下游引物P2：5’ACGCGTCGACCTACGCTATGACAACACCGCCCA-3’，引入SalI酶切位点及终止密码子TAG。
以人SH-SY5Y细胞cDNA为模板进行PCR扩增，产物片断长度为147bp。扩增条件：Pfu DNA聚合酶，94℃30s，60℃30s，72℃1min条件下扩增30个循环。
(3)PCR产物与载体的双酶切及连接：对上述PCR产物及载体pGEX-4T-1进行BamHI和SalI双酶切(34℃水浴过夜)。经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收酶切产物；将回收的目的片段和载体用T4连接酶连接。
大肠杆菌感受态的制备和连接产物的转化：向经CaCl2处理的新鲜制备的DH5α感受态菌中加入连接产物，混匀后置冰中2分钟，37℃培养1小时，室温离心弃上清，悬浮，平铺于含氨苄青霉素的固体LB培养基中，37℃培养过夜。挑取阳性单菌落克隆。
(4)重组表达质粒鉴定
①菌落PCR：以转化平板上长出的单菌落为模板，采用Aβ上下游引物，或载体pGEX通用引物，PCR鉴定；
②质粒鉴定：提取转化菌落质粒，按1∶100稀释作为模板，采用Aβ上下游引物，或载体pGEX通用引物，PCR鉴定；
③质粒双酶切鉴定：将提取质粒进行BamHI和SalI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后观察有无长度为139bp的目的片断释放；
④重组表达质粒测序：将重组菌落扩大培养后，送公司测序，与genbank中人Aβ42的基因序列进行比对；
经测序鉴定正确，将构建好的重组质粒转入pGEX-4T-1/Aβ42/DH5α菌株扩增保种。并提取质粒pGEX-4T-1/Aβ42转入表达菌株E.coli BL21(DE3)中，即成Aβ42的原核表达菌株pGEX-4T-1/Aβ42/BL21。
实施例2：GST-Aβ42融合蛋白的原核表达及纯化
(5)预表达。将经鉴定序列及插入方向正确的重组质粒转化表达菌株大肠杆菌BL21。空载体pGEX-4T-1表达的GST蛋白分子量为27KD，GST-Aβ42融合蛋白的分子量约为32KD。以1mM IPTG 37℃诱导0，1，3，5小时，1×SDS裂解液融解离心菌体，95℃煮沸5min，SDS-PAGE电泳分析，并做相应抗体(GST和Aβ42)的western blot分析。SDS-PAGE和Western blot均有阳性条带出现，说明GST-Aβ42融合蛋白已在表达菌中表达。
诱导条件优化。已构建好的pGEX-4T-1/Aβ42/BL 21表达菌株分别于37℃或25℃下培养，新鲜菌按1∶100接种，振摇培养至OD600为1.0～1.2，加入不同终浓度的IPTG，诱导表达1～4h，40,000×g离心15min，收集菌体。结果显示最适诱导条件为25℃，1mmol/L IPTG，诱导2h。
超声条件的优化。每2克菌体以15mL PBS磷酸盐缓冲液重悬，菌液于冰上超声裂解，通过检测离心后菌液上清的GST酶活确定最适超声条件为400W、超5s，停20s，共20min。
(6)GST-Aβ42融合蛋白的纯化。将超声裂解液12,000×g离心20min，收集上清，上清挂Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱，经PBS磷酸盐缓冲液充分洗涤后，以10mM还原性谷胱甘肽溶液洗脱融合蛋白，收集洗脱液，即得纯化的GST-Aβ42融合蛋白。
(7)GST-Aβ42融合蛋白的Western bloting鉴定：将上述GlutathioneSepharose 4B亲和层析洗脱样品分别用抗Aβ42抗体及抗GST抗体进行Westernbloting分析，结果显示，洗脱的蛋白不仅能与抗Aβ42抗体反应，同时也能与抗GST抗体反应，证实该蛋白为GST-Aβ42融合蛋白。
实施例3：Aβ42蛋白的酶切及鉴定
(8)Aβ42蛋白酶切纯化：纯化得到的GST-Aβ42融合蛋白经凝血酶，10U/mg融合蛋白，在pH7.4、50mM PBS磷酸盐缓冲液体系中于23℃反应16小时，再依次经Glutathione Sepharose 4B亲和柱去除酶切下的GST蛋白，苯甲脒柱去除凝血酶，得到纯的Aβ42蛋白；
(9)Aβ42蛋白的Western bloting鉴定：将上述经酶切及双亲和纯化得到的Aβ42蛋白样品分别用抗Aβ42抗体与抗GST抗体进行Western bloting鉴定，结果显示，所得蛋白仅能与抗Aβ42抗体反应，而不能与抗GST抗体反应，证实该蛋白为Aβ42蛋白；
(10)Aβ42蛋白聚集分析：利用能与淀粉样结构特异结合的荧光物质硫磺素-T分析Aβ42蛋白在体外聚集的性质。30μM纯的Aβ42蛋白溶于pH7.4、50mM PBS磷酸盐缓冲液，分别置于-20、37℃孵育7天。孵育结束，各组取3.6μL孵育液和120μL新鲜配制的3.0μM硫磺素-T溶液(pH 6.0、50mM PBS磷酸盐缓冲液配制)充分混合，在激发光418nm和发射光486nm下行记录荧光强度。结果显示：纯化得到的Aβ42蛋白在37℃下可形成聚集体。