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1、(10)申请公布号 CN 102660623 A (43)申请公布日 2012.09.12 CN 102660623 A *CN102660623A* (21)申请号 201210154214.5 (22)申请日 2012.05.17 C12P 39/00(2006.01) C12P 7/64(2006.01) (71)申请人 江苏科技大学 地址 212003 江苏省镇江市梦溪路 2 号 (72)发明人 李强 季更生 谷绪顶 费娟娟 唐玉斌 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 楼高潮 (54) 发明名称 混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方 法 (57)。
2、 摘要 本发明公开一种混合发酵直接利用纤维素制 备生物柴油的方法。本发明涉及利用植物纤维降 解菌和油脂生产菌进行混菌发酵直接利用秸秆等 天然植物纤维生产乙醇。首先采用响应面等优化 方法设计出混菌发酵的培养基， 然后利用正交试 验、 响应面分析法等方法优化得到最佳的混合发 酵温度、 菌种混合比例和菌种混合时间等发酵条 件。根据优化的发酵条件， 利用植物纤维作为碳 源， 纤维素酶产生菌降解纤维素成为可发酵的糖， 在培养体系中加入产油脂微生物进行混合发酵。 油脂产生菌利用植物纤维不断酶解产生的糖作为 碳源， 发酵生产油脂， 微生物油脂经过甲酯化反应 得到生物柴油。 (51)Int.Cl. 权利要求书。
3、 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法， 其特征在于包括如下步骤 ： （1） 制备微生物种子液 ： 将纤维素降解菌和油脂产生菌分别在 PDA 培养基中 25-30培 养 3-5d 后制得 ； （2） 将油脂产生菌和纤维素降解菌按照细胞重量比2-31添加到混合发酵培养基中， 28、 180r/min 摇床培养 5-14d ； 其中所述混合发酵培养基为 ： 培养基 ： 10-50g 纤维素材料 ； 9g Na2HPO412H2。
4、O ； 1.5g KH2PO4； 1.2mg FeNH4-Citrate ； 0.34g （NH4） 2SO4； 0.15g Peptone ； 0.15g Yeast extract ； 0.3g CaCl2， 0.3g MgSO4， 0.005gFeSO47H2O ； 0.0016g MnSO4H2O ； 0.0014g ZnSO4H2O ； 0.002g CoCl2； 1000mL H2O， pH 调节为弱酸性 pH6.0-6.8 ； 或， 培养基 ： 10-50g 纤维素材料 ； 2g KH2PO4； 1.4g（NH4） 2SO4； 0.3g MgSO4； 0.3g CaCl2； 0.。
5、5g 蛋白胨 ； 0.005g FeSO4 7H2O ； 0.0016g MnSO4 H2O， 0.0014g ZnSO4 H2O ； 0.002g CoCl2， 1000mL H2O ； pH 调节为弱酸性 pH6.0-6.8 ； 或， 改造的 Mandel 培养基 ： 10-50g 纤维素材料 ； 1g Peptone， 2.0g NaNO3， 1.5g K2HPO4， 0.3g CaCl2， 0.3g MgSO4， 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.5g CoCl2， 1.5g Yeast extract， H。
6、2O 1000mL， pH7.0 ； 或， 改造的察氏培养基 ： 10g 纤维素材料 ； 3g NaNO3； 1gK2HPO4； 0.5g MgSO47H2O ； 0.5gKCl ； 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.002g CoCl2；蒸 馏 水 1000mL， pH 调节为弱酸性 pH6.0-6.8 ； （3） 将所得到的培养物过滤除去纤维素降解菌和发酵液中的残渣， 得到含有产油微生 物的培养液， 再过滤得到产油微生物细胞 ； （4） 产油微生物细胞用高压匀质机将细胞破碎， 加入萃取剂， 浸提， 收集上层有机溶。
7、剂 层， 蒸发回收溶剂， 剩余的部分为微生物油脂 ； （5） 微生物油脂经过甲酯化反应得到生物柴油。 2. 根据权利要求 1 所述的混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法， 其特征在于 所述纤维素材料为微晶纤维素、 秸秆、 麦麸或纸。 3. 根据权利要求 1 所述的混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法， 其特征在于 所述纤维素降解菌为里氏木霉、 绿色木霉、 康宁木霉、 瑞士木霉或黑曲霉 ； 油脂产生菌为红 球菌或粘红酵母。 4. 根据权利要求 1 所述的混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法， 其特征在于 所述高压匀质机的压力为60-80MPa， 萃取溶剂与破碎细胞的体积比为2-31，。
8、 萃取剂为正 己烷， 浸提温度为 40-50， 浸提 2-3 次， 每次 30-40min。 5. 根据权利要求 1 所述的混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法， 其特征在于 所述甲酯化方法为离子液体甲酯化 ： 将相同摩尔数的微生物油脂、 甲醇和 NMPCH3SO3 加 入容器中， 搅拌 4-12h， 倒入分液漏斗静置分层成为两层， 除去下层得到上层生物柴油。 权 利 要 求 书 CN 102660623 A 2 1/6 页 3 混合发酵直接利用纤维素制备生物柴油的方法 技术领域 0001 本发明属于生物能源和生物催化的技术领域， 具体涉及生产生物柴油的微生物混 合发酵法。 背景技术 00。
9、02 生物柴油 (Biodiesel) 是指以油料作物、 野生油料植物和工程微藻等水生植物油 脂以及动物油脂、 餐饮垃圾油等为原料油通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的再生性 柴油燃料。生物柴油是生物质能的一种， 它是生物质利用热裂解等技术得到的一种长链脂 肪酸的单烷基酯。生物柴油是含氧量极高的复杂有机成分的混合物， 这些混合物主要是一 些分子量大的有机物， 几乎包括所有种类的含氧有机物， 如 ： 醚、 酯、 醛、 酮、 酚、 有机酸、 醇 等。 生物柴油具有如下优良特性 ： (1)具有优良的环保特性 ： 生物柴油和化石柴油相比含硫 量低， 使用后可使二氧化硫和硫化物排放大大减少。 权威数据显。
10、示， 二氧化硫和硫化物的排 放量可降低约 30。生物柴油不含对环境造成污染的芳香族化合物， 燃烧尾气对人体的损 害低于化石柴油， 同时具有良好的生物降解特性。 和化石柴油相比， 柴油车尾气中有毒有机 物排放量仅为 1/10， 颗粒物为 20， 二氧化碳和一氧化碳的排放量仅为 10， 排放尾气指 标可达到欧洲号和号排放标准。(2) 低温启动性能 ： 和化石柴油相比， 生物柴油具有良 好的发动机低温启动性能， 冷滤点达到 -20。(3) 生物柴油的润滑性能比柴油好 ： 可以降 低发动机供油系统和缸套的摩擦损失， 增加发动机的使用寿命， 从而间接降低发动机的成 本。(4) 具有良好的安全性能 ： 生。
11、物柴油的闪点高于化石柴油， 它不属于危险燃料， 在运输、 储存、 使用等方面的优点明显。(5) 具有优良的燃烧性能 ： 生物柴油的十六烷值比柴油高， 因此燃料在使用时具有更好的燃烧抗暴性能， 因此可以采用更高压缩比的发动机以提高其 热效率。虽然生物柴油的热值比柴油低， 但由于生物柴油中所含的氧元素能促进燃料的燃 烧， 可以提高发动机的热效率， 这对功率的损失会有一定的弥补作用。(6) 具有可再生性 ： 生物柴油是一种可再生能源， 其资源不会像石油、 煤炭那样会枯竭。(7) 具有经济性 ： 使用 生物柴油的系统投资少， 原用柴油的引擎、 加油设备、 储存设备和保养设备无需改动。 (8)可 调和性。
12、 ： 生物柴油可按一定的比例与化石柴油配合使用， 可降低油耗， 提高动力， 降低尾气 污染。(9) 可降解性 ： 生物柴油具有良好的生物降解性， 在环境中容易被微生物分解利用。 0003 生物柴油的优良性能使得采用生物柴油的发动机废气排放指标不仅满足目前的 欧洲 II 号标准， 甚至满足随后即将在欧洲颁布实施的更加严格的欧洲号排放标准。而且 由于生物柴油燃烧时排放的二氧化碳远低于该植物生长过程中所吸收的二氧化碳， 从而改 善由于二氧化碳的排放而导致的全球变暖这一有害于人类的重大环境问题。 因而生物柴油 是一种真正的绿色柴油。 0004 随着世界工业的迅速发展， 石油等化石资源的逐渐枯竭， 利用。
13、可再生资源生产生 物能源的研究越来越受到国内外研究者的关注。纤维素是地球上最丰富的可再生资源， 具 有价廉、 可降解和不污染生态环境等优点， 因此纤维素的开发与利用对解决人类面临的资 源和能源危机具有重要意义。纤维素材料可以通过制备成生物柴油的方式转化成燃料。从 说 明 书 CN 102660623 A 3 2/6 页 4 生物油脂的元素组成来看， 主要是 C、 H、 O 元素， 与石油基柴油的组成类似， 因此生物柴油的 开发利用备受关注。 0005 但是， 纤维素是以葡萄糖基通过糖苷键连接起来的、 具有线性结构的高分子化合 物， 其结构复杂， 内部存在大量的晶区、 非晶区结构和氢键， 造成了。
14、纤维素资源化利用的障 碍。纤维素酶酶解纤维素被认为最有效的破坏纤维素的复杂结构， 高效利用纤维素材料的 方法之一。纤维素酶产生菌能够分泌纤维素酶降解纤维素成为糖， 这些糖可以被微生物利 用发酵成为生物柴油、 生物乙醇等能源产品， 有助于解决能源危机。 发明内容 ： 0006 解决的技术问题 ： 本发明针对纤维素酶产生菌虽然能够高效降解纤维素材料， 但 是不能用于生产生物柴油等产品 ； 而微生物油脂高产菌不能利用纤维素的技术难题， 提供 了一种纤维素降解菌和产油微生物混合发酵的方式生产生物柴油的方法。 0007 技术方案 ： 本发明中， 构建立了纤维素降解菌和产油微生物混合发酵的模式。 利用 纤。
15、维素材料作为碳源， 纤维素酶降解菌在培养体系中分泌纤维素酶降解纤维素成为可发酵 的糖， 然后在培养体系中加入高产油脂微生物进行混合培养。产油脂微生物利用纤维素酶 不断水解产生的糖作为碳源， 得出最佳的产油发酵条件， 经过发酵制备微生物油脂。然后， 利用甲酯化的方法将微生物油脂制备成生物柴油。 0008 本发明涉及的一种纤维素降解菌和产油微生物混合发酵的模式， 按照如下步骤进 行 ： 0009 （1） 采用单因素实验、 正交试验、 响应面分析法等方法筛选并且设计出混合发酵的 培养基， 并且得到最佳的培养条件 ； 0010 （2） 根据前面的发酵优化条件， 利用纤维素材料作为碳源， 纤维素降解菌降。
16、解纤维 素成为可发酵的糖， 然后在培养体系中加入高产油脂微生物进行混合培养。产油微生物利 用纤维素酶不断水解产生的糖作为碳源， 得出最佳的产油发酵条件 ； 0011 （3） 将步骤 （2） 得到的培养物用纱网 （或纱布等） 进行过滤除去纤维素降解微生物 和发酵液中的残渣， 得到只含有产油微生物等产油微生物的培养物， 再过滤得到产油微生 物细胞。得到的产油微生物用高压匀质机将细胞破碎， 加入萃取剂， 浸提， 收集上层有机溶 剂层， 蒸发回收溶剂， 剩余的部分为微生物油脂 ； 0012 （4） 利用甲酯化的方法将微生物油脂制备成生物柴油。 0013 具体步骤为 ： 0014 混合发酵直接利用纤维素。
17、制备生物柴油的方法， 包括如下步骤 ： 0015 （1）制备微生物种子液 ： 将纤维素降解菌和油脂产生菌分别在 PDA 培养基中 25-30培养 3-5d 后制得 ； 0016 （2） 将油脂产生菌和纤维素降解菌按照细胞重量比 2-3 1 添加到混合发酵培养 基中， 28、 180r/min 摇床培养 5-14d ； 其中所述混合发酵培养基为 ： 0017 培 养 基 ： 10-50g 纤 维 素 材 料 ； 9g Na2HPO412H2O ； 1.5g KH2PO4； 1.2mg FeNH4-Citrate ； 0.34g（NH4） 2SO4； 0.15g 蛋白胨 ； 0.15g Yeast。
18、 extract ； 0.3g CaCl2， 0.3g MgSO4， 0.005gFeSO47H2O ； 0.0016g MnSO4H2O ； 0.0014g ZnSO4H2O ； 0.002g CoCl2； 1000mL H2O， pH 调节为弱酸性 pH6.0-6.8 ； 或， 说 明 书 CN 102660623 A 4 3/6 页 5 0018 培 养 基 ： 10-50g 纤 维 素 材 料 ； 2g KH2PO4； 1.4g（NH4） 2SO4； 0.3g MgSO4； 0.3g CaCl2； 0.5g 蛋白胨 ； 0.005g FeSO47H2O ； 0.0016g MnSO4H。
19、2O， 0.0014g ZnSO4H2O ； 0.002g CoCl2， 1000mLH2O ； pH 调节为弱酸性 pH6.0-6.8 ； 或， 0019 改造的 Mandel 培养基 ： 10-50g 纤维素材料 ； 1g 蛋白胨， 2.0g NaNO3， 1.5g K2HPO4， 0.3g CaCl2， 0.3g MgSO4， 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.5g CoCl2， 1.5g Yeast extract， H2O 1000mL， pH7.0 ； 或， 0020 改造的察氏培养基 ： 10g 纤维素。
20、材料 ； 3g NaNO3； 1gK2HPO4； 0.5g MgSO47H2O ； 0.5gKCl ； 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.002g CoCl2； 蒸 馏水 1000mL， pH 调节为弱酸性 pH6.0-6.8 ； 0021 （3） 将所得到的培养物过滤除去纤维素降解菌和发酵液中的残渣， 得到含有产油 微生物的培养液， 再过滤得到产油微生物细胞 ； 0022 （4） 产油微生物细胞用高压匀质机将细胞破碎， 加入萃取剂， 浸提， 收集上层有机 溶剂层， 蒸发回收溶剂， 剩余的部分为微生物油脂 ； 002。
21、3 （5） 微生物油脂经过甲酯化反应得到生物柴油。 0024 上述纤维素材料为微晶纤维素、 秸秆、 麦麸或纸。 0025 上述纤维素降解菌为里氏木霉、 绿色木霉、 康宁木霉、 瑞士木霉或黑曲霉 ； 油脂产 生菌为红球菌或粘红酵母。 0026 上述高压匀质机的压力为60-80MPa， 萃取溶剂与破碎细胞的体积比为2-31， 萃 取剂为正己烷， 浸提温度为 40-50， 浸提 2-3 次， 每次 30-40min。 0027 上述甲酯化方法为离子液体甲酯化 ： 将相同摩尔数的微生物油脂、 甲醇和 NMP CH3SO3 加入容器中， 搅拌 4-12h， 倒入分液漏斗静置分层成为两层， 除去下层得到上。
22、层生 物柴油。 0028 有益效果 ： 0029 1、 绿色环保的生物柴油生产技术 0030 石油生产柴油需要高温高压， 同时其废水、 废气造成了环境污染。 而微生物转化能 在水相、 室温和中性 pH 的环境下进行， 无需高压和极端条件， 节省了能源， 减少了化学合成 工艺对环境的污染， 是一项相对 “绿色” 的技术， 符合可持续发展的需要。 0031 2、 以可再生原料生物合成生物柴油 0032 传统的柴油以石油为原料 ； 而本研究采用可再生的秸秆等富含纤维素的废弃物为 原料， 原料丰富， 再生循环迅速， 有助于解决能源短缺问题。 总之， 本发明针对石油资源短缺 和价格飞涨， 开发石油替代品。
23、， 利用可再生资源通过微生物发酵生产生物柴油， 实现了秸秆 等纤维素废弃物的高值转化。 0033 3、 直接高效利用纤维素材料制备生物油脂 0034 本研究直接利用纤维素材料， 不需要外加糖类就可以制备生物油脂。纤维素酶产 生菌将纤维素水解成糖， 混合培养的产油微生物直接利用这些还原糖发酵制备生物油脂， 还原糖的消耗解除了糖积累对于纤维素降解的反馈抑制， 提高了纤维素的利用效率。 附图说明 0035 图 1 为红球菌油脂制备的生物柴油气相色谱图。 说 明 书 CN 102660623 A 5 4/6 页 6 具体实施方式 0036 实施例 1 0037 混合发酵的培养基的确定 ： 0038 根。
24、据纤维素分解微生物和产油微生物的培养特点， 利用单因素实验、 正交试验、 响 应面分析等方法将步骤 （1） 所述的培养基成分进行优化， 筛选并且设计出混合发酵培养基 如下 ： 0039 培养基 ： 10g 纤维素 ； 9g Na2HPO412H2O ； 1.5g KH2PO4； 1.2mg FeNH4-Citrate ； 0.34g （NH4） 2SO4； 0.15g Peptone 【蛋白胨】 ； 0.15g Yeast extract ； 0.3g CaCl2， 0.3g MgSO4， 0.005gFeSO47H2O ； 0.0016g MnSO4H2O ； 0.0014g ZnSO4H2。
25、O ； 0.002g CoCl2； 1000mL H2O， pH 调节为弱酸性 pH6.0-6.8。 0040 培养基 ： 10g 纤维素 ； 2g KH2PO4； 1.4g（NH4） 2SO4； 0.3g MgSO4； 0.3g CaCl2； 0.5g 蛋 白 胨 ； 0.005g FeSO47H2O ； 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O ； 0.002g CoCl2， 1000mLH2O ； pH 调节为弱酸性 pH6.0-6.8， 121灭菌 20min。 0041 改造的Mandel培养基 ： 10g纤维素 ； 1gPeptone 【蛋白胨】 ， 2。
26、.0g NaNO3， 1.5g K2HPO4， 0.3g CaCl2， 0.3g MgSO4， 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.5g CoCl2， 1.5gYeast extract， H2O 1000mL， pH7.0， 121灭菌 20min。 0042 改造的察氏培养基 ： 10g 纤维素 ； 3g NaNO3； 1gK2HPO4； 0.5g MgSO47H2O ； 0.5gKCl ； 0.005g FeSO47H2O， 0.0016g MnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O， 0.002g C。
27、oCl2；蒸 馏 水 1000mL， pH 调节为弱酸性 pH6.0-6.8。 0043 混合发酵模式的建立 ： 0044 (1) 菌种的活化 0045 制备微生物种子液的方法如下 ： 将纤维素降解菌 （里氏木霉、 绿色木霉、 康宁木霉、 瑞士木霉或黑曲霉） 和油脂产生菌 （红球菌或粘红酵母） 分别在 PDA 培养基中 25-30培养 3-5d 后制得。 0046 (2) 培养模式 0047 活化完毕的纤维素降解菌菌液按照 5 wt 的比例接入培养基， 以活化的油脂产生 菌推迟接入0(同时接入)、 1、 2、 3、 4、 5d的组合形式接入混合培养基， 30、 180r/min摇床培 养。从第。
28、二天开始每天取样， 在 5000r/min、 4条件下离心 10min 取上清液 （粗酶液） 测定 滤纸酶活力 (FPA) 和 - 葡萄糖苷酶活力 (-GA)， 同时测定 3 组平行样， 取平均值。 0048 （3） 产生物柴油方法 0049 活化后的产油微生物， 与产酶菌液以不同的推迟接种时间 ( 因素 A)、 不同的初始 pH( 因素 B)、 不同的培养温度 ( 因素 C) 混合， 做三因素四水平的正交试验。从 2d 开始每天 取样， 测定产油微生物的生物量和微生物油脂的产量。 0050 混合发酵生产生物油脂 ： 0051 确定了混合培养的最佳条件， 纤维素酶产生菌和产油微生物培养的 pH。
29、6.5、 温度 30， 在相同培养条件下可以较好的混合发酵。 0052 混合发酵培养在 5L 发酵罐中， 发酵培养基 3.5L， 121灭菌 25min， 冷却至 30 时按 2 wt 的接种量进行无菌接种。通过温度电极和 pH 电极感应， 自动调节发酵液的温 说 明 书 CN 102660623 A 6 5/6 页 7 度和 pH， 使其保持在合适的参数， 培养温度 30发酵培养 5-8d， 培养物用纱网 （或 8 层纱 布） 过滤除去大部分丝状真菌 （纤维素降解菌） 和发酵液中的残渣， 得到只含有产油微生物 的培养液， 再滤纸过滤或离心得到产油微生物细胞。得到的产油微生物细胞用高压匀质机 。
30、将细胞破碎， 加入萃取剂正己烷， 浸提， 收集上层有机溶剂层， 蒸发回收溶剂， 剩余的部分 为微生物油脂， 利用甲酯化的方法将微生物油脂制备成生物柴油。其中， 高压匀质机的压 力为 60-80MPa， 萃取剂与破碎细胞的体积比为 2-3 1， 萃取溶剂为正己烷， 浸提温度为 40-50， 浸提 2-3 次， 每次 30-40min。 0053 微生物油脂制备生物柴油 ： 0054 （1） BF3 甲酯化 ： 大量样品制备 ： 取 50mL 的菌液， 离心取沉淀， 用 10mL 提取剂 （氯 仿甲醇体积比为 2 1） 抽提沉淀过夜。离心除去沉淀， 氮吹 （氮气保护） 浓缩上清液至 2mL， 加内。
31、标二十烷酸 (2mL， 1mg/mL)。加入 5mL 皂化试剂为甲醇水溶液 （甲醇水体积比为 4 1， 含 6 wtNaOH） 70皂化 4h。加入 5mL 的甲酯化剂 （BF3甲醇质量比为 1 4） 70 甲酯化 4h。用 10mL 正己烷萃取浓缩到 2mL。得到的脂肪酸甲酯 （生物柴油） 直接用 GC-MS 和 NaOH 滴定的方法检测确定含量， 计算产率。 0055 （2） 离子液体甲酯化 ： 采用离子液体 NMPCH3SO3 作为催化剂催化合成脂肪酸甲 酯 （生物柴油） ， 将相同摩尔数的微生物油脂、 甲醇和NMPCH3SO3加入圆底烧瓶， 二十烷酸 作为内标加入各个样品当中， 配合磁。
32、力搅拌 4-12h， 加入分液漏斗静置分层成为两层， 除去 下层得到上层即是脂肪酸甲酯 （生物柴油） ， 得到的脂肪酸甲酯直接GC-MS检测确定含量， 得 到的脂肪酸采用 NaOH 滴定的方法确定浓度， 计算产率。 0056 （3） 脂肪酸甲酯成分分析 ： 用正己烷溶解得到的脂肪酸甲酯， 离心后取上清夜， 用 气相色谱 - 质谱连用仪分析油脂的含量和组成。30m HP-5 气相色谱柱 (300.320.25)。 检测器为氢火焰离子检测器 (FID)。进样口温度 225， 检测器温度 250， 分流比 10 1， 线速 30cm/min， 衰减 16。程序升温条件为 ： 柱温 100， 维持 5。
33、min， 15min 升至 250， 再以 4 /min 升至 250， 维持 10min。 0057 实施例 2 0058 采用产油微生物浑浊红球菌 （Rhodococcus opacus ACCC41043） 与纤维素降解菌 里氏木霉 （Trichoderma reesei ATCC 26921） 作为混合菌种进行混合发酵。混合发酵培 养基采用培养基 ： 15g 纤维素 ； 9g Na2HPO412H2O ； 1.5g KH2PO4； 1.2mg FeNH4-Citrate ； 0.34g（NH4） 2SO4； 0.15g Peptone ； 0.15g Yeast extract ； 0。
34、.3g CaCl2， 0.3g MgSO4， 0.005g FeSO47H2O ； 0.0016gMnSO4H2O ； 0.0014g ZnSO4H2O ； 0.002g CoCl2； 1000mL H2O， pH 调节 到 pH6.8。发酵罐为 5L 发酵罐， 培养温度为 28， 里氏木霉按照 2 v/v 接种量接种， 培养 12h 后浑浊红球菌按照 2 v/v 接种量接种进入发酵罐进行混菌发酵。 0059 脂肪酸的提取 ： 发酵 5d， 取 2L 的菌液， 离心取沉淀， 用 500mL 提取剂 （体积比 ： 氯 仿甲醇 =2 1） 抽提沉淀过夜。离心除去沉淀， 用氮吹仪氮吹浓缩， 加入 5。
35、00mL 皂化试剂 为甲醇水溶液 （体积比 ： 甲醇水 =4 1， 含 6 wtNaOH） 60皂化 1h。 0060 生 物 柴 油 的 制 备 ：用 离 子 液 体 N-methyl-2-pyrrolidonium methyl sulfonate(NMPCH3SO3) 作为催化剂进行甲酯化， 在 70条件下， 甲醇菌产脂肪酸 离子液体 （NMPCH3SO3） 按体积比 =1 1 0.3， 反应 6h 将皂化的脂肪酸甲酯化成为生 物柴油。用气质联用仪检测生物柴油的成分和含量 （见图 1） 。结果表明生产的生物柴油主 说 明 书 CN 102660623 A 7 6/6 页 8 要成分为 C。
36、18 和 C16 的脂肪酸甲酯占总量的 81.11， 其余 18.89为十七烷酸和二十烷 酸， 是性质较优良的生物柴油。 0061 表 1. 产生的生物柴油主要成分 0062 十六烷酸 十六烯酸 十八烷酸 十八烯酸 百分比 23.26 18.12 16.72 23.01 0063 实施例 3 0064 采用产油微生物浑浊红球菌 （Rhodococcus opacus ACCC41043） 与纤维素降解菌 黑曲霉 (Aspergillus niger DSMZ 821) 作为混合菌种进行混合发酵。培养基 ： 18g 甘蔗 渣 ； 2g KH2PO4； 1.4g （NH4） 2SO4； 0.3g 。
37、MgSO4； 0.3g CaCl2； 0.5g Peptone ； 0.005g FeSO4 7H2O ； 0.0016gMnSO4H2O， 0.0014g ZnSO4H2O ； 0.002g CoCl2， 1000mL H2O ； pH 调节为 pH 6.8 ； 发 酵容器为 250mL 锥形瓶， 培养温度为 28， 黑曲霉按照 2 v/v 接种量接种， 培养 12h 后浑 浊红球菌按照 2 v/v 接种量接种进入进行混菌发酵。 0065 脂肪酸的提取 ： 发酵5d， 取50mL的菌液， 离心取沉淀， 用500mL提取剂 （体积比 ： 氯 仿甲醇 =2 1） 抽提沉淀过夜。离心除去沉淀， 用。
38、氮吹仪氮吹浓缩， 加入 500mL 皂化试剂 为甲醇水溶液 （体积比 ： 甲醇水 =4 1， 含 6 wtNaOH） 60皂化 1h。 0066 生 物 柴 油 的 制 备 ：用 离 子 液 体 N-methyl-2-pyrrolidonium methyl sulfonate(NMPCH3SO3) 作为催化剂进行甲酯化， 在 70条件下， 甲醇菌产脂肪酸 离子液体 （NMPCH3SO3） 按体积比 =1 1 0.3， 反应 6h 将皂化的脂肪酸甲酯化成为生 物柴油。用气质联用仪检测生物柴油的成分和含量 （见图 1） 。结果表明生产的生物柴油主 要成分为 C18 和 C16 的脂肪酸甲酯占总量的 84.29， 其余 15.89为十七烷酸和二十烷 酸， 是性质较优良的生物柴油。 0067 表 2. 产生的生物柴油主要成分 0068 十六烷酸 十六烯酸 十八烷酸 十八烯酸 百分比 24.80 19.31 15.25 24.93 说 明 书 CN 102660623 A 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102660623 A 9 。