从白锥花中分离的抗疟化合物.pdf

本发明提供了一种从白锥花(Gomphostema niveum)中分离的式(I)的新型抗疟化合物3－[2－(2－羟甲基－1，4a，5－三甲基－7－氧代－1，2，3，4，4a，7，8，8a－八氢萘－1－基)－乙基]－5H－呋喃－2－酮或其药学可接受衍生物，本发明还提供了提取该化合物的方法以及使用所述化合物治疗疟疾的方法。

权利要求书
1.  下面式1的3-[2-(2-羟甲基-1，4a，5-三甲基-7-氧代-1，2，3，4，4a，7，8，8a-八氢萘-1-基)-乙基]-5H-呋喃-2-酮或其药学可接受衍生物


2.  一种从白锥花(G.niveum)的叶、皮、根制备基本上纯的权利要求1中化合物的方法，其包括：

(a)使用溶剂提取白锥花(Gomphostema niveum)的干燥且粉末化的植物部分；
(b)过滤步骤(a)中所得的提取物并在减压下蒸发所述提取物；
(c)将步骤(b)中所得的滤液冷冻干燥以得到粉末形式；
(d)从所述粉末中分离式1的化合物。

3.  权利要求2的方法，其中所述化合物分离自白锥花的干燥叶。

4.  权利要求2的方法，其中所述溶剂选自水、甲醇、乙醇、氯仿、乙醚及其任意混合物。

5.  权利要求4的方法，其中所述溶剂是水。

6.  权利要求4的方法，其中所述溶剂是甲醇。

7.  权利要求4的方法，其中所述溶剂是乙醇。

8.  权利要求4的方法，其中所述溶剂是水和甲醇的混合物。

9.  权利要求4的方法，其中所述溶剂是乙醇和水的混合物。

10.  权利要求4的方法，其中所述溶剂是甲醇和氯仿的混合物。

11.  权利要求4的方法，其中所述溶剂是乙醇和氯仿的混合物。

12.  权利要求4的方法，其中所述溶剂是氯仿。

13.  权利要求4的方法，其中所述溶剂是乙醚和氯仿的混合物。

14.  权利要求4的方法，其中所述溶剂是乙醇、甲醇、氯仿和乙醚的混合物。

15.  权利要求2的方法，其中所述化合物通过正相薄层色谱和柱色谱、或通过反相薄层色谱和柱色谱从所述植物提取物中分离得到。

16.  权利要求2的方法，其中所述植物部分选自叶、根和皮。

17.  权利要求2的方法，其中将所述植物部分风干，然后以常规方式将其粉碎以获得所述粉末。

18.  一种用于治疗疟疾的药物组合物，其包含药学可接受量的式1化合物

以及一种或多种药学可接受添加剂。

19.  权利要求18的组合物，其中所述一种或多种药学可接受添加剂选自辅药、载体、赋形剂、稀释剂、调味剂、乳化剂、增粘剂、粘合剂、稳定剂、溶剂等。

20.  基本上如前文所述并参考前述实施例和附图的式1的3-[2-(2-羟甲基-1，4a，5-三甲基-7-氧代-1，2，3，4，4a，7，8，8a-八氢萘-1-基)-乙基]-5H-呋喃-2-酮。

21.  一种基本上如前文所述并参考前述实施例和附图的制备式1的3-[2-(2-羟甲基-1，4a，5-三甲基-7-氧代-1，2，3，4，4a，7，8，8a-八氢萘-1-基)-乙基]-5H-呋喃-2-酮的方法。

22.  一种基本上如前文所述并参考前述实施例和附图的药物组合物，其包含式1的3-[2-(2-羟甲基-1，4a，5-三甲基-7-氧代-1，2，3，4，4a，7，8，8a-八氢萘-1-基)-乙基]-5H-呋喃-2-酮。

说明书从白锥花中分离的抗疟化合物
技术领域
本发明提供了一种从白锥花(Gomphostema niveum)中提取的新的抗疟化合物。本发明还涉及分离此化合物的方法以及其在患疟疾的对象中治疗疟疾的用途。更具体地，本发明涉及抑制恶性疟原虫(Plasmodiumfaciparum)和伯氏疟原虫(Plasmodium berghi)的方法。已从白锥花的干燥叶的提取物中提取并分离了本发明的化合物。

背景技术
疟疾是一种在世界多个地区内流行的疾病，并且在这些地区是地方病。在有记载的历史上，在世界的热带和亚热带地区，疟疾每年导致超过200万人死亡和将近4亿病例(Greenwood et.al Nature(415)，670(2002))。疟疾是一种寄生虫感染。在所发生的各种类型的疟疾中，由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)引起的脑性疟是重要的致死原因。超过半数的世界人口生活在易受疟疾感染的地区(Sachs et.al，Nature，(415，686(2002))。
尽管已知数种药物可以抗疟，并且全世界政府都在采取措施通过控制传播媒介的方法消除该病，但是疟疾的发病率在过去数年中变得更加严重。这主要是由于疟原虫对几种市售抗疟药物(Reed et al.，Nature(403)，906(2000))(如氯喹)产生了日益增强的抗药性(Ringwaid et.al，Bulletin of the world health organization，77(1)，34，(1999))。由于蚊子病媒中对当前可用杀虫剂的抗药性的平行传播，使得使用控制传播媒介的方法(如使用杀虫剂)消除作为大流行病的疟疾变得更加复杂。
大多数抗疟药比如氯喹、甲氟喹、伯氨喹等是化学合成产品。然而，在过去几年中付出了相当的努力来筛选天然资源以获得可用作抗疟药的新型化合物/混合物。这些努力已经导致例如从中国植物黄花蒿(Artemisia annua)中发现了作为潜在抗疟药的青蒿素。该寄生虫中对现有化合物的抗药性和病媒对杀虫剂的抗药性的产生导致了持续且迫切需要鉴定新类型的抗疟药以及将其开发为具有多种作用模式的药物以克服抗药性的问题(Tulp et al，Drug discovery today(9)450，(2004))。
现有技术集中于使用植物来源来获得抗疟药。例如，奎宁(Brooking，GB 106430，(1917))和青蒿素(Klayman，Science(228)，1049(1985))的发现已导致了对于植物作为抗疟剂的研究，二者均是源于植物的迄今非常有效的抗疟药。用于从植物来源中寻找新的抗疟剂的民族药理学(ethanopharmacological)方法已证实更有预见性。几个研究小组现在正致力于开发作为氯喹和青蒿醚(artether)(一种青蒿素衍生物)替代物的新的活性化合物。从两种均源自植物的重要化学治疗剂氯喹和青蒿素的成功来看，可以充分证明植物是新抗疟药的来源。植物除了已经用于抗发热和疟疾的金鸡纳以外，还包括生长于中国的常山(Dichroafebrifuga)。然而，已经报道，在性质上属于生物碱的天然常山碱(febrigugine)和异常山碱(isofibrifugine)在用于人时具有高的毒性(Jiang et.al WO2004000319，(2003))。近来在中国已对天然来源的抗疟药青蒿素进行了研究。近来Ihara等公开了来自合成的具有抗疟活性的化合物(US 6,710,074(2004))。有几个专利文献和已公开的专利申请公开了不同类型的具有抗疟活性的化合物，例如取代的1，2，4-三噁烷(trioxane)(US 6,737,438(2004))、类黄酮(WO 2004000306(2003))、萘基异喹啉(US 6,627,641(2003))、吲哚并喹唑啉(indoloquinazole)(US 6,531,487(2003))、三氧戊环类(trioxolanes)(US 6,486,199(2002))、β-咔啉生物碱(US 6,143,756(2000))、vocamine(WO 9948501(1999))、乙酰基葡糖胺衍生物(DE3220426(1983))等。US 6,710074、WO2004000319、US 5,362,726、US2003212098、WO2004000306、EP1076057、WO9948501、US 4,290,553、US 6,143,756和US 6,627,641公开了天然来源(主要是植物)的具有抗恶性疟原虫活性的化合物。天然资源将是未来抗疟疾药物开发的潜在来源。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种可用作抗疟药的天然来源新活性成分。
本发明的另一个目的是提供一种用于从白锥花提取新的抗疟化合物的方法。
本发明的又一个目的是提供一种使用天然来源的化合物治疗/抑制基于恶性疟原虫(P.faciparum)或伯氏疟原虫(P.berghi)的疟疾的方法。
发明内容
本发明提出了一种新的抗疟化合物，其命名为锥花素(Gomphostinin)，该化合物是从白锥花(一种可见于印度东北部的植物)的叶中提取、分离、化学鉴定到的。所述化合物锥花素是一种γ-内酯，其结构如下。
因此，本发明提供了一种新的抗疟化合物，即从白锥花中提取的下面式1的3-[2-(2-羟甲基-1，4a，5-三甲基-7-氧代-1，2，3，4，4a，7，8，8a-八氢萘-1-基)-乙基]-5H-呋喃-2-酮及其药学可接受衍生物。

本发明还提供了从白锥花(G.niveum)的叶、皮、根中制备基本上纯的权利要求1中化合物的方法，其包括：
(a)使用溶剂提取白锥花的干燥且粉末化的植物部分；
(b)过滤步骤(a)中所得的提取物并在减压下蒸发所述提取物；
(c)将步骤(b)中所得的滤液冷冻干燥以得到粉末形式；
(d)从所述粉末中分离式1的化合物。
在本发明的一个实施方案中，所述化合物从白锥花的干燥的皮、根或叶中分离得到。
在本发明的另一个实施方案中，将所述植物部分风干，然后以常规方式粉碎以获得粉末。
在本发明的另一个实施方案中，所述溶剂选自水、甲醇、乙醇、氯仿、乙醚及其任意混合物。
在本发明的另一个实施方案中，所述溶剂选自水和甲醇的混合物，乙醇和水的混合物，氯仿的混合物以及乙醇、甲醇、氯仿和乙醚的混合物。
在本发明的另一个实施方案中，所述化合物系通过正相薄层色谱法和柱色谱法、或通过反相薄层色谱法和柱色谱法从所述植物提取物中分离得到。
本发明还提供了一种治疗疟疾的药物组合物，其包含药学可接受量的式1化合物或其药学可接受衍生物

以及一种或多种药学可接受添加剂。
在本发明的一个实施方案中，所述一种或多种药学可接受添加剂选自辅药、载体、赋形剂、稀释剂、调味剂、乳化剂、增粘剂、粘合剂、稳定剂、溶剂等。
本发明还提供了在患有疟疾的对象中治疗疟疾的方法，其包括给所述对象施用药物组合物，其包含药学可接受量的式1化合物

和一种或多种药学可接受添加剂。
被治疗的疟疾可以是由恶性疟原虫或伯氏疟原虫所引起的疟疾。
可口服施用式1化合物或含有所述化合物的药物组合物。
对本领域技术人员而言，根据以下举例说明本发明最佳实施方式的优选实施方案的详细说明，本发明的其它目的、特征和优点将是显而易见的。
附图说明
图1是作为本发明化合物的式1的3-[2-(2-羟甲基-1，4a，5-三甲基-7-氧代-1，2，3，4，4a，7，8，8a-八氢萘-1-基)-乙基]-5H-呋喃-2-酮的ORTEP图。
图2是式1化合物的IR谱。
图3是式1化合物的EIMS谱。
图4是式1化合物的质量片段化分析数据。
图5是式1化合物的ESI MS谱。
图6是式1化合物的ESI MSMS谱。
图7是式1化合物的质子NMR谱。
图8是式1化合物的C13NMR谱。
图9是式1化合物的DEPT 135谱。
发明详述
由于其高发病率和高死亡率，疟疾是重要的人寄生虫感染，威胁到超过20亿生活在高发地区的人们。恶性疟原虫是疟疾恶性形式的病原体，通过突变具有高度适应性且对各种类型的抗疟药具有抗药性，由于其使得廉价且曾经有效的药物(如氯喹)无法使用，因此导致抗疟计划的严重倒退。需要新类型的活性化合物以及具有独立作用机制的多化学治疗剂相关分子(poly chemotherapy associating molecule)以降低抗药性的风险。
抗疟药奎宁的成功和青蒿素的发现，这两种最有效的抗疟药均来自植物来源这一事实引起了对植物作为抗疟剂的研究。白锥花的干燥粉末化叶的水提取物显示了抗疟活性。使用粗提取物治疗疟疾可能不是有效和可靠的。它还有培养此东北印度植物的显著缺点，而利用分离的纯的活性成分则不然。因此，需要分离并鉴定存在于白锥花粗提取物中的活性成分。
锥花素及其衍生物是抗疟化合物，其具有抑制疟原虫生长的能力。锥花素及其衍生物显示出体外抗恶性疟原虫和体内抗伯氏疟原虫的显著抑制活性。优选口服施用所述化合物。也可将所述生物活性化合物与药物添加剂如载体稀释剂、溶剂、过滤介质(filter)、润滑剂、赋形剂、粘合剂或稳定剂联合施用给患者。
已从初筛中发现白锥花的含水叶提取物具有抗疟活性。然而，负责该抗疟活性的成分是未知的。考虑到叶提取物明显的抗疟活性，本发明人纯化并鉴定了起作用的化合物。采用生物导引的分级分离和色谱技术，从白锥花干燥叶的含水提取物中分离并纯化了一种白色晶体化合物，其显示体外抗恶性疟原虫和体内抗伯氏疟原虫的抑制作用。锥花素的结构显示其为一种新化合物。该化合物的IUPAC命名是3-[2-(2-羟甲基-1，4a，5-三甲基-7-氧代-1，2，3，4，4a，7，8，8a-八氢萘-1-基)-乙基]-5H-呋喃-2-酮。尚未阐明锥花素通过何种机制表现出抗疟活性。然而，已证实锥花素对于体外抗恶性疟原虫和伯氏疟原虫寄生虫是有效的。锥花素提供了预防和治疗疟疾的另一种方法，考虑到恶性疟原虫对多种已知抗疟药的抗药性，这种方法是非常需要的。
所述活性级分提取自白锥花的干燥植物部分比如叶、皮和根，优选风干的叶。用于提取的溶剂可以是水、甲醇、乙醇、氯仿或乙醚中的任何一种或多种。通过正相薄层色谱法和柱色谱法或通过反相薄层色谱法和柱色谱法从植物提取物中分离所述活性化合物。在本发明的方法中，通过正相高效液相柱色谱以及也通过反相高效液相色谱分析所述活性化合物。重结晶所述分离的活性化合物并通过X-射线结晶分析以及通过光谱法确定其结构。重结晶后，测试所述化合物的体外抗恶性疟原虫和体内抗伯氏疟原虫的抗疟原虫的效力(尤其是与磷酸氯喹相比较)。
实施例1：锥花素的提取
在6月和9月，从位于印度东北部的Dhimaji，Assam采集白锥花的叶。在回流状态下用1000ml水提取白锥花的粉末化风干叶(100g)6小时。将浓缩提取物用200ml乙醚分配三次。将乙醚部分混合并在减压下浓缩至干(B)。
实施例2：锥花素的分离
将约10g的B装填到硅胶柱上并以己烷-乙酸乙酯体系洗脱。随后分析柱级分对恶性疟原虫和伯氏疟原虫的抑制活性。用于从醚级分洗脱不同成分的其它溶剂是己烷500ml(1-8个级分)、在己烷中的10％乙酸乙酯(1升)、在己烷中的40％乙酸乙酯(1升)、在己烷中的50％乙酸乙酯(1.5升)。结果表明，使用在己烷中的50％乙酸乙酯洗脱的柱级分中的化合物能抑制疟原虫并因此具有治疗疟疾的能力。通过干燥和从乙醚中重结晶，从上述柱级分中得到为白色晶体物质的锥花素(gomphostenin)。
实施例3：高效液相色谱(HPLC)分析
为快速评价提取和分离过程，开发了HPLC方法，其中使用以60∶40比例的水、乙腈作为流动相，流速为1ml/分钟。使用SGE Nucleosil C8(250*4.6，5μ)柱，UV检测器波长设定在254nm。将1mg的所述化合物溶于1ml甲醇中，将5μl溶液注入HPLC系统中。锥花素的峰出现在5.6分钟处。
实施例4：锥花素的重结晶
在通过柱色谱分离并通过HPLC分析证实纯度之后，将50mg所述化合物溶于2ml乙醚中。将溶液在试管中放置过夜以使乙醚缓慢蒸发。出现微细结晶，将其用于X射线晶体分析。
实施例5：X-射线晶体分析
从所述试管底部取出一小晶体并将其放入X-射线晶体分析仪器的探头中。通过X-射线晶体分析确定所述化合物的化学结构。X-射线晶体结构(图1)表明存在5元γ-内酯环。所述化合物的IUPAC命名是3-[2-(2-羟甲基-1，4a，5-三甲基-7-氧代-1，2，3，4，4a，7，8，8a-八氢萘-1-基)-乙基]-5H-呋喃-2-酮。
实施例6：光谱分析
在KBr沉淀中记录的锥花素的红外(IR)光谱(图2)显示了在1667和1733cm-1的强烈羰基吸收和在3434cm-1的强烈OH伸缩吸收(stretching absorption)。1733和1759cm-1的吸收对于内酯而言是特征性的，而在1667cm-1的吸收则是由于不与所述内酯共轭的羰基所引起的。
使用Finnigan MAT质谱仪得到锥花素的电子电离(EI)质谱(图3)。锥花素的EI质谱给出了m/z 332的M+离子和m/z 317、299、287、222、221、191、175、161、150、147和135的片段离子(图4)。使用Micromass的四极杆飞行时间(Q ToF Micro)质谱仪实施电喷雾质谱(ESI-MS)。使用Waters HPLC系统将所述化合物注入质谱仪，使用ESI+作为离子化模式。锥花素的ESI-MS谱给出了m/z 333的(M+H)+离子(图5)。通过Q-ToF micro质谱仪，使用锁定喷雾(lock spray)参比质量磺胺二甲氧哒嗪(311.0814Da)，保持碰撞能量在25V，样品锥电压在40V，以氩气作为碰撞气体，进行在333Da的离子的高分辨质量(HRMS)测定(图6)。测定的准确质量333.2053对应于经验式C20H28O4，误差为1.3mDa单位。
锥花素的质子NMR谱(图7)给出了对应于28个质子的共振情况。谱图包含了在0.80、1.05和1.89ppm的三个甲基的信号。具有信号1.89ppm的甲基连接于sp2杂化的碳即C＝C上。锥花素的全质子去偶碳NMR谱(图8)表明存在20个碳。DEPT 135分析(图9)连同碳NMR表明存在3个甲基、7个亚甲基、4个次甲基和6个季碳。在199ppm处的信号是由于存在与碳双键共轭的羰基。在174ppm处的信号表明存在内酯的羰基，其在红外研究中也检测到。在172、144、133和125ppm处的信号表明存在两个碳-碳双键。在133ppm处的信号是季碳。因此，具有1.89ppm的质子NMR位移的甲基是与此碳相连的。通过NMR研究获得的碳和氢的数目与通过质谱研究计算的经验式相一致。
实施例7 抗疟活性的体外评价
两株氯喹敏感性恶性疟原虫，一株恶性疟原虫，分离自印度Jagadalpur地区的患者，将它们在体外培养。按照标准培养方法培养所述培养物。
疟原虫生长在加入了添加10％人血清的RPMI 1640培养基的O +ve的人RBC中。将所述细胞在37℃、5％CO2气氛中培养，24小时后检查寄生虫血并更换培养基。当寄生虫血超过10％的细胞感染寄生虫时，通过加入新鲜RBC对培养物进行传代。通过山梨醇裂解法使所述寄生虫的生长同步化，同步化的环状体期寄生虫用于测试。体外测试在每孔100μl完全培养基中进行，所述每孔添加了含有2％环状期寄生虫的10μl红细胞。所有测试均以一式两份在96孔平底组织培养板中进行，将每种测试化合物制成倍比稀释液，其单个对照孔仅含有RPMI 1640和人血清添加物。通过检测孵育24小时后制成的姬姆萨(giemsa)染色血涂片监测在每种测试化合物、氯喹存在下以及对照孔的寄生虫生长。对200个无性生殖寄生虫中存在的成熟裂殖体进行计数，通过公式(1-Nt/Nc)×100计算裂殖体成熟抑制平均值，其中Nt和Nc分别代表测试和对照中存在的裂殖体的数目。通过使用商业统计软件包Sigmastat计算IC50和IC90值。
分析锥花素以测定IC50值，其为在规定时间内有效抑制50％的与其接触的测试生物体生长的所述化合物的中值浓度。还测定氯喹和青蒿醚的IC50作为对照。结果见表1。
  IC50(μg/ml)  IC90(μg/ml)  粗提取物  153.23  752.29  锥花素  8.23  24.29  氯喹  12.87  23.69