说明书具有改良的岩藻糖化水平的抗体的生产方法
本申请要求2005年6月3日提交的美国临时申请流水号60/687,625和2005年11月14日提交的60/736,982的权益，在此收入其完整公开内容作为参考。
发明领域
本发明涉及岩藻糖减少且Fc功能提高的抗体的生成。
发明背景
重组治疗用蛋白质通常在数种哺乳动物宿主细胞系中产生，包括鼠骨髓瘤NS0和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Anderson and Krummen，2002；Chu andRobinson，2001)。每种细胞系在生产力和该细胞所产生的蛋白质的特性方面有其优势和劣势。商业生产细胞系的选择常常平衡了对高生产力的需要与呈递给定产物所要求的产品质量特征的能力。通常要求高滴度过程的一类重要的治疗用重组蛋白是单克隆抗体。有些单克隆抗体需要效应器功能，通过Fc区介导，以引发它们的生物学功能。以Rituximab(RituxanTM，Genentech和Biogen-Idec)为例，它是一种与细胞表面CD20结合并导致B细胞消减的嵌合单克隆抗体(Carton et al.，2002；Idusogie et al.，2000)。其它抗体，诸如Bevacizumab(AvastinTM，Genentech)，一种人源化抗VEGF(血管内皮生长因子)抗体，它们的活性不需要Fc效应器功能。
哺乳动物宿主细胞中产生的单克隆抗体在每条重链(每个完整的抗体分子有两条)的Asn297处包含一个N-连接的糖基化位点。抗体上的聚糖通常是复杂的双触角结构，具有很少的或者没有等分的N-乙酰葡糖胺(等分GlcNAc)，并具有高水平的核心岩藻糖化(Saba et al.，2002)。聚糖末端包含很少的或者不包含末端唾液酸，且包含可变量的半乳糖。有关糖基化对抗体功能的影响的综述参阅例如Wright & Morrison，Trend Biotechnol.15：26-31(1997)。相当多的工作显示，抗体聚糖结构的糖组成的变化可改变Fc效应器功能(Kumpel et al.，1994；Kumpel et al.，1995；Schuster et al.，2005；Shields etal.，2002；Umana et al.，1999)。对抗体活性有贡献的重要碳水化合物结构被认为是通过α1，6键附着于Fc区N-连接寡糖最内部N-乙酰葡糖胺(GlacNAc)残基的岩藻糖残基(Shields et al.，2002；Shinkawa et al.，J.Biol.Chem.278(5)：3466-3473(2003))。FcγR结合要求存在共价附着于Fc区中保守Asn297处的寡糖(Wright & Morrison，1997)。最近已经将非岩藻糖化结构与体外抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性的显著升高联系起来(Shields et al.，2002；Shinkawa et al.，2003)。包括我们自己在内的数个实验室已经成功的采用RNA干扰(RNAi)或敲除技术来改造CHO细胞以便降低FUT8 mRNA转录产物水平或完全敲除基因表达(Mori et al.，2004；Yamane-Ohnuki et al.，2004)。Mori等人于2004年报导，通过将细胞改造成组成型表达针对FUT8基因的siRNA并应用LCA选择，将已建立的稳定的抗体生产细胞系转变成产生ADCC提高了的抗体的细胞系。Mori证明了包含直到70％非岩藻糖化聚糖的抗体的产生。NiwaR.et al.，Cancer Res.64(6)：2127-2133(2004)报导了在植入有人PBMC的小鼠模型中，具有较低岩藻糖含量的抗CD20抗体可显著延长动物的存活。
历史上，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，最常用的工业用宿主之一中生成的抗体群中包含大约2-6％的非岩藻糖化抗体。然而，YB2/0(大鼠骨髓瘤)和Lec13(CHO系的凝集素突变体，其具有缺陷型GDP-甘露糖4，6-脱水酶，导致α1，6-岩藻糖基转移酶的底物GDP-岩藻糖或GDP-糖中间物缺乏(Ripka etal.，1986))细胞系可生成具有78-98％非岩藻糖化类型的抗体。遗憾的是，来自这些细胞的抗体产量极低，因此这些细胞系对于商业性制备治疗用抗体产品是不实用的。FUT8基因编码α1，6-岩藻糖基转移酶，它催化岩藻糖残基从GDP-岩藻糖转移至N-聚糖的Asn-连接(N-连接)GlcNac的第6位(Yanagidani etal.，J.Biochem 121：626-632(1997))。已知α1-6岩藻糖基转移酶是唯一负责将岩藻糖加至IgG抗体CH2结构域中Asn297处N-连接双触角碳水化合物的酶。
抗体Fc区附着有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构的抗体记载于美国专利申请US 2003/0157108(Presta，L.)。涉及“脱岩藻糖化的”或“岩藻糖缺陷型”抗体，包括抗CD20抗体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US2004/0093621，US 2004/0132140，和US 2004/0110704(3项都是Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd的)；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；US2006/0063254；US 2006/0064781；US 2006/0078990；US 2006/0078991；US6,602,684和US 2003/0175884(Glycart Biotechnology)；Yamane-Ohnuki et al.，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Mori et al.，Biotechnology and Bioengineering88(7)：901-908(2004)；Li et al.，(GlycoFi)2006年1月22日在线发表于NatureBiology；Niwa R.et al.，Cancer Res.64(6)：2127-2133(2004)；Okazaki et al.，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Shinkawa et al.，J.Biol.Chem.278(5)：3466-3473(2003)。产生脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请US2003/0157108 A1，Presta，L；和WO 2004/056312 A1，Adams et al.，尤其是实施例11)，及敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki et al.，Biotech.Bioeng.87：614(2004))。有关具有改良糖基化的抗原结合分子还可参见US 2005/0123546(Umana et al.)。
RNA干扰(RNAi)是高度保守的、序列特异性的转录后基因沉默机制，其使用双链RNA(dsRNA)作为信号来触发同源mRNA的降解。序列特异性mRNA降解的介质是由核糖核酸酶III切割较长dsRNA产生的21-23nt干扰性小RNA(siRNA)。dsRNA是I型干扰素(IFN)合成的有力诱导物，也是两类IFN诱导的酶(其产物激活潜伏的核糖核酸酶RNase L)的激活剂。这些对dsRNA的非特异性应答不被短于30bp的dsRNA触发。最主要的加工产物是具有对称的2nt 3’突出端的21和22nt RNA的双链体，它也是mRNA降解的最有效介质(Elbashir et al.，Nature 411：494-498(2001)；Elbashir et al.，Methods 26：199-213(2002))。
关注CD20抗体的专利和专利出版物包括美国专利5,776,456，5,736,137，5,843,439，6,399,061和6,682,734，以及美国专利申请US 2002/0197255A1，US2003/0021781A1，US2003/0082172A1，US2003/0095963A1，US2003/0147885A1(Anderson等)；美国专利6,455,043B1和WO00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO00/27428(Grillo-Lopez和White)；WO00/27433(Grillo-Lopez和Leonard)；WO00/44788(Braslawsky等)；WO01/10462(Rastetter，W.)；WO01/10461(Rastetter和White)；WO01/10460(White和Grillo-Lopez)；US2001/0018041A1，US2003/0180292A1，WO01/34194(Hanna和Hariharan)；美国申请US2002/0006404和WO02/04021(Hanna和Hariharan)；美国申请US2002/0012665A1和WO01/74388(Hanna，N.)；美国申请US2002/0058029A1(Hanna，N.)；美国申请US2003/0103971A1(Hariharan和Hanna)；美国申请US2002/0009444A1和WO01/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO01/97858(White，C.)；美国申请US2002/0128488A1和WO02/34790(Reff，M.)；WO02/060955(Braslawsky等)；WO02/096948(Braslawsky等)；WO02/079255(Reff和Davies)；美国专利6,171,586B1和WO98/56418(Lam等)；WO98/58964(Raju，S.)；WO99/22764(Raju，S.)；WO99/51642，美国专利6,194,551B1，美国专利6,242,195B1，美国专利6,528,624B1和美国专利6,538,124(Idusogie等)；WO00/42072(Presta，L.)；WO00/67796(Curd等)；WO01/03734(Grillo-Lopez等)；美国申请US2002/0004587A1和WO01/77342(Miller和Presta)；美国申请US2002/0197256(Grewal，I.)；美国申请US2003/0157108A1(Presta，L.)；美国专利6,565,827B1，6,090,365B1，6,287,537B1，6,015,542，5,843,398和5,595,721(Kaminski等)；美国专利5,500,362，5,677,180，5,721,108，6,120,767，6,652,852B1(Robinson等)；美国专利6,410,391B1(Raubitschek等)；美国专利6,224,866B1和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO01/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO00/67795(Goldenberg)；美国申请US2003/0133930A1和WO00/74718(Goldenberg和Hansen)；WO00/76542(Golay等)；WO01/72333(Wolin和Rosenblatt)；美国专利6,368,596B1(Ghetie等)；美国专利6,306,393和美国申请US2002/0041847A1(Goldenberg，D.)；美国申请US2003/0026801A1(Weiner和Hartmann)；WO02/102312(Engleman，E.)；美国专利申请US2003/0068664(Albitar等)；WO03/002607(Leung，S.)；WO03/049694，US2002/0009427A1和US2003/0185796A1(Wolin等)；WO03/061694(Sing和Siegall)；US2003/0219818A1(Bohen等)；US2003/0219433A1和WO03/068821(Hansen等)；US2002/0136719A1(Shenoy等)；WO2004/032828(Wahl等)；WO2004/035607(Teeling等)；US2004/0093621(Shitara等)。还可参见美国专利5,849,898和欧洲申请330,191(Seed等)；美国专利4,861,579和EP332,865A2(Meyer和Weiss)；WO95/03770(Bhat等)，US2001/0056066(Bugelski等)；WO2004/035607(Teeling等)；WO2004/056312(Lowman等)；US2004/0093621(Shitara等)；和WO2004/103404(Watkins等)。关注CD20抗体的出版物包括：Teeling，J.et al.，“Characterisation of new human CD20 monoclonal antibodieswith potent cytolytic activity against non-Hodgkin′s lymphomas”Blood，Jun2004；10.1182。
在如Yamane-Ohnuki 2004和Kyowa Hakko专利所述的FUT8敲除细胞系中，抗体的产生需要将编码期望抗体的基因转染入已建立的敲除细胞系。需要一种有效的方法在期望细胞系中生产抗体，同时控制重组工程抗体的岩藻糖含量，并且无需每次都经历在选定细胞系中创建FUT8基因敲除的繁琐过程。本发明满足了这种需要并且具有下文详述中显而易见的其它优势。
发明概述
改进抗体对FcγRIII的结合亲和力的一条途径是改变Fc区中的氨基酸序列(参阅Shields et al.，2002)。表3所示的人源化抗CD20抗体变体在Fc中掺入了增强FcγRIII结合和ADCC的氨基酸替代。本发明提供了产生具有较低岩藻糖含量的抗体的方法，在与Fc区中增强FcγRIII结合的氨基酸变化联合时显示出对FcγRIII亲和力和ADCC的相加效应。
本发明提供了在哺乳动物宿主细胞中产生包含IgG Fc的抗体同时降低抗体岩藻糖含量的方法，包括将至少一种编码抗体的核酸和编码靶向SEQ IDNO.1之FUT8基因序列不同编码区的至少两种siRNA的第二种核酸同时引入宿主细胞，其中siRNA抑制FUT8的表达并降低抗体的岩藻糖化水平。
本发明还提供了更有效的产生抗体生产细胞系同时敲低(knockdown)岩藻糖化的方法，产生的抗体与哺乳动物细胞中以正常岩藻糖化水平合成的抗体相比ADCC有所改进。可采取这样的方法来构建呈现高抗体生产力和受控岩藻糖化水平的细胞系。这样的细胞系可用于抗体的规模化扩大生产，正如治疗用抗体的商业生产中的那样。因此，提供了用于产生具有改进的ADCC的IgG抗体的方法，包括将至少一种编码抗体的核酸和编码靶向SEQ ID NO.1之FUT8基因序列不同编码区的至少两种siRNA的第二种核酸同时引入宿主细胞，其中抗体和siRNA在细胞中表达以产生与在没有siRNA的细胞中所产生的抗体相比岩藻糖化降低而ADCC活性升高的抗体。
在用于产生ADCC有所改进的IgG抗体的方法的一个实施方案中，所述抗体在Fc区中包含至少一处改进抗体对FcγRIII的结合和/或ADCC的氨基酸改变。所述抗体可包含S298A、E333A、K334A的Fc氨基酸替代。
本发明还提供了制备缺乏岩藻糖的人源化CD20结合抗体的组合物的方法。
在本发明方法的一个实施方案中，编码抗体的核酸编码抗体的轻(L)链和重(H)链二者。在一个实施方案中，抗体的H和L链及siRNA在同一表达载体上编码。在一个备选的实施方案中，H和L链在分开的表达载体上编码，另外，每个编码H和L链的表达载体还包含编码至少两个siRNA的核酸。
在所有前述方法的一个实施方案中，两个siRNA在不同的启动子的控制下表达。当Pol III启动子用于驱动表达载体中siRNA转录时，一个siRNA可以在H1启动子的控制下表达，而第二个siRNA在不同的Pol III启动子U6的控制下表达。
在一个具体的实施方案中，第一个和第二个siRNA分别靶向SEQ ID NO.1之FUT8基因序列的第733-751和1056-1074位核苷酸。
在以上方法的任一实施方案中，优选抗体岩藻糖化水平降低至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％。
还提供了用以上方法产生的抗体。
在所有前述方法的一个优选实施方案中，所述抗体是治疗用抗体。在一个实施方案中，所述抗体结合CD20。在一个实施方案中，所述抗体结合BR3。在优选的实施方案中，所述抗体结合人和其它灵长类动物的CD20。在一个实施方案中，CD20结合抗体是人源化抗体。在优选的实施方案中，所述人源化抗体是人源化2H7抗体，优选下文表3和4中所述的。在不同的实施方案中，所述人源化抗体包含以下这些成对VL和VH区之一：SEQ ID NO.2的L链可变区序列和SEQ ID NO.8的H链可变区序列；SEQ ID NO.25的L链可变区序列和SEQ ID NO.22的H链可变区序列；或SEQ ID NO.25的L链可变区序列和SEQ ID NO.33的H链可变区序列。在具体的实施方案中，人源化2H7抗体包含以下序列的一对L和H链：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27；及SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.34。
人源化抗CD20抗体的其它实施方案有hA20(又称为IMMU-106，或90Y-hLL2；US 2003/0219433，Immunomedics)；和AME-133(US 2005/0025764；Applied Molecular Evolution/Eli Lilly)。在一个不同的实施方案中，所述CD20结合抗体是人抗体，优选HUMAX-CD20TM(GenMab)。在另一个不同的实施方案中，所述CD20结合抗体是嵌合抗体，优选的实施方案是rituximab(Genentech，Inc.)和嵌合cA20抗体(参阅US 2003/0219433，Immunomedics)。
在另一个实施方案中，用本发明方法产生的抗体是结合BR3的抗体。
本发明另外提供了包含SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43之序列的核酸，SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43的序列编码与FUT8基因的两个不同编码区互补的两个siRNA。
提供了包含具有Fc区的人源化CD20结合抗体和载体的组合物，其中组合物中至少95％的抗体没有岩藻糖。
在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物。
另一方面是包含至少一种编码抗体的核酸和编码靶向SEQ ID NO.1之FUT8基因序列不同编码区的至少两种siRNA的第二种核酸的宿主细胞，其中的宿主细胞表达所述抗体和所述siRNA。
还提供了用前述岩藻糖缺陷型抗体组合物用于治疗疾病的用途。
附图简述
图1：附着有岩藻糖残基的N-聚糖的Asn-连接的(N-连接的)GlcNac。
图2：RNAi技术介导对基因表达的抑制的示意图。
图3：用于产生FUT8特异性siRNA的pSilencer3.1-H1 Puro质粒的图示。参见实施例1。
图4：RNAi探针序列。依照文献中公布的规则设计了五种序列。粗体序列相互互补并且代表所产生RNA的发夹部分。探针1-5对应于图5B中的RNAi1-5。参见实施例1。
图5A和5B：图5A显示了全长和flag-FUT8融合构建体及探针区的示意图。图5B显示了用M2抗flag抗体检测flag标记的部分CHO FUT8蛋白的免疫印迹。参见实施例1。
图6：来自RNAi 2和RNAi 4瞬时转染细胞的2H7抗体的岩藻糖含量(表示为％非岩藻糖化)，如实施例2所述。
图7A-E：含较少岩藻糖的2H7抗体对不同Fcγ受体的结合活性：FcγRI(图7A)；FcγRIIA(图7B)；FcγRIIB(图7C)；FcγRIII F158(图7D)；和FcγRIII V158(图7E)，如实施例2所述。
图8：Northern印迹分析。FUT8 mRNA为约3.5kb，大小与大鼠FUT8相似。泳道2和泳道3显示出比泳道1的对照少的FUT8。参见实施例2。
图9A和9B：概括开发岩藻糖化较少的克隆的流程图。图9A：标准细胞系开发规程。图9B：表达质粒中包含RNAi单元的新细胞系开发规程。
图10A、10B和10C：质粒结构。图10A：抗体HC和LC在分开质粒上的对照质粒组；图10B：HC和LC在包含一个或两个RNAi转录单元的分开质粒上的测试质粒；图10C：HC和LC在包含一个或两个RNAi转录单元的同一质粒上的测试质粒。缩写：HC，重链；LC，轻链；CMV：巨细胞病毒启动子和增强子序列；PUR-DHFR：嘌呤霉素和二氢叶酸还原酶融合基因。参见实施例4。
图11A和11B：稳定转染得到的克隆的抗体表达水平，如实施例4所述。对于每次质粒转染，挑取了72个MTX抗性克隆并用ELISA对抗体表达进行了筛选。图11A：CMV.PD.v511.RNAi4质粒转染的表达滴度。图11B：CMV.PD.v511.RNAi2.4质粒转染的表达滴度。
图12：FUT8 mRNA水平的Taqman分析。从衍生自CMV.PD.v511RNAi4和CMV.PD.v511.RNAi2.4质粒转染的克隆纯化总RNA。用对FUT8基因特异性的Taqman引物和探针测量FUT8 mRNA水平。参见实施例4。
图13：相等接种密度测定法。将两个来自CMV.PD.v511质粒转染的对照克隆、两个来自CMV.PD.v511.RNAi4质粒转染并具有最低非岩藻糖化的克隆和四个来自CMV.PD.v511.RNAi2.4质粒转染并具有最低非岩藻糖化的克隆以5×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中供抗体生产。用ELISA测定抗体滴度。
参见实施例4。
图14：用RNAi4或RNAi2.4质粒转染的克隆产生的人源化2H7.v511抗体的非岩藻糖化水平。具有大约5％非岩藻糖化的2H7.v511(图中的v511)作为对照包括在测定法中。参见实施例4。
图15A和15B：人源化2H7.v511抗体的岩藻糖化变体的FcγRIII结合亲和力。图15A比较了抗体对FcγRIII受体的F158低亲和力同种型的结合亲和力；图15B比较了对V158高亲和力受体同种型的结合亲和力。对照是具有大约5％非岩藻糖化的h2H7.v511。参见实施例4。
图16A和16B：ADCC活性测定法。利用Wil2-S细胞以基于细胞的测定法比较了两个人源化2H7变体，即v16和v511以及它们的非岩藻糖化(NF)变体的ADCC活性。2H7.v16和.v511抗体组合物具有大约5％的非岩藻糖化。v16-NF和v511-NF变体具有大约65-70％的非岩藻糖化。图16A显示了测定法中使用VF158供体NK细胞的ADCC活性，而图16B显示了使用VV158供体细胞的活性。
图17显示了编码全长CHO FUT8的DNA序列(SEQ ID NO.1)。
优选实施方案的详述
“CD20”抗原是在超过90％来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上找到的、分子量约35kD的非糖基化跨膜磷蛋白。CD20在早期前(pre)B细胞发育过程中表达，并保留至浆细胞分化；它在人干细胞、淋巴样祖细胞或正常浆细胞上找不到。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上。CD20在文献中的其它名称包括“B淋巴细胞限制分化抗原”和“Bp35”。CD20抗原记载于例如Clark and Ledbetter，Adv.Can.Res.52：81-149(1989)和Valentine et al.，J.Biol.Chem.264(19)：11282-11287(1989)。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性或功能。
本发明的人源化CD20结合抗体的生物学活性将至少包括抗体与人CD20的结合，更优选与人和其它灵长类动物CD20(包括猕猴、恒河猴、黑猩猩、狒狒)的结合。抗体会以不高于1×10-8的Kd值，优选不高于约1×10-9的Kd值结合CD20，而且在体内能够杀死或消减B细胞，优选与未用此类抗体处理的适宜的阴性对照相比至少达20％。B细胞消减可以是ADCC、CDC、凋亡或其它机制其中一种或多种的结果。在本文中的疾病治疗的有些实施方案中，可能希望特定效应器功能或机制胜过其它的，而且优选以人源化2H7的某些变体来实现那些生物学功能，诸如ADCC。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠结构中散发出六个高变环(重链和轻链各3个环)，促成结合抗原的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体在一级氨基酸序列方面相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler et al.，Nature 256：495(1975)；Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988；Hammerling et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas，563-681，Elsevier，N.Y，1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA101(34)：12467-12472(2004)；Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利No.5,545,806；5,569,825；5,591,669(都属于GenPharm)；5,545,807；WO 1997/17852；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Markset al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild et al.，NatureBiotechnology 14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
本发明的CD20结合抗体的“功能性片段”指那些保留与衍生它们的完整全长分子以基本上相同的亲和力结合CD20且根据体外或体内测定法(诸如那些本文所述的)的测量显示出包括消减B细胞在内的生物学活性的片段。
术语“可变的”指可变域中的某些区段在抗体间序列差异广泛的实情。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变域跨越的110个氨基酸。事实上，V区由15-30个氨基酸，称作框架区(FR)的相对不变异的区段及将框架区分开的每个长度为9-12个氨基酸，称作“高变区”的极度变异的较短区域组成。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近及VH中的残基31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近；Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(例如VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及VH中的残基26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
在本文中提及时，“共有序列”或共有V结构域序列指衍生自已知人免疫球蛋白可变区序列氨基酸序列比较的人工序列。基于这些比较，制备编码V结构域氨基酸序列的重组核酸序列，所述V结构域氨基酸序列是衍生自人κ链和人H链亚类IIIV结构域的共有序列。共有V序列不具有任何已知的抗体结合特异性或亲和力。
“嵌合”抗体(免疫球蛋白)中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗体是嵌合抗体的一个子集。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能诸如结合亲和力。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR，尽管FR可包含一处或多处提高结合亲和力的氨基酸替代。FR中这些氨基酸替代的数目通常在重链中不超过6处，在轻链中不超过3处。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetchand Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或Presta美国专利No.6,737,056中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。若抗体是CD20结合抗体，则ADCC活性可如下所述在表达人CD20加CD16的转基因小鼠(hCD20+/hCD16+Tg小鼠)中测试。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述Daёron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))并调节免疫球蛋白的动态平衡。
WO 00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入该专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields et al.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
关于对FcRn的结合亲和力，在一个实施方案中，抗体的EC50或表观Kd(在pH 6.0)＜＝100nM，更优选＜＝10nM。至于对FcγRIII(F158；即低亲和力同种型)提高的结合亲和力，在一个实施方案中，EC50或表观Kd＜＝10nM，而对于FcγRIII(V158；高亲和力)，EC50或表观Kd＜＝3nM。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997，Hinton 2004)以及下文所述。可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中，或者在施用了Fc变体多肽的灵长类动物中。在某些实施方案中，本发明的人源化2H7抗体还包含IgG Fc中的氨基酸改变并展示出对人FcRn提高的结合亲和力，比具有野生型IgG Fc的抗体高至少60倍、至少70倍、至少80倍、更优选至少100倍、优选至少125倍、甚至更优选至少150倍至约170倍。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。
具有更改的Fc区氨基酸序列及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551 B1和WO 99/51642。在此明确收入那些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie et al.，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
贯穿本说明书和权利要求书，除非另有说明，免疫球蛋白重链恒定域的残基编号方式是如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中的EU索引的编号方式，在此明确收入作为参考。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。V区的残基依照Kabat编号方式编号，除非明确指明依序或其它编号系统。
CD20抗体的例子包括：“C2B8”，现在称作“rituximab”(“RITUXAN/MABTHERA”)(美国专利No.5,736,137)；钇[90]标记的2B8鼠抗体，称作“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”(ZEVALIN)，可从BiogenIdec，Inc.购买(例如美国专利No.5,736,137；2B8于1993年6月22日保藏于ATCC，编号HB11388)；鼠IgG2a“B1”，也称作“Tositumomab”，任选用131I标记以产生“131I-B1”或“碘131 tositumomab”抗体(BEXXARTM)，可从Corixa购买(还可参见美国专利No.5,595,721)；鼠单克隆抗体“1F5”(例如Press et al.，Blood 69(2)：584-591(1987))及其变体，包括“框架修补的”或人源化的1F5(例如WO 2003/002607，Leung，S.；ATCC保藏物HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗体(例如美国专利No.5,677,180)；人源化2H7(例如WO 2004/056312(Lowmanet al.)及下文所列)；HUMAX-CD20TM完全人的高亲和力抗体，靶向B细胞细胞膜中的CD20分子(Genmab，丹麦；参见例如Glennie and van de Winkel，DrugDidcovery Today 8：503-510(2003)和Cragg et al.，Blood 101：1045-1052(2003))；WO 04/035607和WO 2005/103081(Teeling et al.，GenMab/Medarex)中所列的人单克隆抗体；US 2004/0093621(Shitara et al.)中所记载的Fc区结合有复杂N-糖苷连接的糖链的抗体；结合CD20的单克隆抗体和抗原结合片段(例如WO 2005/000901，Tedde et al.)，诸如HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11；结合CD20的单链蛋白质(例如US 2005/0186216(Ledbetter andHayden-Ledbetter)；US 2005/0202534(Hayden-Ledbetter and Ledbetter)；US2005/0202028(Hayden-Ledbetter and Ledbetter)；US 2005/0202023(Hayden-Ledbetter and Ledbetter)-Trubion Pharm Inc.)；诸如AME系列抗体的CD20结合分子，例如WO 2004/103404和US 2005/0025764(Watkins et al.，Applied Molecular Evolution，Inc.)中所列的AME-133TM抗体和例如WO2005/070963(Allan et al.，Applied Molecular Evolution，Inc.)中所列的具有Fc突变的CD20抗体；诸如WO 2005/016969和US 2005/0069545(Carr et al.)中所记载的CD20结合分子；例如WO 2005/014618(Chang et al.)中所列的双特异性抗体；人源化LL2单克隆抗体，例如US 2005/0106108(Leung and Hansen；Immunomedics)中所记载的；针对CD20的嵌合的或人源化的B-Ly1抗体，例如WO2005/044859和US 2005/0123546(Umana et al.；GlycArt BiotechnologyAG)中所记载的；A20抗体或其变体，诸如嵌合的或人源化的A20抗体(分别是cA20、hA20)和IMMUN-106(例如US 2003/0219433，Immunomedics)；及单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，可从国际白细胞分类研究组(International Leukocyte Typing Workshop)获得(例如Valentine et al.，in：Leukocyte Typing III，McMichael编，p.440，Oxford University Press(1987))。本文中优选的CD20抗体是人源化的、嵌合的、或人的CD20抗体，更优选rituximab，一种人源化2H7、嵌合的或人源化的A20抗体(Immunomedics)、HUMAX-CD20TM人CD20抗体(Genmab)、和结合CD20的免疫球蛋白/蛋白质(Trubion Pharm Inc.)。
术语“BR3”、“BR3多肽”或“BR3受体”在用于本文时涵盖“天然序列BR3多肽”。人BR3序列(SEQ ID NO：44)
1 MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGASS PAPRTALQPQ
61 ESVGAGAGEA ALPLPGLLFG APALLGLALV LALVLVGLVS WRRRQRRLRG ASSAEAPDGD
121 KDAPEPLDKV IILSPGISDA TAPAWPPPGE DPGTTPPGHS VPVPATELGS TELVTTKTAG
181 PEQQ
在用于本文时，“B细胞消减”指药物或抗体治疗后，与治疗前的水平相比，动物或人体中B细胞水平的降低。B细胞水平可使用众所周知的测定法来测量，诸如通过获得全血细胞计数、通过对已知B细胞标志进行染色的FACS分析、及通过诸如实验性实施例中描述的方法。B细胞消减可以是部分的或完全的。在一个实施方案中，表达CD20的B细胞的消减是至少25％。在接受B细胞消减药的患者中，B细胞消减的持续时间一般是药物在患者体内的循环时间及B细胞恢复的时间。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“分离的”核酸分子指已经鉴定且与抗体核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
表述“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
“载体”包括穿梭载体和表达载体。典型的是，质粒构建物还将包含复制起点(例如ColE1复制起点)和选择标志(例如氨苄青霉素或四环素抗性)，分别用于质粒在细菌中的复制和选择。“表达载体”指包含在细菌或真核细胞中表达抗体包括本发明的抗体片段所必需的控制序列或调控元件的载体。下文公开了合适的载体。
生成人源化CD20结合抗体诸如本发明的人源化2H7抗体的细胞将包括其中已经导入了编码该抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。下文公开了合适的宿主细胞。
术语“标记物”在用于本文时指与抗体直接或间接偶联的可检测化合物或组合物。标记物自身可以是通过自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
本发明的方法和组合物
RNAi干扰
长的双链RNA(dsRNA；通常＞200nt)可用于沉默靶基因在多种生物体和细胞类型(例如蠕虫、果蝇和植物)中的表达。在引入后，长dsRNA进入通常称为RNA干扰(RNAi)途径的细胞途径。首先，dsRNA通过称为Dicer的RNA酶III样酶被加工成20-25个核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNA)(起始步骤)。然后，siRNA被装配入称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的含内切核糖核酸酶的复合物，在此过程中解旋。siRNA链随后引导RISC至互补的RNA分子处，在那里它们切割和破坏关联RNA(效应步骤)。关联RNA切割发生在siRNA链所结合区域的中部附近，导致特异性的基因沉默。然而，由于大多数哺乳动物细胞呈现有力的抗病毒应答，其特征为在引入长于30bp的dsRNA后非特异性抑制蛋白质合成和RNA降解，所以研究者用21-23bp的siRNA转染细胞以便在这些系统中诱导RNAi而不引起抗病毒应答。在本发明的方法中，使用至少一种靶向特定基因转录产物(在此案例中是FUT8)的特异性dsRNA来诱导RNAi途径。将dsRNA通过任何合适的dsRNA投递系统投递入细胞。适宜的阴性对照将是不靶向生物体中的任何转录产物的dsRNA(例如靶向萤光素酶的dsRNA)。
在本发明的方法中，使用至少一种靶向特定基因转录产物(在此案例中是FUT8)的特异性dsRNA来诱导RNAi途径。在哺乳动物的培养细胞中，通常通过直接引入siRNA或在细胞内自DNA构建体表达为发夹结构来诱导RNAi。
产生siRNA的方法
有5种普遍知道的方法来产生用于基因沉默研究的siRNA：(i)化学合成；(ii)体外转录；(iii)用RNA酶III家族的酶(例如Dicer、RNA酶III)消化长dsRNA；(iv)在细胞中自siRNA表达质粒或病毒载体表达，和(vi)在细胞中自PCR衍生的siRNA表达盒表达。前三种方法涉及在体外制备siRNA，然后通过脂转染、电穿孔或其它技术直接引入哺乳动物细胞。后两种方法依靠引入在细胞内表达siRNA的基于DNA的载体和表达盒。所有这些方法，除了通过消化长dsRNA产生siRNA群之外，都需要仔细设计siRNA以便使靶基因的沉默最大化同时使对脱靶(off-target)基因的影响最小化。化学合成是优选的且最广泛使用的siRNA制备方法，用于瞬时转染培养的哺乳动物细胞，随后通过下游测定法来监测RNAi效果。siRNA比质粒更容易转染。
例示性的siRNA表达载体有来自Ambion公司(Austin，Texas)的pSilencerTM siRNA表达载体，它使用U6(Kunkel and Pederson，1988；Miyashiand Taira，2002)或H1聚合酶III启动子在哺乳动物细胞内表达siRNA。例如，pSilencer3.0-H1(质粒组成如图3所示)以H1 RNA启动子为特色(H1 RNA是RNA酶P的组成部分)。多种选择标志诸如潮霉素、新霉素、嘌呤霉素可包含在这些载体中。用BamH I和Hind III将pSilencer2.0-U6和3.0-H1 siRNA表达载体线性化，留下便于定向克隆的突出端。为了引起沉默，将编码靶向目的基因的短发夹RNA的小DNA插入片段克隆入载体，位于Pol III启动子下游。一旦转染入哺乳动物细胞，含有插入片段的载体就表达短发夹RNA，它被细胞体系迅速加工成siRNA。
将siRNA投递入培养细胞
对于许多永生化细胞系，siRNA的转染可利用基于脂质或胺的试剂进行，例如Ambion的siPORTTM Lipid和siPORTTM Amine Transfection Agents。对于投递入原代细胞和悬浮细胞，使用专门的、对细胞温和的缓冲液和优化的脉冲条件进行电穿孔一般导致很有效的siRNA投递而不损害细胞的生存能力。
siRNA实验的对照
不靶向任何内源转录产物的阴性对照(例如靶向萤光素酶的dsRNA)可用作由于引入任何siRNA引起的对基因表达的非特异性影响的对照。容易测定的(easy-to-assay)阳性对照可用于优化转染条件，确保siRNA得到有效投递，并确定特定的下游测定法是可用的。由于阳性对照被用于RNAi实验的许多不同方面，因此常常需要超过一种对照。对于转染优化实验，SilencerTMGAPDH siRNA是一种理想的阳性对照。此siRNA有效沉默GAPDH表达而且它的效果可通过qRT-PCR或其它方法在RNA水平、或者通过Western印迹或免疫荧光在蛋白质水平容易的监测。
RNAi效果的测定法
有数种测定法可用于测量RNAi效果。可用于了解敲低靶基因的生物学效果的测定法包括基于细胞的测定法、酶促测定法、阵列分析。siRNA在mRNA水平发挥它们的效果。用于siRNA确认和转染优化的最简单测定法依赖qRT-PCR来测量相对于阴性对照siRNA处理细胞而言基因特异性siRNA处理细胞中的靶转录产物水平。Applied Biosystems的TaqManGene ExpressionAssays，可用于超过41,000种人的、小鼠的和大鼠的基因，也可用于此目的。Ambion的siRNA数据库提供了与基因特异性SilencerTM预设计和确认的siRNA匹配的各个测定法的链接。还可以在蛋白质水平评估敲低程度。由于在大多数情况中回收到天然蛋白质，因此也可以进行酶促测定法。siRNA、靶mRNA和靶蛋白质水平可以关联起来。
本发明的抗体包含IgG Fc区且通常在体外和在体内与FcγRIIIA结合并呈现ADCC。常用于产生具有IgG Fc区或其保留Asn糖基化位点和ADCC效应器功能之片段的抗体的哺乳动物宿主细胞一般产生一群抗体，其中94-98％的单克隆抗体是岩藻糖化的。通过本发明方法产生且表达2个或更多个靶向FUT8基因的siRNA的转染子细胞将产生一群预期的抗体，它们具有与具有正常、未修饰的FUT8表达的宿主细胞所产生的抗体群相比降低的岩藻糖化水平，结果是岩藻糖化降低的抗体群总体上能够在存在适宜的效应器细胞时改进FcγRIIIA结合和/或ADCC。
在一个实施方案中，通过本发明方法产生的岩藻糖化降低的抗体结合CD20，特别是灵长类动物的CD20。在一个实施方案中，这些抗体结合人的CD20。
在一个实施方案中，本发明提供了通过本发明方法产生的具有减少的岩藻糖的人源化2H7抗体。hu2H7抗体的产生详细记载于WO 04/056312，完整收入本文作为参考。在具体的实施方案中，所述变体是2H7.v16、hu2H7.v511和hu2H7.v114。
在全长抗体中，本发明的人源化CD20结合抗体将包含相连的人源化的V结构域和人免疫球蛋白的C结构域。在一个优选的实施方案中，H链C区来自人IgG，优选IgG1或IgG3。L链C结构域优选来自人κ链。
为本发明目的，“人源化2H7”指如下完整抗体或抗体片段，其包含轻链可变区(VL)序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAP
SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT
KVEIKR(SEQ ID NO：2)；
和重链可变区(VH)序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：8)。
若人源化2H7抗体是完整抗体，优选的是，它包含v16轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAP
SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT
KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS
SPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：13)；
和重链氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA
LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPG(SEQ ID NO：14)。
前述人源化2H7 mAb的一种变体是2H7.v31，它具有与上文SEQ ID NO：13相同的L链序列且包含如下H链氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA
LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAK
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGK(SEQ ID NO：15)。
前述人源化2H7抗体的另一种变体是这样一种抗体，它包含2H7.v114的SEQ ID NO.25的VL：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPS
NLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTK
VEIKR(SEQ ID NO.25)；
和SEQ ID NO.22的VH：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
VVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.22)。
2H7.v114的完整L链氨基酸序列具有如下序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPS
NLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTK
VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：26)；
2H7.v114的完整H链氨基酸序列为：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
VVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL
GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF
PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY
KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK(SEQ ID NO：27)。
另一种变体是2H7.v138，它包含SEQ ID NO.26的H链氨基酸序列。
另一种变体，2H7.v477，包含SEQ ID NO.25的VL和SEQ ID NO.22的VH，且具有H链氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
VVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL
GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF
PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENY
KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQKS
LSLSPGK(SEQ ID NO：31)。
前述人源化2H7抗体的另一种变体是这样一种抗体，它包含2H7.v511的SEQ ID NO.25的VL和SEQ ID NO.33的VH(见表4)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
VVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.33)。
在一个实施方案中，抗体包含2H7.v511轻链(SEQ ID NO.26)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPS
NLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTK
VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA
LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC；
和2H7.v511重链(SEQ ID NO.34)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
VVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL
GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF
PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENY
KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPG。
基于v16的所有其它变体的V区将具有v16的氨基酸序列，除了下文表3所示氨基酸替代的位置。除非另有说明，2H7变体将具有与v16相同的L链。人源化抗体2H7.v16也称为rhuMAb2H7、PRO70769或Ocrelizumab。
表3
2H7型式 轻链(VL) 变化重链(VH)变化Fc变化
16供参照 -
31 -- S298A，E333A，K334A
73 M32LN100A
75 M32LN100A S298A，E333A，K334A
96 S92AD56A，N100A
114 M32L，S92A D56A，N100A S298A，E333A，K334A
115 M32L，S92A D56A，N100A S298A，E333A，K334A，E356D，M358L
116 M32L，S92A D56A，N100A S298A，K334A，K322A
138 M32L，S92A D56A，N100A S298A，E333A，K334A，K326A
477 M32L，S92A D56A，N100A S298A，E333A，K334A，K326A，N434W
375 - - K334L
511 M32L，S92A D56A，N100Y， S100aR S298A，E333A，K334A，K326A
588 - - S298A，E333A，K334A，K326A
表4
2H7型式 VL SEQ ID NO. VH SEQ ID NO. 完整L链 SEQ ID NO. 完整H链 SEQ ID NO.
16 2 8 13 14
31 2 8 13 15
73 16 17 18 19
75 16 17 18 20
96 21 22 23 24
114 25 22 26 27
115 25 22 26 28
116 25 22 26 29
138 25 22 26 30
477 25 22 26 31
375 2 8 13 32
511 25 33 26 34
588 2 8 35 36
残基编号方式依照Kabat et al.，Sequences of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)，插入以a、b、c、d和e表示，缺口在序列图中以破折号表示。在包含Fc区的CD20结合抗体中，Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可去除，例如，在抗体纯化过程中或通过重组工程改造编码抗体多肽的核酸。因此，本发明的人源化2H7抗体组合物可包含具有K447的抗体、去除了所有K447的抗体、或者具有与没有K447残基的抗体的混合物。
IgG中的N-糖基化位点位于CH2结构域中的Asn297。本发明的人源化2H7抗体组合物包括具有Fc区的任何前述人源化2H7抗体的组合物，其中组合物中大约80-100％(优选大约90-99％)的抗体包含缺少岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构，附着于糖蛋白的Fc区。此类组合物在本文中证实展现出与FcγRIIIA(F158)结合方面惊人的改善，在与人IgG相互作用方面FcγRIIIA(F158)不像FcγRIIIA(V158)那样有效。在正常的、健康的非洲裔美国人和高加索人中FcγRIIIA(F158)比FcγRIIIA(V158)更常见。参见Lehrnbeche etal.，Blood 94：4220(1999)。
双特异性人源化2H7抗体涵盖这样的抗体，其中抗体的一条臂至少具有本发明人源化2H7抗体H链和/或L链的抗原结合区，而另一条臂具有针对第二抗原的V区结合特异性。在具体的实施方案中，所述第二抗原选自CD3、CD64、CD32A、CD16、NKG2D或其它NK活化配体。
在某些实施方案中，本发明的人源化2H7抗体进一步包含IgG Fc中的氨基酸更改，并且展现出较之具有野生型IgG Fc的抗体提高的对人FcRn的结合亲和力，提高至少60倍、至少70倍、至少80倍，更优选至少100倍，优选至少125倍，甚至更优选至少150倍至大约170倍。
若siRNA转染细胞中的FUT8转录产物或蛋白质水平与未转染和表达FUT8抑制性siRNA的同样细胞中的水平相比有可测量的降低，则FUT8的表达受到抑制或敲低。细胞中的FUT8转录产物或蛋白质及所产生抗体的岩藻糖含量可通过下文所述方法定量。优选FUT8表达的抑制水平导致组合物中抗体的岩藻糖化水平降低至少65％，优选75-80％，更优选90％，甚至更优选95％或99％。
可用于驱动siRNA表达的启动子有Pol III型启动子，诸如H1或U6启动子。也可使用tRNA启动子。
宿主细胞将包括真核细胞，诸如哺乳动物和植物细胞。优选宿主细胞是哺乳动物细胞，诸如CHO细胞，但本文中也提供了其它合适的宿主细胞。
若抗体展示出结合水平和ADCC活性较之具有正常FUT8基因功能而无RNAi和FUT8敲低的宿主细胞中所产生的同样抗体有升高，则FcγRIII结合和/或ADCC得到改进。测量FcγR结合和ADCC的方法记载在下文中。
抗体的生产
单克隆抗体
单克隆抗体可以使用最初由Kohler et al.，Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法来生成，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来生成。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principlrs and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称为融合配偶体)生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的融合配偶体骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选择的抗体生产细胞稳定且高水平的生成抗体、且对针对未融合的亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，SanDiego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤所衍生的及可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，Maryland，USA)获得的SP-2和衍生物例如X63-Ag8-653。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也有用于生成人单克隆抗体的记载(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur et aL.，Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson et al.，Anal.Biochem.107：220(1980)中记载的Scatchard分析来测定。
一旦鉴定出生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，所述克隆就可通过有限稀释规程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养，例如通过将细胞腹膜内注射到小鼠中。
可通过常规抗体纯化流程，诸如例如亲和层析(例如使用蛋白A或蛋白G-Sepharose)、离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。一旦分离，就可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外生成抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262(1993)及Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty et al.，Nature 348：552-554(1990)中记载的技术构建的噬菌体抗体库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)及Marks et al.，J.Mol. Biol.222：581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库进行的鼠和人抗体的分离。后续出版物记载了通过链改组生成高亲和力(nM范围)的人抗体(Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids Res.21：2265-2266(1993))。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
可以修饰编码抗体的DNA以生成嵌合或融合抗体多肽，例如通过用人重链和轻链恒定区(CH和CL)序列替代同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的整个或部分编码序列融合。可以用非免疫球蛋白多肽序列替代抗体的恒定区，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
人源化抗体
本领域已经记载了用于人源化非人抗体的方法。优选的是，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们典型的取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Reichmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science239：1534-1536(1988))，通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体典型的是这样的人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代。
将用于构建人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，在抗体意图用于人类治疗性用途时对于降低抗原性和HAMA(人抗小鼠抗体)应答非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。鉴定出与啮齿类最接近的人可变域序列并接受其中的人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高结合亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可得到的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。可得到图解和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选择出FR残基并组合，从而实现期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，高变区残基直接且最实质性的涉及对抗原结合的影响。
人源化抗体可以是抗体片段，诸如Fab，它任选与一种或多种细胞毒剂偶联以生成免疫偶联物。或者，人源化抗体可以是全长抗体，诸如全长IgG1抗体。
人抗体和噬菌体展示方法学
作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成这样的转基因动物(例如小鼠)，它们在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源性抗体生成的完全抑制。将大量人种系免疫球蛋白基因转移到此类种系突变小鼠中将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year inImmuno.7：33(1993)；美国专利No.5,545,806，5,569,825，5,591,669(都属于GenPharm)；5,545,807；WO 97/17852。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.，Nature 348：552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变域(V)基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体可变域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因得到选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行，综述参见例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库中分离出大量不同的抗唑酮抗体。可基本上遵循Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith et al.，EMBO J.12：725-734(1993)所记载的技术，由未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。
如上所述，还可通过体外激活B细胞来生成人抗体(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)。
抗体片段
在某些情况中，使用抗体片段有优势，而不是完整抗体。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于接近实体瘤。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24：107-117(1992)；Brennan et al.，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容许容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及美国专利No.5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering，Borrebaeck编，supra。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合CD20蛋白质的两种不同表位。其它此类抗体可将CD20结合位点与另一种蛋白质的结合位点联合在一起。或者，可将抗CD20臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD3)、或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)、或NKG2D或其它NK细胞活化配体的臂联合在一起，使得细胞防御机制聚焦和定位于CD20表达细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达CD20的细胞。这些抗体拥有CD20结合臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
WO 96/16673记载了一种双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体，美国专利No.5,837,234披露了一种双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体。WO 98/02463显示了一种双特异性抗ErbB2/Fcα抗体。美国专利No.5,821,337教授了一种双特异性抗ErbB2/CD3抗体。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein et al.，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO93/08829及Traunecker et al.，EMBO J.10：3655-3659(1991)。
依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主细胞中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供期望双特异性抗体的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例对期望链组合的产量没有显著影响时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入单一表达载体。
在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.，Methods in Enzymology 121：210(1986)。
依照美国专利No.5,731,168中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。
文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al，Science 229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.175：217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳瘤靶物的溶解活性。
还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。
Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的VH和VL，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber e tal.，J.Immunol.152：5368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al，J.Immunol.147：60(1991)。
多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易的通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文设想的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。
其它氨基酸序列修饰
设想了本文所述CD20结合抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适宜的核苷酸变化引入抗CD20抗体核酸或者通过肽合成来制备抗CD20抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗CD20抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。只4要最终的构建物具有期望特性，可进行删除、插入和替代的任意组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变抗CD20抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
可用于鉴定抗CD20抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989)中所记载的。在此，鉴定了一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以影响氨基酸与CD20抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代展现出功能敏感性的氨基酸位置。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析给定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的抗CD20抗体变体筛选期望活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围从一个残基至包含上百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。未端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗CD20抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗CD20抗体分子的其它插入变体包括在抗CD20抗体的N-或C-末端融合酶(例如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗CD20抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但也设想了FR改变。保守替代在下表中显示在标题“优选替代”下。如果此类替代导致生物学活性的变化，那么可以引入表中称为“例示替代”的更实质性变化，或者如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。
氨基酸替代表
原始残基例示替代优选替代
Ala(A)Val；Leu；Ile Val
Arg(R)Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N)Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D)Glu；Asn Glu
Cys(C)Ser；Ala Ser
Gln(Q)Asn；Glu Asn
Glu(E)Asp；Gln Asp
Gly(G)Ala Ala
His(H)Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I)Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L)正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K)Arg；Gln；Asn Arg
Met(M)Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F)Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P)Ala Ala
Ser(S)Thr Thr
Thr(T)Ser Ser
Trp(W)Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y)Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V)Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，将天然存在残基如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一的成员交换另一个类别的。
任何不牵涉保持抗CD20抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改善分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改良的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法牵涉使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单的说，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和人CD20之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，就如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。改变意味着删除在抗体中找到的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加糖基化位点是通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利的完成的(用于N-连接的糖基化位点)。还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变(用于O-连接的糖基化位点)。
编码抗CD20抗体的氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体型式的抗CD20抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，例如增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改良的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可如Wolff et al.，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中所记载的使用异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体介导的溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
为了延长抗体的血清半衰期，可如例如美国专利No.5,739,277中所记载的将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。
其它抗体修饰
本文还设想了抗体的其它修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物之一连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。还可将抗体包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编，1980。
筛选具有期望特性的抗体
可以如实验性实施例中所述选择具有某些生物学特性的抗体。
本发明抗CD20抗体的生长抑制效果可通过本领域知道的方法来评估，例如使用内源性的或在用CD20基因转染后表达CD20的细胞。例如，可将肿瘤细胞系和CD20转染细胞用多种浓度的本发明抗CD20单克隆抗体处理数天(例如2-7天)，并用结晶紫或MTT染色，或者通过一些其它比色测定法进行分析。测量增殖的另一种方法将是通过比较在存在或缺乏本发明抗CD20抗体时处理的细胞的3H-胸苷摄取。抗体处理后，收获细胞并在闪烁计数器中对掺入DNA的放射性的量定量。适宜的阳性对照包括用已知抑制选定细胞系生长的生长抑制性抗体处理该细胞系。
为了选择诱导细胞死亡的抗体，可相对于对照评估通过例如碘化丙啶(PI)、锥虫蓝或7AAD摄取显示的膜完整性丧失。PI摄取测定法可在缺乏补体和免疫效应细胞时进行。在单独的培养基或含有浓度为例如约10μg/ml的适宜单克隆抗体的培养基中温育表达CD20的肿瘤细胞。将细胞温育3天的时限。每次处理后，将细胞清洗并等分到35mm盖有滤网(strainer-capped)的12×75管中(每管1ml，每个处理组3管)以除去细胞团块。然后向管中加入PI(10μg/ml)。可以使用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTM CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。可以将那些根据PI摄取的测定诱导统计学显著水平的细胞死亡的抗体选作诱导细胞死亡的抗体。
为了筛选结合CD20上目的抗体所结合的表位的抗体，可进行常规交叉阻断测定法，诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane，1988中所记载的。此测定法可用于测定测试抗体是否与本发明的抗CD20抗体结合相同位点或表位。或者/另外，可通过本领域知道的方法进行表位作图。例如，可对抗体序列进行诱变，诸如通过丙氨酸扫描，以鉴定接触残基。首先对突变型抗体测试多克隆抗体的结合以确保正确折叠。在一种不同的方法中，可将对应于CD20不同区域的肽与测试抗体或者与测试抗体及具有已表征或已知表位的抗体一起用于竞争测定法。
载体、宿主细胞和重组方法
本发明还提供了编码人源化2H7变体抗体的分离的核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞、及用于生产所述抗体的重组技术。
为了重组生产抗体，分离编码抗体的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
(i)信号序列构件
本发明的人源化2H7抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然CD20结合抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO 90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
将此类前体区(precursor region)的DNA以符合读码框的方式与编码人源化2H7抗体的DNA连接。
(ii)复制起点构件
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。
(iii)选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是那些能够鉴定有能力摄取编码人源化2H7抗体的核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)，DHFR的一种竞争性拮抗剂的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
或者，可以通过细胞在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中的生长来选择经编码人源化2H7抗体、野生型DHFR蛋白质、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利No.4,965,199。
适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.，Nature 282：39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones，Genetics 85：12(1977)。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤随之提供了用于通过在缺少色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg，Bio/Technology 8：135(1990)。还披露了用于由克鲁维氏酵母属的工业用菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer et al.，Bio/Technology 9：968-975(1991)。
(iv)启动子构件
表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码人源化2H7抗体的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码CD20结合抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体。
适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录人源化2H7抗体受到例如从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)基因组，从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及从热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et al.，Nature 297：598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(v)增强子元件构件
常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明人源化2H7抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，位于CD20结合抗体编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
(vi)转录终止构件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码CD20结合抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中披露的表达载体。
(vii)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码CD20结合抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.ffagilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适于表达糖基化人源化2H7抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda(毛虫)、埃及伊蚊Aedes aegypti(蚊子)、白纹伊蚊Aedesa albopictus(蚊子)、黑腹果蝇Drosophila melanogaster(果蝇)和家蚕Bombyx mori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa califomica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Grahamet al.，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。
用上文所述用于生产CD20结合抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
(viii)培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生产本发明CD20结合抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
(ix)抗体的纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter et al.，Bio/Technology10：163-167(1992)记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么一般首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
在任何预备性纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可进行低pH疏水相互作用层析，使用pH大约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度进行(例如大约0-0.25M盐)。
抗体偶联物
抗体可以与细胞毒剂诸如毒素或放射性同位素偶联。在某些实施方案中，所述毒素是加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、auristatin E及其类似物或衍生物。
优选的药物/毒素包括DNA损伤剂、微管聚合或解聚的抑制剂、及抗代谢物。细胞毒剂的优选类别包括例如酶抑制剂诸如二氢叶酸还原酶抑制剂和胸苷酸合酶抑制剂、DNA嵌入剂、DNA切割剂、拓扑异构酶抑制剂、蒽环类抗生素(anthracycline)药物家族、长春类(vinca)药物、丝裂霉素(mitomycin)、博来霉素(bleomycin)、细胞毒性核苷、蝶啶(pteridine)药物家族、二炔类抗生素(diynenes)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)和分化诱导物。那些类别特别有用的成员包括例如甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氨喋呤(methopterin)、二氯甲氨蝶呤(dichloromethotrexate)、5-氟尿嘧啶(fluorouracil)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、美法仑(melphalan)、洛诺生(leurosine)、洛诺西丁(leurosidine)、放线菌素(actinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、N-(5，5-二乙酰氧基戊基)多柔比星、吗啉代-多柔比星、1-(2-氯乙基)-1，2-二甲基磺酰肼(1-(2-choroehthyl)-1，2-dimethanesulfonyl hydrazide)、N8-乙酰基亚精胺(N8-acetyl spermidine)、氨基喋呤(aminopterin)、甲氨喋呤(methopterin)、埃斯波霉素(esperamicin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、丝裂霉素A(mitomycin A)、放线菌素(actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、洋红霉素(carminomycin)、氨基喋呤(aminopterin)、他利霉素(tallysomycin)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)及鬼臼毒素衍生物诸如依托泊苷(etoposide)或磷酸依托泊苷、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、泰素(taxol)、泰索帝(taxotere)、视黄酸(retinoic acid)、丁酸(butyric acid)、N8-乙酰基亚精胺(N8-acetyl spermidine)、喜树碱(camptothecin)、加利车霉素(calicheamicin)、苔藓抑素(bryostatin)、cephalostatins、安丝菌素(ansamitocin)、actosin、美登木素生物碱类(maytansinoid)诸如DM-1、美登素(maytansine)、美登醇(maytansinol)、N-去甲基-4，5-去环氧美登醇、C-19-脱氯美登醇、C-20-羟基美登醇、C-20-脱甲氧基美登醇、C-9-SH美登醇、C-14-烷氧甲基美登醇、C-14-羟基或乙酰氧甲基美登醇、C-15-羟基/乙酰氧基美登醇、C-15-甲氧基美登醇、C-18-N-脱甲基美登醇和4，5-脱氧美登醇；auristatin，诸如auristatin E、M、PHE和PE；dolostatin，诸如dolostatin A、dolostatin B、dolostatin C、dolostatin D、dolostatin E(20-表和11-表)、dolostatin G、dolostatin H、dolostatin I、dolostatin1、dolostatin 2、dolostatin 3、dolostatin 4、dolostatin 5、dolostatin 6、dolostatin7、dolostatin 8、dolostatin 9、dolostatin 10、deo-dolostatin 10、dolostatin 11、dolostatin 12、dolostatin 13、dolostatin 14、dolostatin 15、dolostatin 16、dolostatin17和dolostatin 18；cephalostatin，诸如cephalostatin 1、cephalostatin 2、cephalostatin 3、cephalostatin 4、cephalostatin 5、cephalostatin 6、cephalostatin7、25′-表-cephalostatin 7、20-表-cephalostatin 7、cephalostatin 8、cephalostatin9、cephalostatin 10、cephalostatin 11、cephalostatin 12、cephalostatin 13、cephalostatin 14、cephalostatin 15、cephalostatin 16、cephalostatin 17、cephalostatin 18和cephalostatin 19。
美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白聚合来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物披露于例如美国专利No.4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533，在此明确收入其公开内容作为参考。
已经将美登素和美登木素生物碱类与特异性结合肿瘤细胞抗原的抗体偶联。包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其治疗用途披露于例如美国专利No.5,208,020；5,416,064及欧洲专利EP 0 425 235 B1，在此明确收入其公开内容作为参考。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱类的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示出抗肿瘤活性。Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱类经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱类偶联物，包括例如美国专利No.5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1及Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)中所披露的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上述专利中所披露的，优选二硫化物和硫醚基团。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体与美登木素生物碱类的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱类分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。
加利车霉素
另一种感兴趣的免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的CD20结合抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都属于美国Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research53：3336-3342(1993)；Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些药剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒性效果。
放射性同位素
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联的抗CD20抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))可用于掺入碘-123。Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy，Chatal，CRC Press，1989详细记载了其它方法。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所记载的来制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
治疗用途
本发明的人源化2H7 CD20结合抗体可用于治疗许多恶性和非恶性疾病包括CD20阳性癌症诸如B细胞淋巴瘤和白血病，及自身免疫病。骨髓中的干细胞(B细胞前体)缺乏CD20抗原，使得健康B细胞能在处理后再生并在数月内回到正常水平。hu2H7.v511是将用于本文中的治疗方法的优选抗体。
CD20阳性癌症指这样的癌症，其中在细胞表面上表达CD20的细胞异常增殖。CD20阳性B细胞肿瘤包括CD20阳性何杰金氏(Hodgkin)病，包括淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD)；非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；毛细胞性白血病。
术语“非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤”或“NHL”在用于本文时指何杰金氏淋巴瘤以外的淋巴系统癌症。一般可通过何杰金氏淋巴瘤中存在里-施(Reed-Sternberg)细胞而非何杰金氏淋巴瘤中不存在所述细胞将何杰金氏淋巴瘤与非何杰金氏淋巴瘤区分开来。非何杰金氏淋巴瘤在该术语用于本文时所涵盖的例子包括本领域技术人员(例如肿瘤学家或病理学家)依照本领域已知的分类表将鉴定为此类的任何淋巴瘤，诸如Color Atlas of ClinicalHematology，第3版，Victor A.Hoffbrand和John E.Pettit编，Harcourt PublishersLtd.，2000中记载的Revised European-American Lymphoma(REAL)scheme(欧美淋巴瘤修正表)。具体参见图11.57、11.58和11.59中的表。更具体例子包括但不限于复发性或顽固性NHL、前线(front line)低级NHL、阶段III/IV NHL、化疗耐受性NHL、前体B成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或前淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性淋巴瘤、免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性(lymphoplasmacytic)淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、节外边缘区(extranodal marginal zone)-MALT淋巴瘤、节边缘区(nodal marginal zone)淋巴瘤、毛细胞性白血病、浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤、低级/滤泡淋巴瘤、中级/滤泡NHL、套细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤(滤泡的)、中级弥漫性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、攻击性(agressive)NHL(包括攻击性前线NHL和攻击性复发性NHL)、自体干细胞移植后复发性或顽固性NHL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、高级成免疫细胞NHL、高级成淋巴细胞NHL、高级小无核裂细胞NHL、贮积病(bulkydisease)NHL、伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤、前体(外周)大粒状淋巴细胞白血病、蕈样肉芽肿病和/或塞扎里(Sezary)综合征、皮肤淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤。
无痛淋巴瘤是一种生长缓慢的、不能治愈的疾病，其中患者在多次病情消退和复发后平均存活6至10年。在一个实施方案中，将人源化CD20结合抗体或其功能性片段用于治疗无痛NHL。
本发明的人源化2H7抗体或其功能性片段可作为单一药剂治疗用于例如复发性或顽固性低级或滤泡性CD20阳性B细胞NHL，或者可以与其它药物联合成多药物方案施用于患者。
在具体的实施方案中，将人源化CD20结合抗体及其功能性片段用于治疗非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
“自身免疫病”在本文中指因个体自身组织引起的和针对个体自身组织的疾病或病症或其共分离(co-segregate)或表现或者由此产生的疾患。自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎诸如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、感染性关节炎、莱姆(Lyme)关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节炎和幼发型类风湿性关节炎，骨关节炎，慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)，变形性关节炎，慢性原发性多关节炎，反应性关节炎，和强直性脊柱炎)，炎性过度增殖性皮肤病，银屑病诸如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑病，特应性包括特应性疾病诸如干草热和乔布氏(Job)综合征，皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎，x连锁的高IgM综合征，荨麻疹诸如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹包括慢性自身免疫性荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，青少年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化诸如系统性硬化、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼(spino-optical)MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发性消退性(relapsing remitting)MS(RRMS)、进行性系统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化(sclerosis disseminata)和共济失调性(ataxic)硬化，炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏(Crohn)病，自身免疫介导的胃肠病，结肠炎诸如溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、微观(microscopic)结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎，和自身免疫性炎性肠病)，坏疽性脓皮症，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，巩膜外层炎，呼吸窘迫综合征包括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，整个或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液学病症，类风湿性脊椎炎，突发性听觉丧失，IgE介导的疾病诸如过敏反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen)脑炎和边缘系和/或脑干脑炎，葡萄膜炎诸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和没有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜增殖性或膜性增殖性GN(MPGN)包括I型和II型、和急进性GN，变应性疾患和应答，变应性反应，湿疹包括变应性或特应性湿疹，哮喘诸如支气管哮喘(asthma bronchiale)和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的疾患，针对外来抗原诸如妊娠期间胎儿A-B-O血型的免疫反应，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，系统性红斑狼疮(SLE)(systemiclupus erythematodes)诸如皮肤SLE、亚急性皮肤红斑狼疮、新生儿狼疮综合征(NLE)、播散性红斑狼疮、狼疮(包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮、狼疮脱发)，幼发型(I型)糖尿病包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成人期发作的糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病，粒细胞缺乏，血管炎病包括血管炎(包括大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu))动脉炎)，中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)，微观(microscopic)多动脉炎，CNS血管炎，坏死性、皮肤性或超敏感性血管炎，系统性坏死性血管炎，和ANCA相关血管炎诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或综合征(CSS))，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，库姆斯(Coombs)阳性贫血，戴-布二氏(DiamondBlackfan)贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血(anemia pemiciosa)，阿狄森氏(Addison)病，单纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞渗出的疾病，CNS炎性病症，多器官损伤综合征诸如那些败血症、外伤或出血继发的，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，贝切特氏(Bechet或Behcet)病，卡斯尔曼氏(Castleman)综合征，古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征，雷诺氏(Reynaud)综合征，斯耶格伦氏(Sjogren)综合征，史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征，类天疱疮诸如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮和红斑性天疱疮)，自身免疫性多内分泌病，莱特氏(Reiter)病或综合征，免疫复合物肾炎，抗体介导的肾炎，视神经脊髓炎，多神经病，慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经病，血小板减少症(例如心肌梗死患者发生的)包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、肝素诱发的血小板减少症、和自身免疫或免疫介导的血小板减少症诸如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP，睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退症，甲状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎诸如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏(Hashimoto)病、慢性甲状腺炎(桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺病，特发性甲状腺功能减退症，格雷夫斯氏(Graves)病，多腺性综合征诸如自身免疫性多腺体综合征(或多腺性内分泌病综合征)，瘤外综合征包括神经学瘤外综合征诸如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特(Lambert-Eaton)综合征，僵体或僵人综合征，脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力诸如胸腺瘤相关重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，和感觉神经病，多病灶运动神经病，席汉氏(Sheehan)综合征，自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，淋巴样间质性肺炎(LIP)，梗阻性细支气管炎(非移植)对NSIP，格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征，贝格尔氏(Berger)病(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，原发性胆汁性肝硬化，肺硬变，自身免疫性肠病综合征，乳糜泻，腹部疾病，口炎性腹泻(麸质肠病)，顽固性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白血症，肌萎缩侧索硬化(ALS)(卢格里克氏(Lou Gehrig)病)，冠状动脉病，自身免疫性耳病诸如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听觉丧失，视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，多软骨炎诸如顽固性或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，淀粉样变，巩膜炎，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和性质未确定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS))，周围神经病，瘤外综合征，通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病，孤独症，炎性肌病，局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝脏病学病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特氏(Schmidt)综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病，糖尿病肾病，德雷斯勒氏(Dressler)综合征，斑秃，CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏(Raynaud)现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细管扩张)，男性和女性自身免疫性不孕不育，混合性结缔组织病，恰加斯氏(Chagas)病，风湿热，习惯性流产，农民肺，多形红斑，心脏切开术后综合征，柯兴氏(Cushing)综合征，养鸟者肺，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞性血管炎，阿尔波特氏(Alport)综合征，肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风，疟疾，利什曼病，锥虫病(kypanosomiasis)，血吸虫病，蛔虫病，曲霉病，Sampter氏综合征，卡普兰氏(Caplan)综合征，登革，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)，胎儿成红细胞增多症，嗜曙红细胞性筋膜炎(faciitis)、舒尔曼氏(Shulman)综合征，费尔提氏(Felty)综合征，flariasis，睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或Fuch氏睫状体炎，亨诺-许兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，艾柯病毒感染，心肌病，阿尔茨海默氏(Alzheimer)病，细小病毒感染，风疹病毒感染，种痘后综合征，先天性风疹感染，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染、腮腺炎，埃文斯(Evans)综合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病，链球菌后肾炎，闭塞性血栓血管炎(thromboangitis ubiterans)，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞性多肌痛，内分泌性眼病，慢性超敏感性肺炎，干燥性角膜结膜炎，流行性角膜结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血-再灌注损伤，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道疾病，硅沉着病，口疮，口疮性口炎，动脉硬化性病症，无精子发生(aspermiogenese)，自身免疫性溶血，伯克氏(Boeck)病，冷球蛋白血症，杜普伊特伦氏(Dupuytren)挛缩，晶体过敏性眼内炎(endophthalmiaphacoanaphylactica)，变应性小肠炎(enteritis allergica)，麻风节结性红斑，特发性面瘫，慢性疲乏综合征，风湿热(febris rheumatica)，哈-里二氏(Hamman-Rich)病，感觉神经性听觉丧失，阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuriaparoxysmatica)，性腺功能减退，局限性回肠炎(ileitis regionalis)，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯性(traverse)脊髓炎，原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmia symphatica)，肉芽肿性睾丸炎(orchitisgranulomatosa)，胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮症，奎尔万氏(Quervain)甲状腺炎，获得性脾萎缩，由于抗精虫抗体的不育症，非恶性胸腺瘤，白癜风，SCID和爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒相关疾病，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，寄生虫病诸如利什曼虫，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的疾患，白细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，变应性神经炎，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性粘液水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，周围神经病，自身免疫性多腺性综合征I型，成人期发作的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)，全秃，扩张型心肌病，获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosa acquisita，EBA)，血色素沉着，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎，上颌窦炎或蝶窦炎，嗜曙红细胞相关病症诸如嗜曙红细胞增多症、肺嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏(Loffler)综合征、慢性嗜曙红细胞性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿、或含有嗜曙红细胞的肉芽肿，过敏反应，血清阴性脊椎关节炎病，多内分泌自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝酵母病，布鲁顿氏(Bruton)综合征，婴儿期一过性低丙种球蛋白血症，威斯科特-奥尔德里齐(Wiskott-Aldrich)综合征，共济失调性毛细管扩张，与以下各项有关的自身免疫性病症：胶原病、风湿病、神经病学疾病、淋巴结炎、缺血再灌注紊乱、血压应答降低(reduction in blood pressureresponse)、血管功能障碍、毛细管扩张(antgiectasis)、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血和伴随血管化的疾病，变应性超敏感性病症，肾小球肾炎病，再灌注损伤，心肌或其它组织的再灌注损伤，具有急性炎性成分的皮肤病，急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症，眼和眶炎性病症，粒细胞输血相关综合征，细胞因子诱发的中毒，急性重度炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，肺硬变，糖尿病性视网膜病，糖尿病性大动脉病症，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎，和子宫内膜异位症。
在具体的实施方案中，将人源化2H7抗体及其功能性片段用于治疗类风湿性关节炎和幼年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)包括狼疮肾炎、韦格纳氏(Wegener)病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、ANCA相关血管炎、糖尿病、雷诺氏(Reynaud)综合征、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、视神经脊髓炎(NMO)和肾小球肾炎。
“处理”或“治疗”或“减轻”指治疗性处理，其中目标是若不能治愈则减缓(减轻)所针对的病理学疾患或病症或者预防疾患的复发。如果在依照本发明的方法接受治疗量的本发明人源化CD20结合抗体后，患者在特定疾病的一项或多项征候和症状中显示出可观察和/或可测量的降低或消失，那么受试者成功“治疗”了自身免疫病或CD20阳性B细胞恶性肿瘤。例如，对于癌症，显著的癌细胞数减少或癌细胞消失；肿瘤体积缩小；肿瘤转移受到抑制(即一定程度的减缓，优选停止)；肿瘤生长受到一定程度的抑制；消退期延长；和/或与特定癌症有关的一种或多种症状得到一定程度的减轻；发病率和死亡率降低；及生命质量提高。疾病的征候或症状的减轻还可以由患者感受到。治疗可实现完全响应，定义为癌症的所有征候消失，或者部分响应，其中肿瘤体积缩小，优选超过50％，更优选75％。若患者的病情得到稳定，也认为患者得到治疗。在优选的实施方案中，用本发明抗体进行的治疗有效导致癌症患者的癌症在治疗后4个月没有发展，优选治疗后6个月，更优选1年，甚至更优选2年或更多年。用于评估疾病的成功治疗和改善的这些参数易于通过本领域胜任的内科医师所熟悉的常规规程来测量。
“治疗有效量”指抗体和药物有效“治疗”受试者中的疾病或病症的量。就癌症而言，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上减缓，优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓和优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与癌症有关的症状。参见前述“治疗”的定义。就自身免疫病而言，治疗有效量的抗体或其它药物有效减轻疾病的征候和症状。
用于评估瘤的治疗功效或成果的参数将是在相应疾病方面胜任的内科医师所知道的。通常，胜任的内科医师将期待特定疾病的征候和症状的减轻。参数可包括到病情稳定、消退时间、疾病发展的中值时间。
以下参考文献记载了淋巴瘤和CLL、它们的诊断、治疗和用于测量治疗功效的标准医学规程：Canellos GP，Lister，TA，Sklar JL，The Lymphomas，W.B.Saunders Company，Philadelphia，1998；van Besien K and Cabanillas，F，Clinical Manifestations，Staging and Treatment of Non-Hodgkin′s Lymphoma，Chap.70，pp 1293-1338，in：Hematology，Basic Principles and Practice，第3版，Hoffman et al.(编)，Churchill Livingstone，Philadelphia，2000；及Rai，K andPatel，D，Chronic Lymphocytic Leukemia，Chap.72，pp 1350-1362，in：Hematology，Basic Principles and Practice，第3版，Hoffman et al.(编)，Churchill Livingstone，Philadelphia，2000。
用于评估自身免疫病或自身免疫相关疾病的治疗功效或成果的参数将是在相应疾病方面胜任的内科医师所知道的。通常，胜任的内科医师会期待特定疾病的征候和症状的减轻。举例如下。
在一个实施方案中，将人源化2H7抗体和具体的hu2H7.v511及其功能性片段用于治疗类风湿性关节炎。
RA是影响超过两百万美国人且阻碍受害者日常活动的虚弱性自身免疫病。当身体的自身免疫系统不当攻击关节组织并引起破坏健康组织的慢性炎症和关节内损伤时发生RA。症状包括关节发炎、肿胀、僵硬和疼痛。另外，由于RA是系统性疾病，它可能对其它组织诸如肺、眼和骨髓有影响。还不知道有治愈的。治疗包括多种类固醇和非类固醇抗炎药、免疫抑制剂、缓解病情的抗风湿药(DMARD)和生物制剂。然而，许多患者继续对治疗响应不足。
抗体可用作早期RA(即未用过甲氨蝶呤(MTX))患者中的一线疗法，作为单一疗法或者联合例如MTX或环磷酰胺。或者，抗体可作为二线疗法用于治疗DMARD和/或MTX耐受性患者，作为单一疗法或者联合例如MTX。人源化CD20结合抗体可用于预防和控制关节损伤，延迟结构损伤，减轻与RA中的炎症有关的疼痛，且通常减轻中度至重度RA中的征候和症状。RA患者可在用治疗RA所用的其它药物(参见下文的联合疗法)治疗之前、之后或者与它们一起用人源化CD20抗体治疗。在一个实施方案中，用本发明的人源化CD20结合抗体治疗先前减缓解病情的抗风湿药失败了和/或对单独的甲氨蝶呤响应不足的患者。在这种治疗的一个实施方案中，患者在17天治疗方案中接受单独的人源化CD20结合抗体(第1天和第15天静脉内输注1g)；CD20结合抗体+环磷酰胺(第3天和第17天静脉内输注750mg)；或者CD20结合抗体+甲氨蝶呤。
评估RA中的治疗功效的一种方法以美国风湿病学学会(AmericanCollege of Rheumatology，ACR)的标准为基础，它测量触痛和肿胀关节的改善百分比等。与无抗体处理(例如处理前的基线)或安慰剂处理相比，RA患者可评分为例如ACR 20(20％改善)。评估抗体治疗功效的其它方式包括X射线评分诸如用于对结构损伤诸如骨侵蚀和关节腔变窄评分的Sharp X射线评分。还可基于治疗期间或之后各时期的健康评估问卷(Health AssessmentQuestionnaire，HAQ)得分、AIMS得分、SF-36对患者评估失能的预防或改善。ACR 20标准可包括触痛(疼痛)关节数和肿胀关节数二者的20％改善+如下5项额外测量中至少3项的20％改善：
1.依据直观类比标度的患者疼痛评价(VAS)，
2.疾病活性的患者整体评价(VAS)，
3.疾病活性的医师整体评价(VAS)，
4.由健康评估问卷测量的患者自我评价失能，和
5.急性期反应物，CRP或ESR。
ACR 50和70定义类似。优选的是，对患者施用一定量的本发明CD20结合抗体，其足以实现至少ACR 20的得分，优选至少ACR 30，更优选至少ACR 50，甚至更优选至少ACR 70，最优选至少ACR 75和更高。
银屑病关节炎具有唯一的和独特的放射线照相特征。对于银屑病关节炎，也可通过Sharp得分来评估关节侵蚀和关节空间变窄。本发明的人源化CD20结合抗体可用于预防关节损伤以及减轻病症的疾病征候和症状。
本发明的另一个方面是通过对患有SLE或狼疮肾炎的患者施用治疗有效量的本发明人源化CD20结合抗体来治疗病症的方法。SLEDAI得分提供了疾病活性的数值量化。SLEDAI是已知与疾病活性有关的24项临床和实验室参数的加权指数，数值范围0-103。参见Bryan Gescuk & John Davis，“Noveltherapeutic agent for systemic lupus erythematosus”，in：Current Opinion inRheumatology 2002，14：515-521。认为针对双链DNA的抗体引起肾发红(renalflares)和狼疮的其它表现。可对接受抗体治疗的患者监测到达肾发红的时间(time to renal flare)，这定义为血清肌酸酐、尿液蛋白质或尿液中血的显著的、可重现的升高。或者/另外，可对患者监测抗核抗体和针对双链DNA的抗体的水平。SLE的治疗包括高剂量的皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)。
脊椎关节病是一组关节病症，包括强直性脊柱炎、银屑病关节炎和克罗恩氏(Crohn)病。治疗成果可通过经过验证的患者和医师整体评估测量工具来测定。
银屑病的治疗功效通过监测疾病的临床体征和症状较之基线状况的变化来评估，包括医师整体评价(PGA)变化和银屑病面积和严重性指数(PASI)得分、银屑病症状评价(PSA)。可在整个治疗期间在用于指示特定时间点经受的发痒程度的直观类比标度上定期测量用本发明的人源化CD20结合抗体诸如hu2H7.v511治疗的银屑病患者。
患者可能在他们首次输注治疗用抗体时经受输注反应或输注相关症状。这些症状的严重程度有所不同且通常可通过医学干预逆转。这些症状包括但不局限于流感样发热、寒战/僵直、恶心、荨麻疹、头痛、支气管痉挛、血管性水肿。对于本发明的疾病治疗方法而言期望输注反应降至最低。为了减轻或最小化此类不利事件，患者可接受初始适应或耐受剂量的抗体，随后才是治疗有效剂量。适应剂量(conditioning dose)将低于治疗有效剂量以使患者适应而耐受更高剂量。
剂量给药
根据待治疗的适应症和本领域熟练内科医师所熟悉的与剂量给药有关的因素，将以有效治疗该适应症同时毒性和副作用降至最低的剂量施用本发明的抗体。理想的剂量可能取决于疾病和疾病的严重程度、疾病的阶段、期望的B细胞调控水平，及本领域熟练内科医师所熟悉的其它因素。
对于自身免疫病的治疗，可能希望根据疾病和/或个体患者中疾患的严重程度通过调整人源化2H7抗体的剂量来调控B细胞消减的程度。B细胞消减可以而非必须是完全的。或者，在最初的治疗中可能期望全部B细胞消减，但在后续治疗中可调整剂量以达到只有部分消减。在一个实施方案中，B细胞消减是至少20％，即与治疗前的基线水平相比保留80％或更少的CD20阳性B细胞。在其它实施方案中，B细胞消减是25％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。优选的是，B细胞消减足以阻止疾病的发展，更优选减轻处于治疗中的具体疾病的体征和症状，甚至更优选治愈疾病。
Genentech和Biogen Idec的临床调查评估了使用多剂范围从低达10mg至高达1g一剂的抗CD20(hu2H7.v16和Rituximab)治疗自身免疫病的治疗效力(见关于Rituximab研究的背景部分；及WO 04/056312，实施例16)。一般而言，在这些临床调查中施用两剂抗体，间隔约两周。临床调查中所研究的治疗方案的例子包括：人源化CD20抗体2H7.v16用于类风湿性关节炎时为2×10mg(即2剂，每剂10mg；对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量～10.1mg/m2)、2×50mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量55mg/m2)、2×200mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量220mg/m2)、2×500mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量～550mg/m2)、和2×1000mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量～1100mg/m2)；而Rituxan为2×500mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量～550mg/m2)、2×1000mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量～1100mg/m2)。在每个这些剂量，在施用第一剂抗体后观察到实质性的循环中B淋巴细胞消减。
在自身免疫病患者中治疗自身免疫病和消减B细胞的本发明方法中，在一个实施方案中，以范围为0.1mg至1000mg的1剂平剂量施用人源化2H7.v511抗体。我们发现在低于300mg，甚至10mg的平剂量实现了实质性B细胞消减。如此，在本发明的B细胞消减和治疗方法中，在不同的实施方案中，以0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200或250mg的剂量施用hu2H7.v511抗体。如果目标是部分或短期B细胞消减，那么可以使用较低剂量，例如20mg、10mg或更低。
对于CD20阳性癌症的治疗，可能希望将作为本发明抗CD20抗体靶物的B细胞的消减最大化。如此，对于CD20阳性B细胞肿瘤的治疗，希望B细胞消减至少足以阻止疾病的发展，这可以由本领域熟练内科医师来评估，例如通过监测肿瘤生长(大小)、癌性细胞类型的增殖、转移、具体癌症的其它体征和症状。优选的是，B细胞消减足以在至少2个月的时间里阻止疾病的发展，更优选3个月，甚至更优选4个月，更优选5个月，甚至更优选6个月或更多个月。在甚至更优选的实施方案中，B细胞消减足以将消退时间延长至少6个月，更优选9个月，更优选1年，更优选2年，更优选3年，甚至更优选5年或更多年。在一个最优选的实施方案中，B细胞消减足以治愈疾病。在优选的实施方案中，癌症患者中的B细胞消减是治疗前基线水平的至少约75％且更优选80％、85％、90％、95％、99％和甚至100％。
hu2H7抗体包括v16和v511用于治疗NHL的临床试验的剂量用药方案和剂量的例子记载于下文实验性实施例18-20。
以mg/剂计的剂量50、75、100、125、150、200、250、300、350mg/剂也可用于B细胞恶性肿瘤诸如NHL的维持疗法。
给药频率可随若干因素变化。将对患者施用至少2剂人源化2H7 CD20结合抗体，在不同的实施方案中可接受2-4剂、2-8剂、2-10剂。通常，在一个月内施用2剂，一般间隔1、2或3周。根据疾病改善的水平或复发，可在整个患病期间施用更多剂或者作为疾病的维持疗法。
一种或多种现行疗法无效、耐受不良或禁忌的自身免疫病或B细胞恶性肿瘤患者可以用任何本发明剂量给药方案来治疗。例如，本发明设想了将本发明的治疗方法用于对肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂疗法或对减轻疾病的抗风湿药(DMARD)疗法响应不足的RA患者。
在另一个实施方案中，低剂量200mg/剂或更低剂量的治疗可用于维持疗法。
在一个实施方案中，在治疗类风湿性关节炎(RA)时使用此剂量和剂量给药方案。
“长期”施用指与短期模式相反，以连续模式施用药剂，从而将初始治疗效果(活性)维持较长一段时间。“间歇”施用指不是无间断连续进行的治疗，而是本质上周期性的。
施用路径
人源化2H7抗体依照已知方法施用于人类患者，诸如通过静脉内施用，例如推注或通过连续灌注一段时间，通过皮下、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内或吸入路径，通常通过静脉内或皮下施用。
在一个实施方案中，人源化2H7抗体以0.9％氯化钠溶液作为输注媒介通过静脉内输注来施用。
在另一个实施方案中，人源化2H7抗体通过皮下注射来施用。
联合疗法
在治疗上述B细胞肿瘤时，患者可以用本发明的人源化2H7抗体与一种或多种治疗剂诸如化疗剂联合的多药物方案来治疗。人源化2H7抗体可以与化疗剂同时、序贯或交替施用，或者在其它疗法无响应后施用。用于淋巴瘤治疗的标准化疗可包括环磷酰胺、阿糖胞苷、美法仑(melphalan)、和米托蒽醌(mitoxantrone)+美法仑。CHOP是用于治疗非何杰金氏淋巴瘤的最常用化疗方案之一。以下是用于CHOP方案的药物：环磷酰胺(商标cytoxan，neosar)；阿霉素(多柔比星/羟基多柔比星)；长春新碱(Oncovin)；和泼尼松龙(有时称为Deltasone或Orasone)。在具体的实施方案中，CD20结合抗体与一种或多种以下化疗剂联合施用于有所需要的患者：多柔比星、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松龙。在一个具体的实施方案中，用本发明的人源化2H7抗体与CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙)疗法联合来治疗淋巴瘤(诸如非何杰金氏淋巴瘤)患者。在另一个实施方案中，癌症患者可以用本发明的人源化2H7 CD20结合抗体联合CVP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松龙)化疗来治疗。在一个具体的实施方案中，用人源化2H7.v511联合CVP来治疗CD20阳性NHL患者。在治疗CLL的一个具体实施方案中，hu2H7.v511抗体与利用氟达拉滨(fludarabine)和环磷酰胺(cytoxan)之一或二者的化疗联合施用。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；TLK 286(TELCYTATM)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))和蒽环类抗生素(anthracyclines)诸如annamycin、AD 32、alcarubicin、柔红霉素(daunorubicin)、右雷佐生(dexrazoxane)、DX-52-1、表柔比星(epirubicin)、GPX-100、伊达比星(idarubicin)、KRN5500、美诺立尔(menogaril)、dynemicin包括dynemicin A、埃斯波霉素(esperamicin)、新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、多柔比星脂质体和脱氧多柔比星)、依索比星(esorubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinicacid)(leucovorin)；醋葡醛内酯(aceglatone)；抗叶酸抗瘤剂，诸如ALIMTA、LY231514培美曲塞(pemetrexed)、二氢叶酸还原酶抑制剂诸如甲氨喋呤(methotrexate)、抗代谢物类，诸如5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)及其前药诸如UFT、S-1和卡培他滨(capecitabine)，及胸苷酸合酶抑制剂和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶抑制剂诸如雷替曲塞(raltitrexed)(TOMUDExTM，TDX)；二氢嘧啶脱氢酶抑制剂诸如恩尿嘧啶(eniluracil)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirambicin)；洛索蒽醌(Iosoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(ELDISINE，FILDESIN)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)和紫杉烷类(taxanes)，例如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristo1-MyersSquibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE多西他塞(docetaxel)(Rhne-PoulencRorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；铂(platinum)；铂类似物或基于铂的类似物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)(VELBAN)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)(ONCOVIN)；长春花生物碱类(vinca alkaloid)；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoid)，诸如视黄酸(retinoic acid)；任何上述物质的药剂学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
该定义还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏氯唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制涉及粘附细胞增殖的信号途经中的基因表达的，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXrmRH；及任何上述物质的药剂学可接受盐、酸或衍生物。
在治疗上文所述自身免疫病或自身免疫相关疾患时，患者可以用一种或多种hu2H7抗体诸如hu2H7.v511联合第二种治疗剂诸如免疫抑制剂，诸如以多药物方案进行治疗。hu2H7抗体可以与免疫抑制剂同时、序贯或交替施用，或者在其它疗法无响应后施用。免疫抑制剂可以以与本领域所列相同或较低的剂量施用。优选的辅助免疫抑制剂取决于许多因素，包括所治疗病症的类型以及患者的病史。
“免疫抑制剂”在本文中用于辅助疗法时指作用为抑制或掩盖患者的免疫系统的物质。此类药剂将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括类固醇，诸如糖皮质类固醇，例如泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利No.4,665,077)；硫唑嘌呤(azathioprine)(或环磷酰胺(cyclophosphamide)，如果对硫唑嘌呤有不良反应的话)；溴隐亭(bromocryptine)；戊二醛(它掩盖MHC抗原，如美国专利No.4,120,649中记载的)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体；抗肿瘤坏死因子-α抗体；抗肿瘤坏死因子-β抗体；抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛(pan)T抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(WO 90/08187，公布于90年7月26日)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(美国专利No.5,114,721)；T细胞受体片段(Offner et al.，Science 251：430-432(1991)；WO 90/11294；WO 91/01133)；及T细胞受体抗体(EP 340,109)，诸如T10B9。
对于类风湿性关节炎的治疗，患者可以用hu2H7抗体联合一种或多种以下药物进行治疗：DMARD(减轻疾病的抗风湿药)(例如甲氨喋呤)、NSAI或NSAID(非类固醇抗炎药)、HUMIRATM(阿达木单抗，adalimumab；AbbottLaboratories)、ARAVA(来氟米特，leflunomide)、REMICADE(英夫利昔单抗，infliximab；Centocor Inc.，Malvern，Pa)、ENBREL(依那西普，etanercept；Immunex，WA)、COX-2抑制剂。通常用于RA的DMARD是羟氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、甲氨喋呤(methotrexate)、来氟米特(leflunomide)、依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)、硫唑嘌呤(azathioprine)、D-青霉胺、金(Gold)(口服)、金(Gold)(肌肉内)、米诺环素(minocycline)、环孢霉素(cyclosporine)、葡萄球菌蛋白A免疫吸附。阿达木单抗(Adalimumab)是结合TNFα的人单克隆抗体。英夫利昔单抗(Infliximab)是结合TNFα的嵌合单克隆抗体。依那西普(Etanercept)是“免疫粘附素”融合蛋白，由人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分与人IgG1的Fc部分相连而组成。对于RA的常规治疗，参见例如“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis”，Arthritis &Rheumatism 46(2)：328-346(February，2002)。在一个具体的实施方案中，用本发明的hu2H7 CD20抗体联合甲氨喋呤(MTX)来治疗RA患者。MTX的例示剂量是大约7.5-25mg/kg/周。MTX可通过口服和皮下施用。
对于强直性脊柱炎、银屑病关节炎和克罗恩氏病的治疗，可以用本发明的CD20结合抗体联合例如Remicade(英夫利昔单抗infliximab；CentocorInc.，Malvern，Pa)、ENBREL(依那西普etanercept；Immunex，WA)来治疗患者。
SLE的治疗包括高剂量皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)。
对于银屑病的治疗，患者可施用CD20结合抗体联合局部治疗，诸如局部类固醇、蒽啉(anthralin)、卡泊三烯(calcipotriene)、氯倍他索(clobetasol)和他扎罗汀(tazarotene)，或者联合甲氨喋呤、类视黄酸、环孢霉素、PUVA和UVB疗法。在一个实施方案中，序贯或同时用CD20结合抗体和环孢霉素治疗银屑病患者。
为了将毒性降至最低，可以以轮回的、序贯的、联合的或间歇的治疗方案施行传统的系统性疗法，或者是hu2H7 CD20结合抗体组合物采用当前剂量的较低剂量联合方案。
药用配制剂
依照本发明使用的hu2H7 CD20结合抗体的治疗用配制剂通过将具有期望纯度的抗体与任选的药剂学学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合，以冻干配制剂或水溶液的形式制备。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
例示性的hu2H7抗体配制剂记载于WO 98/56418中，在此明确收入作为参考。另一种配制剂是液态多剂配制剂，包含40mg/mL hu2H7抗体，25mM乙酸盐，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％聚山梨醇酯20 pH5.0，最小保存期是在2-8℃保存两年。另一种感兴趣的抗CD20抗体配制剂在9.0mg/mL氯化钠，7.35mg/mL二水合柠檬酸钠，0.7mg/mL聚山梨醇酯80，和注射用无菌水pH6.5中包含10mg/mL抗体。还有一种含水药用配制剂包含10-30mM乙酸钠，大约pH4.8至大约pH5.5优选pH5.5，作为表面活性剂的大约0.01-0.1％v/v量的聚山梨醇酯，大约2-10％w/v量的海藻糖，和作为防腐剂的苯甲醇(U.S.6,171,586)。适于皮下施用的冻干配制剂记载于WO 97/04801。此类冻干配制剂可用合适的溶剂重建至高蛋白质浓度，重建的配制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。
人源化2H7.v511变体的一种配制剂是10mM组氨酸，6％蔗糖，0.02％聚山犁醇酯20，pH5.8中的12-14mg/ml抗体。在一个具体的实施方案中，2H7变体，特别是2H7.v511配制成10mM硫酸组氨酸，60mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山犁醇酯20，和注射用无菌水pH5.8中的20mg/ml抗体。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，可能希望进一步提供细胞毒剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的免疫抑制剂，诸如环孢霉素或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的抗体)。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量、疾病或病症或治疗的类型、及上文讨论的其它因素。这些通常是以与本文所述相同的剂量，以本文所述施用路径而使用的，或是迄今所采用的剂量的大约1-99％。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。
制品和试剂盒
本发明的另一个实施方案是包含可用于治疗自身免疫病和相关疾患和CD20阳性癌症诸如非何杰金氏淋巴瘤的物质的制品。所述制品包括容器及容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有有效治疗所述疾患的组合物，可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或带有皮下注射针可刺穿的塞子的药瓶)。所述组合物中的至少一种活性药剂是hu2H7抗体，例如本发明的hu2H7.v511。所述标签或包装插页指明该组合物用于治疗所述具体疾患。所述标签或包装插页进一步包含关于对患者施用所述抗体组合物的说明书。
包装插页指通常包括在治疗用产品商品化包装中的说明书，它包含有关此类治疗用产品使用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌和/或警告信息。在一个实施方案中，包装插页指明该组合物用于治疗非何杰金氏淋巴瘤。
另外，所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药剂学可接受缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。
还提供了可用于各种目的的试剂盒，例如用于B细胞杀伤测定法，用作凋亡测定法的阳性对照，用于从细胞中纯化或免疫沉淀CD20。为了分离和纯化CD20，所述试剂盒可包含与珠子(例如sepharose珠子)偶联的hu2H7.v511抗体。可提供包含用于CD20体外检测和定量的抗体，例如在ELISA或Western印迹中进行的。与制品一样，所述试剂盒包括容器及容器上或与容器相关的标签或包装插页。所述容器装有包含至少一种本发明抗CD20抗体的组合物。可包括装有例如稀释剂和缓冲液、对照抗体的别的容器。所述标签或包装插页可提供该组合物的描述以及意图体外或诊断使用的说明书。
实验性实施例
实施例1：现有细胞系向岩藻糖化较少的细胞系的转变
为了在CHO细胞中实现高产量的非岩藻糖化抗体，采用RNAi方法来敲低FUT8基因的表达。使用来自Ambion公司(Austin，TX)的pSilencer3.1-H1-Puro质粒来产生短发夹siRNA，其组成为对FUT8基因特异性的19nt(核苷酸)有义siRNA序列与其反向互补反义siRNA序列通过一个短间隔区(9nt发夹环)连接，随后是3’端的5-6个U(图3)。用于设计靶向CHO FUT8基因的siRNA探针的方法参阅Elbashir et al.，2002。基于可获得的CHO FUT8DNA序列设计了五种不同的siRNA探针(探针#1-5)来靶向不同区域(图4)。探针1(SEQ ID NO.3和NO.4)；探针2(SEQ ID NO.5和NO.6)；探针3(SEQ IDNO.7和NO.37)；探针4(SEQ ID NO.38和NO.39)；探针5(SEQ ID NO.40和NO.41)。由19nt有义序列通过间隔区与反义序列相连和5-6个U组成的siRNA编码序列是探针#2(SEQ ID 5中的第7-59位)中的SEQ ID NO.42和探针#4中的SEQ ID NO.43。探针1-5对应于图5B中的RNAi 1-5。所述5种siRNA探针是通过将退火的合成寡核苷酸独立克隆入pSilencer 3.1-H1-Puro质粒而构建的。
为了测试这些RNAi探针的功效，使用来自Genbank的CHO FUT8部分DNA序列(编号P_AAC63891)构建FLAG标记的FUT8融合蛋白。使用自CHO细胞纯化的总RNA和FUT8引物通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆FUT8编码序列的3’端0.98kb片段并将所得PCR片段与5’端FLAG标签序列融合。将8个氨基酸的Flag标签(metAspTyrLysAspAspAspAspLys-SEQ ID NO._)加至分离的部分cDNA序列的5’端。将带标记的FUT8片段克隆入表达载体。将RNAi探针质粒和flag标记的FUT8质粒共转染入CHO细胞。转染后24小时提取细胞裂解产物并使用抗flag M2抗体(Sigma，MO)通过免疫印迹分析FUT8融合蛋白水平。在存在RNAi探针时，5个案例中有4个的融合蛋白表达受到显著抑制(图5)。
通过将每种siRNA表达质粒与Flag标记的FUT8质粒瞬时共转染入CHO细胞来测试这些探针切割FUT8转录产物的能力。转染后24小时裂解细胞并用抗Flag M2抗体(Sigma，MO)通过Western印迹分析细胞裂解产物。
正如预期的，RNAi1(探针1)转染细胞显示出Flag标记的FUT8产物的强表达，因为Flag标记的FUT8融合蛋白不包含此探针所靶向的序列(图5A、5B)。相反，siRNA探针2(RNAi2)至5均对Flag标记的FUT8融合蛋白表达具有不同程度的抑制效果(图5B)。探针#2和#4显示出最好的抑制效果并被选择用于进一步的评估。
实施例2：通过瞬时siRNA表达操纵稳定表达的抗体的岩藻糖含量
将RNAi2和RNAi4质粒瞬时转染入先前建立的表达人源化抗CD20抗体2H7.v16的稳定CHO细胞系(克隆#60)。然后将转染细胞分开接种入250ml旋转瓶中的无血清培养基用于产生抗体。
用蛋白A柱纯化收获的细胞培养液中表达和分泌的2H7.v16抗体并如Papac et al.，1998中所述通过基质辅助激光解吸/离子化-飞行时间质谱分析(MALDI-TOF)分析N-连接寡糖的岩藻糖含量。还在FcγR结合测定法(下文有记载)中测定抗体。有三类人Fcγ受体：FcγRI，FcγRII和FcγRIII。其中一些具有功能性等位基因多态性，产生具有不同受体特性的同种异型(Dijstelbloem et al.，1999；Lehrnbecher et al.，1999)。FcγRIII(F158)在第158位具有苯丙氨酸并且具有比第158位具有缬氨酸的FcγRIII(V158)低的对人IgG Fc区的结合亲和力(Shields et al.，2001和2002)。
RNAi瞬时转染细胞产生了大约35-37％的非岩藻糖化2H7抗体，如图6所示。与具有大约2-4％的非岩藻糖化抗体(即常规CHO细胞所产生的抗体的典型水平)的2H7对照细胞系(用无关RNAi质粒转染)相比，具有35％至37％非岩藻糖化的2H7抗体集合分别显示出对FcγRIII(F158等位基因)和FcγRIII(V158等位基因)的结合亲和力提高了6倍和4倍(图7D、7E)。未看到对其它Fc受体的影响(例如FcγRI和FcγRII-参阅图7A、7B、7C)。从RNAi质粒转染的和模拟物转染的细胞二者产生的抗体分离的聚糖在比较无半乳糖(G0)、一个半乳糖(G1)和两个半乳糖(G2)时具有相似的半乳糖含量分布。这些数据显示从稳定生产细胞系分泌的抗体的岩藻糖含量可通过瞬时RNAi质粒转染而降低而且所述效果不改变其它主要的聚糖组成，包括G0、G1和G2分布。
为了证实RNAi转染细胞确实具有较少的FUT8 RNA表达，用转染后24小时自转染细胞提取的RNA样品进行Northern印迹。对来自含有对照质粒(随机小鼠DNA序列，与任何已知小鼠蛋白质没有同源性)和2个RNAi质粒的细胞的总RNA进行纯化并与300bp的探针进行杂交。如图8所示，两种RNAi质粒转染细胞中的mRNA水平敲低了(泳道2和3)。这与在两种RNAi质粒转染细胞中检测到较低FUT8蛋白量的免疫印迹相符。CHO FUT8 mRNA的大小与大鼠细胞中的相似，大约是3.5kb。内源α1，6-岩藻糖基转移酶RNA的敲低通过定量PCR得到进一步的证实(数据未显示)。
由于RNAi2和RNAi4两种构建体都可有效敲低内源FUT8基因RNA水平，只选择RNAi4质粒用于进一步的稳定转染。用RNAi4构建体稳定转染处于600nM甲氨蝶呤(MTX)抗性且在生物反应器中产量超过1.5g/L的抗体细胞系克隆60，所述构建体中嘌呤霉素基因从pSilencer质粒中消除并以在SV40启动子控制下的潮霉素替换，用500μg/ml潮霉素进行选择。将阳性克隆挑取入96孔组织培养板并通过Taqman筛选内源FUT8 mRNA水平。将显示不同水平FUT8 mRNA降低的4个克隆扩大规模，在250ml旋转瓶中生产抗体。对HCCF中的抗体进行蛋白A纯化并进行岩藻糖含量测定和FcγRIII结合测定。图7A-E的结果显示在所测试的Fcγ受体中只有FcγRIII结合受到含岩藻糖较少的抗体的影响。因此，对来自稳定转染的抗体产物只进行FcγRIII结合测定。
岩藻糖含量分析显示所述4个系产生的非岩藻糖化抗体在45-70％或80％范围内。对包含5种不同水平岩藻糖化的抗体测定它们与FcγRIII的结合。FcγRIII结合测定显示与低亲和力FcγRIII(F158)的改进较之FcγRIII(V158)有增加，如表1所示。当以升高倍数对各抗体样品中非岩藻糖化物质百分比的平方作图时，对两种FcγRIII变体都观察到了线性关系。完整的人IgG1包含两条重链，每条在Fc区CH2结构域中Asn297处具有一个N-糖基化位点。因此，对于Fc而言在核心碳水化合物结构的岩藻糖占有率方面存在3种可能性。一条重链是岩藻糖化的而一条不是；两条重链都是岩藻糖化的；或者两条重链都未岩藻糖化。对FcγRIII的亲和力的升高倍数与非岩藻糖化聚糖百分比的平方之间的线性关系指示假如这样的话两条重链都未岩藻糖化的抗体分子可能对升高的FcγRIII结合亲和力的提高起主要作用。
在用两种稳定转染克隆在生物反应器中进一步扩大规模的抗体生产中，岩藻糖含量的分析显示了岩藻糖化水平在79天的研究期间维持稳定，大约80％的非岩藻糖化。在生物反应器运转结束时抗体滴度以及抗体聚糖上的％G0、G1和G2也在预期范围内。因此，将RNAi质粒转染入已建立的蛋白质生产细胞系(在此案例中是抗体生产细胞系)是可用于产生这样的宿主细胞的一条途径，该宿主细胞产生有商业价值数量的、具有受控量的非岩藻糖化碳水化合物的治疗用抗体。
表1：FcγRIII与不同岩藻糖含量的抗体的结合亲和力
克隆非岩藻糖化(％)FcγRIII(V158)结合(倍)FcγRIII(F158)结合(倍)
对照 3 1 1
5B 45 7.5 24.2
6C 60 10.1 34.0
5F 70 13.7 52.4
7C 63 10.4 32.4
亲本 5 1 1
实施例3
在此实施例中，我们构建了一种新型RNAi质粒，它包含两个RNAi转录单元，靶向FUT8基因的两个不同区域。此质粒比先前只靶向基因一个区域的质粒类型更有效。
实施例4：具有岩藻糖含量的同步代谢工程(岩藻糖化水平的敲低)的新的稳定细胞系的产生
材料和方法
细胞培养和转染
将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞于37℃在含5％FBS(胎牛血清)和1X GHT(甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷)的生长培养基中培养。对于瞬时转染，使用DMRIE-C转染试剂(Invitrogen)。对于稳定转染，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)。
选择
转染后，将细胞离心以收集沉淀物。然后将沉淀物重悬于含25nM甲氨蝶呤(MTX)的培养基。每3-4天更换培养基。转染后大约2周，挑取单独的克隆并在96孔板中培养。通常需要大约1周使细胞在96孔板中生长至汇合。
相等接种密度测定法
将5×104个细胞/孔接种入96孔板。次日，除去生长培养基并以生产培养基替换。加入生产培养基后的那天，将板于33℃温育5-6天，然后可进行ELISA测定。
ELISA测定法
当细胞汇合时，除去生长培养基并将生产培养基加入每个孔。加入生产培养基后的那天，将板于33℃温育5-6天，然后可进行ELISA测定。通常用连续稀释液进行ELISA。
RNA分析
用Qiagen的RNA纯化试剂盒纯化总RNA并用基因特异性引物和探针通过Taqman定量。
Fcγ受体结合测定法-ELISA
将MaxiSorp 96孔微孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)用在50mM碳酸盐缓冲液pH9.6中配制的2μg/ml抗GST(clone 8E2.1.1，Genentech)以100μl/孔于4℃包被过夜。将板用含0.05％聚山梨醇酯的PBS pH7.4(清洗缓冲液)清洗并用含0.5％BSA的PBS pH7.4以150μl/孔封闭。于室温温育1小时后，将板用清洗缓冲液清洗。将在含0.5％BSA、0.05％聚山梨醇酯20的PBS pH7.4(测定缓冲液)中配制的人FcγRIII以0.25μg/ml、100μl/孔加到板中。将板温育1小时然后用清洗缓冲液清洗。将抗体与山羊F(ab’)2抗κ(Cappel，ICNPharmaceuticals，Inc.，Aurora，Ohio)以1∶2(w/w)的比率一起温育1小时以形成抗体复合物。将复合的IgG抗体(0.85-50000ng/ml，以三倍连续稀释)在测定缓冲液中配制的11个两倍连续稀释液加到板中。温育2小时后，将板用清洗缓冲液清洗。通过以100μl/孔加入在测定缓冲液中配制的过氧化物酶标记的山羊F(ab’)2抗人IgG F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，检测所结合的IgG。温育1小时后，将板用清洗缓冲液清洗并以100μl/孔加入底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)(Kirkegaard & Perry Laboratories)。通过以100μl/孔加入1M磷酸，终止反应。在multiskan Ascent reader(ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)上读取450nm的吸光度。计算标准曲线中点处的吸光度(mid-OD)。用四参数非线性回归曲线拟合程序(KaleidaGraph，Synergysoftware，Reading，PA)从滴定曲线确定标准品和样品在此mid-OD的对应浓度。通过将标准品的mid-OD浓度除以样品的，计算相对活性。
抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)测定法
一种ADCC测定法格式如下。基本上如(Shields et al.，J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001))所述用乳酸脱氢酶(LDH)读数测定2H7 IgG变体介导天然杀伤(NK)细胞裂解WIL2-S细胞(一种表达CD20的成淋巴细胞样B细胞系)的能力。从用100mL PBS(磷酸盐缓冲盐水)稀释的100mL肝素化血液制备NK细胞，所述血液获自针对FcγRIII(又称为CD16)鉴定了同种型的正常人供体(Koene et al.，Blood 90：1109-1114(1997))。NK细胞可来自CD16为杂合的(F158/V158)或者V158或F158为纯合的人类供体。将稀释后的血液层覆在15mL淋巴细胞分离介质(ICN Biochemical，Aurora，Ohio)上并以2000RPM离心20分钟。将层与层间界面处的白细胞分装入4个干净的50mL管，管内装满含15％胎牛血清的RPMI培养基。将管以1400RPM离心5分钟，弃去上清液。将沉淀物重悬于MACS缓冲液(0.5％BSA，2mM EDTA)，并用珠子(NK细胞分离试剂盒，130-046-502)依照制造商的方案(Miltenyi Biotech)纯化NK细胞。将NK细胞用MACS缓冲液稀释至2×106个/mL。
将抗体在测定介质(F12/DMEM 50：50，无甘氨酸的，1mM HEPES缓冲液pH7.2，青霉素/链霉素(100单位/mL；Gibco)，谷氨酰胺，和1％热灭活胎牛血清)中的连续稀释液(0.05mL)加至96孔圆底组织培养板。将WIL2-S细胞在测定缓冲液中稀释至浓度为4×105个/mL。将WIL2-S细胞(每孔0.05mL)在96孔板中与稀释的抗体混合并于室温温育30分钟，使抗体与CD20结合(调理作用)。
通过向每个孔中加入0.1mL NK细胞，起动ADCC反应。在对照孔中，加入2％Triton X-100。然后将板于37℃温育4小时。用细胞毒性(LDH)检测试剂盒(Kit#1644793，Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana)遵循制造商的说明书测量LDH释放水平。将0.1mL LDH显色剂加至每个孔，随后混合10秒。然后将板用铝箔覆盖并于室温在黑暗中温育15分钟。然后读取490nm处的光密度并通过除以在对照孔中测量到的总LDH用于计算裂解百分率。将裂解百分率作为抗体浓度的函数作图，并用4参数曲线拟合(KaleidaGraph)来确定EC50浓度。
天冬酰胺连接的寡糖的基质辅助激光解吸/离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析
使用Papac et al.，Glycobiology 8：445-454(1998)中的规程从重组糖蛋白中释放出N-连接的寡糖。简而言之，通过对Millipore Multiscreen真空歧管施加真空使100μl甲醇流过PDVF膜而使96孔PVDF衬里的微量滴定板(Millipore，Bedford，MA)的孔条件化(condition)。用3×250μl水清洗条件化的PVDF膜。在所有清洗步骤之间通过对歧管施加温和真空使各孔完全排干。用还原和羧甲基化缓冲液(RCM)清洗膜，所述缓冲液含6M盐酸胍，360mM Tris，2mMEDTA，pH 8.6。将糖蛋白样品(50μg)施加至各孔，再次通过温和真空使其流过PVDF膜并用2×50μl RCM缓冲液清洗各孔。通过向每孔中加入50μl 0.1M二硫苏糖醇(DTT)溶液并将微量滴度板于37℃温育1小时，使已固定的样品还原。通过真空除去DTT并用4×250μl水清洗各孔。通过加入50μl在1M NaOH中新鲜配制并用RCM缓冲液稀释至0.1M的0.1M碘乙酸(IAA)溶液，使半胱氨酸残基羧甲基化。通过于环境温度在黑暗中温育30分钟完成羧甲基化。对板施加真空以除去IAA溶液并用4×250μl纯化水清洗各孔。通过加入100μl 1％PVP360(聚乙烯吡咯烷酮360,000MW)(Sigma)溶液并于环境稳定温育30分钟，封闭PVDF膜。通过温和真空除去PVP-360溶液并用4×250μl水清洗各孔。向每个孔中加入PNGase F(New England Biolabs，Beverly，MA)消化液，即25μl在10mM Tris乙酸盐，pH8.3中配制的25单位/ml溶液，并于37℃进行3小时消化。消化后，将样品转移至500μl Eppendorf管并向每份样品中加入2.5μl1.5M乙酸溶液。将酸化的样品于环境稳定温育2小时，使寡糖从糖基胺(glycosylamine)转变成羟基形式。在MALDI-TOF质谱分析前，用装入小型反应管(US Biochemical，Cleveland，OH)的0.7ml床体积的阳离子交换树脂(氢型AG50W-X8树脂)(Bio-Rad，Hercules，CA)浆使释放的寡糖脱盐。
对于主动模式(positive mode)中样品的MALDI-TOF质谱分析，将脱盐后的寡糖(0.5μl等分试样)施加至装有0.5μl 2，5-二羟基苯甲酸基质(sDHB)的不锈钢靶管中，所述基质是通过将2mg 2，5-二羟基苯甲酸与0.1mg 5-甲氧基水杨酸一起溶于1ml含1mM NaCl的25％乙醇水溶液中配制成的。将样品/基质混合物经真空干燥。将样品/基质混合物真空干燥，然后在分析之前使其吸收大气湿度。在PerSeptive BioSystems Voyager-ELITE质谱仪上通过MALDI-TOF分析释放的寡糖。以主动模式在20kV以线性构型并利用延时提取操作质谱仪。用大约1100的激光功率并以数据叠加模式(240次扫描)获取数据以提高信噪比。在给出质量之前用标准寡糖对仪器进行校准并用19点Savitsky-Golay算法使数据平坦。用Caesar 7.2数据分析软件包(SciBridge Software)完成质谱数据的整合(integration)。
结果和讨论
在先前的实施例中，使用RNAi技术敲低了2H7.v16细胞系中的α-1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)活性。所述RNAi靶向FUT8基因可读框(ORF)内的区域。由此细胞系所产生的岩藻糖化较少的抗体展示了比更高岩藻糖化抗体高的对FcγRIII受体的结合亲和力和更高的ADCC活性。图9A显示了用于开发岩藻糖化较少的2H7.v16细胞系的过程。上述过程是要求在RNAi质粒转染之前存在稳定的抗体生产细胞系的两步法。
为了缩短此过程所需要的时间，探索了一种新的一步法，其中siRNA单元包含在表达目的蛋白质(例如抗体)的表达质粒中，如图9B所示。首先，测试包含抗体表达盒和RNAi单元的表达质粒以了解抗体和RNAi是否可在瞬时转染中同时表达。瞬时转染的5套质粒的结构如图10所示。测定由那5套质粒表达的蛋白质的岩藻糖化水平。
在下文表2中，v511和v114指表3中所述的hu2H7抗体变体。如表2所示，来自不含RNAi单元的对照质粒的抗体具有9％的非岩藻糖化。由包含一种RNAi单元的质粒表达的抗体具有33％-49％范围的非岩藻糖化。由包含两种RNAi单元的质粒表达的抗体具有62％-65％范围的非岩藻糖化。这些结果显示，与在表达质粒上只添加一种RNAi单元所具有的33-49％相比，在表达质粒上添加两种RNAi转录单元导致所产生的抗体具有更高的62-65％的非岩藻糖化，表明了两种siRNAi转录产物的相加效应。此实施例中表达的抗体是人源化抗CD20抗体2H7.v511(在本文中又称为hu2H7.v511)，其序列提供于上文CD20结合抗体部分。
表2
质粒 非岩藻糖化百分率
rkHCv511+rkLCv114 9
rkHCv511RNAi4+rkLCv114RNAi4 49
rkHCv511RNAi2.4+rkLCv114RNAi2.4 62
CMV.PD.v511.RNAi4 33
CMV.PD.v511.RNAi2.4 65
用两种质粒CMV.PD.v511.RNAi4或CMV.PD.v511.RNAi2.4(图10C)之一稳定转染细胞并用25nM甲氨蝶呤(MTX)选择转染后的细胞。从每次转染中挑取72个克隆并针对抗体表达进行筛选。表达滴度如图11所示。来自CMV.PD.v511.RNAi2.4质粒转染的克隆看起来具有与其它两种转染相比大体上较低的滴度。
为了了解具有较好表达滴度的克隆是否也具有较低的岩藻糖化水平，通过Taqman对大约20％具有较高表达的克隆分析了FUT8 mRNA表达。如图12所示，来自CMV.PD.v511.RNAi2.4质粒转染的克隆一般具有与来自CMV.PD.v511.RNAi4质粒转染的克隆相比较低的FUT8 mRNA水平。
将具有最低FUT8 mRNA表达水平的6个克隆(两个来自CMV.PD.v511.RNAi4质粒转染，四个来自CMV.PD.v511.RNAi2.4质粒转染)使用相等接种密度测定法进一步评估抗体表达。结果表明这6个克隆的滴度与对照2H7 v511克隆(来自CMV.PD.v511质粒转染的克隆18和63)相当，如图13所示。然而，CMV.PD.v511.RNAi2.4克隆看起来具有比CMV.PD.v511.RNAi4克隆和对照克隆低的滴度。
如上所述通过MALDI-TOF质谱分析测定图14中所示2H7.v511克隆所产生的抗体的岩藻糖含量。发现一个克隆，RNAi2.4-3d，达到了94-95％的非岩藻糖化。
用含65％非岩藻糖化(来自瞬时转染)或含94-95％非岩藻糖化(来自最稳定的克隆RNAi2.4-3d)的抗体2H7.v511进行FcγRIII结合测定。结果如图15A和图15B所示。与具有大约5％非岩藻糖化的对照抗体集合相比，65％非岩藻糖化的物质显示出对高亲和力(V158等位基因，图15B)和低亲和力(F158等位基因，图15A)受体的亲和力分别有4.8和6.2倍的适度升高，而95％非岩藻糖化的物质显示出对两种受体同种型的亲和力有6.8和9.8倍的升高。
因为非岩藻糖化抗体似乎更好的与FcγRIII结合，所以对它们测试ADCC活性。将从2H7.v16克隆7F(60-70％范围的非岩藻糖化)和从2H7.v511瞬时转染(65％非岩藻糖化)收集的材料用于ADCC活性测定。如在图16A和16B中见到的，两种形式的岩藻糖化较少的2H7都展示出比它们的相应高岩藻糖化对等物高的ADCC活性。
在此我们描述了一种新的简化(streamline)方法，从代谢上改造CHO细胞以产生甚至更高的(可高达95％)非岩藻糖化抗体，即通过将抗体重链和轻链转录单元连同1-2个siRNA转录单元一起掺入同一质粒。此方法中所使用的两个siRNA转录产物靶向FUT8基因中的不同编码区并且受不同的Pol III型启动子H1和U6指导。
总之，我们已经证明了将RNAi技术加入人源化2H7细胞系的开发以敲低岩藻糖化水平是可行的。现有的抗体生产细胞系成功的转变成岩藻糖化较少的细胞系。此外，还成功的实现了在产生新的抗体生产细胞系的同时敲低岩藻糖化。
参考文献
本申请中所引用的参考文献，包括专利、已公布的申请和其它出版物，在此收入作为参考。
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