草珊瑚的组培快繁方法.pdf

本发明公开了一种草珊瑚的组培快繁方法，以无菌的小苗的根系作为外植体进行愈伤组织的诱导培养，通过愈伤组织增殖、分化培养等过程，最终获得小苗，从而解决了常规的草珊瑚组培过程中，用茎尖、茎段、叶片诱导胚性愈伤组织过程中出现的诱导难及培养物内生菌污染严重的问题，对实现草珊瑚种苗的规模化育苗具有现实的意义。

权利要求书
1.  一种草珊瑚的组培快繁方法，其步骤为：
(1)选取草珊瑚无菌播种或茎段腋芽诱导获得的试管苗为试材，待小苗长出2-4张叶，根长1-1.5cm时，用无菌刀片环割其根系待用；
(2)培养基准备：
A：诱导培养基：以MS培养基为基本培养基，附加的细胞分裂素为1-2mg.L-16-苄基氨基嘌呤(benzylaminopurine，简称BA)，生长素为0.1-0.2mg.L-1的萘乙酸(naphthylene acetic acid，简称NAA)；
B：增殖、分化培养基：以MS培养基为基本培养基，附加3-5mg.L-1的BA和0.1-0.2mg.L-1的NAA；
C：生根培养基：基本培养基为1/2MS，附加生长素为0.1-0.5mg.L-1吲哚丁酸(indolebutyric acid，简称IBA)；
(3)待根长至1-3cm时，将封口膜打开，炼苗1周，用自来水洗净试管苗根部的培养基，即可进行试管苗移栽。移栽基质为泥炭加蛭石加沙，三者体积比为2∶2∶1。
其特征在于：
以无菌的小苗的根系作为外植体进行愈伤组织的诱导培养，用无菌刀片环割根系，在培养温度为25±2℃，光照强度为1000-1500Lux，光照周期为16h/d，将外植体置于基本培养基培养，再将诱导出的愈伤组织从根系上剥离下来，进行愈伤组织增殖、分化培养，最终获得小苗。

2.  根据权利要求1所述的草珊瑚组培快繁方法，其特征还在于：所述的诱导培养基中还包含4.5g.L-1琼脂粉、30g.L-1蔗糖和1.5g.L-1活性炭(activatedcharcoal，简称AC)，PH值5.8。

3.  根据权利要求1所述的草珊瑚组培快繁方法，其特征还在于：所述的试管苗移栽时以用50％多菌灵可湿性粉剂的800-1000倍液进行基质消毒，移栽后搭建塑料拱棚保湿。

4.  根据权利要求1所述的草珊瑚组培快繁方法，其特征还在于：所述的增殖、分化培养基中还包含4.2g.L-1琼脂粉、30g.L-1蔗糖，PH值5.8。

5.  根据权利要求1所述的草珊瑚组培快繁方法，其特征还在于：所述的生根培养基中还包含4.5g.L-1琼脂粉、30g.L-1白砂糖和1.5g.L-1活性炭activatedcharcoal，简称AC)，PH值5.8。

说明书草珊瑚的组培快繁方法
技术领域
本发明涉及一种草珊瑚的组培快繁方法，属于植物组织培养的领域。
前景技术
草珊瑚(又名肿节风、九节茶、接骨木)为常用中药，主要分布在浙江、江西、安徽、福建等省。其味辛、苦，性平，有抗菌消炎、清热解毒、祛风除湿、活血止痛、通经接骨等功效，用于治疗各种炎症性疾病、风湿关节痛、疮疡肿毒、跌打损伤、骨折等。现代药理和毒理研究表明，肿节风具有抗菌消炎、抑制流感病毒、抗肿瘤、促进骨折愈合及镇痛等多种活性，而且肿节风及其提取物具有较好的安全性，急性毒性试验结果属实际无毒，动物精子畸形试验、小鼠骨髓细胞微核试验、Ames试验均为阴性，未发现致突变。肿节风用于治疗肿瘤(胰腺癌、胃癌、直肠癌、肝癌、食道癌等)、细菌性痢疾、骨折及多种口腔疾病均有较显著效果。《中华人民共和国药典》2005版一部收载其作为法定药材使用，同时以肿节风为原料的肿节风片、肿节风注射液、血康口服液也已收入2005版药典，肿节风浸膏、万通炎康片、新癀片、消炎片、三蛇胆川贝液均收入部颁药品标准中。全国现有几十家企业以肿节风为原料生产中成药，产值达数亿元。
长期以来，草珊瑚药材一直依赖野生资源，资源的利用方式是非可再生性采挖，导致野生资源急剧减少，药材质量参差不齐，充分利用优良种质资源，选育优良品种，进行人工栽培是保障其资源可持续利用、产业可持续发展的必然途径。植物组织培养技术是良种繁育最有效的手段之一，对于恢复和发展草珊瑚资源具有重要的现实意义。
目前国内外有关草珊瑚细胞工程研究报道甚少。据报道：1995年，江西省科学院生物资源所涂艺声、江洪如等人进行了利用植物离体组织培养产生草珊瑚有效成分的的研究。该项研究技术解决了草珊瑚外植体在诱导培养基进行愈伤组织诱导，从而获得草珊瑚中的有机酸(延胡索酸等)、异嗪皮啶等有效成分。然而，由于该项技术的研究目标在于利用组织培养获得草珊瑚的有效成分，故并未完成从愈伤组织诱导到植株根、茎、叶的诱导分化过程，即小苗培养过程。至今尚未见通过愈伤组织的途径获得草珊瑚幼苗，从而实现草珊瑚人工大面积栽培的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种草珊瑚组培快繁的方法，实现在短期内获得大量优质的试管苗，从而解决草珊瑚苗木规模化生产问题。
本发明是通过下述方式实现的：
一种草珊瑚的组培快繁方法，其步骤为：
(1)选取草珊瑚无菌播种或茎段腋芽诱导获得的试管苗为试材，待小苗长出2-4张叶，根长1-1.5cm时，用无菌刀片环割其根系待用；
(2)培养基准备：
A：诱导培养基：以MS培养基为基本培养基，附加的细胞分裂素为1-2mg.L-16-苄基氨基嘌呤(benzylaminopurine，简称BA)，生长素为0.1-0.2mg.L-1的萘乙酸(naphthylene acetic acid，简称NAA)；
B：增殖、分化培养基：以MS培养基为基本培养基，附加3-5mg.L-1的BA和0.1-0.2mg.L-1的NAA；
C：生根培养基：基本培养基为1/2MS，附加生长素为0.1-0.5mg.L-1吲哚丁酸(indolebutyric acid，简称IBA)；
其特征在于：
以无菌的小苗的根系作为外植体进行愈伤组织的诱导培养，用无菌刀片环割根系，在培养温度为25±2℃，光照强度为1000-1500Lux，光照周期为16h/d，将外植体置于诱导培养基中培养，获得草珊瑚愈伤组织后，将诱导出的愈伤组织从根系上剥离下来，置入增殖、分化培养基中进行愈伤组织增殖、分化培养，获得草珊瑚丛苗，当丛苗长至3-4cm时，切取单苗置入生根培养基，进行生根培养，最终获得小苗。
所述的试管苗移栽时以用50％多菌灵可湿性粉剂的800-1000倍液进行基质消毒，移栽后搭建塑料拱棚保湿。
所述的诱导培养基中还包含4.5g.L-1琼脂粉、30g.L-1蔗糖和1.5g.L-1活性炭(activated charcoal，简称AC)，PH值5.8。
所述的增殖、分化培养基中还包含4.2g.L-1琼脂粉、30g.L-1蔗糖，PH值5.8。
所述的生根培养基中还包含4.5g.L-1琼脂粉、30g.L-1白砂糖和1.5g.L-1活性炭activated charcoal，简称AC)，PH值5.8。
本发明的有益效果是：以无菌的小苗的根系作为外植体进行愈伤组织的诱导培养，通过愈伤组织增殖、分化培养等过程，最终获得小苗，从而解决了常规的草珊瑚组培过程中，用茎尖、茎段、叶片诱导胚性愈伤组织过程中出现的诱导难及培养物内生菌污染严重的问题，对实现草珊瑚种苗的规模化育苗具有现实的意义。
具体实施方式
选取草珊瑚优良单株的成熟种子为外植体，在0--4℃下低温储藏45天后，在无菌条件下用0.2％的HgCl2进行表面消毒，用无菌水冲洗后，放在1/2MS(MS培养基的大量元素减半)培养基中进行发芽培养。培养温度为25±2℃，光照强度为800-1000Lux，光照周期为16h/d；待草珊瑚小苗长出2-4张叶，根长1-1.5cm时，用无菌刀片环割根系，环割深度不达木质部，然后将小苗转接到MS+BA2mg.L-1+NAA0.1mg.L-1+4.5g.L-1琼脂粉+30g.L-1蔗糖+1.5g.L-1活性炭(activatedcharcoal，简称AC)，PH值5.8的诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，45天时愈伤组织诱导率为65.6％。将诱导出的愈伤组织从根部剥离，放在MS+BA4mg.L-1+NAA0.1mg.L-1+4.2g.L-1琼脂粉+30g.L-1蔗糖，PH值5.8的增殖、分化培养基中培养，至50天时，愈伤组织的月增殖倍数为3.35，芽苗分化率为68％。待丛苗长至3-4cm时，切取单苗放入1/2MS+IBA0.5mg.L-1+4.5g.L-1琼脂粉+30g.L-1白砂糖+1.5g.L-1活性炭activated charcoal，(简称AC)PH值5.8的生根培养基中进行生根培养，培养至40天时生根率79.6％，平均根长2.1cm和平均根数为2.21根。以上各阶段培养条件为：培养温度为25±2℃，光照强度为800-1500Lux，光照周期为16h/d。待根长至1-3cm时，将封口膜打开，炼苗1周，取出苗用自来水洗净试管苗根部的培养基，稍晾干表面的水分，即可进行试管苗移栽。移栽基质为泥炭加蛭石加沙，三者体积比为2∶2∶1，基质移栽前用50％多菌灵可湿性粉剂的800倍液进行基质消毒，消毒后将基质装入50孔的穴盆中，移入试管苗，搭建塑料拱棚，将湿度保持在85％以上，移栽10天后逐渐降低湿度，30天后行常规管理。