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1、(10)申请公布号 CN 102659903 A (43)申请公布日 2012.09.12 CN 102659903 A *CN102659903A* (21)申请号 201210143594.2 (22)申请日 2012.05.10 C07J 63/00(2006.01) (71)申请人 青川德康源药业有限公司 地址 628115 四川省绵阳市青川县竹园镇竹 园经济开发区 (72)发明人 索志荣 张翠鳌 马璇 杨占国 马家骅 杨兴旺 (74)专利代理机构 四川力久律师事务所 51221 代理人 曹晋玲 刘雪莲 (54) 发明名称 柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法 (57) 摘要 。
2、本发明涉及中药制备领域， 具体公开了一种 柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d 的提取纯化方法。柴胡 皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 包括步骤 ： （1） 柴胡总皂苷的提取 ；（2） 柴胡皂苷 a 或柴胡皂 苷 d 的提取纯化， 所述步骤 （2） 包括正相硅胶和反 相硅胶层析。进一步， 所述步骤 （1） 包括柴胡皂苷 提取、 大孔树脂分离及氧化铝纯化步骤。 本发明方 法获得的柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d 纯度高， 并适合 于工业化生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 。
3、说明书 8 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 其特征在于， 包括步骤 ： （1） 柴胡总皂苷的提取 ； （2） 柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化 ； 所述步骤 （2） 包括 ： D. 取步骤 （1） 制得的柴胡总皂苷， 加入 5 10 倍量 （mL/g） 溶剂 2， 得上样溶液 ； 取相 当于所述柴胡总皂苷1550倍量 （g/g） 正相硅胶， 干法装柱， 所述上样溶液加入柱顶， 用所 述溶剂 2 以每小时 1 3BV 速度洗脱， 收集洗脱液， 薄层检识， 分别合并含有柴胡皂苷 a 或 柴胡皂苷 d 的流分， 回收溶剂得柴胡皂苷 a 。
4、或柴胡皂苷 d 粗品 ； E. 分别取柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 粗品， 加 5 10 倍量 （mL/g） 溶剂 3， 得上样溶液 ； 取相当于所述柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 粗品 15 50 倍量 （g/g） 反相硅胶， 湿法装柱， 所述 上样溶液加入柱顶， 用所述溶剂 3 以每小时 0.15 1.5BV 洗脱， 收集洗脱液， 薄层检识， 分 别合并含有柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的流分， 分别得柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d ； 所述溶剂 2 选自水、 乙醇、 甲醇、 二氯甲烷、 氯仿或丙酮的任一种或它们的任意混合物 ； 所述溶剂 3 选自水、 甲醇、 异丙醇或乙腈的任一种或它们的任意。
5、混合物。 2.根据权利要求1所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法， 其特征在于， 所述 步骤 （1） 包括步骤 ： A. 取柴胡或者柴胡提取完挥发油后的药渣， 粉碎， 溶剂提取， 提取液浓缩回收溶剂， 得 总提取物 ； B.A 步骤制得的总提取物加水分散， 上大孔树脂吸附柱， 碱水洗脱除杂， 水洗脱至中性， 体积百分比浓度 20% 45% 乙醇 / 水溶液洗脱除杂， 体积百分比浓度 70% 90% 乙醇 / 水 溶液洗脱， 收集洗脱液， 浓缩回收溶剂， 得柴胡皂苷粗品 ； C. 取步骤 B 制得的柴胡皂苷粗品， 用 3 5 倍量 （mL/g） 溶剂 1 分散， 加入相当于所述 柴胡皂苷粗。
6、品 2 5 倍量 （g/g） 氧化铝， 拌干溶剂， 得拌样氧化铝 ； 或取步骤 B 制得的柴胡 皂苷粗品， 加入 5 20 倍量 （mL/g） 溶剂 1 溶解， 得柴胡皂苷上样溶液 ； 取相当于所述柴胡 皂苷粗品 8 20 倍量 （g/g） 氧化铝， 干法装柱 ； 将所述拌样氧化铝或所述柴胡皂苷上样溶 液加入柱顶， 所述溶剂 1 以每小时 5 10BV 速度洗脱， 收集洗脱液， 薄层检识， 合并含有柴 胡皂苷的流分， 浓缩回收溶剂， 得柴胡总皂苷 ； 所述溶剂 1 选自水、 乙醇、 甲醇、 二氯甲烷、 氯仿或丙酮的任一种或它们的任意混合物。 3.根据权利要求1所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取。
7、纯化方法， 其特征在于， 步骤 D 所述的正相硅胶柱的径高比为 1 5 1 15。 4.根据权利要求1所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法， 其特征在于， 步骤 E 所述的反相硅胶柱的径高比为 1 5 1 15。 5. 根据权利要求 2 所述的柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 其特征在于， 步 骤 B 所述大孔吸附树脂选自非极性、 弱极性、 中等极性大孔吸附树脂中的任一种 ； 所述碱水 溶液为碱性或弱碱性盐类成分的水溶液。 6.根据权利要求2所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法， 其特征在于， 步骤 A 所述溶剂选自任一醇类溶剂或水， 或它们的任意混合物。 7.根据权。
8、利要求2所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法， 其特征在于， 步骤 C 所述的氧化铝柱的径高比为 1 3 1 5。 权 利 要 求 书 CN 102659903 A 2 2/2 页 3 8.根据权利要求2所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法， 其特征在于， 步骤 C 所述的氧化铝选自碱性氧化铝或中性氧化铝。 9.根据权利要求3所述的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法， 其特征在于， 步骤 D 所述的正相硅胶柱的径高比为 1 15。 10. 根据权利要求 4 所述的柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 其特征在于， 步 骤 E 所述的反相硅胶柱的径高比为 1 15。 权 。
9、利 要 求 书 CN 102659903 A 3 1/8 页 4 柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法 技术领域 0001 本发明属于中药制备技术领域， 特别涉及一种柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯 化方法。 背景技术 0002 柴胡是大宗常用中药，神农本草经列为上品， 为伞形科植物柴胡 Bupleurum chinense DC或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd的干燥根， 味苦， 微寒， 归肝、 胆经， 是和解表里， 疏肝， 升阳之要药。柴胡主要有效成分为柴胡挥发油和柴胡皂苷。研究 表明， 柴胡皂苷中， 柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d 含量。
10、最高， 药理作用最显著， 具有明显的解热、 镇痛、 消炎、 保肝等作用。因此提取高纯度的柴胡皂苷 a 单体和柴胡皂苷 d 单体， 对柴胡制 剂和新药开发等具有重要意义。 0003 目前， 本领域尚没有一套系统的提取分离高纯度柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d 的制备 工艺。中国专利申请 CN 101333240A（公开日 2008 年 12 月 31 日） “一种提取分离高纯度 柴胡皂苷 A 的制备工艺” ， 公开了一种提取分离高纯度柴胡皂苷 a 的制备工艺。具体是， 取 柴胡药材， 粉碎后， 加热提取， 减压浓缩， 大孔吸附树脂分离柱分离， 收集洗脱液， 然后采用 高速逆流色谱分离浓缩液， 紫外检。
11、测收集柴胡皂苷a。 前述方法虽提供了一种柴胡皂苷a的 提取分离方法， 但提取得到的柴胡皂苷 a 纯度并不理想， 并且由于高速逆流色谱法上样量 非常小， 一次制备很难获得大量柴胡皂苷 a， 而且仪器价格昂贵， 生产成本高， 该方法很难得 到工业化推广。 0004 因此， 寻找一种能提取分离高纯度的柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d， 并能实现工业化生 产， 成本可控的工艺方法， 是本领域尚未解决的问题。 发明内容 0005 本发明的主要目的是， 针对上述现有技术中提取方法获得的柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d 纯度不高， 且不适宜工业化生产的问题， 提供一种柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方 法。。
12、该方法获得的柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d 纯度高， 方法适于工业化应用。 0006 为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 0007 柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 包括步骤 ： 0008 （1） 柴胡总皂苷的提取 ； 0009 （2） 柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化 ； 0010 所述步骤 （2） 包括 ： 0011 D. 取步骤 （1） 制得的柴胡总皂苷， 加入 5 10 倍量 （mL/g） 溶剂 2， 得上样溶液 ； 取 相当于所述柴胡总皂苷 15 50 倍量 （g/g） 正相硅胶， 干法装柱， 所述上样溶液加入柱顶， 用所述溶剂 2 以每小时 1。
13、 3BV 速度洗脱， 收集洗脱液， 薄层检识， 分别合并含有柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的流分， 回收溶剂得柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 粗品 ； 0012 E. 分别取柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 粗品， 加 5 10 倍量 （mL/g） 溶剂 3， 得上样溶 说 明 书 CN 102659903 A 4 2/8 页 5 液 ； 取相当于所述柴胡皂苷a或柴胡皂苷d粗品1550倍量 （g/g） 反相硅胶， 湿法装柱， 所 述上样溶液加入柱顶， 用所述溶剂 3 以每小时 0.15 1.5BV 洗脱， 收集洗脱液， 薄层检识， 分别合并含有柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的流分， 分别得柴胡皂苷 。
14、a 或柴胡皂苷 d ； 0013 所述溶剂 2 选自水、 乙醇、 甲醇、 二氯甲烷、 氯仿或丙酮的任一种或它们的任意混 合物 ； 所述溶剂 3 选自水、 甲醇、 异丙醇或乙腈的任一种或它们的任意混合物。 0014 作为本发明的柴胡皂苷a或柴胡皂苷d的提取纯化方法， 步骤 （1） 柴胡总皂苷的提 取可采用本领域已知的柴胡皂苷提取方法， 如超声提取、 微波提取、 高压提取、 加热回流、 煎 煮中的任意一种。例如， 可采用 CN102166235A“一种柴胡皂苷的提取纯化方法” 所公开的 柴胡皂苷的提取方法。本发明的柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 在步骤 （1） 制 得的柴胡总皂苷后。
15、， 进行正相硅胶和反相硅胶吸附、 洗脱， 并通过筛选流动相、 洗脱速度和 固定相使用量， 提取得到的柴胡皂苷 a 纯度达到 98% 以上， 柴胡皂苷 d 纯度达到 98% 以上。 0015 作为优选， 前述柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 所述步骤 （1） 包括步 骤 ： 0016 A. 取柴胡或者柴胡提取完挥发油后的药渣， 粉碎， 溶剂提取， 提取液浓缩回收溶 剂， 得总提取物 ； 0017 B.A 步骤制得的总提取物加水分散， 上大孔树脂吸附柱， 碱水洗脱除杂， 水洗脱至 中性， 体积百分比浓度 20% 45% 乙醇 / 水溶液洗脱除杂， 体积百分比浓度 70% 90% 乙醇。
16、 / 水溶液洗脱， 收集洗脱液， 浓缩回收溶剂， 得柴胡皂苷粗品 ； 0018 C. 取步骤 B 制得的柴胡皂苷粗品， 用 3 5 倍量 （mL/g） 溶剂 1 分散， 加入相当于 所述柴胡皂苷粗品 2 5 倍量 （g/g） 氧化铝， 拌干溶剂， 得拌样氧化铝 ； 或取步骤 B 制得的 柴胡皂苷粗品， 加入 5 20 倍量 （mL/g） 溶剂 1 溶解， 得柴胡皂苷上样溶液 ； 取相当于所述 柴胡皂苷粗品 8 20 倍量 （g/g） 氧化铝， 干法装柱 ； 将所述拌样氧化铝或所述柴胡皂苷上 样溶液加入柱顶， 所述溶剂 1 以每小时 5 10BV 速度洗脱， 收集洗脱液， 薄层检识， 合并含 有。
17、柴胡皂苷的流分， 浓缩回收溶剂， 得柴胡总皂苷 ； 0019 所述溶剂 1 选自水、 乙醇、 甲醇、 二氯甲烷、 氯仿或丙酮的任一种或它们的任意混 合物。 0020 通过在提取得到柴胡皂苷粗品后增加氧化铝纯化步骤， 得到的柴胡总皂苷质量百 分含量达到 70% 90%， 其中柴胡皂苷 a+d 的质量百分量达到 60% 80%， 有利于进一步提 高步骤 （2） 制得的柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d 的纯度。 0021 作为优选， 前述柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 步骤 D 所述的正相硅胶 柱的径高比为 1 5 1 15。 0022 作为优选， 前述柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提。
18、取纯化方法， 步骤 E 所述的反相硅胶 柱的径高比为 1 5 1 15。 0023 径高比是柱层析的重要工艺参数， 影响到产物的纯度和洗脱速度， 径高比过高影 响洗脱速度， 径高比过低影响产物纯度。 发明人通过大量研究及筛选， 获得了本发明中正相 硅胶柱和反相硅胶柱的径高比。本发明筛选得到的正相硅胶柱和反相硅胶柱的径高比， 既 能得到高纯度的柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d， 又能满足工业化生产， 有效提高提纯效率。 0024 作为优选， 前述柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 步骤 B 所述大孔吸附树 脂选自非极性、 弱极性、 中等极性大孔吸附树脂中的任一种 ； 所述碱水溶液为碱性或。
19、弱碱性 说 明 书 CN 102659903 A 5 3/8 页 6 盐类成分的水溶液。作为进一步优选， 所述碱性水溶液的 pH 值为 7.5 9。 0025 作为优选， 前述柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 步骤 A 所述溶剂选自任 一醇类溶剂或水， 或它们的任意混合物。 0026 作为优选， 前述柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 步骤 C 所述的氧化铝柱 的径高比为 1 3 1 5。通过优选氧化铝柱的径高比， 能进一步提高柴胡皂苷 a、 柴胡 皂苷 d 的纯度， 有效控制提取效率。 0027 作为优选， 前述柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 步骤 。
20、C 所述的氧化铝选 自碱性氧化铝或中性氧化铝。通过优选碱性氧化铝或中性氧化铝， 制得的柴胡皂苷 a、 柴胡 皂苷 d 的纯度获得进一步有效提高。 0028 作为进一步优选， 前述柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 步骤 D 所述的正 相硅胶柱的径高比为 1 15。 0029 作为进一步优选， 前述柴胡皂苷 a 或柴胡皂苷 d 的提取纯化方法， 步骤 E 所述的反 相硅胶柱的径高比为 1 15。 0030 通过进一步优选正相硅胶柱、 反相硅胶柱的径高比， 本发明制得的柴胡皂苷 a、 柴 胡皂苷 d 的纯度达到最优。 0031 与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： 0032 一、 。
21、发明人通过在提取得到柴胡总皂苷后， 增加正相硅胶和反相硅胶层析的方法， 并筛选工艺条件， 提取纯化得到的柴胡皂苷 a 纯度可达到 98% 以上， 柴胡皂苷 d 纯度可达到 98% 以上 ； 并能根据需要同时或分别提取纯化柴胡皂苷 a 和 / 或柴胡皂苷 d ； 0033 二、 发明人通过在提取得到柴胡皂苷粗品后增加氧化铝纯化步骤， 所得的柴胡总 皂苷质量百分含量达到 70% 90%， 其中柴胡皂苷 a+d 的质量百分量达到 60% 80%， 进一 步有效提高了柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d 的纯度。 附图说明 0034 图 1 是步骤 C 不同氧化铝对柴胡总皂苷提取效果的影响比较图。 0035 。
22、图 2 是步骤 C 不同上样方式及流动相用量对柴胡总皂苷提取效果的影响比较图。 0036 图 3 是步骤 C 不同装柱径高比对柴胡总皂苷提取效果的影响比较图。 0037 图 4 是步骤 D 正相硅胶不同装柱径高比对柴胡皂苷 a 和 d 的影响比较图。 0038 图 5 是步骤 E 反相硅胶不同装柱径高比对柴胡皂苷 a 和 d 的影响比较图。 具体实施方式 0039 下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。 0040 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。 在不脱离本发明上 述技术思想情况下， 根据本领域普通技术知识和惯用手段， 做出各种替换和变更， 均应包。
23、括 在本发明的范围内。 0041 以下实施例、 对比例及试验例中， 柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d 的测定方法 ： 0042 HPLC 测定方法 ： 0043 高 效 液 相 色 谱 柱 条 件 ： 美 国 agilent 高 效 液 相 色 谱 仪 ； 色 谱 条 件 ： Zorbaxextend-C18(250mm4.6mm， 5.0m) 色谱柱 ； 流动相为乙腈 - 水 ； 梯度洗脱， 时间程 说 明 书 CN 102659903 A 6 4/8 页 7 序为 0 24 27 30min， 乙腈体积分数相应为 25% 69% 25% 25% ； 流速为 0.8ml/ min ； 柱温为 3。
24、0 ； 检测波长 210nm。进样量 ： 10 微升。 0044 以下实施例及试验例中， 柴胡总皂苷的测定方法 ： 0045 比色法 ： 0046 对照品溶液的制备:精密称取柴胡皂苷a 4.6mg， 加甲醇溶解， 定容于10mL容量瓶 中， 摇匀， 制得每 1mL 含 0.46mg 的标准品溶液。 0047 供试品的制备 : 准确称取柴胡总皂苷 20mg， 用 20mL 蒸馏水分两次溶解， 水溶液用 20mL饱和正丁醇萃取5次， 再分别经过5%氨水洗2次， 每次50mL， 上层饱和正丁醇液于70 水浴中蒸干， 残留物用甲醇溶解， 定容至 20mL 容量瓶中， 摇匀。 0048 测定方法 ： 取。
25、供试品或对照品溶液 0.2mL， 加入 0.4% 的对二甲氨基苯甲醛 - 乙醇 溶液， 在 70水浴中反应 10min， 放至室温， 加入磷酸 4ml， 在 50水浴中反应 20min 后， 在 545nm 处测定吸光值， 计算含量即可。 0049 实施例 1 0050 本实施例是柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d 的提取纯化工艺 ： 0051 步骤 （1） ： 0052 A. 取柴胡药材 20kg， 清洗、 切片、 晾晒 / 干燥后， 粉碎至 16 目， 加入 15 倍量 （L/g） 的 60% （v/v） 、 pH 值为 7 的乙醇浸泡 24 小时， 进行渗漉， 渗漉流速为 15mL/min， 。
26、收集渗漉液， 65减压浓缩成相对密度为 1.1 1.2 的浓缩液 ； 0053 B. 将浓缩液上 D101 大孔树脂柱， 树脂柱径高比为 1 3， 搅拌吸附 12h， 再动态吸 附， 吸附流速为 1BV/h， 然后用 5BV 水洗柱除杂， 再用 3BV30%（v/v） 乙醇除杂 （前述碱水溶 液 pH 值为 7.5-9） ； 85%（v/v） 乙醇 8BV 洗脱， 洗脱流速 1.5BV/h， 收集 85%（v/v） 乙醇洗脱 液， 50减压浓缩回收溶剂得柴胡总皂苷粗品， 检测可得 ： 柴胡皂苷 a+d 含量为 35.7%， 柴胡 总皂苷含量为 54.2% ； 0054 C. 取上述柴胡总皂苷粗。
27、品 100g， 加 11 倍量 （mL/g） 二氯甲烷甲醇 10 1(v/v)， 5000转离心15min， 取上清液， 上碱性氧化铝柱， 碱性氧化铝用量为柴胡总皂苷粗品的10倍 量 （g/g） ， 径高比为 1 3， 二氯甲烷 ： 甲醇 6 1 10 1 混合溶剂洗脱， 洗脱速度每小时 8BV， 收集洗脱液， 薄层检识， 合并含有柴胡皂苷的流分， 浓缩回收溶剂， 得高纯度柴胡总皂 苷， 检测可得 ： 柴胡皂苷 a+d 质量百分量为 77.4%， 柴胡总皂苷质量百分比含量为 87.3%。 0055 步骤 （2） ： 0056 D. 取 C 步骤中所得柴胡总皂苷用 8 倍量 （mL/g） 二氯甲。
28、烷 ： 甲醇 6 1（V/V） 溶 解， 取相当于柴胡总皂苷 15 倍量 （g/g） 正相硅胶， 干法装柱径高比为 1 10， 二氯甲烷 ： 甲 醇 6 1-9 1（V/V） 梯度洗脱， 洗脱速度每小时 2BV， 经薄层检识， 分离得 7 部分， 各部分 浓缩回收溶剂。 0057 E. 取 D 步骤中第 3 部分用 8 倍量 （mL/g） 70%（V/V） 甲醇溶解， 取相当于 D 步骤中 第 3 部分 15 倍量 （g/g） 反相硅胶， 湿法装柱， 径高比为 1 10， 用 70%-100%（V/V） 甲醇水 溶液梯度洗脱， 洗脱速度每小时 0.5BV， 分离得到 5 个部分， 经薄层检识，。
29、 第 3 部分即为柴胡 皂苷a， 第5部分为柴胡皂苷d， 经液相色谱检测， 皂苷a纯度为98.3%， 皂苷d纯度为98.9%。 0058 E-2. 取 D 步骤中第 5 部分 8 倍量 （mL/g） 60%(V/V) 甲醇溶解， 取相当于 D 步骤中 第 5 部分 15 倍量 （g/g） 反相硅胶， 湿法装柱， 径高比为 1 10， 用 60%-80%(V/V) 甲醇水溶 说 明 书 CN 102659903 A 7 5/8 页 8 液梯度洗脱， 洗脱速度每小时0.6BV， 分离得到9个部分。 经薄层检识， 第5、 6部分为柴胡皂 苷 a， 合并 5、 6 部分， 经液相色谱检测， 柴胡皂苷 。
30、a 纯度为 98.7%。 0059 实施例 2 0060 本实施例是柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d 的提取纯化工艺 ： 0061 步骤 （1） ： 0062 A. 取柴胡经超临界萃取挥发油后药渣 20kg， 加入 12 倍量 （L/kg） 的 65%（v/v） 、 pH 值为 8 的乙醇浸泡 24 小时， 进行渗漉， 渗漉流速为 10mL/min， 收集渗漉液， 65减压浓缩成 相对密度为 1.1 1.2 的浓缩液 ； 0063 B. 将浓缩液上 D101 大孔树脂柱， 树脂柱径高比为 1:3， 静态吸附 6 小时， 搅拌吸附 6h， 再动态吸附， 吸附流速为 1.5BV/h， 然后用 6BV 。
31、水洗柱除杂， 再用 4BV30%（v/v） 乙醇除 杂 （前述碱水溶液 pH 值为 7.5-9） ； 80%（v/v） 乙醇 6BV 洗脱， 洗脱流速 1BV/h， 收集 80%（v/ v） 乙醇洗脱液， 50减压浓缩回收溶剂得柴胡总皂苷粗品， 检测可得 ： 柴胡皂苷 a+d 含量为 36.5%， 柴胡总皂苷含量为 56.8%。 0064 C取上述柴胡总皂苷粗品 200g， 加 15 倍量 （mL/g） 乙醇溶解， 5000 转离心 15min， 取上清液， 上碱性氧化铝柱， 碱性氧化铝用量为柴胡总皂苷粗品的 10 倍量 （g/g） , 干法装 柱， 径高比为 1 5， 二氯甲烷 ： 甲醇 6。
32、 1-10 1（V/V） 混合溶剂洗脱， 洗脱速度每小时 6BV， 收集洗脱液， 薄层检识， 合并含有柴胡皂苷的流分， 浓缩回收溶剂， 得高纯度柴胡总皂 苷， 检测可得 ： 柴胡皂苷 a+d 质量百分比量为 75.4%， 柴胡总皂苷质量百分比含量为 86.7%。 0065 步骤 （2） ： 0066 D. 取 C 步骤中所得柴胡总皂苷用 10 倍量 （mL/g） 二氯甲烷 ： 甲醇 6 1(v/v) 溶 解， 取相当于 C 步骤中所得柴胡总皂苷 20 倍量 （g/g） 正相硅胶， 干法装柱， 径高比 1 15， 二氯甲烷 ： 甲醇 6 1-9 1（V/V） 梯度洗脱， 洗脱速度每小时 1.5B。
33、V， 经薄层检识， 分离得 7 部分， 各部分浓缩回收溶剂。 0067 E. 取 D 步骤中 4、 5 部分合并， 用 10 倍量 （mL/g） 50%(V/V) 甲醇水溶液溶解， 取相 当于 D 步骤中 4、 5 部分 20 倍量 （g/g） 反相硅胶， 湿法装柱， 径高比 1 15， 50%-80%（v/v） 甲醇水溶液洗脱， 洗脱速度每小时 0.2BV， 经薄层检识， 分离得 7 部分， 第 4 部分为柴胡皂苷 a， 第 5 部分为柴胡皂苷 d， 经高效液相色谱检测， 柴胡皂苷 a 纯度为 98.0%， 柴胡皂苷 d 纯度 为 98.8%。 0068 E-2. 取 D 步骤中第 7 部分。
34、浓缩回收溶剂， 用 5 倍量 （mL/g） 60%(V/V) 甲醇水溶液溶 解， 取相当于 D 步骤中第 7 部分 20 倍量 （g/g） 反相硅胶， 湿法装柱， 径高比 1 10， 60%-80% 甲醇水溶液洗脱， 洗脱速度每小时0.3BV， 经薄层检识， 得7部分， 第4部分含皂苷a,第7部 分含皂苷 d， 经高效液相色谱检测， 柴胡皂苷 a 纯度为 98.5%， 柴胡皂苷 d 纯度为 98.1%。 0069 实施例 3 0070 本实施例是柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d 的提取纯化工艺 ： 0071 步骤 （1） ： 0072 步骤 A、 步骤 B 同实施例 2。 0073 C. 取上述柴。
35、胡总皂苷粗品 200g， 加 3 倍量 （mL/g） 乙醇分散， 加相当于上述柴胡总 皂苷粗品 2 倍量 （g/g） 中性氧化铝， 拌干溶剂得拌样氧化铝 ； 取相当于上述柴胡总皂苷粗品 20 倍量 （g/g） 中性氧化铝 , 干法装柱， 径高比为 1 ： 5， 二氯甲烷 ： 甲醇 6 1-10 1（v/v） 说 明 书 CN 102659903 A 8 6/8 页 9 混合溶剂洗脱， 洗脱速度 8BV， 收集洗脱液， 薄层检识， 合并含有柴胡皂苷的流分， 浓缩回收 溶剂， 得高纯度柴胡总皂苷， 检测可得 ： 柴胡皂苷 a+d 质量百分量为 70.1%， 柴胡总皂苷质量 百分比含量为 83.2%。
36、。 0074 步骤 （2） ： 0075 D. 取 C 步骤中所得柴胡总皂苷用 10 倍量 （mL/g） 二氯甲烷 ： 甲醇 6 1（V/V） 溶 解， 得上样溶液， 取相当于 C 步骤中所得柴胡总皂苷 50 倍量 （g/g） 正相硅胶， 干法装柱， 径 高比 1 15， 二氯甲烷 ： 甲醇 6 1-9 1（V/V） 梯度洗脱， 洗脱速度每小时 1.5BV， 经薄层 检识， 分离得 7 部分， 各部分分别浓缩回收溶剂。 。 0076 E. 取 D 步骤中 4、 5 部分合并， 浓缩回收溶剂， 用 10 倍量 （mL/g） 50%（v/v） 甲醇水 溶液溶解， 取相当于 D 步骤中 4、 5 部。
37、分 50 倍量 （g/g） 反相硅胶， 湿法装柱， 径高比 1 15， 50%-80%（V/V） 甲醇水溶液洗脱， 洗脱速度每小时 0.6BV， 经薄层检识， 分离得 7 部分， 第 4 部分为柴胡皂苷a， 第5部分为柴胡皂苷d， 经高效液相色谱检测， 柴胡皂苷a纯度为98.3%， 柴胡皂苷 d 纯度为 98.8%。 0077 E-2. 取 D 步骤中第 7 部分， 用 10 倍量 （mL/g） 60%（V/V） 甲醇水溶液溶解， 取相当 于 D 步骤中第 7 部分 20 倍量 （g/g） 反相硅胶， 湿法装柱， 径高比 1 10， 60%-80%（v/v） 甲 醇水溶液洗脱， 洗脱速度每小时。
38、0.9BV， 经薄层检识， 得7部分， 第4部分含皂苷a,第7部分 含皂苷 d， 经高效液相色谱检测， 柴胡皂苷 a 纯度为 98.5%， 柴胡皂苷 d 纯度为 98.1%。 0078 实施例 4 0079 本实施例是柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d 的提取纯化工艺 ： 0080 步骤 （1） ： 0081 步骤 A、 步骤 B 同实施例 2。 0082 步骤 （2） ： 0083 C. 取上述柴胡总皂苷粗品 100g， 加 5 倍量 （mL/g） 二氯甲烷 ： 甲醇 5 1(v/v) 分 散， 加相当于上述柴胡总皂苷粗品 5 倍量 （g/g） 酸性氧化铝， 拌干溶剂， 得拌样氧化铝 ； 取相 当。
39、于上述柴胡总皂苷粗品 8 倍量 （g/g） 酸性氧化铝， 干法装柱， 径高比为 1 3， 二氯甲烷 ： 甲醇 6 1 10 1 （V/V） 混合溶剂洗脱， 洗脱速度每小时 5BV， 收集洗脱液， 薄层检识， 合 并含有柴胡皂苷的流分， 浓缩回收溶剂， 得高纯度柴胡总皂苷， 检测可得 ： 柴胡皂苷 a+d 质 量百分比量为 62.4%， 柴胡总皂苷质量百分比含量为 76.5%。 0084 步骤 （2） ： 0085 D. 取 C 步骤中所得柴胡总皂苷用 5 倍量 （mL/g） 二氯甲烷 ： 甲醇 6 1（V/V） 溶 解， 取相当于 C 步骤中所得柴胡总皂苷 15 倍量 （g/g） 正相硅胶， 。
40、干法装柱， 径高比为 1 5， 二氯甲烷 ： 甲醇61-91(v/v)梯度洗脱， 洗脱速度每小时3BV， 经薄层检识， 分离得7部 分， 各部分浓缩回收溶剂。 0086 E. 取 D 步骤中第 3 部分用 5 倍量 （mL/g） 70%(v/v) 甲醇溶解， 取相当于 D 步骤中 第 3 部分 15 倍量 （g/g） 反相硅胶， 湿法装柱， 径高比为 1 5， 用 70%-100%(v/v) 甲醇水溶 液梯度洗脱， 洗脱速度每小时0.15BV， 分离得到5个部分， 经薄层检识， 第3部分即为柴胡皂 苷 a， 第 5 部分为柴胡皂苷 d， 经液相色谱检测， 皂苷 a 纯度为 98.1%， 皂苷 。
41、d 纯度为 98.2%。 0087 E-2. 取 D 步骤中第 5 部分用 5 倍量 （mL/g） 60%(v/v) 甲醇溶解， 取相当于 D 步骤 中第 5 部分 15 倍量 （g/g） 反相硅胶， 湿法装柱， 径高比为 1 5， 用 60%-80%(v/v) 甲醇水溶 说 明 书 CN 102659903 A 9 7/8 页 10 液梯度洗脱， 洗脱速度每小时 0.15BV， 分离得到 9 个部分。经薄层检识， 第 5、 6 部分为柴胡 皂苷 a， 合并 5、 6 部分， 经液相色谱检测， 柴胡皂苷 a 纯度为 98.2%。 0088 对比例 1 0089 采用 CN102166235A 。
42、中实施例 3 的方法， 取使用超临界提取过挥发油的柴胡药材 1kg， 加入 8 倍药材体积的 30%（v/v） 、 pH 值为 8 的乙醇浸泡 24 小时， 进行渗漉， 渗漉流速 5mL/min， 收集渗漉液， 60减压浓缩， 浓缩成稀浸膏， 再加pH值为8的碱水将浓缩浸膏稀释 至柴胡总皂苷含量为 0.8g/mL， 将稀释药液上 D101 大孔树脂柱， 树脂柱径高比为 1 4， 静 置 6h， 搅拌吸附 10h， 再动态吸附， 吸附流速为 2BV/h， 然后用 4BV 水洗柱除杂， 再用 4BV30% （v/v） 乙醇除杂 ； 78%（v/v） 乙醇 6BV 洗脱， 洗脱流速 2BV/h， 收。
43、集洗脱液， 60减压浓缩， 浓 缩液冻干成淡黄色粉末。 0090 检测可得 ： 柴胡皂苷 a+d 含量为 34.6%， 总皂苷含量为 58.5%。 0091 对比例 2 0092 按照 CN 101333240A 中实施例 2 进行 ： 取柴胡饮片 10kg， 0.5%NaOH-55% 乙醇 15L 回流提取 3 次， 每次提取 1.5 小时， 回收溶剂， 提取物加水分散溶解， 使水溶液稀释倍数为 1 12 （以生药量计） 通过 6L AB-8 大孔吸附树脂， 吸附流速 4BV/h， 树脂柱径高比为 1 7， 上样量为 0.16g/ml（以生药量计） ， 45% 乙醇洗脱 4 倍树脂体积进行除。
44、杂， 除杂流速为 2BV/ h， 85% 乙醇洗脱 4 倍树脂体积， 洗脱流速为 2BV/h， 收集 85% 乙醇洗脱液， 回收溶剂， 减压干 燥， 即为柴胡总皂苷提取物。 0093 测定柴胡总皂苷提取物中总皂苷含量为 48.2%， 其中柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 c、 柴胡 皂苷 d 三种成分的含量之和为 23.5%。 0094 通过以上两个对比例可见， 本发明通过在柴胡皂苷粗品基础上增加氧化铝纯化步 骤， 得到的柴胡总皂苷、 柴胡皂苷 a、 柴胡皂苷 d 的含量大大提高。 0095 以下就本发明筛选研究中的对比效果摘要如下 ： 0096 试验例 1 0097 步骤 C 不同氧化铝对柴胡总皂苷。
45、提取效果的影响 0098 本试验例提取分离柴胡皂苷的方法， 包括 （1） 药材加工、（2） 提取、（3） 浓缩、（4） 大孔树脂处理、（5） 氧化铝处理、（6） 含量测定， 其中步骤 （5） 中所用氧化铝分别为酸性、 碱 性、 中性三种氧化铝， 方法同实施例 1。用 HPLC 测定柴胡皂苷 a+d 的含量， 用比色法测定柴 胡总皂苷的含量， 比较提取效果， 结果如图 1。 0099 由此对比试验可得， 碱性和中性氧化铝处理结果优于酸性氧化铝。 0100 试验例 2 0101 步骤 C 不同上样方式及流动相用量对柴胡皂苷提取效果的影响 . 0102 本试验例提取分离柴胡皂苷的方法， 包括 （1）。
46、 药材加工、（2） 提取、（3） 浓缩、（4） 大孔树脂处理、（5） 氧化铝处理、（6） 含量测定， 其中步骤 （5） 中所用氧化铝为中性氧化铝 , 上样方式及浓度分别为 ： 加相当于柴胡总皂苷粗品 1， 3、 5、 7 倍量 （g/g） 碱性氧化铝拌样 （5 倍量溶剂分散） ， 加相当于柴胡总皂苷粗品 3、 5、 10、 15、 20、 25 倍量 （mL/g） 溶剂溶解后上碱 性氧化铝柱， 上药液分别进行分离， 其余方法同试验例 1。每种提取分离方法平行三份取均 值， 用 HPLC 测定柴胡皂 a+d 的含量， 用比色法测定柴胡总皂苷的含量， 比较提取效果， 结果 见图 2。 说 明 书 。
47、CN 102659903 A 10 8/8 页 11 0103 由图 2 可知 ：（1） 氧化铝拌样时， 氧化铝用量选用 3 5 倍量效果较好， 少于 3 倍 量时， 提取效果不好， 多余 5 倍量时， 提取效果并没有相应明显提高 ；（2） 采用溶解上样时， 溶剂用量选用 5 20 倍量效果较好， 当溶剂用量小于 5 倍时， 提取效果不好， 当溶剂用量大 于 20 倍量时， 提取效果没有明显提高。 0104 试验例 3 0105 步骤 C 不同装柱径高比对柴胡皂苷提取效果的影响 0106 本试验例提取分离柴胡皂苷的方法， 包括 （1） 药材加工、（2） 提取、（3） 浓缩、（4） 大孔树脂处理。
48、、（5） 氧化铝处理、（6） 含量测定， 其中步骤 （5） 中所用氧化铝为中性氧化铝 , 装径高比分别为 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1.9 中性氧化铝柱， 上药液分别进行分离， 其余 方法同试验例1。 每种提取分离方法平行三份取均值， 用HPLC测定柴胡皂苷a+d的含量， 用 比色法测定柴胡总皂苷的含量， 比较提取效果， 结果见图 3。 0107 由图 3 可知 ： 步骤 C 氧化铝柱的径高比在 1 3 1 5 时， 柴胡皂苷提取效果 好， 并在选取 1 5 时效果最佳 ； 径高比小于 1 3 时， 提取效果有显著下降 ； 径高比大于 1 5 时， 提取效果并无明显提高。 0108 试验例 4 0109 步骤 D 正相硅胶不同装柱径高比对柴胡皂苷 a 和 d 的影响 0110 本试验例提取分离柴胡皂苷的方法， 包括 （1） 药材加工、（2） 提取、（3） 浓缩、（4） 大 孔树脂处理、（5） 氧化铝处理、（6） 正相硅胶处理、（7） 含量测定， 。