治疗Ⅱ型糖尿病和逆转胰岛素抵抗的药物复合制剂及其制备方法.pdf

本发明的目的在于提供用于临床治疗II型糖尿病和逆转胰岛素抵抗的药物复合制剂，所述药物复合制剂包含由表没食子酸儿茶素、任选茶多酚和青钱柳水提物组成的药物组合物作为有效成分和药用辅料，并且提供用于制备所述药物复合制剂的方法。本发明的药物复合制剂可有效用于临床治疗II型糖尿病和逆转胰岛素抵抗。

权利要求书
1.  用于临床治疗II型糖尿病和逆转胰岛素抵抗的药物复合制剂，其中所述药物复合制剂包含由表没食子酸儿茶素、任选茶多酚和青钱柳水提物组成的药物组合物作为有效成分和药用辅料。

2.  权利要求1所述的药物复合制剂，其中，在10重量份的所述药物组合物中，茶多酚的含量为0～9重量份，表没食子酸儿茶素的含量为1～7重量份并且青钱柳水提物的含量为0～3重量份。

3.  权利要求1或2任何一项的药物复合制剂，其中，在10重量份的所述药物组合物中，茶多酚的含量为4重量份，表没食子酸儿茶素的含量为3重量份并且青钱柳水提物的含量为3重量份。

4.  权利要求1或2任何一项的药物复合制剂，其中，在10重量份的所述药物组合物中，茶多酚的含量为5重量份，表没食子酸儿茶素的含量为3重量份并且青钱柳水提物的含量为2重量份。

5.  权利要求1或2任何一项的药物复合制剂，其中，在10重量份的所述药物组合物中，茶多酚的含量为8重量份，表没食子酸儿茶素的含量为1重量份并且青钱柳水提物的含量为1重量份。

6.  权利要求1或2任何一项的药物复合制剂，其中，在10重量份的所述药物组合物中，茶多酚的含量为9重量份并且表没食子酸儿茶素的含量为1重量份。

7.  权利要求1的药物复合制剂，其中，所述药物复合制剂为胶囊、片剂或口服液。

8.  权利要求7的药物复合制剂，其中，当所述药物复合制剂为胶囊时，其中药用辅料是葛根粉；当所述药物复合制剂为片剂时，其中药用辅料是淀粉；当所述药物复合制剂为口服液时，其中药用辅料是柠檬酸水溶液。

9.  权利要求1的药物复合制剂的制备方法，所述方法包含将有效量的所述药物组合物与所述药用辅料混合。

10.  权利要求1-8任何一项的药物复合制剂在制备用于临床治疗II型糖尿病和逆转胰岛素抵抗的药物中的应用。

说明书治疗Ⅱ型糖尿病和逆转胰岛素抵抗的药物复合制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及治疗II型糖尿病和逆转胰岛素抵抗的药物复合制剂。
背景技术
II型糖尿病是一种代谢综合症，与肥胖症密切相关，它影响多个器官，代谢和激素混乱逐渐导致了糖尿病。II型糖尿病是非常严重的国际性的健康问题。据估计，在全世界，II型糖尿病将从1995的1.35亿升至2025的3亿，而这将主要发生在发展中国家。环境因素对II型糖尿病的形成与发展起着很重要的作用。一般研究者认为脂肪细胞营养过剩以及糖脂毒性是导致II型糖尿病的根本原因。随着我国国民经济的发展和人民生活水平的提高，我国糖尿病，特别是II型糖尿病的发病比例呈明显上升趋势，严重影响人民的健康。
国内外目前用于治疗II型糖尿病的药物比较有效的是类激素药物曲格列酮(TZD)，可以明显降低血糖，主要作用于外周脂肪。但是有引起肥胖的明显副作用(Peter Arner：The adipocyte in insulin resistance：keymolecules and the impact of the thiazolidinediones。TRENDS inEndocrinology and Metabolism.14，137-136，2003)。针对II型糖尿病的病因，研究者提出了相应的治疗方案即控制饮食、改善胰岛素的耐性、刺激胰岛素的分泌和抑制糖的合成等方法，都有的有一定效果，但都不能真正起到治疗II型糖尿病和逆转胰岛素抵抗的结果，目前国内外仍然没有好的解决办法。
至今为止，在现有技术中还未发现由茶多酚、表没食子酸儿茶素和青钱柳水提物组成的药物组合物用于治疗II型糖尿病和逆转胰岛素抵抗的报道。
发明内容
鉴于上述原因和现有技术中存在的主要问题，当前迫切需要寻求一种新的药物或药物组合物治疗II型糖尿病。为此，本发明要解决的技术问题是提供用于临床治疗II型糖尿病和逆转胰岛素抵抗的药物复合制剂。本发明进一步要解决的技术问题是提供制备上述药物复合制剂的方法。
本发明的技术方案概述如下。
本发明提供用于临床治疗II型糖尿病和逆转胰岛素抵抗的药物复合制剂，其中，所述药物复合制剂包含由表没食子酸儿茶素、任选茶多酚和青钱柳水提物(主要成分是黄酮类)组成的药物组合物作为有效成分和药用辅料。
本发明的药物复合制剂的特征在于，在10重量份的所述药物组合物中，茶多酚的含量为0～9重量份，表没食子酸儿茶素的含量为1～7重量份并且青钱柳水提物的含量为0～3重量份。
本发明的药物复合制剂的特征在于，在10重量份的所述药物组合物中，优选茶多酚的含量为4重量份，表没食子酸儿茶素的含量为3重量份并且青钱柳水提物的含量为3重量份。
本发明的药物复合制剂的特征在于，在10重量份的所述药物组合物中，也优选茶多酚的含量为5重量份，表没食子酸儿茶素的含量为3重量份并且青钱柳水提物的含量为2重量份。
本发明的药物复合制剂的特征在于，在10重量份的所述药物组合物中，也优选茶多酚的含量为8重量份，表没食子酸儿茶素的含量为1重量份并且青钱柳水提物的含量为1重量份。
本发明的药物复合制剂的特征在于，在10重量份的所述药物组合物中，也优选茶多酚的含量为9重量份并且表没食子酸儿茶素的含量为1重量份，可以不含青钱柳水提物。
在本发明的药物复合制剂中，所述药用辅料是葛根粉、淀粉、或水溶液。
在本发明的药物复合制剂中，所述药物复合制剂为胶囊、片剂或口服液。当本发明的药物复合制剂为胶囊时，其中药用辅料优选是葛根粉。当本发明的药物复合制剂为片剂时，其中药用辅料优选是淀粉。当本发明的药物复合制剂为口服液时，其中药用辅料优选是柠檬酸水溶液。
本发明提供所述药物复合制剂的制备方法，该方法包含将有效量的所述药物组合物与所述药用辅料以适当比例混合，优选将10重量％的药物组合物与90重量％的药用辅料混合，以制备临床中所需的剂型。
本发明还提供所述药物复合制剂在制备用于临床治疗II型糖尿病和逆转胰岛素抵抗的药物中的应用。
本领域技术人员应当理解，上述重量比例组成是本发明的各组分之间优选的比例，本领域技术人员通过常规方法适当调整和改变所述药物组合物各组分之间的比例也可以达到本发明的目的，因此意欲将此调整和改变也包括在本发明的内容之内。上述涉及的药物复合制剂的组分是市场可以采购到的药用级产品。
本发明所提供的上述的治疗II型糖尿病和逆转胰岛素抵抗药物复合制剂，在具体实施方式中经过细胞和动物实验，探明了作用机理，所述药物复合制剂具有以下功能特征和有益效果：本发明的药物复合制剂对羟基、超氧阴离子自由基有明显清除作用，对高脂食物诱导血糖升高有明显降低作用，对高脂食物诱导脂肪细胞活性氧升高有明显抑制作用，对链脲酶素诱导血糖升高有明显降低作用，对链脲酶素诱导脂质过氧化升高有明显抑制作用，对黄色肥胖II型糖尿病转基因鼠(KKAY)血糖升高有明显降低作用，对黄色肥胖II型糖尿病转基因鼠(KKAY)脂肪细胞活性氧升高有明显抑制作用，对地塞米松(DEX)和肿瘤坏死因子(TNF-α)导致的脂肪细胞活性氧升高有明显抑制作用，对地塞米松(DEX)和肿瘤坏死因子(TNF-α)导致脂肪细胞活性氧升高有明显抑制作用，对地塞米松(DEX)导致脂肪细胞胰岛素抗性因子升高有明显抑制作用。
附图说明
图1是表明本发明的药物复合制剂对羟基和超氧阴离子自由基的清除作用的图。
图2是表明本发明的药物复合制剂对高脂食物诱导大鼠血糖升高有明显降低作用的图。
图3是表明本发明的药物复合制剂对高脂食物诱导大鼠脂肪细胞活性氧(ROS)升高有明显抑制作用的图。
图4是表明本发明的药物复合制剂对链脲酶素诱导大鼠血糖升高有明显降低作用的图。
图5是表明本发明的药物复合制剂对链脲酶素诱导大鼠脂质过氧化(TBARS，硫代巴比妥酸(TBA，Thiobarbituric acid)reactive substance)升高有明显抑制作用的图。
图6是表明本发明的药物复合制剂对黄色肥胖II型糖尿病转基因鼠(KKAY)血糖升高有明显降低作用的图。
图7是表明本发明的药物复合制剂对黄色肥胖II型糖尿病转基因鼠(KKAY)脂肪细胞活性氧升高有明显抑制作用的图。
图8是表明本发明的药物复合制剂对地塞米松(DEX)和肿瘤坏死因子(TNF-α)导致脂肪细胞活性氧升高有明显抑制作用的图，其中“+”表示添加有相应物质，“-”表示无相应物质。
图9是表明本发明的药物复合制剂对地塞米松(DEX)和肿瘤坏死因子(TNF-α)导致脂肪细胞活性氧升高有明显抑制作用的图，其中“+”表示添加有相应物质，“-”表示无相应物质。
图10是表明本发明的药物复合制剂对地塞米松(DEX)导致脂肪细胞胰岛素抗性因子升高有明显抑制作用的图，其中“+”表示添加有相应物质，“-”表示无相应物质。
在附图2至10中，“*”表示与正常对照相比有显著差异(P＜0.05)，“#”表示与损伤对照相比有显著差异(P＜0.05)。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明的药物复合制剂的制备方法。实施例1.本发明的药物复合制剂的制备——胶囊的制备
每粒300毫克，有效成分为80％，其它添加葛根粉(购自四川富贵人生物工程有限公司)。茶多酚(购自四川富贵人生物工程有限公司)：表没食子酸儿茶素(购自浙江大学茶学系)：青钱柳水提物(购自福建省龙岩市天马茗茶有限公司)的重量比例和各自的重量分别见表1。
表1
    编号茶多酚∶表没食子酸儿茶素∶青钱柳水提物(重量比)    茶多酚    (mg)表没食子酸儿茶素(mg)  青钱柳水提  物(mg)葛根粉(mg)    16∶1∶3    14424  7260    27∶1∶2    16824  4860    38∶1∶1    19224  2460    49∶1∶0    21624  060    55∶2∶3    12048  7260    66∶2∶2    14448  4860    77∶2∶1    26848  2460    88∶2∶0    19248  060    94∶3∶3    9672  7260    105∶3∶2    12072  4860    116∶3∶1    14472  2460    127∶3∶0    16872  060    133∶4∶3    7296  7260    144∶4∶2    9696  4860    155∶4∶1    12096  2460    166∶4∶0    14496  060    172∶5∶3    48120  7260    183∶5∶2    72120  4860    194∶5∶1    96120  2460    205∶5∶0    120120  060    211∶6∶3    24144  7260    222∶6∶2    48144  4860    233∶6∶1    72144  2460    244∶6∶0    96144  060    250∶7∶3    0168  7260    261∶7∶2    24168  4860    272∶7∶1    48168  2460    283∶7∶0    72168  060
在GMP车间，将茶多酚、表没食子酸儿茶素和青钱柳水提物及添加剂葛根粉按要求的比例在搅拌器(CH-10小型混合机，中南制药机械厂)中充分搅拌混合(1小时)，在胶囊机(半自动胶囊充填机，山东省青州市精诚机械制造有限公司)上装胶囊(A型肠溶胶囊，潮州市强基制药厂)，采用好乐股份公司的紫外技术bluepoint 4经济型紫外消毒器消毒，包装(YLE-500+YLH-500L包装机，裕隆包装设备有限公司)。
实施例2.本发明的药物复合制剂的制备——口服液的制备
每瓶10毫升，将组合药物溶解在蒸馏水中，有效成分为80％，其它添加柠檬酸(食用级，购自山东济南云翔化工有限责任公司)，其中茶多酚(购自四川富贵人生物工程有限公司)：表没食子酸儿茶素(购自浙江大学茶学系)：青钱柳水提物(购自福建省龙岩市天马茗茶有限公司)的重量比例和各自的重量分别见表2。
表2
    编号茶多酚∶表没食子酸儿茶素∶青钱柳水提物(重量比)    茶多酚    (mg)表没食子酸儿茶素(mg)青钱柳水提物(mg)柠檬酸(mg)    16∶1∶3    144247260    27∶1∶2    168244860    38∶1∶1    192242460    49∶1∶0    21624060    55∶2∶3    120487260    66∶2∶2    144484860    77∶2∶1    268482460    88∶2∶0    19248060    94∶3∶3    96727260    105∶3∶2    120724860    116∶3∶1    144722460    127∶3∶0    16872060    133∶4∶3    72967260    144∶4∶2    96964860    155∶4∶1    120962460    166∶4∶0    14496060    172∶5∶3    481207260    183∶5∶2    721204860    194∶5∶1    961202460    205∶5∶0    120120060    211∶6∶3    241447260    222∶6∶2    481444860    233∶6∶1    721442460    244∶6∶0    96144060    250∶7∶3    01687260    261∶7∶2    241684860    272∶7∶1    481682460    283∶7∶0    72168060
在GMP车间，将茶多酚、表没食子酸儿茶素和青钱柳水提物及添加剂柠檬酸按要求的比例在搅拌器(RW 20 DZM.n顶置式机械搅拌器，上海丽度电子科技发展有限公司)中充分搅拌混合，在罐装机(DGDG系列台式液体灌装机，中南制药机械厂)上装装瓶，采用好乐股份公司的紫外技术bluepoint 4经济型紫外消毒器消毒，包装(YLE-500+YLH-500L包装机，裕隆包装设备有限公司)。
实施例3.本发明的药物复合制剂的制备——片剂的制备
每片300毫克，有效成分为80％，其它添加剂为淀粉(天津森众商贸公司)。茶多酚∶表没食子酸儿茶素∶青钱柳水提物的重量比例和各自的重量分别见表3。
表3
    编号茶多酚∶表没食子酸儿茶素∶青钱柳水提物(重量比)    茶多酚    (mg)表没食子酸儿茶素(mg)青钱柳水提物(mg)    淀粉    (mg)    16∶1∶3    1442472    60    27∶1∶2    1682448    60    38∶1∶1    1922424    60    49∶1∶0    216240    60    55∶2∶3    1204872    60    66∶2∶2    1444848    60    77∶2∶1    2684824    60    88∶2∶0    192480    60    94∶3∶3    967272    60    105∶3∶2    1207248    60    116∶3∶1    1447224    60    127∶3∶0    168720    60    133∶4∶3    729672    60    144∶4∶2    969648    60    155∶4∶1    1209624    60    166∶4∶0    144960    60    172∶5∶3    4812072    60    183∶5∶2    7212048    60    194∶5∶1    9612024    60    205∶5∶0    1201200    60    211∶6∶3    2414472    60    222∶6∶2    4814448    60    233∶6∶1    7214424    60    244∶6∶0    961440    60    250∶7∶3    016872    60    261∶7∶2    2416848    60    272∶7∶1    4816824    60    283∶7∶0    721680    60
在GMP车间，将茶多酚、表没食子酸儿茶素和青钱柳水提物及添加剂淀粉按要求的比例在搅拌器(RW 20 DZM.n顶置式机械搅拌器，上海丽度电子科技发展有限公司)中充分搅拌混合，在制片机(TDP-1.5单冲压片机，中南制药机械厂)上装制片，采用好乐股份公司的紫外技术bluepoint 4经济型紫外消毒器消毒，包装(YLE-500+YLH-500L包装机，裕隆包装设备有限公司)。
试验例 
以下通过具体的试验例进一步阐明本发明组合药物复合制剂的有益效果。
试验例1.对自由基的清除作用
自由基，特别是活性氧自由基，如羟基、超氧阴离子自由基，是引起胰岛素抵抗的重要因素。采用电子自旋共振技术(ESR)测试，条件如下：在Brucker ER200 D-SRC型ESR波谱仪(德国Brucker公司)上进行测定时，X波段，微波功率10mW，调制频率100kHz，调幅1G，中心磁场3385G，扫宽200G，室温下检测(参见，Zhao，B-L，Li，X-J，He，R-G， Cheng，S-J，Xin，W-J：Scavenging effect of extracts of green tea and natural antioxidants onactive oxygen radicals.Cell Biophys.14：175.1989)。测试结果表明本发明的药物复合制剂对羟基、超氧阴离子自由基有明显清除作用。由图1可以看出，本发明的药物复合制剂对羟基和超氧阴离子自由基的清除作用的IC50几乎是一样的，大约为7μM。从总趋势看，治疗II型糖尿病和逆转胰岛素抵抗复合制剂对超氧阴离子自由基的清除作用比对羟基的清除作用略强(参见图1)。
试验例2.对高脂食物诱导大鼠血糖升高的降低作用
雄性30天日龄的SD大鼠(体重180-200g，购自维通利华公司)饲养在SPF(无特异病原微生物)环境下，室温为22℃，12小时的昼夜循环。大鼠在喂食基础生长饲料适应环境三天后，随机分为两组。一组喂食基础生长饲料(CHOW)，一组喂食高脂饲料。30天后称重，判断肥胖模型的建立。把高脂和基础组各随机分为两组，即组合药物复合制剂组和对照组。组合药物复合制剂组的动物每天以表2的4号口服液制剂灌胃(1毫升/kg)，基础组动物每天以相同体积的双蒸水灌胃。每天记录动物体重。灌胃45天后，用乌拉坦(Sigma公司，美国)麻醉动物，空腹取血，采用SUPERGLUCOCARDII葡萄糖检测仪(中生北控公司产品)测试血糖，测试条件如下：用KRBH缓冲液(Sigma公司，美国)洗3-4遍，保证孔内没有残留葡萄糖；每孔加1ml KRBH缓冲液，需要胰岛素刺激的细胞每孔胰岛素工作浓度一般为100nM，37℃孵育20min；每孔加入KRBH缓冲液配成的3H标记的脱氧葡萄糖(3H-2DG，deoxyglugose)与2-脱氧葡萄糖(2DG)的混合溶液(Sigma公司，美国)，3H-2DG工作单位为0.5μCi/孔，2DG的终浓度为50μM，37℃孵育5min；吸去含3H-2DG的溶液，用KRBH缓冲液洗三遍以上，；每孔加300μl 1％triton X-100(Sigma公司，美国)，或1％十二烷基硫酸钠(SDS)(Sigma公司，美国)，使细胞破裂；将每孔中的液体全部转移到测量瓶中，每个液闪瓶中装有3ml液闪液，即溶液与测量液体积比不能超过1∶10；将测量瓶带到仪器进行检测。然后将其处死，取脂肪组织冻存在-80℃。长时间的高脂饲料饲养(30+45天)能显著的升高大鼠的血糖(39.4％)。而灌胃茶多酚(45天)能显著的降低大鼠血糖(基础组降低18.8％，高脂组降低了31.7％)。试验结果见图2。
试验例3.对高脂食物诱导大鼠脂肪细胞活性氧升高的抑制作用
雄性30天日龄的SD大鼠(体重180-200g，购自维通利华公司)饲养在SPF(无特异病原微生物)环境下，室温为22℃，12小时的昼夜循环。大鼠在喂食基础生长饲料适应环境三天后，随机分为两组。一组喂食基础生长饲料(CHOW)，一组喂食高脂饲料。30天后称重，判断肥胖模型的建立。把高脂和基础组各随机分为两组，即组合药物复合制剂组和对照组。组合药物复合制剂采用表2的8号口服液制剂，动物每天灌胃(1毫升/kg)，基础组动物每天以相同体积的双蒸水灌胃。每天记录动物体重。灌胃45天后，用乌拉坦麻醉动物，空腹取血，然后处死，取脂肪组织冻存在-80℃。采用电子自旋共振技术(ESR)测试在Brucker ER200 D-SRC型ESR波谱仪上进行测定时，条件如下：X波段，微波功率10mW，调制频率100kHz，调幅1G，中心磁场3385G，扫宽200G，室温下检测。长时间的高脂饲料饲养能显著的升高大鼠脂肪组织的活性氧类别(ROS)水平(52.3％)。灌胃茶多酚(45天)能显著的降低大鼠脂肪组织的ROS水平(基础组降低28.4％，高脂组降低了26.2％)。试验结果见图3。
试验例4.对链脲酶素诱导大鼠血糖升高的降低作用
雄性SD大鼠(280-320g，购自维通利华公司)饲养在温度和湿度都受控制的房间，可自由摄取食物和水。经过一周的环境适应后，动物饥饿过夜(大于15小时)，腹腔注射溶于柠檬酸溶液中的链脲霉素(STZ)(Sigma公司，美国)，0.2ml，(50μM)。对照组注射等对应体积的柠檬酸溶液。STZ注射两天后，检测禁食12小时的动物全血糖。采用SUPER GLUCOCARDII葡萄糖检测仪(中生北控公司产品)测试血糖，测试条件如下：用KRBH缓冲液洗3-4遍，保证孔内没有残留葡萄糖；每孔加1ml KRBH缓冲液，需要胰岛素(Sigma公司，美国)刺激的细胞每孔胰岛素工作浓度一般为100nM，37℃孵育20min；每孔加入KRBH缓冲液配成的3H标记的脱氧葡萄糖(3H-2DG，deoxyglugose)与2-脱氧葡萄糖(2DG)(Sigma公司，美国)工作单位为0.5μCi/孔，2DG的终浓度为50μM，37℃孵育5min；吸去含3H-2DG的溶液，用KRBH缓冲液洗三遍以上；每孔加300μl 1％tritonX-100，或1％SDS，使细胞破裂；将每孔中的液体全部转移到测量瓶中，每个液闪瓶中装有3ml液闪液，即溶液与测量液体积比不能超过1∶10；将测量瓶带到仪器进行检测。血糖浓度大于16.6mM的动物为糖尿病鼠。在STZ处理前6天，组合药物复合制剂采用表2的12号口服液制剂，动物每天灌胃(1毫升/kg)，一天一次，直到三个月后动物被处死。检测血糖发现，茶多酚组合药物复合制剂处理组的动物全血糖从糖尿病组的约22.5mM降至约2.5mM。试验结果见图4。
试验例5.对链脲酶素诱导大鼠脂质过氧化升高的抑制作用
雄性SD大鼠(280-320g，购自维通利华公司)饲养在温度和湿度都受控制的房间，可自由摄取食物和水。经过一周的环境适应后，动物饥饿过夜(大于15小时)，如试验例4所述腹腔注射溶于柠檬酸溶液中的链脲霉素(STZ)。对照组注射等对应体积的柠檬酸溶液。STZ注射两天后，检测禁食12小时的动物全血糖。采用SUPER GLUCOCARDII葡萄糖检测仪(中生北控公司产品)测试血糖，条件如下：用KRBH缓冲液洗3-4遍，保证孔内没有残留葡萄糖；每孔加1ml KRBH缓冲液，需要胰岛素刺激的细胞每孔胰岛素工作浓度一般为100nM，37℃孵育20min；每孔加入KRBH缓冲液配成的3H标记的脱氧葡萄糖(3H-2DG，deoxyglugose)工作单位为0.5μCi/孔，2-脱氧葡萄糖(2DG)(Sigma公司，美国)的终浓度为50μM，37℃孵育5min；吸去含3H-2DG的溶液，用KRBH缓冲液洗三遍以上；每孔加300μl1％表面活性剂(triton X-100)(Sigma公司，美国)，或1％SDS，使细胞破裂；将每孔中的液体全部转移到测量瓶中，每个液闪瓶中装有3ml液闪液，即溶液与测量液体积比不能超过1∶10；将测量瓶带到仪器进行检测。血糖浓度大于16.6mM的动物为糖尿病鼠。在STZ处理前6天，用表2的16号口服液制剂灌胃(1毫升/kg)，一天一次，直到三个月后动物被处死。在糖尿病鼠脂质过氧化增加到对照的约300％，茶多酚处理组中，脂质过氧化降低约20％，二者均有显著差异。试验结果见图5。
试验例6.对黄色肥胖II型糖尿病转基因鼠(KKAY)血糖升高的降低作用
黄色肥胖II型糖尿病转基因鼠(KKAY)(28-32g，购自中国医学科学院动物中心)饲养在温度和湿度都受控制的房间，可自由摄取食物和水。经过一周的环境适应后，动物饥饿过夜。采用SUPER GLUCOCARDII葡萄糖检测仪(中生北控公司产品)测试血糖，测试条件如下：用KRBH缓冲液洗3-4遍，保证孔内没有残留葡萄糖；每孔加1ml KRBH缓冲液，需要胰岛素刺激的细胞每孔胰岛素工作浓度一般为100nM，37℃孵育20min；每孔加入KRBH缓冲液配成的3H标记的脱氧葡萄糖(3H-2DG，deoxyglugose)与2-脱氧葡萄糖(2DG)(Sigma公司，美国)的混合溶液，3H-2DG工作单位为0.5μCi/孔，2DG的终浓度为50μM，37℃孵育5min；吸去含3H-2DG的溶液，用KRBH缓冲液洗三遍以上，；每孔加300μl 1％表面活性剂(triton X-100)(Sigma公司，美国)，或1％SDS，使细胞破裂；将每孔中的液体全部转移到测量瓶中，每个液闪瓶中装有3ml液闪液，即溶液与测量液体积比不能超过1∶10；将测量瓶带到仪器进行检测。检测血糖浓度大于16.6mM的动物为糖尿病鼠。用表2的20号口服液制剂为动物灌胃(1毫升/kg)，一天一次，直到一个半月后动物被处死。检测血糖发现，长时间的高脂饲料饲养(30+45天)能显著的升高II型糖尿病转基因鼠的血糖(39.4％)，而灌胃茶多酚(45天)能显著的降低II型糖尿病转基因鼠血糖(基础组降低18.8％，高脂组降低了31.7％。试验结果见图6。
试验例7.对黄色肥胖II型糖尿病转基因鼠(KKAY)脂肪细胞活性氧升高的抑制作用
黄色肥胖II型糖尿病转基因鼠(KKAY)(28-32g，购自中国医学科学院动物中心)(Houstis N，Rosen ED，Lander ES.Reactive oxygen species havea causal role in multiple forms of insulin resistance.Nature 2006；440：944-8.)饲养在温度和湿度都受控制的房间，可自由摄取食物和水。经过一周的环境适应后，动物饥饿过夜。检测血糖浓度大于16.6mM的动物为糖尿病鼠。组合药物复合制剂采用24号口服液制剂，动物每天灌胃(1毫升/kg)，一天一次，直到一个半月后动物被处死。采用电子自旋共振技术(ESR)测试，长时间的高脂饲料饲养能显著的升高大鼠脂肪组织的ROS水平(52.3％)。灌胃茶多酚(45天)能显著的降低大鼠脂肪组织的ROS水平(基础组降低28.4％，高脂组降低了26.2％)。试验结果见图7。
试验例8.对地塞米松DEX或TNF-α诱导的对脂肪细胞胰岛素刺激后葡萄糖吸收抑制的恢复作用
胰岛素刺激后的葡萄糖吸收是反映脂肪细胞功能以及脂肪细胞对胰岛素反应的能力的重要指标。用地塞米松(dexameson，DEX)(Sigma公司，美国)(20nM)或肿瘤坏死因子TNF-α(turmor necrosis factor-α，15nM)(Sigma公司，美国)处理6天诱导成熟分化的脂肪细胞3T3-L1(购自中国医学科学院细胞中心，参见Houstis N，Rosen ED，Lander ES.Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulinresistance.Nature 2006；440：944-8.)氧化应激，并用0.5毫升的组合药物复合制剂的表2的28号口服液制剂与DEX或TNF-α共同处理。DEX和TNF-α都能显著的降低脂肪细胞胰岛素刺激后对葡萄糖的吸收，II型糖尿病茶多酚组合药物复合制剂能部分的恢复脂肪细胞的葡萄糖吸收功能。试验结果见图8。
试验例9.对地塞米松(DEX)和肿瘤坏死因子(TNF-α)导致脂肪细胞活性氧升高的抑制作用
地塞米松DEX(dexameson)(20nM)或肿瘤坏死因子TNF-α(turmornecrosis factor-α)与表没食子酸儿茶素共同处理脂肪细胞3T3-L1(购自中国医学科学院细胞中心)6天后，用荧光探针直接测量当时细胞内的ROS水平，细胞内活性氧水平是由荧光探针2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯(2’，7’-dichlorofluorescin diacetate，简称2’，7’-DCF-DA)(Sigma公司，美国)来测量。DCF-DA本身并没有荧光，但是它进入细胞以后，在过氧化氢的作用下，可以脱掉酯基变成带有荧光的DCF。Hanks平衡盐溶液(Sigma公司，美国)和10ml 0.5mM的DCF-DA溶解在N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethyl-formamide)(Sigma公司，美国)中，加入6孔板中。DCF-DA和细胞共孵育50分钟，孵育结束时，细胞被立刻洗掉孵育液，并装入荧光分光度计中检测(485nm激发，535nm吸收)。测量的荧光值被表征成相对于对照的百分数，DEX和TNF-α都能显著的增加脂肪细胞的ROS水平，而II型糖尿病茶多酚组合表2的4号药物复合制剂能减少ROS水平。试验结果见图9。
试验例10.对地塞米松(DEX)和肿瘤坏死因子(TNF-α)导致脂肪细胞胰岛素抗性因子升高的抑制作用
地塞米松DEX(20nM)或肿瘤坏死因子TNF-α(turmor necrosis factor-α)都能通过增加JNK(jun活化区域连接蛋白，c-jun N-terminal Kinase)的磷酸化而激活JNK通路，而II型糖尿病茶多酚组合药物复合制剂能抑制JNK的磷酸化(Houstis N，Rosen ED，Lander ES.Reactive oxygen species have acausal role in multiple forms of insulin resistance.Nature 2006；440：944-8.)。DEX处理脂肪细胞3T3-L1(购自中国医学科学院细胞中心)能使脂肪细胞有益因子脂联素(adiponectin)的释放减少，而增加促使胰岛素抗性产生的因子抵抗素的释放，而II型糖尿病茶多酚组合表2的4号药物复合制剂能浓度依赖的部分恢复脂联素的释放，而减少抵抗素的释放。(有益因子脂联素和抗性因子互为反比关系，所以图10中仅表示了抗性因子的比较)。试验结果见图10。