热稳定的木糖异构酶.pdf

本发明涉及分离的多肽，其包含与选自SEQ ID NO 2、SEQ ID NO21和SEQ ID NO 22的序列具有至少80％一致性的氨基酸序列，还涉及编码这样多肽的多核苷酸以及其在生产果糖糖浆中的用途。

权利要求书
1.  一种分离的多肽，其特征在于其包含与选自SEQ ID NO 2、SEQ IDNO 21和SEQ ID NO 22的序列在所述序列全部长度上具有至少80％一致性的氨基酸序列，其片段和变体。

2.  一种分离的多肽，其包含选自SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 21和SEQID NO 22的氨基酸序列，其片段和变体。

3.  一种分离的多肽，其选自SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 21和SEQ IDNO 22，其片段和变体。

4.  根据权利要求1-3中任一项的多肽，其特征在于其能够将葡萄糖转化为果糖。

5.  一种分离的多核苷酸，其特征在于其编码权利要求1-4中任一项的多肽。

6.  一种分离的多核苷酸，其特征在于其在所述序列全部长度上与权利要求5的多核苷酸具有至少80％的一致性。

7.  一种分离的多核苷酸，其特征在于其包含权利要求5或6的多核苷酸。

8.  一种分离的多核苷酸，其特征在于其包含与选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20的序列在所述序列全部长度上具有至少80％一致性的核苷酸序列，其片段和变体。

9.  一种分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20的核苷酸序列，其片段和变体。

10.  一种分离的多核苷酸，其选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20，其片段和变体。

11.  一种分离的多核苷酸，其特征在于其与权利要求5-10中任一项的多核苷酸互补。

12.  一种分离的多肽，其由权利要求5-11中任一项的多核苷酸所编码。

13.  一种表达载体，其特征在于其包含根据权利要求5-11中任一项的多核苷酸。

14.  一种重组宿主细胞，其特征在于其包含权利要求13的载体。

15.  一种生产根据权利要求1-4或12中任一项所述多肽的方法，其包括在足以生产所述多肽的条件下培养权利要求14的宿主细胞的步骤；和从培养基中回收所述多肽的步骤。

16.  根据权利要求15所述方法可获得的多肽。

17.  选择性结合权利要求1到4、12或16中任一项所述多肽的抗体。

18.  一种生产果糖糖浆的方法，其包括在有效使葡萄糖转化为果糖的条件下将含葡萄糖的组合物与根据权利要求1到4、12或16中任一项所述多肽相接触的步骤。

19.  根据权利要求18的方法，其特征在于反应温度范围是在60℃到110℃，优选80℃到100℃。

20.  根据权利要求18或19的方法，其特征在于所述反应混合物的pH范围是在4.5到8，优选5到7，更优选5到6。

21.  根据权利要求18-20中任一项的方法，其特征在于所述反应在存在至少一种选自Mg2+和Mn2+的二价阳离子的情况下进行。

22.  根据权利要求18-21中任一项所述方法可获得的果糖糖浆，优选高果糖糖浆，更优选高果糖玉米糖浆。

说明书热稳定的木糖异构酶
技术领域
本发明涉及热稳定的木糖异构酶、以及编码这种酶的多核苷酸序列及其用途。
背景技术
木糖异构酶(EC 5.3.1.5)是在体内催化从D-木糖到D-木酮糖的可逆异构化的酶。此外，它能够在体外催化从D-葡萄糖转化为D-果糖，因此也可称为“葡萄糖异构酶”。这后一种活性在工业中可用于生产高果糖玉米糖浆(high fructose corn syrups，HFCS)。
含有55％或更多果糖的HFCS具有比蔗糖更高的增甜力(sweetening power)。因此在食品和饮料工业中对于这样的糖浆有着重要需求，随着HFCS市场的增长，对更有效的木糖异构酶的需求也在增长。
通常，商品化木糖异构酶的最适pH范围是约7.5到约9.0。这把葡萄糖异构化过程中所使用的反应温度限制在约60℃。高于此温度，由于在还原糖和蛋白之间发生非酶促反应(例如美拉德反应)，所以形成不希望的褐变产物。
令人遗憾的是，此温度限制不利于高的葡萄糖转化率。事实上，葡萄糖的异构化达到一种平衡，其在较高温度下朝果糖方向偏移(Tewari，et al.(1984)J.Solut.Chem.13，523-547)。在60℃时，生产出只含有约40％果糖的糖浆。为了生产具有更高果糖浓度的HFCS，需要另外的色谱步骤。显然，希望消除此额外步骤。
在较高温度(例如90-95℃)下进行异构化会带来HFCS中较高的果糖浓度。有利地是，它还可导致更快的反应速率，更高的过程稳定性，降低底物和产物流的粘度，减少微生物污染和更少有形成副产物的问题。但令人遗憾的是，大部分商品化木糖异构酶在这样的高温下不稳定。
已经尝试获得热稳定木糖异构酶，例如通过定点诱变或者通过筛选高度嗜热生物的木糖异构酶活性。例如，US5656497和WO03/062387描述了从高度嗜热的微生物新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)中分离木糖异构酶。来自新阿波罗栖热袍菌的木糖异构酶在97℃下显示出活性。但是它们的活性在90℃下2小时后降低到只有40％，它们的最适pH仍然很高(高于7)。
作为另一个例子，WO2004/044129确认了对高温和低pH下保持高水平活性的木糖异构酶的需要。参考图6-9中所示实验结果，可见此文献中公开的肽只在pH高于5时具有最佳活性(见图6B和6D)，在高于90℃时不稳定(见图8B和8D；分别在1小时后和30分钟后丧失50％的活性)。另外，为了保持高水平活性，这些酶需要钴(Co2+)的存在作为辅助因子(见图9A和9B)。令人遗憾的是，不推荐Co2+用于生产供人消费的果糖糖浆。不仅仅是其与一些可能的健康问题相关，而且其使用后培养基的处理还可造成环境污染。
对特定离子的需要通常取决于木糖异构酶的来源。因此，来自嗜热菌种类例如新阿波罗栖热袍菌和海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的基因编码的木糖异构酶通常需要Co2+。在食品相关的应用中Co2+的可能替代物包括Mn2+和Mg2+。但是，这些通常只在与来自非嗜热或轻微嗜热生物的酶组合时是有效的。事实上，已发现Co2+与Mn2+或Mg2+的作用是不可互换的。换句话说，特定来源的木糖异构酶的活化只在天然相关的辅助因子存在下是可能的(Callens，et al.(1986)Enzyme Microb.Technol.8，696-700；Callens，et al.(1988)Enzyme Microb.Technol.10，675-700；和Gaikward，et al.(1992)Enzyme Microb.Technol.14，317-320)。
因此，理想情况下，适用于食品工业的木糖异构酶应在酸性条件下(即pH约为6或更低)工作以避免褐变反应；其应在较高反应温度下(即85℃或更高)保持稳定以有益于果糖的形成；应不需要使用可能有害的辅助因子例如Co2+；以及应高水平表达以利于生产和降低成本。本发明的目的是提供这样的酶。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供了分离的多肽，特征在于其包含与选自SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 21和SEQ ID NO 22的序列在所述序列全部长度上具有至少80％一致性的氨基酸序列，以及所述多肽的片段和变体。
根据本发明的另一个方面，提供了分离的多核苷酸，特征在于其包含与选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20的序列在所述序列全部长度上具有至少80％一致性的核苷酸序列，以及所述多核苷酸的片段和变体。
根据本发明的另一个方面，提供了表达载体，特征在于其包含如上所定义的多核苷酸；还提供了重组宿主细胞，其包含这种载体。
根据本发明的另一个方面，提供生产如上定义之多肽的方法，其包括在足以生产所述多肽的条件下培养本发明宿主细胞的步骤以及从培养基中回收所述多肽的步骤。
根据本发明的另一个方面，提供选择性结合如上定义之多肽的抗体。
根据本发明的又一个方面，提供生产果糖糖浆的方法，其包括在有效将葡萄糖转化为果糖的条件下使含有葡萄糖的组合物与如上定义之多肽接触；还提供可根据所述方法获得的果糖糖浆。
附图说明
图1.以葡萄糖为底物在不同pH和不同离子辅因子存在下对木糖异构酶活性的比较。将SM-1突变体的表达与从野生型(Sp1、Sp2+Sp5)中克隆得到的基因的表达以及与通过随机诱变产生的其它突变体(1、2、6、16、27+37)表达进行比较(在相同诱导条件下)。在1mM IPTG诱导后，克隆进pET22b(+)的基因在BL21Star(DE3)细胞中表达。
图2.以葡萄糖为底物在pH6.85的马来酸缓冲液中，存在Mg2+和Co2+的情况下，对木糖异构酶活性的比较。在1mM IPTG诱导后，来自不同野生型(Sp1至Sp8)克隆进pET22b(+)的基因在BL21Star(DE3)细胞中表达。
图3.SM-1突变体和市售GENSWEETSGI木糖异构酶之间热稳定性的比较。在表达诱导和热处理(95℃30分钟，板的上部)之后，用葡萄糖作为底物在pH6.85(马来酸缓冲液)在Mg2+和Co2+存在下进行测试。制备多个稀释度。不作热处理重复进行测试作为对照。这些结果显示于板的下半部分。
图4.来自SM-2突变体的总蛋白质提取物的系列稀释物与来自Sp2的总蛋白质提取物(n.d.＝未稀释；2、4和8是稀释倍数)在PAGE凝胶上进行比较。所有总蛋白质提取物在1mM IPTG诱导后获得。对应于木糖异构酶(XIso)的蛋白质条带由箭头指示。
图5.PAGE凝胶，显示染色后的酶表达(SM-1、SM-2、Sp1、Sp2)(左)和质量标准化后的稀释结果(右)。
图6.SM-1和SM-2突变体以及Sp1和Sp2株在90℃在0到180分钟的热稳定性比较。
发明详述
介绍
本发明的目的，如上所述，是提供适用于工业化或商品化生产果糖糖浆的热稳定木糖异构酶(xylose isomerase，xylose isomeraseenzyme)。
本文所用术语“热稳定”指当暴露于高于60℃的温度2个小时仍保持至少40％活性的酶。优选地，本发明的木糖异构酶在60℃到110℃的温度范围中保持稳定，更优选地，在80℃到100℃的温度范围中保持稳定。因此其也可称为“超热稳定”酶。
本发明的酶优选地在酸性条件下也是稳定的。这意味着当它们在高温下接触低于8的pH值2小时仍应保持至少40％的活性。优选地，所述酶在pH4.5到8的范围内、更优选地在5到7的范围内、甚至更优选在5到6的范围内保持稳定。
另外，本发明的酶优选地不需要存在钴离子作为果糖生产的辅助因子。更优选地，它们能够只使用Mn2+和/或Mg2+作为辅助因子将葡萄糖转化为果糖。
最后，当通过标准重组技术生产时，本发明的酶优选以与其它已知木糖异构酶等价或更高的水平表达。
如权利要求中所定义的以及下文详细描述的多肽和多核苷酸满足了本发明的这些目的。
多肽
在本发明的第一个方面，提供了木糖异构酶多肽(本文也称为木糖异构酶)，以及其生物学、工业和商业有用的片段和变体，以及包含其的组合物。
本文所用术语“多肽”指任何大于10个、优选大于100个氨基酸的肽链，不论其处于非折叠、部分折叠还是完全折叠的状态。完全折叠的多肽还可称为“成熟”多肽或蛋白质。
本发明的多肽可以是“独立的”或者可以是更大蛋白质(例如前体或融合蛋白)的一部分。实际上包括另外的氨基酸序列可以是有利的，所述另外的序列含有分泌或先导序列、辅助纯化的序列(例如多组氨酸残基)或用于在重组生产中保持稳定的另外序列。
具体来说，本发明提供分离的多肽，其包含以下部分或由其组成：
(a)与选自SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 21和SEQ ID NO 22的氨基酸序列在其整个长度上具有至少80％一致性、优选至少85％一致性、更优选至少90％一致性、更优选至少95％一致性、更优选至少97％一致性、更优选至少99％一致性以及最优选完全一致的氨基酸序列；
(b)由下述分离多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20的核苷酸序列在其整个长度上具有至少80％一致性、优选至少85％一致性、更优选至少90％一致性、更优选至少95％一致性、更优选至少97％一致性、更优选至少99％一致性以及最优选完全一致的核苷酸序列；或
(c)由下述分离多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与编码根据(a)之多肽的核苷酸序列在其整个长度上具有至少80％一致性、优选至少85％一致性、更优选至少90％一致性、更优选至少95％一致性、更优选至少97％一致性、更优选至少99％一致性以及最优选完全一致的核苷酸序列。
本发明还提供上文所定义之多肽的变体。在本文中，术语“变体”指通过替换、缺失和/或添加至少一个氨基酸而不同于参考多肽但保留其必要特性的多肽。一般来说，差异限于使得参考多肽的序列与变体的序列整体上非常类似，在许多情况下，具有完全一致的大区域。
根据本发明的优选变体具有与参考多肽相似或相同的功能特征，例如仅包含沉默替换、添加或缺失的变体。举例来说，优选变体可包含保守性氨基酸替换，其中一个残基被另一个具有相似特征的残基取代。这种替换的例子包括Ala、Val、Leu和Ile之间；Ser和Thr之间；酸性残基Asp和Glu之间；Asn和Gln之间；碱性残基Lys和Arg之间；以及芳香残基Phe和Tyr之间的改变。
本发明还涉及任何上述多肽的片段。片段是具有与参考多肽的部分(但不是全部)氨基酸序列完全相同之氨基酸序列的多肽。片段可以是“独立的”，或包含在更大的多肽中，以形成其部分或区域。典型片段的例子包括截短型多肽、由宿主细胞产生或者在宿主细胞中产生的降解多肽、以及具有结构或功能特征的片段(例如包含α螺旋、β片层、亲水区、疏水区、底物结合区等的片段)。
优选地，本发明的片段是上文定义的任何多肽(或其变体)的片段，其包含至少50个、更优选至少100个连续氨基酸。理想地，它们能够催化从葡萄糖到果糖的转化。
相对于具有选自SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 21和SEQ ID NO 22的氨基酸序列的成熟多肽，上文所述的同源物、变体和片段优选保留至少20％、更优选至少40％、更优选至少60％，更优选至少80％、更优选至少90％、最优选100％的葡萄糖异构酶活性。
本发明的多肽可以以任何合适方式制备，其包括例如，重组表达或合成生产。这样的方法是本领域公知的。
抗原和抗体
本发明还涉及来源于上述多肽的抗原和能够与其反应的抗体。
抗原(或“抗原性肽”)是全长多肽序列(例如多肽SEQ ID NO2、21或22)的片段，其包含至少6个、优选至少10个、更优选至少15个、更优选至少20个、更优选至少30个连续氨基酸。它应包括该序列的表位(即当处于完全折叠状态时位于多肽表面的序列的区域)，使得针对该片段的抗体能够与全长序列(或者与来自其并含有所述表位的任何序列或部分序列)形成特异性免疫复合物。
本文所用的术语“抗体”指能够特异性结合这类抗原的分子，即免疫球蛋白分子或者这类分子的免疫活性部分，其能够与上文定义之抗原或包含这些抗原的多肽形成免疫复合物。它们可包括但不限于，多克隆、单克隆、嵌合和单链抗体，可使用许多公知技术中任一种来产生(例如标准多克隆或单克隆抗体制备技术)。
多核苷酸
在本发明的另一个方面中，提供了能够编码如上文所定义之木糖异构酶的多核苷酸，以及所述多核苷酸的生物学、工业和商业有用的片段和变体，以及包含其的组合物。
本文所用的术语“多核苷酸”指含有至少10个、优选至少100个核苷酸碱基的任意核苷酸链。所述核苷酸碱基可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，因此所述多核苷酸可以是RNA或DNA分子(不论单链或双链形式)。多核苷酸的例子包括但不限于，未加工RNA、核酶RNA、mRNA、cDNA、基因组DNA和合成DNA。
具体来说，本发明提供分离的多核苷酸，其包含以下部分或由其组成：
(a)与选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20的多核苷酸序列在所述序列全部长度上具有至少80％一致性、优选至少85％一致性、更优选至少90％一致性、更优选至少95％一致性、更优选至少97％一致性、更优选至少99％一致性以及最优选完全一致的多核苷酸序列；
(b)编码与选自SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 21和SEQ ID NO22的氨基酸序列在所述序列全部长度上具有至少80％一致性、优选至少85％一致性、更优选至少90％一致性、更优选至少95％一致性、更优选至少97％一致性、更优选至少99％一致性以及最优选完全一致的多肽的核苷酸序列；
(c)与(b)中定义之多核苷酸在所述序列全部长度上具有至少80％一致性、优选至少85％一致性、更优选至少90％一致性、更优选至少95％一致性、更优选至少97％一致性、更优选至少99％一致性以及最优选完全一致的核苷酸序列；或
(d)与上文(a)-(c)中定义的任一多核苷酸互补、或杂交(优选在严格条件下)的核苷酸序列。为了便于参考，由SEQ ID NO 1、19和20定义的多核苷酸序列表示为DNA序列。当然应理解，这些序列只代表本发明的一个实施方案，所述序列的其它形式(包括，例如，它们的RNA等价物)也落入本发明的范围内。
本发明还提供编码上文定义之任一多肽变体、多肽片段、前体或融合蛋白的多核苷酸。另外，本发明提供这些多核苷酸和上文(a)-(d)中定义之多核苷酸的变体和片段。
在本文中术语“变体”指由于至少一个核苷酸的替换、缺失和/或添加而不同于参考多核苷酸但仍保持其必要特性的多核苷酸。核苷酸序列的改变可以改变或者不改变(例如由于遗传密码的冗余)所编码多肽的氨基酸序列。如果核苷酸序列的变化确实导致所编码氨基酸序列的改变，则此改变优选将不影响所得多肽的功能特征(例如，所述改变将限于保守性氨基酸替换)。
术语“片段”指具有与参考多核苷酸的部分(但不是全部)核苷酸序列完全相同的核苷酸序列的多核苷酸。优选的片段包含至少5个、更优选至少10个、更优选至少50个核苷酸，仅仅作为举例，其可用作鉴定或合成全长多核苷酸序列的引物。以这种方式，有多种可用且本领域技术人员公知的获得全长多核苷酸序列的方法。
所有上述多核苷酸可以是“独立的”或它们可包含一个或多个另外的核苷酸序列。这些另外的序列可以是非编码序列(例如rho依赖或非rho依赖型终止信号、核糖体结合位点、Kozak序列、增强子序列、mRNA稳定序列、内含子和多聚腺苷酸化信号)。它们也可编码另外的氨基酸(例如辅助最终多肽纯化的标记序列)。
本发明的多核苷酸可通过任何合适方式制得，其包括，例如，通过标准克隆技术或合成生产(例如通过聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)或基于核酸序列的扩增(Nucleic AcidSequence-based Amplification，NASBA))。这些方法是本领域公知的。
载体、宿主细胞和表达系统
本发明的多肽可通过本领域技术人员公知的方法制备，所述方法尤其包括通过用适当表达载体(即用包含本发明多核苷酸的表达载体)遗传改造宿主细胞。
因此，本发明还提供：
(a)包含本发明多核苷酸的表达载体；
(b)包含根据(a)之表达载体的宿主细胞；和
(c)通过在合适条件下培养根据(b)的宿主细胞来生产本发明多肽的方法。
本文所用的术语“表达载体”指适于维持、扩增或表达特定多核苷酸序列和/或适于在选定宿主中表达特定多肽的任何载体。某些载体能够在所述宿主中自主复制，而其它一些载体必须整合进宿主并与其一同复制。
通常，本发明的载体是克隆载体，其含有必需调控区(例如诱导型或组成型启动子)以启动和调节所克隆多核苷酸的转录和翻译。所述载体优选地还含有一个或多个选择标记，其允许容易选择已转化的宿主细胞(例如通过生物杀灭剂或病毒抗性或通过对重金属的抗性)。
根据本发明的表达载体可选自任意的本领域已知的大量适合载体。仅仅作为举例，这些包括染色体、附加体和病毒来源的载体(例如来自细菌质粒、来自噬菌体、来自转座子、来自酵母染色体元件或来自病毒的载体，所述病毒例如乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒和逆转录病毒)以及来源于其组合的载体，例如来源于质粒和噬菌体遗传元件的载体(例如粘粒和噬菌粒)。载体的选择可取决于所用宿主的类型。优选地，表达载体是质粒。
本发明的多核苷酸可通过多种公知常规技术中的任一种插入到所选择的表达载体中(例如见下文：Sambrook J.，Fritsch E.F andManiatis T.(1989)“Molecular Cloning：a Laboratory Manual”2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press(ISBN 0-88989-509-8))。
可通过多种公知方法中的任一种将表达载体导入宿主细胞。仅仅作为举例，这些方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位(transvection)、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、缀合(conjugation)、转导、划痕标记(scrape loading)、弹道导入(ballistic introduction)和感染。
术语“宿主细胞”用于指能够接受、维持并增殖重组表达载体的细胞。优选地，所述宿主细胞适于大量生产重组多肽。
合适宿主的例子包括(但不限于)：细菌细胞，例如链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、链霉菌属、蓝细菌和芽孢杆菌属的细胞；真菌细胞，例如酵母(克鲁弗氏酵母属(Kluveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、亚罗酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia))的细胞，担子菌(basidimycete)(念珠菌属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、顶孢霉属(Acremonium)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢霉属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、大角间座壳属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)和木霉属(Trichoderma))的细胞；昆虫细胞例如果蝇属(Drosophila)S2和灰翅夜蛾属(Spodoptera)Sf9的细胞；哺乳动物细胞例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤细胞；植物细胞例如裸子植物或被子植物细胞；和藻类细胞。
这些细胞的培养物在许多保藏单位中是公众可方便获得的，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，DSMZ)、皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、和农业研究服务专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection，Northern Regional Research Centre，NRRL)。
优选地，宿主细胞是细菌或真菌细胞。更优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.Coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞。
为了生产根据本发明的多肽，在合适条件下培养如上文所定义的宿主细胞。合适条件的选择显然取决于所使用的宿主细胞，但是可包括，例如选择合适的营养培养基、培养温度和pH。对于每种类型的宿主细胞，合适的培养条件是本领域中已经建立的。仅仅作为举例，所述细胞可培养于摇瓶中或者小规模或大规模发酵罐中(包括连续、分批、补料分批和固态发酵罐)。
根据一个替代实施方案，本发明的多肽还可例如Zubay G.(Ann.Rev.Genet.7，267-287(1973))所述在体外翻译。
可用任意已知技术实现所述多肽的回收和纯化。这些包括离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、色谱和沉淀。如果所述多肽在宿主细胞中产生并分泌进入培养基，可直接从所述培养基中将其回收。如果所述多肽不分泌，可从细胞裂解物中将其回收。如果所述多肽在无细胞系统(即体外)中产生，可直接从产生它的反应混合物中回收。
令人惊奇的发现，当在相同条件下生产时，本发明的多肽(尤其是SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20的多核苷酸编码的多肽)可以比从野生型新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)中分离到的木糖异构酶序列以高得多的水平表达。
果糖糖浆
本发明的多肽，例如根据上述方法得到的那些多肽，可用于例如将葡萄糖转化为果糖的工业中，因此可用于生产果糖糖浆。
因此，根据本发明的另一个方面，提供了用于生产果糖糖浆的方法，其包括在使葡萄糖转化为果糖的有效条件下将含葡萄糖的组合物与上文所述多肽相接触的步骤。
本发明的果糖糖浆优选含有以重量计至少30％的果糖，更优选至少40％的果糖，更优选至少50％的果糖。根据一个具体实施方案，本发明的果糖糖浆是高果糖玉米糖浆(HFCS)。高果糖玉米糖浆通常含有以重量计41-43％的果糖。优选地，本发明的高果糖玉米糖浆含有以重量计至少50％、更优选至少55％的果糖。
在上述方法中用作底物的含葡萄糖组合物可以是允许生产如上文所定义之果糖糖浆的任何含有足够量葡萄糖的组合物，例如葡萄糖糖浆。但是优选地，所述含葡萄糖组合物是包含至少90％、更优选至少95％葡萄糖(以重量计)的葡萄糖糖浆。
可在本领域已建立的标准反应条件下将葡萄糖转化为果糖。但是优选地，在范围是60℃至110℃、更优选范围是80℃至100℃、更优选范围是85℃至95℃的反应温度下进行。所述反应混合物的pH优选范围是4.5到8，更优选5到7，更优选5到6，最优选5.2到5.7。
除了所述多肽，所述反应混合物还应含有木糖异构酶辅助因子。这优选选自Mg2+、Mn2+和其混合物。所述多肽可以是游离的(例如分批或连续加入)或是固定化的。
根据上述方法获得的果糖糖浆也构成本发明的一部分。它们可用于例如食品和饮料工业，用于生产蛋糕、焙烤产品、软饮料和其它消费品。
本发明优点
本发明的产品和方法有许多优点。以下是这些优点的不完全列表：
-本发明的木糖异构酶在高温下稳定；
-其在低pH下稳定；
-其不需要使用有潜在危险的辅助因子例如Co2+；
-其对Mn2+有非常强的亲和性；
-其以与其它木糖异构酶等价或更高的水平表达；
-其允许产生高含量的果糖糖浆；
-使用本发明的酶生产的果糖糖浆不需要进一步纯化(例如通过另外的色谱步骤)；
-在葡萄糖转化为果糖期间减少或消除了褐变反应；
-增加反应速率；
-减少微生物污染；
-等等。
一般定义
本文所用术语“一致性”指两个或更多个多肽或多核苷酸序列之间的关系。具体地，它指这些序列之间的序列相关性程度。两个序列之间的相关性程度(或“一致性百分数”)很容易通过已知方法使用广泛可用的计算机软件进行计算。一个这样方法的例子是ClustalW方法，其可从www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html得到。为便于参考，具有特定程度一致性的序列在本文中被称为“同源物”。
在提到多核苷酸序列时，表述“在所述序列全部长度上的一致性”指在该序列整个开放读码框上与参考序列具有特定程度一致性的序列。
术语“互补”指可与参考序列形成双链结构的核酸序列。“完全互补”序列是每个核酸碱基都与其参考序列上对应碱基互补的序列(例如G对C和A对T)。
对于杂交来说，术语“严格条件”指杂交只在序列间有至少95％、优选至少97％一致性的时候发生。杂交条件是本领域公知的，例如见Sambrook，et al.(同上)。
如本文所用的与多肽和多核苷酸相关的术语“分离”是指从它们的天然或原始环境中改变和/或移出的化合物。例如，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”。但是，与其天然状态下共同存在的材料分开的相同多核苷酸或多肽被称为“分离的”。另外，导入生物体(例如通过转化或遗传操作)的多核苷酸或多肽是“分离的”，即使其仍然存在于所述生物中。
本文所用的表述“编码多肽的多核苷酸”指能够编码本发明多肽的多核苷酸，其或者是在单个连续区域中或者是在不连续区域中(例如，由整合的噬菌体、整合的插入序列、整合的载体序列或整合的转座子序列分隔开的多核苷酸)，任选地还带有其它的可含有编码和/或非编码序列的区域。
通过下述实施例来进一步描述本发明，所述实施例不应视作对本发明范围的限制。除非另外详细描述，使用标准技术实施下述实施例，所述技术是本领域技术人员公知且常规的。
实施例1.合适的木糖异构酶多核苷酸序列的鉴定
介绍
实施下述步骤以产生能够编码适于工业应用的木糖异构酶的多核苷酸序列：
(i)将从新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(DSM-5068)和高温厌氧芽孢杆菌(Thermoanaerobacterium sp.)(DSM-8685)的木糖异构酶基因木糖异构酶基因获得的重组嵌合体形式的突变克隆入合适质粒表达载体中，并将此载体转化入大肠杆菌的模式菌株中；
(ii)使用来自许多野生型菌株(Sp1到Sp8)的木糖异构酶基因重复步骤(i)。这些菌株包括其木糖异构酶基因序列被用做产生步骤(i)嵌合体基础的菌株(分别为Sp2和Sp1)。
(iii)比较步骤(i)的嵌合突变体酶和步骤(ii)的野生型木糖异构酶的表达和活性。活性方面，所述比较集中于在高温、低pH和存在Co2+、Mg2+和Mn2+离子(单独或组合)的情况下从葡萄糖糖浆向果糖糖浆的转化。
(iv)确定嵌合突变体木糖异构酶基因的核苷酸序列，并预测其对应的氨基酸序列；
(v)进行多轮随机诱变以提高步骤(i)的嵌合突变体木糖异构酶的特性；
(vi)表达新的突变体，针对所期望特性进行筛选；
(vii)确定新选择的突变体木糖异构酶基因的核苷酸序列，推导其所编码酶的氨基酸序列。
材料和方法
·木糖异构酶基因的细菌野生型来源
从DSMZ(Deutsche Sammlung von Microorganismen undZellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)购买下述菌株：高温厌氧芽孢杆菌(Thermoanaerobacterium sp.)(DSM-8685)，下文称之为Sp1。
新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(DSM-5068)，下文称之为Sp2。
Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes(DSM-2229)，下文称之为Sp3。
Thermoanaerobacterium saccharolyticum(DSM-7060)，下文称之为Sp4。
海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(DSM-3109)，下文称之为Sp5。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(DSM-4424)，下文称之为Sp6。
嗜热栖热菌(Thermus termophilus)(DSM-579)，下文称之为Sp7。
下述菌株获得自国家农业应用研究中心ARS培养物保藏中心(Peoria，Illinois，USA)：
节杆菌(Arthrobacter)(NRRL-B3728)，下文称之为Sp8。
生长条件：Sp1到Sp5菌株生长于厌氧条件；Sp6、Sp7和Sp8菌株生长于有氧条件。DSM菌株的生长培养基和温度条件是DSMZ网页上所建议的(http://www.dsmz.de/strains)。采用营养琼脂和肉汤培养Sp8。
·用于质粒转化的细菌宿主菌株
大肠杆菌TOP10(Invitrogen)和BL21 StarTM(DE3)(Invitrogen)分别用作克隆和表达用途的宿主菌株。在标准Luria-Bertani(LB)培养基中培养在液体或固体平板，在需要时，所述培养基中加入了100μg/ml羧苄青霉素(SIGMA)。
·基因组DNA提取
获自Sp1至Sp8菌株的细菌培养物的约300mg细菌沉淀被用来进行基因组DNA提取，其通过“WizardMagnetic-DNAPurification System For Food”试剂盒(Promega)进行。通过不锈钢珠和打浆器(Beat Beater)进行细胞的机械破碎。用ddH2O洗脱DNA，通过标准凝胶电泳进行定量，取小份试样直接用于PCR。
·引物设计
Sp1至Sp8菌株的木糖异构酶基因的DNA序列获自Genbank。设计互补于每个基因末端部分的正向和反向PCR引物。将编码pET22b(+)的限制性位点NdeI上游和SacI下游的序列的5’尾分别加到正向和反向引物上。所设计的反向引物在载体所编码的多组氨酸区之前含有两个终止密码子。上文所述的尾随后用作“通用”正向和反向引物，例如用于回收和进一步克隆随机诱变的基因。
使用热力学预测(可见，例如，Tinoco，et al.(1973)NatureNew Biol.246，40-41；Gralla，et al.(1973)J.Mol.Biol.73，497-511；Papanicolau，et al.(1983)Nucleic Acids Res.12，31-44；和Freier，et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.83，9373-9377)和自制软件设计引物。制得下述引物：
  引物名  5’-3’序列  XIsoSp1-Nde-F  SEQ ID NO 3  XIsoSp1-Sac-R  SEQ ID NO 4  XIsoSp2-Nde-F  SEQ ID NO 5  XIsoSp2-Sac-R  SEQ ID NO 6  XIsoSp3&4-Nde-F  SEQ ID NO 7  XIsoSp3&4-Sac-R  SEQ ID NO 8  XIsoSp5-Nde-F  SEQ ID NO 9  XIsoSp5-Sac-R  SEQ ID NO 10  XIsoSp6-Nde-F  SEQ ID NO 11  XIsoSp6-Sac-R  SEQ ID NO 12
  XIsoSp7-Nde-F  SEQ ID NO 13  XIsoSp7-Sac-R  SEQ ID NO 14  XIsoSp8-Nde-F  SEQ ID NO 15  XIsoSp8-Sac-R  SEQ ID NO 16  通用-Nde-F  SEQ ID NO 17  通用-Sac-R  SEQ ID NO 18
注意：设计了相同的引物用于扩增Sp3和Sp4的木糖异构酶基因，因为它们具有相同的末端序列。
·木糖异构酶基因的扩增和克隆
PCR反应混合物，50μl体积，含有10ng基因组DNA、15pmol每种引物、10μl PlatinumPfx扩增缓冲液、0.3mM每种dNTP、1mM MgSO4、1.25单位PlatinumPfx DNA聚合酶(Invitrogen)。热循环参数由以下组成，最初变性步骤94℃ 5分钟，然后是50个循环的94℃ 15秒、54和64℃之间的退火温度(取决于引物对)30秒和68℃ 2分钟。
通过取小份反应试样在1.3％ TAE琼脂糖凝胶上电泳来检测1.4kb产物的扩增。使用QIAquickPCR纯化试剂盒或QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化PCR产物，然后将其克隆入pET22b(+)的NdeI和SacI位点。所使用的限制性酶购买自Promega、Fermentas或New England BioLabs。使用限制性内切核酸酶消化DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，用Shrimp碱性磷酸酶(Promega)对载体去磷酸化，用T4 DNA连接酶(New EnglandBioLabs)连接DNA片段，以上均使用标准分子生物学技术完成(Sambrook，et al.同上)，并遵从制造商的建议(在需要时有小的改动)。
通过电穿孔将克隆进pET22b(+)的木糖异构酶基因转化进大肠杆菌BL21 StarTM(DE3)细胞。按照Ausubel I.等所述的方案完成细胞准备(“Current Protocols in Molecular Biology”(1994-2000)John Wiley Sons Inc.(ISBN 0-471-50338-X))。约150μl细胞悬液在2mm电极间隙杯中用Gene PulserII装置(Bio-Rad)进行电穿孔。设置工作参数为2.5kV，25μF和200Ohm。
·序列分析和比较
使用下述程序比对一些木糖异构酶基因的序列(来自Genbank)：
ClustalW(www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html)；
NCBI Blast2(www.ebi.ac.uk/blastall/index.html)；和
EMBOSS(http://emboss.sourceforge.net)。
此比对提供了工具，用以预测所需特性和鉴定可能的稳定mRNA二级结构，所述结构可抑制翻译起始和正确终止。
·嵌合突变体的生产
基于上述比对，在不破坏正确读码框的情况下，使用改造的PCR引物将BclI限制性位点引入到Sp2和Sp1的木糖异构酶基因中。
通过PCR，制备了包含Sp2木糖异构酶基因的完整5’部分和3’末端部分中BclI位点的DNA片段。也制备了包含Sp1木糖异构酶基因的完整3’部分和5’末端部分中BclI位点的DNA片段。在与上述相同条件下使用PlatinumPfx DNA聚合酶(Invitrogen)在56℃退火温度下实现这些扩增。通过QIAquick凝胶提取试剂盒纯化DNA产物。然后用20单位BclI(Fermentas)在55℃切割500ng每种扩增片段3个小时。
如上文所述从凝胶纯化期望的限制性产物，并取其小份进行连接。总量100ng的DNA放入终体积20μl的反应中。16℃过夜孵育后，通过在70℃加热10分钟终止所述反应，立即置于冰上，通过QIAquickPCR纯化试剂盒进行纯化。使用“通用引物”和上述PCR方案回收连接产物。
通过QIAquick凝胶提取试剂盒纯化预期大小的扩增产物，用NdeI和SacI消化，然后克隆进pET22b(+)的相应限制性位点。通过电穿孔转化入TOP10或BL21 StarTM(DE3)大肠杆菌细胞，在含100μg/ml羧苄青霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂平板上孵育过夜。
·随机诱变
将随机突变导入被克隆进pET22b(+)的NdeI和SacI限制性位点内的木糖异构酶嵌合基因突变体中。用上文所述“通用引物”进行PCR。所述反应混合物，根据Cadwell和Joyce的方案(1992-PCRMeth.Appl.2，28-33)，在50μl反应体积中含有2ng嵌合基因DNA、30pmol每种引物、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3)、7.0mMMgCl2、0.5mM MnCl2、1mM dCTP、1mM dTTP、0.2mM dATP、0.2mM dGTP和2.5单位AmpliTaq DNA聚合酶(AppliedBiosystems)。在最初的94℃3分钟的变性步骤后，设置循环参数为40个循环的94℃30秒、54℃30秒和72℃1分钟。
将反应物在1.3％琼脂糖凝胶上进行电泳来检测1.4kb产物的扩增。使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化PCR产物，然后将其连入去磷酸化pET22b(+)的NdeI和SacI位点，如上所述。
对于下述多轮随机诱变，使用来自所选突变体的基因作为模板。进行3轮随机诱变。每次筛选约10000个样品的库，选择最佳候选物，对其进行下一轮诱变。
通过电穿孔转化入大肠杆菌BL21 StarTM(DE3)细胞，在含100μg/ml羧苄青霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂平板上孵育过夜。
·寡核苷酸合成和DNA测序
由MWG(Ebersberg，Germany)进行PCR引物合成和DNA测序。
·在96孔板中培养重组克隆，细胞热裂解和对葡萄糖异构化检测
将单菌落转移到96孔板中，每个孔含有100μl LB和终浓度为100μg/ml的羧苄青霉素。在轨道摇床上以200rpm 37℃过夜培养平板使得细胞生长。将55μl培养物从每个孔转移到另一个板中。母板保存于+4℃，以保存原始克隆。将5μl LB基质中的IPTG溶液加入子板中，使得IPTG终浓度为1mM。所述板又在轨道摇床上以200rpm 37℃培养8个小时。进行95℃30分钟的热处理步骤，然后加入60μl包含葡萄糖作为底物的缓冲溶液(见下文)。将板密封，在60℃烘箱中放置20-24小时。使用Kennedy和Chaplin提出的硫酸方法(1975-Carbohydrate Res.40，227-233)定量检测D-果糖：在室温下将之冷却下来后，加入120μl的66％硫酸，紧密密封每个板，在60℃孵育30-60分钟。通过在微板读数器(BMG)上使用405nm滤光片读数确定显色程度。从母板回收所选择的在确定阈值之上的样品，在更大的体积中培养之后进一步进行研究(见下文)。每个板上带有“空”pET22b(+)或克隆进pET22b(+)的来自Sp1至Sp8的木糖异构酶基因的BL21 StarTM(DE3)细胞粗提物被用作参考对照。所有涉及微板的操作均手动进行，或者通过HT自动工作站(Beckman-Coulter)进行。
·在50ml管中培养重组克隆，细胞酶促裂解和对葡萄糖异构化的检测
单菌落来源的细胞预培养物在3ml含终浓度100μg/ml羧苄青霉素的LB中培养过夜。取一百微升接种于含有10ml含100μg/ml羧苄青霉素的LB培养基的50ml聚丙烯管中，使之在轨道摇床上以250rpm在37℃培养20小时。加入IPTG至终浓度1mM，在轨道摇床上以250rpm在37℃继续生长8小时。
弃去上清，加入1/5培养体积的BugBusterHT(Novagen)以及1/75培养体积的rLysozymeTM(Novagen)裂解沉淀。后一组分在临用前以1∶750(w/v)溶解于50mM TrisCl pH7.8。裂解在室温进行30分钟。不时人工摇动管。室温以4200×g离心样品10分钟，然后将60μl的上清转移到96孔微板。进行95℃30分钟的热处理步骤，然后加入60μl底物和缓冲溶液。将板密封，置于60℃孵箱20-24小时。在室温下将所述板冷却下来后，加入120μl 66％的硫酸，将板紧紧密封，在60℃孵育30-60分钟。通过在微板读数器(BMG)上使用405nm滤光片读数确定显色程度。
使用如上所述的相同酶活性对照。市售木糖异构酶制备物，如GENSWEETSGI(Genencor)用作参考对照。
·用于酶测试的缓冲液条件
在100mM马来酸缓冲液pH6.85或50mM醋酸钠缓冲液pH5.2中进行酶测试。在加入细胞裂解粗提取物后，最终pH值显示提高约0.5-0.6个pH单位。加入D-葡萄糖作为底物，其终浓度为12.5％。通过加入终浓度为10mM的MgSO4、终浓度0.5mM的CoCl2和终浓度5mM的MnCl2确定金属阳离子的作用。单独或组合评价所述离子的作用(MgSO4+CoCl2和MgSO4+MnCl2)。
结果与讨论
最佳木糖异构酶突变体，为清楚起见下文称之为SM-1，由SEQ ID NO 1给定的序列编码(其中下划线显示导入的BclI位点，其如上所述连接原始的Sp1和Sp2片段)，其推断出的蛋白质序列表示为SEQ ID NO 2。所述突变体在细胞质中细胞内表达，已除去了pET22b(+)载体的NdeI和SacI限制性位点之间编码的pelB前导肽。此突变体和其它所有突变体以类似于天然的构象产生，即没有任何氨基或羧基端延伸。对SM-1以及也克隆在pET22b(+)/BL21 StarTM(DE3)系统中的其它物种(Sp1至Sp8)基因编码的木糖异构酶的性能进行比较。具体来说，在不同缓冲液条件和存在不同离子组合的情况下监测酶活性(图1和图2)。通过PAGE分析对表达水平进行进一步分析。
在60℃测试酶性能，但之前经过95℃30分钟的加热步骤，其不只裂解生长于微板的细菌细胞，还消除了不耐热蛋白以及具有低效热性能的突变木糖异构酶的背景。从所示数据中明显看出，在这些条件下，所选突变体SM-1显示了相比于市售木糖异构酶如GENSWEETSGI更高的耐热性(图3)。所述突变体的耐热性非常类似于来自新阿波罗栖热袍菌(Sp2)和海栖热袍菌(Sp5)的超嗜热木糖异构酶。当与其它高嗜热物种比较时，以葡萄糖作底物的所述酶的性能在pH7.5以及Mg2+和Co2+存在下更高，在pH5.7以及Mg2+和/或Mn2+存在下(单独或组合)高了更多(图1)。所选突变体SM-1的蛋白质表达类似于新阿波罗栖热袍菌(Sp2)。
由于这些原因，由所选突变体SM-1产生的木糖异构酶可用于在高温、低pH和不存在Co2+离子条件下将葡萄糖高效转化为果糖。
实施例2.木糖异构酶的表征
介绍
进行测试以更好地表征两种新的改进的木糖异构酶：
·SM-1(对应于SEQ ID NO 1和2)
·SM-2(对应于SEQ ID NO 19和21)
为了比较，对两种野生型酶也进行了相同的测试：
·Sp1(来自非热稳定高温厌氧芽孢杆菌的木糖异构酶)
·Sp2(来自热稳定新阿波罗栖热袍菌的木糖异构酶)
如下有三个目的：
·酶质量的标准化。通过凝胶染色评估所表达酶的浓度。然后将每种酶稀释以得到相同的最终质量浓度。
·酶热稳定性评价。将酶在90℃孵育6个不同时间(其时间范围为30-180分钟)后测定其活性。通过用硫酸对酶产物染色和用620nm滤光片读取吸光度来进行活性测量。
·质量特异性酶活性评价。测试不同的条件(pH从5.2到6.85，辅助因子Co-Mn-Mg，温度60℃，孵育时间24小时)。通过HPLC分析进行活性测量。
木糖异构酶突变体表达水平的PAGE分析
如上所述进行SM-2和Sp2的细胞培养和表达诱导，其具有如下改动：
将单菌落接种于含10ml LB培养基+100μg/ml的羧苄青霉素的50ml聚丙烯管，使之在轨道摇床上以250rpm在37℃生长48-72小时。加入IPTG达到终浓度为1mM，在轨道摇床上以250rpm在37℃进行约24小时的诱导步骤。取5毫升在+4℃以4200×g离心20分钟。弃去上清，加入1ml的BugBusterHT(Novagen)和70μl的rLysozymeTM(Novagen)到所述沉淀，后者在临用前溶解(1∶750(w/v)溶于50mM TrisCl pH8.0)。涡旋混合后，室温进行25分钟裂解。定时用手摇动管。所述样品以4200×g在4℃再次离心20分钟。粗提物，即上清，含有待研究的可溶性蛋白组分，将其保存于+4℃。
对于PAGE分析，使用预制的NuPAGENovex Bis-Tris凝胶(Invitrogen)，10％聚丙烯酰胺，1mm宽，含有10孔或15孔，在Xcell SureLockTM Mini-cell中进行蛋白质电泳(Invitrogen)。在冰上，3或2μl粗提物被等分到1.5ml聚丙烯管中。加ddH2O至6.5μl体积。加1μl的NuPAGE还原剂10×(Invitrogen)和2.5μl的NuPAGELDS样品缓冲液4×(Invitrogen)至10μl终体积。用移液器混匀样品，并离心下来。紧密闭合所述管，样品在70℃水浴变性10分钟。
在NuPAGEMOPS SDS电泳缓冲液1×(Invitrogen)中进行电泳。内槽中所含的200ml缓冲液补充500μl的NuPAGE还原剂10×(Invitrogen)。使用微量加样器加入2至5μl之间的变性样品。3μl的SeeBluePlus2预染标准(Invitrogen)用作蛋白质分子量标准。木糖异构酶基因的预期分子质量是约50kDa。根据说明，电泳在200伏恒压进行50分钟。在轻微搅拌下每个凝胶在20ml的SimplyBlueTM SafeStain(Invitrogen)中染色1小时，在蒸馏水中脱色约1小时。结果在图4中显示。
酶质量标准化
如上所述表达SM-1、SM-2、Sp1和Sp2酶。使用Novogen的BugBuster HT方法提取它们。然后在BugBuster HT试剂中按如下稀释提取物：SM-1 1∶1，SM-2 1∶8，Sp1 1∶5和Sp2 1∶1。
图5显示凝胶染色后表达的酶(左)和质量标准化后的稀释结果(右)。如图中所见，SM-2具有比野生型热稳定酶Sp2高得多的表达水平。
热稳定性评价
每种酶在90℃在1ml管中(150μl)孵育0、30、60、90、120、150和180分钟。然后，将60μl热处理的酶提取物和60μl底物缓冲液(马来酸+Co+Mg+25％葡萄糖，pH6.85)置于微板中，在60℃孵育8小时，以评价残余酶活性。最后，再在60℃与120μl硫酸(66％)孵育1小时。通过用硫酸染色酶产物和使用620nm滤光片的吸光度读数获得活性测定。结果显示于图6。
如预期的，参考酶Sp1不是热稳定的，在很短时间内丧失活性。SM-2显示热稳定性，其等效于野生型热稳定酶Sp2。有趣的是，SM-1具有比Sp2高得多的稳定性。
质量特异性酶活性的评价
如上所述制备稀释的酶提取物。然后，将100μl的每种提取物与400μl的每种缓冲液1-12(如下表所示)在60℃孵育24小时。
如下所述制备所述缓冲液：
·醋酸钠/醋酸缓冲液底物(pH5.2)
1.000ml基础溶液的成分：
276.4g一水合二葡萄糖
52.50ml醋酸(CH3COOH)溶液(0.2M)
197.50ml醋酸钠溶液(0.2M)
底物n°1＝加100ml MgSO4溶液(0.2M)
底物n°2＝加100ml MnCl2溶液(0.1M)
底物n°3＝加100ml MgSO4溶液(0.2M)+100ml MnCl2溶液(0.1M)
底物N°4＝加10ml CoCl2*6H2O溶液(0.1M)
底物N°5＝加10ml CoCl2*6H2O溶液(0.1M)+100ml MgSO4溶液(0.2M)
底物N°6＝加10ml CoCl2*6H2O溶液(0.1M)+100ml MnCl2溶液(0.1M)
·马来酸缓冲液底物(pH 6.85)
1.000ml基础溶液的成分：
276.4g一水合葡萄糖
23.2g马来酸
底物n°8＝加100ml MgSO4溶液(0.2M)
底物n°9＝加100ml MnCl2溶液(0.1M)
底物n°10＝加100ml MgSO4溶液(0.2M)+100ml MnCl2溶液(0.1M)
底物n°11＝加10ml CoCl2*6H2O溶液(0.1M)
底物n°12＝加10ml CoCl2*6H2O溶液(0.1M)+100ml MgSO4溶液(0.2M)
底物n°13＝加10ml CoCl2*6H2O溶液(0.1M)+100ml MnCl2溶液(0.1M)
用氢氧化钠溶液(8M)在25℃调节pH到6.85
孵育之后，过滤每个样品，通过HPLC进行分析。结果显示于下表：

如这些结果所示，即使在低pH和不存在Co的情况下(测试1-3)，本发明的酶(SM-1和SM-2)仍保持高水平的活性(例如，在测试2和3中，分别比参考热稳定酶Sp2高16倍和17倍以上)。事实上，SM-1在低pH和不存在Co的情况下(测试2，活性＝21.1)具有与Sp2酶在较高pH和存在Co的情况下(测试11，活性＝23.88)相当的性能。SM-1和SM-2对Mn离子也显示出非常强的亲和性。
序列表
SEQ.ID.NO.1
ATGGCTGAATTCTTTCCAGAAATCCCGAAAGTGCAGTTCGAAGGCAAAGAAA
GCACAAATCCACTTGCGTTCAAGTTCTACGATCCAGAAGAGATCATCGACGG
CAAACCCCTCAAGGACCATCTGAAGTTCTCCGTTGCCTTCTGGCACACCTTCG
TGAACGAGGGAAGGGATCCCTTCGGAGACCCAACGGCCGATCGTCCATGGA
ACAGGTACACCGATCCAATGGACAAGGCTTTTGCAAGGGTGGACGCCCTTTT
TGAATTCTGCGAAAAACTCAACATCGAGTACTTCTGCTTCCACGACAGAGAC
ATCGCTCCCGAGGGAAAAACGCTGAGGGAGACAAACAAAATTTTGGACAAA
GTAGTGGAGAGAATCAAAGAGAGAATGAAAGACAGCAACGTGAAGCTCCTC
TGGGGTACTGCAAACCTCTTTTCCCACCCAAGGTACATGCATGGTGCAGCGA
CAACCTGCAGTGCTGATGTTTTTGCGTACGCGGCCGCCCAGGTGAAAAAGGC
CCTTGAGATCACCAAAGAACTTGGAGGAGAAGGGTACACATCCTGGGGTGGA
AGAGAAGGATACGAAACACTCCTCAACACGGACCTTGGATTCGAACTTGAAA
ACCTCGCCCGCTTCCTCAGAATGGCTGTGGATTATGCAAAAAGGATCGGTTTC
ACCGGACAGTTCCTCATCGAACCAAAACCGAAAGAACCCACCAAACACCAGT
ACGACTTCGACGTTGCAACCGCCTATGCCTTCCTGAAGAGCCACGGTCTAGA
TGAGTACTTCAAGTTCAACATTGAAGCGAACCACGCGACACTTGCCGGTCAC
ACATTCCAGCACGAACTGAGGATGGCAAGGATCCTCGGAAAACTTGGAAGCA
TCGACGCCAACCAGGGAGATCTCCTGCTCGGCTGGGACACCGACCAGTTCCC
AACGAACATCTACGACACAACACTTGCCATGTACGAAGTGATCAAGATGGGG
GGATTTGACAAAGGCGGCCTTAACTTCGATGCAAAAGTAAGACGTGCTTCAT
TTGAGCCAGAAGATCTTTTCTTAGGTCACATAGCTGGAATGGATTCTTTTGCA
AAAGGCTTCAAGGTTGCTTACAAGCTTGTGAAAGATGGCGTTTTCGACAAGT
TTATCGAGGAAAGATACGCAAGCTACAAAGATGGCATTGGCGCTGATATTGT
AAGTGGAAAGGCTGACTTCAAGAGCCTTGAGAAGTATGCATTAGAGCACAGC
CAGATTGTCAACAAATCAGGAAGACAAGAGCTATTGGAGTCAATCCTAAATC
AGTATTTGTTTGCAGAATGA
SEQ.ID.NO.2
MAEFFPEIPKVQFEGKESTNPLAFKFYDPEEIIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEG
RDPFGDPTADRPWNRYTDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGK
TLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVF
AYAAAQVKKALEITKELGGEGYTSWGGREGYETLLNTDLGFELENLARFLRMA
VDYAKRIGFTGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKSHGLDEYFKFNIEANH
ATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNIYDTTLAMYEV
IKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGHIAGMDSFAKGFKVAYKLVKDGV
FDKFIEERYASYKDGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQIVNKSGRQELLESILNQ
YLFAE
SEQ.ID.NO.3
ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGAAT
GTATCTAAA
SEQ.ID.NO.4
AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATCATTCTGCAAACAAATACTGATT
SEQ.ID.NO.5
ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTGAATTCTTTCCAGAA
A
SEQ.ID.NO.6
AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATCACCTCAGTTCCAGAATGGTC
SEQ.ID.NO.7
ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGAAC
GTATCTAAA
SEQ.ID.NO.8
AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATTATTCTGCAAACAAATACTGATTTAG
SEQ.ID.NO.9
ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCAGAATTTTTCCCAGAA
A
SEQ.ID.NO.10
AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATCACCTCAGTTCTGCTATTGTCTTC
SEQ.ID.NO.11
ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTCAATCTCATTCCAGT
SEQ.ID.NO.12
AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATTATACTTCTAAAATGTATTGGTTCAATAT
SEQ.ID.NO.13
ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTACGAGCCCAAACCGGA
SEQ.ID.NO.14
AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATCACCCCCGCACCCCCAG
SEQ.ID.NO.15
ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGCGTTCAGCCGACC
SEQ.ID.NO.16
AGCTTGTCGACGAGCTCTTTATTAGCGGGAGCCGAGCAG
SEQ.ID.NO.17
ATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG
SEQ.ID.NO.18
AGCTTGTCGACGAGCTCTTTA
SEQ.ID.NO.19
ATGGCTGAATTCTTTCCAGAAATCCCGAAAGTACAGTTCGAAGGCAAAGAAA
GCACAAATCCACTTGCGTTCAAGTTCTACGATCCAGAAGAGGTCATCGACGG
CAAACCCCTCAAGGACCATCTGAAGTTCTCCGTTGCCTTCTGGCACACCTTCG
TGAACGAGGGAAGGGATCCCTTCGGAGACCCAACGGCCGATCGTCCATGGA
ACAGGTACACCGATCCAATGGACAAGGCTTTTGCAAGGGTGGACGCCCTTTT
TGAATTCTGCGAAAAACTCAACATCGAGTACTTCTGCTTCCACGACAGAGAC
ATCGCTCCCGAGGGAAAAACGCTGAGGGAGACAAACAAAATTTTGGACAAA
GTAGTGGAGAGAATCAAAGAGAGAATGAAAGACAGCAACGTGAAGCTCCTC
TTGGGTACTGCAAACCTCTTTTCCCACCCAAGGTACATGCATGGTGCAGCGAC
AACCTGCAGTGCTGATGTTTTTGCGTACGCGGCCGCCCAGGTGAAAAAGGCC
CTTGAGATCACCAAAGAACTTGGAGGAGAAGGGTACGTATTCTGGGGTGGAA
GAGAAGGATACGAAACACTCCTCAACACGGACCTTGGATTCGAATTTGAAAA
CCTCGCCCGCTTCCTCAGAATGGCTGTGGATTATGCAAAAAAGATCGGTTTCA
CCGGACAGTTCCTCATCGAACCAAAACCGAAAGAACCCACCAAACACCAGTA
CGACTTCGACGTTGCAACCGCCTATGCCTTCCTGAAGAGCCACGGTCTAGAT
GAGTACTTCAAGTTCAACATTGAAGCGAACCACGCGACACTTGCCGGTCACA
CATTCCAGCACGAACTGAGGATGGCAAGGATCCTCGGAAAACTTGGAAGCAT
CGACGCCAACCAGGGAGATCTCCTGCTCGGCTGGGACACCGACCAGTTCCCA
ACGAACGTCTACGACACAACACTTGCCATGTACGAAGTGATCAAGATGGGGG
GATTTGACAAAGGCGGCCTTAACTTCGATGCAAAAGTAAGACGTGCTTCATT
TGAGCCAGAAGATCTTTTCTTAGGTCACATAGCTGGAATGGATTCTTTTGCAA
AAGGCTTCAAGGTTGCTTACAAGCTTGTGAAAGATGGCGTTTTCGACAAGTTT
ATCGAGGAAAGATACGCAAGCTACAAAGATGGCATTGGCGCTGATATTGTAA
GTGGAAAGGCTGACTTCAAGAGCCTTGAGAAGTATGCATTAGAGCACAGCCA
GATTGTCAACAAATCAGGAAGACAAGAGCTATTGGAGTCAATCCTAAATCAG
TATTTGTTTGCAGAATGA
SEQ.ID.NO.20
ATGGCTGAATTCTTTCCAGAAATCCCGAAAGTACAGTTCGAAGGCAAAGAAA
GCACAAATCCACTTGCGTTCAAGTTCTACGATCCAGAAGAGGTCATCGACGG
CAAACCCCTCAAGGACCATCTGAAGTTCTCCGTTGCCTTCTGGCACACCTTCG
TGAACGAGGGAAGGGATCCCTTCGGAGACCCAACGGCCGATCGTCCATGGA
ACAGGTACACCGATCCAATGGACAAGGCTTTTGCAAGGGTGGACGCCCTTTT
TGAATTCTGCGAAAAACTCAACATCGAGTACTTCTGCTTCCACGACAGAGAC
ATCGCTCCCGAGGGAAAAACGCTGAGGGAGACAAACAAAATTTTGGACAAA
GTAGTGGAGAGAATCAAAGAGAGAATGAAAGACAGCAACGTGAAGCTCCTC
TTGGGTACTGCAAACCTCTTTTCCCACCCAAGGTACATGCATGGTGCAGCGAC
AACCTGCAGTGCTGATGTTTTTGCGTACGCGGCCGCCCAGGTGAAAAAGGCC
CTTGAGATCACCAAAGAACTTGGAGGAGAAGGGTACACATCCTGGGGTGGA
AGAGAAGGATACGAAACACTCCTCAACACGGACCTTGGATTCGAATTTGAAA
ACCTCGCCCGCTTCCTCAGAATGGCTGTGGATTATGCAAAAAAGATCGGTTTC
ACCGGACAGTTCCTCATCGAACCAAAACCGAAAGAACCCACCAAACACCAGT
ACGACTTCGACGTTGCAACCGCCTATGCCTTCCTGAAGAGCCACGGTCTAGA
TGAGTACTTCAAGTTCAACATTGAAGCGAACCACGCGACACTTGCCGGTCAC
ACATTCCAGCACGAACTGAGGATGGCAAGGATCCTCGGAAAACTTGGAAGCA
TCGACGCCAACCAGGGAGATCTCCTGCTCGGCTGGGACACCGACCAGTTCCC
AACGAACGTCTACGACACAACACTTGCCATGTACGAAGTGATCAAGATGGGG
GGATTTGACAAAGGCGGCCTTAACTTCGATGCAAAAGTAAGACGTGCTTCAT
TTGAGCCAGAAGATCTTTTCTTAGGTCACATAGCTGGAATGGATTCTTTTGCA
AAAGGCTTCAAGGTTGCTTACAAGCTTGTGAAAGATGGCGTTTTCGACAAGT
TTATCGAGGAAAGATACGCAAGCTACAAAGATGGCATTGGCGCTGATATTGT
AAGTGGAAAGGCTGACTTCAAGAGCCTTGAGAAGTATGCATTAGAGCACAGC
CAGATTGTCAACAAATCAGGAAGACAAGAGCTATTGGAGTCAATCCTAAATC
AGTATTTGTTTGCAGAATGA
SEQ.ID.NO.21
MAEFFPEIPKVQFEGKESTNPLAFKFYDPEEVIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNE
GRDPFGDPTADRPWNRYTDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEG
KTLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLLGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVF
AYAAAQVKKALEITKELGGEGYVFWGGREGYETLLNTDLGFEFENLARFLRMA
VDYAKKIGFTGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKSHGLDEYFKFNIEANH
ATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNVYDTTLAMYE
VIKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGHIAGMDSFAKGFKVAYKLVKDG
VFDKFIEERYASYKDGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQIVNKSGRQELLESILN
QYLFAE
SEQ.ID.NO.22
MAEFFPEIPKVQFEGKESTNPLAFKFYDPEEVIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNE
GRDPFGDPTADRPWNRYTDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEG
KTLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLLGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVF
AYAAAQVKKALEITKELGGEGYTSWGGREGYETLLNTDLGFEFENLARFLRMA
VDYAKKIGFTGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKSHGLDEYFKFNIEANH
ATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNVYDTTLAMYE
VIKMGGFDKGGLNFDAKVRRASFEPEDLFLGHIAGMDSFAKGFKVAYKLVKDG
VFDKFIEERYASYKDGIGADIVSGKADFKSLEKYALEHSQIVNKSGRQELLESILN
QYLFAE