山羊可诱导多能干细胞的制备方法 技术领域 本发明属于基因工程领域， 具体涉及一种山羊由成体细胞重编程为类似胚胎干细 胞的可诱导多能干细胞 (Induced pluripotent stem cell， 简称 iPS 细胞 ) 的制备方法。
背景技术 山羊在畜牧、 医药方面都有巨大的应用前景， 通过对山羊胚胎干细胞 (ESC) 系进 行操作可以产生克隆动物或者转基因动物， 对建造人类疾病模型、 器官移植、 改良物种、 增 加经济效益等方面意义重大。
ESCs 是指来源于哺乳动物囊胚内细胞团的一类细胞。这类细胞呈圆形， 核质比很 大， 自稳定性很好， 具有无限增殖、 自我更新的能力， 能够在体外培养的环境中永久传代， 并 保持正常核型 ； ESCs 还具有 “全能性” ， 无论在体内还是体外环境， 它们都能分化成成体生 物所有的细胞类型。建立动物 ESC 细胞系对于生产转基因动物和克隆动物都具有非常重要 的意义。 基于胚胎干细胞研究的反向遗传学手段对于遗传学、 发育生物学、 基因敲除模型的 建立等方面具有巨大的推动作用。从 25 年前小鼠胚胎干细胞获得到现在， 人们利用反向遗 传学手段不断建立和完善各种小鼠模型 (Demers， S.P.， et al.(2007)， Cloning and stem cells， 9， 512-522)。
经 典 的 建 立 ESC 细 胞 系 的 方 法 是 从 囊 胚 的 内 细 胞 团 分 离 出 ESCs. 但 是 利 用 这个方法所建立的真正意义的胚胎干细胞系被报道的哺乳动物只有小鼠 (Evans MJ， et al.(1981)， Nature， 292， 154-156)、恒 河 猴 (Liu， et al.(2008)， Cell Stem Cell， 3， 587-590)、 人 (Takahashi K.， et al.(2007)， Cell， 131， 861-872) 和 大 鼠 (Li， et al.(2008)， Cell， 135， 1299-1310)。而其他多数哺乳动物， 包括猪、 牛、 羊等， 虽然也有科学 家尝试建立相应胚胎干细胞系， 但都没有获得一株被认可的细胞系， 其中很重要的一个原 因就是没有寻找到适合这些动物 ESC 全能性维持的培养基。此外， 山羊的胚胎发育过程以 及维持山羊 ESCs 全能性的通路研究都不够清楚， 导致目前并没有产生山羊 ESC 细胞系， 也 就制约了转基因山羊及克隆羊的应用， 由上， 建立山羊 ES 细胞系迫在眉睫。
2006 年 8 月， Yamanaka 实 验 室 利 用 外 源 表 达 Oct4， Sox2， c-Myc， Klf4 四 个 转 录因子， 成功诱导小鼠胚胎成纤维细胞为类似小鼠胚胎干细胞的 “可诱导的多能干细 胞” (induced pluripotent stem cells， iPS)， 这项实验结果说明分化细胞可以通过几个转 录因子诱导， 重编程到全能性的状态 (Takahashi K.， et al.(2006).Cell， 126， 663-676) ； 2007 年， 人类 iPS 的建立， 进一步验证了该方法的可行性 (Takahashi K.， et al.(2007)， Cell， 131， 861-872 ； Yu， et al.(2007)， Science， 318， 1917-1920)， 之后， 恒河猴， 大鼠， 猪等 物种的 iPS 细胞系相继建立。大鼠是 iPS 细胞系早于 ES 系建立的先例， 尽管 iPS 细胞并非 百分之百的 ES 细胞， 但有理由相信， iPS 细胞可以运用到那些使用传统方法无法建立 ES 细 胞的物种上， 比如山羊。
发明内容本发明的目的在于， 提供一种山羊可诱导多能干细胞的制备方法。
根据本发明的山羊可诱导多能干细胞的制备方法， 包括步骤 ：
A) 构建 tet-on 可诱导慢病毒载体系统， 所述转录因子选自 ： Oct4、 Sox2、 c-Myc、 Klf4、 Lin28、 Nanog、 SV40large T、 hTert ；
B) 采用步骤 A) 所得慢病毒载体将所述转录因子以组合形式感染山羊成体细胞， 挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养， 通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆， 得 到山羊 iPS 细胞。
根据本发明所述的方法， 所述山羊成体细胞为山羊原代耳尖成纤维细胞。
根据本发明所述的方法， 所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括 ： Oct4、 Sox2、 c-Myc、 Klf4、 Lin28、 Nanog、 SV40 largeT、 hTert。
根据本发明所述的方法， 所述步骤 B) 克隆的产生是在感染第 12 天消化为单细胞 按 1 ∶ 3 的比例传代至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上， 继续培养 14 天， 挑取克隆。
根据本发明所述的方法， 所述步骤 B) 的传代培养是将山羊 iPS 克隆按 1 ∶ 5 ～ 10 的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。
根据本发明所述的方法， 所述步骤 B) 的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细 胞。
C) 山羊 iPS 细胞的干细胞多能性鉴定
根据本发明所述的方法， 所述步骤 C) 山羊 iPS 细胞的多能性鉴定包括 ： 实时定 量 PCR 对山羊 iPSC 细胞系内源多能性基因的检测， 如 Oct4、 Sox2、 nanog 被诱导表达， 此外 CDH1、 Dnmt3b、 TDGF、 Dax1、 Rex1、 Sall4 等干细胞 marker 均被诱导表达 ；
指标为 ：
1) 碱性磷酸酶表达呈阳性 ；
2) 干 细 胞 表 面 特 异 标 记 SSEA-1(+)、 Rex1(+)、 SSEA-3(-)、 SSEA-4(-)、 Tra-1-60(+)、 Tra-1-81(+)、 E-Cadherin(+) ；
3)Nanog 基因的启动子区域被去甲基化 ；
4) 撤 DOX 后， 山羊外源基因的表达检测， 表明外源基因被有效关闭 ；
5) 自然分化形成胚状体后， 外胚层 NeuroD(+)、 Fibronectin(+)， 中胚层 Myf5(+)、 Enolse3(+)、 VEGFR2(+) 和内胚层 DCN1(+)、 AFP(+) ；
6) 体外随机分化， 免疫荧光检测到外胚层 Tuj1(+)、 GFAP(+)， 中胚层 a-SMA(+)、 Myotube(+)， 内胚层 FoxA2(+) ；
7) 山羊 iPS 细胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。
根据本发明所述的方法， 所述畸胎瘤具有外胚层、 中胚层和内胚层。
本发明有助于确立山羊 ES 细胞建系的最适培养条件和方法 ； 山羊 iPS 细胞是山羊 基因打靶的良好载体， 本发明的山羊 iPS 细胞将利于揭示山羊各基因功能和复杂的发育事 件； 此外， 山羊 iPS 是猪的 iPS 成功诱导后第一项其它大型偶蹄目物种的 iPS， 这对于其它 动物 iPS 的诱导有着重大指导意义。 附图说明
图 1 是病毒载体 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-cDNA 和 Lenti-EF1α-rtTA-IRES-EGFP结构图。 图 2 是山羊 iPS 细胞获得的实验流程图。
图 3 是不同转录因子组合情况下， 山羊 PEF 被诱导所产生的克隆数与碱性磷酸酶 检测阳性克隆数统计结果图。
图 4 是山羊 iPS 细胞形态荧光镜检结果图， 其中 A ： 山羊未完全重编程克隆形态 B ： 低倍镜下山羊的 ES-like 克隆 C ： ES-like 克隆形态 D ： 高倍镜下的山羊 iPS 细胞。
图 5 是山羊 iPS 细胞表面及多能型 marker 检测图， 其中 A ： 碱性磷酸酶、 B： SSEA-1、 C： SSEA-3、 D： SSEA-4、 E： Rex1、 F： Tra-1-60、 G： Tra-1-81、 H： E-Cadherin。
图 6 是 Realtime PCR 检测山羊 iPS 细胞多能性 Marker 表达情况电泳图， 从左到 右依次为 ： 山羊耳尖成纤维细胞， 山羊 iPS 细胞 8-3， 山羊 iPS 细胞 8-4， 山羊 iPS 细胞 8-7， 山羊 iPS 细胞 8-9， 阴性对照。其中， 山羊 iPS 细胞 8-3 为 8 个病毒因子诱导出的山羊可诱 导多能干细胞 3 号克隆， 其余同理。
图 7 是绝对定量检测山羊 iPS 细胞基因表达情况电泳图， 从左到右依次为 ： 山羊耳 尖成纤维细胞， 人胚胎干细胞， 山羊 iPS 细胞 8-3， 山羊 iPS 细胞 8-4， 山羊 iPS 细胞 8-7， 山 羊 iPS 细胞 8-9。
图 8 是 Nanog 启动子区去甲基化检测结果图， 分别为 ： 山羊耳尖成纤维细胞， 山羊 iPS 细胞 8-3， 山羊 iPS 细胞 8-4， 山羊 iPS 细胞 8-7， 山羊 iPS 细胞 8-9。
图 9 撤 DOX 后， 山羊外源基因的表达检测结果图， 分别为山羊 iPS 及撤 DOX 2 天、 4 天、 6 天、 8 天的外源基因表达检测。
图 10 是 Realtime PCR 检测山羊 iPS 细胞在体外向三个胚层的分化能力图， 从左 到右泳道依次是 ： 山羊 iPS 细胞 8-3， 山羊 iPS 细胞 8-4， 山羊 iPS 细胞 8-7， 山羊 iPS 细胞 8-9， 山羊 iPS 细胞 8-3 的 EB， 山羊 iPS 细胞 8-4 的 EB， 山羊 iPS 细胞 8-7 的 EB， 山羊 iPS 细 胞 8-9 的 EB 和阴性对照。
图 11 是山羊 iPS 细胞体外随机分化情况的免疫染色图。
图 12 是山羊 iPS 细胞畸胎瘤免疫组化图， 其中 A ： 角化上皮 ( 外胚层 )B ： 平滑肌 ( 中胚层 )C ： 脂肪组织 ( 中胚层 )D 腺管 ( 内胚层 )。
具体实施方式
以下结合具体实施例， 对本发明作进一步说明。 应理解， 以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
以下实施例中， 用到的培养基有 ：
山羊原代耳尖成纤维细胞的培养基， 具体组成为 ： 90 ％的 D-MEM 培养液 ( 购自 Invitrogen， 12571) ； 10％的胎牛血清 ( 购自 HyClone， SH30396.03)。
山羊 iPS 细胞的培养基， 具体组成为 ： 79％的 Knockout D-MEM/F12 培养液 ( 购自 Invitrogen， 12660) ； 20％的 Knockout SR( 购自 Invitrogen， 10828) ； 1mM L- 谷氨酸 ( 购自 Invitrogen， 25030) ； 1％的非必须氨基酸 ( 购自 Invitrogen， 11140050) ； 0.1mMβ- 巯基乙 醇 ( 购自 Sigma， M7522)。
以 下 实 施 例 中 所 使 用 的 原 始 慢 病 毒 载 体 Lenti-EFlα-IRES-EGFP 购 自 Invitrogen 公司， 具有氨苄抗性。以下实施例中， 通用的细胞培养产品均购自 Invitrogen 公司。
实施例 1、 慢病毒载体的构建
1.1、 从 NCBI 网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 查询干细胞中特异表达或高 表达的特定基因 (Oct4， Sox2， c-Myc， Klf4， Lin28， Nanog， hTert， SV40largeT antigen 和 rtTA) 的编码区， 根据编码区序列设计引物， 并引入酶切位点， 引物序列如表 1 所示 ( 其中 F 表示正向引物， R 表示反向引物 )。
表 1 引物序列表
注： 引物序列中大写的字母为引入的酶切位点。
1.2、 PCR 扩增
以人类总 cDNA 为模板， 利用表 1 中各基因引物进行 PCR 扩增， 具体如下 ：
反应体系 (25μl) ： 10×pfxMix 2.5μl， AccuPrime pfx 酶 0.2μl， 上下游引物 (50μM) 各 0.25μl， 模板 0.25μl， ddH2O 21.55μl。
反应条件： 95 ℃ 2min ； 95 ℃ 20sec， 66 ℃ 20sec， 68 ℃ 30sec， 循 环 35 次 ； 68℃ 10min。
1.3、 慢病毒载体的构建
将所得 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 使用天根公司的通用型 DNA 纯化回收试剂 盒 ( 离心柱型 ) 回收各基因片段， 分别利用各自酶切位点双酶切， 用相应的酶双酶切慢病毒 载体 LV-EF1α-EGFP-tetO-cDNA 和 Lenti-EF1α-cDNA-IRES-EGFP， 得到慢病毒载体的骨架 片段， 将慢病毒载体的骨架片段和各基因片段用 T4DNA 连接酶 (Fermentas 公司 ) 于 22℃连 接 3h。
将 连 接 产 物 转 化 GBE180 感 受 态 细 菌 ( 制 备 方 法 见 http://www.chem. uga.edu/scottgrp/GrpProtocols/Competent_cell_preparation.htm)， 在 琼 脂 平 板 上 ( 含 氨 苄 抗 生 素 )， 于 37 ℃ 培 养 12 小 时， 从 平 板 上 挑 取 阳 性 单 菌 落， 使用博大 泰 克 B 型 质 粒 小 量 快 速 提 取 试 剂 盒 提 取 质 粒， 经 测 序 鉴 定 为 正 确 方 可 使 用， 将所得 载 体 分 别 命 名 为 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Oct4、 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Sox2、 L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - c M y c 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - K l f 4 、 L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - L i n 2 8 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - N a n o g 、 L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - h T e r t 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - S V 4 0 T 和 Lenti-EF1α-rtTA-IRES-EGFP。 实施例 2、 细胞培养
2.1、 山羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF) 的培养
取山羊耳朵， 75 ％酒精清洗后剃毛， 浸泡于含双抗 ( 青霉素、 链霉素 ) 的 PBS 中 15min， 再依次使用 PBS， 无血清培养基 (D-MEM) 清洗耳朵数次， 然后将耳朵浸泡于少量含 30％ FBS 的 D-MEM 中， 同时使用无菌剪刀将其剪成小块， 移至培养瓶中， 小块之间保持较小 的距离， 培养瓶倒置。6-8 小时后， 补加含 30％ FBS 的 D-MEM， 正置， 此后每天补加少量该培 养基， 一般 3、 4 天后可明显观察到成纤维细胞， 约一周后传代， 传代时使用 PBS 清洗细胞 2 次， 37℃下 0.25％胰酶消化 5min， 以 10％ FBS 的 D-MEM 终止反应吹打。首次传代按 1 比 1 或 2 传 ( 视细胞量而定 )， 此后每 3 至 4 天传代， 按 1 比 3 或 4 传， 山羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF) 传 10 代以上依然有较好的增殖能力。
2.2、 其它细胞的培养
293T 细胞 ( 购自中科院上海生命科学研究院生化细胞所细胞库 ) 的培养 ： 传代时 37℃下 0.25％胰酶消化 5min， 使用 10％ FBS 的 D-MEM 终止反应， 吹打后按 1 比 8 ～ 10 传 代。
小 鼠 胚 胎 成 纤 维 (MEF) 细 胞 根 据 文 献 (Thomson JA.， Itskovitz-Eldor J.， Shapiro SS.， et al.Science.Nov 61998 ； 282(5391) ： 1145-1147 及 Xu， C.， et al.Nat Biotechnol.2001， 19(10) ： 971-4) 的方法制备， 作为滋养层细胞铺于平板备用。
实施例 3、 病毒包装
3.1、 包装质粒的扩增
将实施例 1 中得到的九种鉴定正确的载体转化感受态细菌以进行扩增， 经 Axygen TM AxyPrep plasmid Maxiprep Kit 试剂盒 (Axygen 公司 ) 中抽后， 在超净工作台中进行纯 化， 即用中抽后质粒的十分之一体积的 3M NaAC 和 2 倍体积的无水乙醇混匀后， 13000rpm 离 心 15min， 去上清， 使用 75％乙醇漂洗， 吸去上清， 于超净工作台中吹干后， 使用无菌去离子 蒸馏水溶解质粒， 最后使用分光光度计及凝胶电泳确定质粒的浓度。
3.2、 转染
按 照 Invitrogen 公 司 转 染 试 剂 盒 (ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems) 的说明书， 使用转染试剂 LipofectamineTM 2000 将步骤 3.1 中的六个慢病毒质粒 分别与包装质粒 ViraPowerTM Packaging Mix(Invitrogen 公司 ) 共同转染 293T 细胞。
具体步骤为 ： 转染实验前一天铺 293T 细胞， 使第二天细胞可生长至 90％满， 对于 TM 一个 T75 瓶， 取 9μg ViraPower Packaging Mix 和 3μg 病毒质粒于 1.5mL opti-MEM 中， 轻轻混匀， 另取已摇匀的 LipofectamineTM 2000 转染试剂 36μl 于另一份 1.5mL opti-MEM 中， 轻轻混匀后， 室温放置 5min， 将上述两份分别含 DNA 和转染试剂的 opti-MEM 轻轻混匀， 室温放置 20min 后将上述混合液至于 293T 细胞 90％满的 T75 培养瓶中。按相同的方法转 染其它五种慢病毒质粒。
3.3、 病毒滴度测定
将步骤 3.2 中转染获得的六种病毒分别在 24h 内更换培养基， 此后收集转染 48h， 72h 和 96h 的病毒上清， 一般无需进行病毒浓缩， 而直接取 5μl 和 1μl 上述六种病毒， 分别 于 24 孔板中悬浮感染 15 万 293T 细胞， 同时加入 polybrene， 由感染 48h 后六种病毒感染的 293T 细胞的 GFP 情况来确定病毒滴度， 可由视野中 GFP 阳性细胞所占比例估算 15 万细胞中 GFP 阳性总细胞数， 继而获知单位体积病毒上清中的病毒颗粒数， 即为相应病毒的滴度。 实施例 4、 病毒感染
将实施例 3 包装的慢病毒， 以 MOI 5 感染 5×104 个山羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF)， 所用病毒的滴度约为 5 ～ 8×106IU/mL，
实验分为 10 组 ：
a) 实验组 1 ： 8 个转录因子的全组合 ；
b) 实验组 2 ： 8 因子 -SV40large T(8 因子去掉 SV40large T) ；
c) 实验组 3 ： 8 因子 -hTert(8 因子去掉 hTert) ；
d) 实验组 4 ： 8 因子 -Oct4(8 因子去掉 Oct4) ；
e) 实验组 5 ： 8 因子 -Sox2(8 因子去掉 Sox2) ；
f) 实验组 6 ： 8 因子 -cMyc(8 因子去掉 cMyc) ；
g) 实验组 7 ： 8 因子 -Klf4(8 因子去掉 Klf4) ；
h) 实验组 8 ： 8 因子 -Lin28(8 因子去掉 Lin28) ；
i) 实验组 9 ： 8 因子 -Nanog(8 因子去掉 Nanog) ；
j) 空白对照组 ： 仅携带有绿色荧光蛋白 (GFP) 的慢病毒 ；
每组实验均有 6 个平行样， 其中 3 个用于碱性磷酸酶 (AP) 染色， 统计阳性克隆数， 另 3 个样用于克隆挑选。
感染 48 小时后， 将上述细胞用 0.25％胰酶， 37℃下消化 5min， 计数后传代转移至 铺好小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 的 6 孔板中， 传代后 24h 内改用加入 10000X DOX 的人胚胎 干细胞 (ES) 培养基， 隔天换液， 待出现克隆后每天换液。
在克隆出现 12 天后， 将上述细胞用 0.25％胰酶， 37℃下消化 5min， 计数后传代转 移至铺好小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 的 6 孔板中， 传代后 24h 内改用人胚胎干细胞 (ES) 培 养基， 持续天天换液， 直至 12 天左右， 形态好的克隆出现。
实施例 5、 转染后阳性细胞的筛选
5.1、 感染细胞的荧光镜检及碱性磷酸酶 (AP) 染色
用荧光显微镜观察实施例 4 感染后的细胞， 发现感染后 48 小时有绿色荧光表达。 感染 7 天后， 仅第 1 组和第 3 组有明显的细胞聚集， 克隆生长代谢很快， 形成很大的团块， 无法挑取克隆。在传代后 12 天， 将克隆用胰酶消化， 传代至新的辐照后的小鼠胚胎成纤维 细胞上。继续培养， 5 到 6 天之后， 圆形致密的克隆开始出现。显微镜观察的结果如图 4 所 示， 其形态主要有两种， 一类是小鼠胚胎干细胞类 (mES-like) 克隆， 其细胞致密， 克隆表面 光滑， 边缘平滑， 边界清晰光亮 ( 见转染山羊 PEF 所得图 4B) ； 另一类克隆中部明显突起， 细 胞相对松散， 边缘不够平滑， 边界相对模糊 ( 图 4A)， 为非 ES-like 克隆。
传代第 12 天对 10 组实验下 6 个平行样中的 3 个进行碱性磷酸酶 (AP) 染色， 统计 阳性克隆数， 结果如图 3 所示， 由图 3 可知， 仅第 1 组和第 3 组的病毒组合产生了 AP 阳性的 4 克隆， 两组的 5×10 个山羊 PEF 传代后分别形成 19±2 个和 2±0.4 个 AP 阳性的 iPS 细胞 集落。
由以上结果可知山羊要比小鼠、 大鼠、 人、 恒河猴、 和猪更难， 需要更多的外源转录 因子参与重编程的过程。SV40 大 T 抗原对于山羊的重编程是必需的， 没有 SV40 大 T 抗原的 参与， 甚至不会产生细胞聚集。 传代对编程完善克隆的释放十分重要， 没有经过传代的细胞 产生不了好的克隆。 5.2、 阳性细胞的筛选
在感染后 26 天随机挑选克隆， 使用 0.25％胰酶 37℃下消化 5min， 吹打为单细胞 后， 用含 10％ SR( 血清替代物 )+10％ FBS 的 D-MEM 的 Knock D-MEM/F12 培养液终止反应， 此 后每天更换该培养基， 此时细胞增殖很快， 每三天可传一代， 每三天按 1 ∶ 5 ～ 10 传代 ( 视 克隆总数而定 ) 至辐照过的滋养层细胞 MEF 上， 此后不断进行克隆挑选和 AP 检测。
山羊 iPS 细胞经多次挑克隆和传代， 其形态逐渐类似于小鼠胚胎干细胞。
实施例 6、 干细胞特性检测
取传至 15 代的小鼠成纤维细胞形成的克隆 8-3、 8-4、 8-7、 8-9 进行以下检测， 以证 明其具备干细胞特性。
6.1、 碱性磷酸酶表达
使用 Chemicon Alkaline Phosphatase Detection Kit(Millipore 公司 ) 进行染 色， 具体步骤如下 ：
使用 PBS 清洗细胞两次， 4％ PFA( 多聚甲醛 ) 室温固定 1-2min， TBST 清洗一遍， AP 染料 ( 按试剂盒中注明的配制 ) 避光染色 15min， TBST 再清洗一遍后使细胞浸泡于 PBS 中。 显微镜检测， 结果如图 5 所示。
由图 5 可以看出， 细胞被染成紫红色， 而紫红色表示细胞具有碱性磷酸酶活性， 从 而说明反复挑克隆后的山羊 iPS 细胞具有很强的碱性磷酸酶活性， 进一步地说形成的山羊 iPS 克隆具有胚胎干细胞特性， 即表达碱性磷酸酶。
6.2、 山羊 iPS 细胞的未分化状态检测
用 realtime PCR 方法检测山羊 iPS 细胞与诱导前细胞山羊 PEF 进行对比， 分析其 未分化基因表达水平。
6.2.1、 引物设计
由于未分化的细胞会特异性表达以下基因， 包括 Oct4、 Sox2、 Nanog、 CDH1、 Dnmt3b、
TDGF、 Dax1、 Rex1、 Sall4， 所以可通过检测这些基因的表达情况得知所获得的山羊 iPS 细胞 的未分化状态。未分化 marker 引物序列设计如表 2 所示， 引物由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成 ( 其中 f 表示正向引物， r 表示反向引物 )。
表 2 未分化 marker 引物序列设计表
基因 Oct4 3’ UTR-f Oct4 3’ UTR-r Sox2 3’ UTR-f Sox2 3’ UTR-r Nanog 3’ UTR-f Nanog 3’ UTR-r CDH1-f CDH1-r Dnmt3b-f Dnmt3b-r TDGF-f TDGF-r Dax1-f Dax1-r Rex1-f Rex1-r Sall4-f Sall4-r GAPDH-f GAPDH-r 引物序列 GGGTTTGTACTAGGGCTTTGGG GCATCATTGAACTTCACCTTCCCT GCACGGCCATTAACGGCACAC CTCCATGCTGTTTCTTGCTGTCCTC TCTGTGTCAGTTTGAGGGACAGG AACAAGTAAAGCCTCCCTATCCCA CACTGCCCCACCCTATGACTCTCT ATACATGTCCGCCAGCTTCTTGAAG TTGGAATAGGAGATCTTGTGTGGGGA AGAACTTGCCATCACCAAACCACTG GATATCTCAGCAAACAAGTTTGCCA GGCAGGTCACTCAGGTTATTGTTGC AGTGCGTGAAGTACATCCAGGGACT CAGGGTGTTAGCGCTGATGAATCTC CACTGTCCTTCGATTACAACCCCAG CCACGTACTTACTGCTGGAGATGGG GGCTAGTTCAGAATCTCCCCTCGG GCGGTAGTGCATCTTGAGTGAGCTC ACGGGAAGCTCACTGGCATGG GCCAGCCCCAGCATCGAAG6.2.2、 PCR 扩增
使 用 Toyobo Syber green PCR Mix， 反 应 体 系 (15μl) ： 模 板 0.3μl， 引物 (5μM)1μl， Syber green Mix 7.5μl， ddH2O 6.2μl， 其中模板为抽提 iPS 细胞的 RNA 反 转得到的 cDNA。
反应条件 ： 94 ℃， 5min ； 94 ℃ 15sec， 66 ℃ 10sec， 72 ℃ 15sec， 循环 40 次 ； 72 ℃， 10min。
将所得 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 结果如图 6 所示， 其中阴性对照的模板为未 进行反转的 RNA。
由图 6 的结果可知， 山羊 iPS 细胞与诱导前的山羊 PEF 相比， 其干细胞相关的 marker， 即 Oct4、 Sox2、 Nanog、 CDH1、 Dnmt3b、 TDGF、 Dax1、 Rex1、 Sall4 均有高水平的表达。
6.2.3、 通过免疫荧光染色检测胚胎干细胞未分化相关 marker 是否表达 ( 包括 SSEA-1 和 Nanog)
使 用 PBS 清 洗 细 胞 两 次， 4 ％ PFA 室 温 固 定 30min， PBS 洗 三 次， 再 用 含 0.2 ％ BSA+0.1 ％ Triton-100 的 PBS 洗 两 次， 接 着 使 用 含 1 ％ BSA+4 ％ normal serum+0.1 ％ Triton-100 的 PBS 封闭细胞 1h， 再将一抗 (SSEA-1 和 Nanog) 稀释在含 0.2 ％ BSA+0.1 ％ Triton-100 的 PBS 中， 然后加到样品上， 室温 2h 或 4℃过夜， 然后用 PBT(0.1％ Triton-100 的 PBS) 洗涤细胞 3-5 次， 将二抗 (anti-mouse IgM 和 anti-rabbit IgG) 稀释在含 0.2％ BSA+0.1 ％ Triton-100 的 PBS 中， 然后加到样品上， 室温 1h， 再用 PBT 洗三次， 将 Hochest 母液以 1 ∶ 1000 用 PBS 稀释， 室温避光放置 5min， 然后 PBS 洗涤两次， 每次 5min， 再用 4％ PFA 室温固定 30min， 最后用 PBS 洗涤两次， 每次 5min。免疫荧光染色结果如图 7 所示。
由图 7 可以看出， 荧光镜检检测到山羊 iPS 细胞表达干细胞相关 marker SSEA-1 和 Rex1， Tra-1-60、 Tra-1-81、 E-Cadherin， 但是为 SSEA-3、 SSEA-4 阴性， 类似于小鼠胚胎肝 细胞， 以上说明山羊 iPS 克隆持续传代后， 仍能自我更新， 维持未分化的状态， 具有胚胎干 细胞能自我更新的特性。
6.3、 山羊 iPS 细胞内外源基因表达水平检测
6.3.1、 引物设计
由于使用人源的基因诱导山羊 PEF 重编程为山羊 iPS 细胞， 因此使用人源的引物 检测外源基因的表达情况， 使用山羊基因检测山羊 iPS 细胞内源基因的表达情况， 引物序 列如表 3 所示， 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成合成 ( 其中 f 表示正向引 物， r 表示反向引物 )。
6.3.2、 PCR 扩增
使 用 Toyobo Syber green PCR Mix 反 应 体 系 (15μl) ： 模 板 0.3μl， 引物 (5μM)1μl， Syber green Mix 7.5μl， ddH2O 6.2μl， 其中模板为抽提 iPS 细胞的 RNA 反 转得到的 cDNA。
反应条件 ： 94 ℃， 5min ； 94 ℃ 15sec， 66 ℃ 10sec， 72 ℃ 15sec， 循 环 40 次 ； 72 ℃， 10min。
根 据 定 量 PCR 原 理， 利 用 绝 对 定 量， 未知样品的量 ( 拷贝数 ) 可以通过从 已 知 量 的 标 准 品 的 范 围 中 推 算 得 出。 为 了 建 立 标 准 曲 线， 需要已知浓度的模板 ( 模 板 即 质 粒 载 体 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Oct4、 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Sox2、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - c M y c 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - K l f 4 、 L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - L i n 2 8 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - N a n o g 、 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-hTert、 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-SV40T)。模板稀释后， 用这些稀 释样品作为标准样品， 将未知的待测样本和标准样本置于同一次实验中进行反应， 用稀释 的样品标准样品构建标准曲线， 通过计算来确定未知样品中目的基因的量。
标准品基因 PCR 的 ct 值与起始量 ( 拷贝数 ) 的对数呈线性关系， 据此可作一条 ct 值对 log( 拷贝数 ) 的曲线， 得到线性相关得方程式， 样本基因的拷贝数可以通过对应的 ct 值利用方程式计算得出， 将结果绘制成图 7。 由图 7 结果可知， 得到的山羊 iPS 细胞， 其内源 的胚胎干细胞全能性相关 marker Oct4， Nanog， Sox2 均得到激活表达， 绝对数量达到人胚胎 肝细胞水平。
表 3 引物序列表
6.4、 干细胞特异启动子去甲基化程度检测
为检测得到的山羊 iPS 细胞的 Nanog 基因的启动子区域是否被去甲基化， 先使用 Bisulphite 处理 DNA， 具体步骤如下 ：
取每份样品 DNA210ng， 双蒸水稀释到 21μl， 每管加入新鲜配置的 2M 的 NaOH 4μl， 50 ℃反应 15min， 向该样品中加入 50 ℃的 50μl 2 ％的低熔点琼脂糖 ( 该琼脂糖预 先置于 100℃ 5min)， 混匀后取 10μl 于预冷的 300μl 液体石蜡中， 冰上至少放置 30min， 使 形 成 的 beads 坚 硬。 然 后 向 beads 中 加 入 500μl 新 配 的 2.5M 焦 亚 硫 酸 钠 (Sodium
metabisulphite) 摇匀， 使 beads 位于分层上， 离心甩一下， 然后 50℃避光反应 4h-12h( 不 超过 16-18h)。接着使用 1ml TE(pH8.0) 洗 3 次， 每次 10min， 0.5ml 0.2M NaOH 洗 2 次， 每 次 15min， 再用 1ml TE， 每次 10min， 然后每管加 100μl TE， 4℃保存。
在山羊目的基因 (Nanog)Promoter 区富含 CpG 区域的上下游设计引物， 将各富 含 CpG 区的 PCR 产物连接至 T 载体上， 转化后抽提质粒酶切鉴定送测序， 其中的 CG 区即为 甲基化位点， 而 TG 区为未甲基化位点， 绘制图谱 (Analysis of DNA methylation using bisulphate sequencing， contributed by Dr.Alexei Gratchev)， 结果见图 8。
由图 8 的结果可见， 诱导前的山羊 PEF 细胞， 其 Nanog 基因的启动子区域被高度甲 基化， 而诱导重编程得到的山羊 iPS 细胞的 Nanog 基因的启动子区域被高度去甲基化， 诱导 后的细胞山羊 PEF 细胞得到有效的重编程。
6.5、 撤 DOX 后外源基因的关闭情况监测
为了检测， 撤 DOX 后外源基因的关闭情况， 我们用实时定量 PCR 的方法检测， 撤去 DOX 2 天、 4 天、 6 天和 8 天的 iPS 细胞外源基因表达。将所得结果进行处理， 如图 9 所示。 由图 9 可见， 4 个山羊 iPS 克隆外源基因在撤去 DOX 后， 表达逐渐下降， 到第 8 天的时候， 基 本为零。证明 tet-on 系统很好的关闭了外源基因的表达。 6.5、 体外拟胚体向三个胚层及滋胚层的分化潜能
为了验证山羊 iPS 细胞的多能性， 使之自然分化形成胚状体 (EB)， 使用实时定量 PCR 的方法， 即在确保看家基因 Gapdh 表达水平基本一致的情况下， 比较各个样品， 其三个 胚层不同标记基因的表达水平间的差异。
将所得 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 结果如图 10 所示。由图 10 的结果可知， 山 羊 iPS 细胞能够表达外胚层 NeuroD、 Fibronectin， 中胚层 Myf5、 Enolse3、 VEGFR2 和内胚层 DCN1、 AFP 的分化基因， 证明山羊 iPS 细胞能够分化形成胚状体中所有三个胚层。
6.6、 体外随机分化能力检测
将自然分化的已培养 8 天的拟胚体传至已铺过明胶的六孔板上， 用 DMEM 培养基培 养， 每天换液， 8 天后孔板中的细胞呈现各种不同的形态， 随后进行免疫荧光染色。
免疫荧光检测结果如图 11 所示到外胚层 Tuj1、 GFAP， 中胚层 a-SMA、 Myotube， 内胚 层 FoxA2 等因子阳性。
6.5 和 6.6 的结果表明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性， 具有体外分化成不 同的组织细胞的潜能。
6.6、 体内畸胎瘤形成的检测
为了验证得到的克隆在体内具有多组织的分化能力， 用畸胎瘤石蜡切片， 苏木 精 - 伊红 (HE) 染色显示三个胚层组织细胞。
6.6.1、 畸胎瘤形成
将 8-4 号 iPS 细胞用 0.25％胰酶消化为单细胞， 将其铺于用于细胞培养的培养皿 中， 置于 37 ℃培养箱静置 45min， 取上层未贴壁的细胞 (feeder 贴壁快， 故可将 feeder 与 iPS 细胞分离 )。计数， 500 万 iPS 细胞悬浮于 300μl 10％ D-MEM 中， 对先天性免疫缺陷小 鼠 NOD-SCID 小鼠进行后腿肌肉注射。第 20 天观察到有瘤形成， 于第 25-30 天将其取出。
6.6.2、 石蜡切片及 HE 染色
畸胎瘤石蜡切片制作步骤 ： 将畸胎瘤用 4 ％ PFA 固定后， PBS 洗三次， 依次使用
30％、 50％、 70％、 80％、 90％、 95％、 100％乙醇脱水 1h， 继续使用 100％乙醇脱水 1h 后， 使用 100％乙醇脱水过夜， 接着用氯仿处理 1h， 处理三次， 之后浸没于石蜡中 2h， 随后包埋， 5μm 切片。
HE 染色步骤 ： 将石蜡切片用二甲苯 (Xylene) 洗四次， 每次 5min( 在脱色摇床上进 行 )， 无水乙醇洗两次， 每次 10min， 95％、 90％、 80％、 70％乙醇依次洗 5min， 再用蒸馏水洗 三次， 每次 5min， 苏木精染色 10min 后流水冲洗 15-30min 至适合的颜色， 接着再用蒸馏水 洗 5min， 伊红 A 液染 1min， 伊红 B 液染 5min， 再用蒸馏水洗， 接着用 70％乙醇涮洗， 90％乙 醇涮洗至适合颜色， 再用无水乙醇洗两次， 每次 10min， 最后用 Xylene 洗四次， 每次 5min 后 封片。
将玻片显微镜镜检， 结果如图 12 所示。由图 12 可以看到， 山羊 iPS 细胞能够在体 内分化形成三个胚层细胞， 包括， 内胚层的腺管结构， 中胚层的平滑肌和脂肪组织以及外胚 层的角化上皮组织。
由以上结果进一步证明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性， 具有在体内分化成 不同的组织细胞的潜能。
综上所述， 本发明山羊成体细胞重编程为类似胚胎干细胞的可诱导多能干细胞， 使用山羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF)， 已获得数株山羊 iPS 细胞， 并由碱性磷酸酶表达、 干 细胞表面特异标记 (SSEA-1， Rex1)， 干细胞特异启动子去甲基化程度、 端粒酶活性、 拟胚体 向三个胚层分化的潜能、 体外随机分化为三胚层细胞的潜能以及畸胎瘤形成， 确认其干细 胞特性。
背景技术 山羊在畜牧、 医药方面都有巨大的应用前景， 通过对山羊胚胎干细胞 (ESC) 系进 行操作可以产生克隆动物或者转基因动物， 对建造人类疾病模型、 器官移植、 改良物种、 增 加经济效益等方面意义重大。
ESCs 是指来源于哺乳动物囊胚内细胞团的一类细胞。这类细胞呈圆形， 核质比很 大， 自稳定性很好， 具有无限增殖、 自我更新的能力， 能够在体外培养的环境中永久传代， 并 保持正常核型 ； ESCs 还具有 “全能性” ， 无论在体内还是体外环境， 它们都能分化成成体生 物所有的细胞类型。建立动物 ESC 细胞系对于生产转基因动物和克隆动物都具有非常重要 的意义。 基于胚胎干细胞研究的反向遗传学手段对于遗传学、 发育生物学、 基因敲除模型的 建立等方面具有巨大的推动作用。从 25 年前小鼠胚胎干细胞获得到现在， 人们利用反向遗 传学手段不断建立和完善各种小鼠模型 (Demers， S.P.， et al.(2007)， Cloning and stem cells， 9， 512-522)。
经 典 的 建 立 ESC 细 胞 系 的 方 法 是 从 囊 胚 的 内 细 胞 团 分 离 出 ESCs. 但 是 利 用 这个方法所建立的真正意义的胚胎干细胞系被报道的哺乳动物只有小鼠 (Evans MJ， et al.(1981)， Nature， 292， 154-156)、恒 河 猴 (Liu， et al.(2008)， Cell Stem Cell， 3， 587-590)、 人 (Takahashi K.， et al.(2007)， Cell， 131， 861-872) 和 大 鼠 (Li， et al.(2008)， Cell， 135， 1299-1310)。而其他多数哺乳动物， 包括猪、 牛、 羊等， 虽然也有科学 家尝试建立相应胚胎干细胞系， 但都没有获得一株被认可的细胞系， 其中很重要的一个原 因就是没有寻找到适合这些动物 ESC 全能性维持的培养基。此外， 山羊的胚胎发育过程以 及维持山羊 ESCs 全能性的通路研究都不够清楚， 导致目前并没有产生山羊 ESC 细胞系， 也 就制约了转基因山羊及克隆羊的应用， 由上， 建立山羊 ES 细胞系迫在眉睫。
2006 年 8 月， Yamanaka 实 验 室 利 用 外 源 表 达 Oct4， Sox2， c-Myc， Klf4 四 个 转 录因子， 成功诱导小鼠胚胎成纤维细胞为类似小鼠胚胎干细胞的 “可诱导的多能干细 胞” (induced pluripotent stem cells， iPS)， 这项实验结果说明分化细胞可以通过几个转 录因子诱导， 重编程到全能性的状态 (Takahashi K.， et al.(2006).Cell， 126， 663-676) ； 2007 年， 人类 iPS 的建立， 进一步验证了该方法的可行性 (Takahashi K.， et al.(2007)， Cell， 131， 861-872 ； Yu， et al.(2007)， Science， 318， 1917-1920)， 之后， 恒河猴， 大鼠， 猪等 物种的 iPS 细胞系相继建立。大鼠是 iPS 细胞系早于 ES 系建立的先例， 尽管 iPS 细胞并非 百分之百的 ES 细胞， 但有理由相信， iPS 细胞可以运用到那些使用传统方法无法建立 ES 细 胞的物种上， 比如山羊。
ESCs 是指来源于哺乳动物囊胚内细胞团的一类细胞。这类细胞呈圆形， 核质比很 大， 自稳定性很好， 具有无限增殖、 自我更新的能力， 能够在体外培养的环境中永久传代， 并 保持正常核型 ； ESCs 还具有 “全能性” ， 无论在体内还是体外环境， 它们都能分化成成体生 物所有的细胞类型。建立动物 ESC 细胞系对于生产转基因动物和克隆动物都具有非常重要 的意义。 基于胚胎干细胞研究的反向遗传学手段对于遗传学、 发育生物学、 基因敲除模型的 建立等方面具有巨大的推动作用。从 25 年前小鼠胚胎干细胞获得到现在， 人们利用反向遗 传学手段不断建立和完善各种小鼠模型 (Demers， S.P.， et al.(2007)， Cloning and stem cells， 9， 512-522)。
经 典 的 建 立 ESC 细 胞 系 的 方 法 是 从 囊 胚 的 内 细 胞 团 分 离 出 ESCs. 但 是 利 用 这个方法所建立的真正意义的胚胎干细胞系被报道的哺乳动物只有小鼠 (Evans MJ， et al.(1981)， Nature， 292， 154-156)、恒 河 猴 (Liu， et al.(2008)， Cell Stem Cell， 3， 587-590)、 人 (Takahashi K.， et al.(2007)， Cell， 131， 861-872) 和 大 鼠 (Li， et al.(2008)， Cell， 135， 1299-1310)。而其他多数哺乳动物， 包括猪、 牛、 羊等， 虽然也有科学 家尝试建立相应胚胎干细胞系， 但都没有获得一株被认可的细胞系， 其中很重要的一个原 因就是没有寻找到适合这些动物 ESC 全能性维持的培养基。此外， 山羊的胚胎发育过程以 及维持山羊 ESCs 全能性的通路研究都不够清楚， 导致目前并没有产生山羊 ESC 细胞系， 也 就制约了转基因山羊及克隆羊的应用， 由上， 建立山羊 ES 细胞系迫在眉睫。
2006 年 8 月， Yamanaka 实 验 室 利 用 外 源 表 达 Oct4， Sox2， c-Myc， Klf4 四 个 转 录因子， 成功诱导小鼠胚胎成纤维细胞为类似小鼠胚胎干细胞的 “可诱导的多能干细 胞” (induced pluripotent stem cells， iPS)， 这项实验结果说明分化细胞可以通过几个转 录因子诱导， 重编程到全能性的状态 (Takahashi K.， et al.(2006).Cell， 126， 663-676) ； 2007 年， 人类 iPS 的建立， 进一步验证了该方法的可行性 (Takahashi K.， et al.(2007)， Cell， 131， 861-872 ； Yu， et al.(2007)， Science， 318， 1917-1920)， 之后， 恒河猴， 大鼠， 猪等 物种的 iPS 细胞系相继建立。大鼠是 iPS 细胞系早于 ES 系建立的先例， 尽管 iPS 细胞并非 百分之百的 ES 细胞， 但有理由相信， iPS 细胞可以运用到那些使用传统方法无法建立 ES 细 胞的物种上， 比如山羊。
发明内容本发明的目的在于， 提供一种山羊可诱导多能干细胞的制备方法。
根据本发明的山羊可诱导多能干细胞的制备方法， 包括步骤 ：
A) 构建 tet-on 可诱导慢病毒载体系统， 所述转录因子选自 ： Oct4、 Sox2、 c-Myc、 Klf4、 Lin28、 Nanog、 SV40large T、 hTert ；
B) 采用步骤 A) 所得慢病毒载体将所述转录因子以组合形式感染山羊成体细胞， 挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养， 通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆， 得 到山羊 iPS 细胞。
根据本发明所述的方法， 所述山羊成体细胞为山羊原代耳尖成纤维细胞。
根据本发明所述的方法， 所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括 ： Oct4、 Sox2、 c-Myc、 Klf4、 Lin28、 Nanog、 SV40 largeT、 hTert。
根据本发明所述的方法， 所述步骤 B) 克隆的产生是在感染第 12 天消化为单细胞 按 1 ∶ 3 的比例传代至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上， 继续培养 14 天， 挑取克隆。
根据本发明所述的方法， 所述步骤 B) 的传代培养是将山羊 iPS 克隆按 1 ∶ 5 ～ 10 的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。
根据本发明所述的方法， 所述步骤 B) 的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细 胞。
C) 山羊 iPS 细胞的干细胞多能性鉴定
根据本发明所述的方法， 所述步骤 C) 山羊 iPS 细胞的多能性鉴定包括 ： 实时定 量 PCR 对山羊 iPSC 细胞系内源多能性基因的检测， 如 Oct4、 Sox2、 nanog 被诱导表达， 此外 CDH1、 Dnmt3b、 TDGF、 Dax1、 Rex1、 Sall4 等干细胞 marker 均被诱导表达 ；
指标为 ：
1) 碱性磷酸酶表达呈阳性 ；
2) 干 细 胞 表 面 特 异 标 记 SSEA-1(+)、 Rex1(+)、 SSEA-3(-)、 SSEA-4(-)、 Tra-1-60(+)、 Tra-1-81(+)、 E-Cadherin(+) ；
3)Nanog 基因的启动子区域被去甲基化 ；
4) 撤 DOX 后， 山羊外源基因的表达检测， 表明外源基因被有效关闭 ；
5) 自然分化形成胚状体后， 外胚层 NeuroD(+)、 Fibronectin(+)， 中胚层 Myf5(+)、 Enolse3(+)、 VEGFR2(+) 和内胚层 DCN1(+)、 AFP(+) ；
6) 体外随机分化， 免疫荧光检测到外胚层 Tuj1(+)、 GFAP(+)， 中胚层 a-SMA(+)、 Myotube(+)， 内胚层 FoxA2(+) ；
7) 山羊 iPS 细胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。
根据本发明所述的方法， 所述畸胎瘤具有外胚层、 中胚层和内胚层。
本发明有助于确立山羊 ES 细胞建系的最适培养条件和方法 ； 山羊 iPS 细胞是山羊 基因打靶的良好载体， 本发明的山羊 iPS 细胞将利于揭示山羊各基因功能和复杂的发育事 件； 此外， 山羊 iPS 是猪的 iPS 成功诱导后第一项其它大型偶蹄目物种的 iPS， 这对于其它 动物 iPS 的诱导有着重大指导意义。 附图说明
图 1 是病毒载体 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-cDNA 和 Lenti-EF1α-rtTA-IRES-EGFP结构图。 图 2 是山羊 iPS 细胞获得的实验流程图。
图 3 是不同转录因子组合情况下， 山羊 PEF 被诱导所产生的克隆数与碱性磷酸酶 检测阳性克隆数统计结果图。
图 4 是山羊 iPS 细胞形态荧光镜检结果图， 其中 A ： 山羊未完全重编程克隆形态 B ： 低倍镜下山羊的 ES-like 克隆 C ： ES-like 克隆形态 D ： 高倍镜下的山羊 iPS 细胞。
图 5 是山羊 iPS 细胞表面及多能型 marker 检测图， 其中 A ： 碱性磷酸酶、 B： SSEA-1、 C： SSEA-3、 D： SSEA-4、 E： Rex1、 F： Tra-1-60、 G： Tra-1-81、 H： E-Cadherin。
图 6 是 Realtime PCR 检测山羊 iPS 细胞多能性 Marker 表达情况电泳图， 从左到 右依次为 ： 山羊耳尖成纤维细胞， 山羊 iPS 细胞 8-3， 山羊 iPS 细胞 8-4， 山羊 iPS 细胞 8-7， 山羊 iPS 细胞 8-9， 阴性对照。其中， 山羊 iPS 细胞 8-3 为 8 个病毒因子诱导出的山羊可诱 导多能干细胞 3 号克隆， 其余同理。
图 7 是绝对定量检测山羊 iPS 细胞基因表达情况电泳图， 从左到右依次为 ： 山羊耳 尖成纤维细胞， 人胚胎干细胞， 山羊 iPS 细胞 8-3， 山羊 iPS 细胞 8-4， 山羊 iPS 细胞 8-7， 山 羊 iPS 细胞 8-9。
图 8 是 Nanog 启动子区去甲基化检测结果图， 分别为 ： 山羊耳尖成纤维细胞， 山羊 iPS 细胞 8-3， 山羊 iPS 细胞 8-4， 山羊 iPS 细胞 8-7， 山羊 iPS 细胞 8-9。
图 9 撤 DOX 后， 山羊外源基因的表达检测结果图， 分别为山羊 iPS 及撤 DOX 2 天、 4 天、 6 天、 8 天的外源基因表达检测。
图 10 是 Realtime PCR 检测山羊 iPS 细胞在体外向三个胚层的分化能力图， 从左 到右泳道依次是 ： 山羊 iPS 细胞 8-3， 山羊 iPS 细胞 8-4， 山羊 iPS 细胞 8-7， 山羊 iPS 细胞 8-9， 山羊 iPS 细胞 8-3 的 EB， 山羊 iPS 细胞 8-4 的 EB， 山羊 iPS 细胞 8-7 的 EB， 山羊 iPS 细 胞 8-9 的 EB 和阴性对照。
图 11 是山羊 iPS 细胞体外随机分化情况的免疫染色图。
图 12 是山羊 iPS 细胞畸胎瘤免疫组化图， 其中 A ： 角化上皮 ( 外胚层 )B ： 平滑肌 ( 中胚层 )C ： 脂肪组织 ( 中胚层 )D 腺管 ( 内胚层 )。
具体实施方式
以下结合具体实施例， 对本发明作进一步说明。 应理解， 以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
以下实施例中， 用到的培养基有 ：
山羊原代耳尖成纤维细胞的培养基， 具体组成为 ： 90 ％的 D-MEM 培养液 ( 购自 Invitrogen， 12571) ； 10％的胎牛血清 ( 购自 HyClone， SH30396.03)。
山羊 iPS 细胞的培养基， 具体组成为 ： 79％的 Knockout D-MEM/F12 培养液 ( 购自 Invitrogen， 12660) ； 20％的 Knockout SR( 购自 Invitrogen， 10828) ； 1mM L- 谷氨酸 ( 购自 Invitrogen， 25030) ； 1％的非必须氨基酸 ( 购自 Invitrogen， 11140050) ； 0.1mMβ- 巯基乙 醇 ( 购自 Sigma， M7522)。
以 下 实 施 例 中 所 使 用 的 原 始 慢 病 毒 载 体 Lenti-EFlα-IRES-EGFP 购 自 Invitrogen 公司， 具有氨苄抗性。以下实施例中， 通用的细胞培养产品均购自 Invitrogen 公司。
实施例 1、 慢病毒载体的构建
1.1、 从 NCBI 网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 查询干细胞中特异表达或高 表达的特定基因 (Oct4， Sox2， c-Myc， Klf4， Lin28， Nanog， hTert， SV40largeT antigen 和 rtTA) 的编码区， 根据编码区序列设计引物， 并引入酶切位点， 引物序列如表 1 所示 ( 其中 F 表示正向引物， R 表示反向引物 )。
表 1 引物序列表
注： 引物序列中大写的字母为引入的酶切位点。
1.2、 PCR 扩增
以人类总 cDNA 为模板， 利用表 1 中各基因引物进行 PCR 扩增， 具体如下 ：
反应体系 (25μl) ： 10×pfxMix 2.5μl， AccuPrime pfx 酶 0.2μl， 上下游引物 (50μM) 各 0.25μl， 模板 0.25μl， ddH2O 21.55μl。
反应条件： 95 ℃ 2min ； 95 ℃ 20sec， 66 ℃ 20sec， 68 ℃ 30sec， 循 环 35 次 ； 68℃ 10min。
1.3、 慢病毒载体的构建
将所得 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 使用天根公司的通用型 DNA 纯化回收试剂 盒 ( 离心柱型 ) 回收各基因片段， 分别利用各自酶切位点双酶切， 用相应的酶双酶切慢病毒 载体 LV-EF1α-EGFP-tetO-cDNA 和 Lenti-EF1α-cDNA-IRES-EGFP， 得到慢病毒载体的骨架 片段， 将慢病毒载体的骨架片段和各基因片段用 T4DNA 连接酶 (Fermentas 公司 ) 于 22℃连 接 3h。
将 连 接 产 物 转 化 GBE180 感 受 态 细 菌 ( 制 备 方 法 见 http://www.chem. uga.edu/scottgrp/GrpProtocols/Competent_cell_preparation.htm)， 在 琼 脂 平 板 上 ( 含 氨 苄 抗 生 素 )， 于 37 ℃ 培 养 12 小 时， 从 平 板 上 挑 取 阳 性 单 菌 落， 使用博大 泰 克 B 型 质 粒 小 量 快 速 提 取 试 剂 盒 提 取 质 粒， 经 测 序 鉴 定 为 正 确 方 可 使 用， 将所得 载 体 分 别 命 名 为 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Oct4、 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Sox2、 L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - c M y c 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - K l f 4 、 L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - L i n 2 8 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - N a n o g 、 L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - h T e r t 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - S V 4 0 T 和 Lenti-EF1α-rtTA-IRES-EGFP。 实施例 2、 细胞培养
2.1、 山羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF) 的培养
取山羊耳朵， 75 ％酒精清洗后剃毛， 浸泡于含双抗 ( 青霉素、 链霉素 ) 的 PBS 中 15min， 再依次使用 PBS， 无血清培养基 (D-MEM) 清洗耳朵数次， 然后将耳朵浸泡于少量含 30％ FBS 的 D-MEM 中， 同时使用无菌剪刀将其剪成小块， 移至培养瓶中， 小块之间保持较小 的距离， 培养瓶倒置。6-8 小时后， 补加含 30％ FBS 的 D-MEM， 正置， 此后每天补加少量该培 养基， 一般 3、 4 天后可明显观察到成纤维细胞， 约一周后传代， 传代时使用 PBS 清洗细胞 2 次， 37℃下 0.25％胰酶消化 5min， 以 10％ FBS 的 D-MEM 终止反应吹打。首次传代按 1 比 1 或 2 传 ( 视细胞量而定 )， 此后每 3 至 4 天传代， 按 1 比 3 或 4 传， 山羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF) 传 10 代以上依然有较好的增殖能力。
2.2、 其它细胞的培养
293T 细胞 ( 购自中科院上海生命科学研究院生化细胞所细胞库 ) 的培养 ： 传代时 37℃下 0.25％胰酶消化 5min， 使用 10％ FBS 的 D-MEM 终止反应， 吹打后按 1 比 8 ～ 10 传 代。
小 鼠 胚 胎 成 纤 维 (MEF) 细 胞 根 据 文 献 (Thomson JA.， Itskovitz-Eldor J.， Shapiro SS.， et al.Science.Nov 61998 ； 282(5391) ： 1145-1147 及 Xu， C.， et al.Nat Biotechnol.2001， 19(10) ： 971-4) 的方法制备， 作为滋养层细胞铺于平板备用。
实施例 3、 病毒包装
3.1、 包装质粒的扩增
将实施例 1 中得到的九种鉴定正确的载体转化感受态细菌以进行扩增， 经 Axygen TM AxyPrep plasmid Maxiprep Kit 试剂盒 (Axygen 公司 ) 中抽后， 在超净工作台中进行纯 化， 即用中抽后质粒的十分之一体积的 3M NaAC 和 2 倍体积的无水乙醇混匀后， 13000rpm 离 心 15min， 去上清， 使用 75％乙醇漂洗， 吸去上清， 于超净工作台中吹干后， 使用无菌去离子 蒸馏水溶解质粒， 最后使用分光光度计及凝胶电泳确定质粒的浓度。
3.2、 转染
按 照 Invitrogen 公 司 转 染 试 剂 盒 (ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems) 的说明书， 使用转染试剂 LipofectamineTM 2000 将步骤 3.1 中的六个慢病毒质粒 分别与包装质粒 ViraPowerTM Packaging Mix(Invitrogen 公司 ) 共同转染 293T 细胞。
具体步骤为 ： 转染实验前一天铺 293T 细胞， 使第二天细胞可生长至 90％满， 对于 TM 一个 T75 瓶， 取 9μg ViraPower Packaging Mix 和 3μg 病毒质粒于 1.5mL opti-MEM 中， 轻轻混匀， 另取已摇匀的 LipofectamineTM 2000 转染试剂 36μl 于另一份 1.5mL opti-MEM 中， 轻轻混匀后， 室温放置 5min， 将上述两份分别含 DNA 和转染试剂的 opti-MEM 轻轻混匀， 室温放置 20min 后将上述混合液至于 293T 细胞 90％满的 T75 培养瓶中。按相同的方法转 染其它五种慢病毒质粒。
3.3、 病毒滴度测定
将步骤 3.2 中转染获得的六种病毒分别在 24h 内更换培养基， 此后收集转染 48h， 72h 和 96h 的病毒上清， 一般无需进行病毒浓缩， 而直接取 5μl 和 1μl 上述六种病毒， 分别 于 24 孔板中悬浮感染 15 万 293T 细胞， 同时加入 polybrene， 由感染 48h 后六种病毒感染的 293T 细胞的 GFP 情况来确定病毒滴度， 可由视野中 GFP 阳性细胞所占比例估算 15 万细胞中 GFP 阳性总细胞数， 继而获知单位体积病毒上清中的病毒颗粒数， 即为相应病毒的滴度。 实施例 4、 病毒感染
将实施例 3 包装的慢病毒， 以 MOI 5 感染 5×104 个山羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF)， 所用病毒的滴度约为 5 ～ 8×106IU/mL，
实验分为 10 组 ：
a) 实验组 1 ： 8 个转录因子的全组合 ；
b) 实验组 2 ： 8 因子 -SV40large T(8 因子去掉 SV40large T) ；
c) 实验组 3 ： 8 因子 -hTert(8 因子去掉 hTert) ；
d) 实验组 4 ： 8 因子 -Oct4(8 因子去掉 Oct4) ；
e) 实验组 5 ： 8 因子 -Sox2(8 因子去掉 Sox2) ；
f) 实验组 6 ： 8 因子 -cMyc(8 因子去掉 cMyc) ；
g) 实验组 7 ： 8 因子 -Klf4(8 因子去掉 Klf4) ；
h) 实验组 8 ： 8 因子 -Lin28(8 因子去掉 Lin28) ；
i) 实验组 9 ： 8 因子 -Nanog(8 因子去掉 Nanog) ；
j) 空白对照组 ： 仅携带有绿色荧光蛋白 (GFP) 的慢病毒 ；
每组实验均有 6 个平行样， 其中 3 个用于碱性磷酸酶 (AP) 染色， 统计阳性克隆数， 另 3 个样用于克隆挑选。
感染 48 小时后， 将上述细胞用 0.25％胰酶， 37℃下消化 5min， 计数后传代转移至 铺好小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 的 6 孔板中， 传代后 24h 内改用加入 10000X DOX 的人胚胎 干细胞 (ES) 培养基， 隔天换液， 待出现克隆后每天换液。
在克隆出现 12 天后， 将上述细胞用 0.25％胰酶， 37℃下消化 5min， 计数后传代转 移至铺好小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 的 6 孔板中， 传代后 24h 内改用人胚胎干细胞 (ES) 培 养基， 持续天天换液， 直至 12 天左右， 形态好的克隆出现。
实施例 5、 转染后阳性细胞的筛选
5.1、 感染细胞的荧光镜检及碱性磷酸酶 (AP) 染色
用荧光显微镜观察实施例 4 感染后的细胞， 发现感染后 48 小时有绿色荧光表达。 感染 7 天后， 仅第 1 组和第 3 组有明显的细胞聚集， 克隆生长代谢很快， 形成很大的团块， 无法挑取克隆。在传代后 12 天， 将克隆用胰酶消化， 传代至新的辐照后的小鼠胚胎成纤维 细胞上。继续培养， 5 到 6 天之后， 圆形致密的克隆开始出现。显微镜观察的结果如图 4 所 示， 其形态主要有两种， 一类是小鼠胚胎干细胞类 (mES-like) 克隆， 其细胞致密， 克隆表面 光滑， 边缘平滑， 边界清晰光亮 ( 见转染山羊 PEF 所得图 4B) ； 另一类克隆中部明显突起， 细 胞相对松散， 边缘不够平滑， 边界相对模糊 ( 图 4A)， 为非 ES-like 克隆。
传代第 12 天对 10 组实验下 6 个平行样中的 3 个进行碱性磷酸酶 (AP) 染色， 统计 阳性克隆数， 结果如图 3 所示， 由图 3 可知， 仅第 1 组和第 3 组的病毒组合产生了 AP 阳性的 4 克隆， 两组的 5×10 个山羊 PEF 传代后分别形成 19±2 个和 2±0.4 个 AP 阳性的 iPS 细胞 集落。
由以上结果可知山羊要比小鼠、 大鼠、 人、 恒河猴、 和猪更难， 需要更多的外源转录 因子参与重编程的过程。SV40 大 T 抗原对于山羊的重编程是必需的， 没有 SV40 大 T 抗原的 参与， 甚至不会产生细胞聚集。 传代对编程完善克隆的释放十分重要， 没有经过传代的细胞 产生不了好的克隆。 5.2、 阳性细胞的筛选
在感染后 26 天随机挑选克隆， 使用 0.25％胰酶 37℃下消化 5min， 吹打为单细胞 后， 用含 10％ SR( 血清替代物 )+10％ FBS 的 D-MEM 的 Knock D-MEM/F12 培养液终止反应， 此 后每天更换该培养基， 此时细胞增殖很快， 每三天可传一代， 每三天按 1 ∶ 5 ～ 10 传代 ( 视 克隆总数而定 ) 至辐照过的滋养层细胞 MEF 上， 此后不断进行克隆挑选和 AP 检测。
山羊 iPS 细胞经多次挑克隆和传代， 其形态逐渐类似于小鼠胚胎干细胞。
实施例 6、 干细胞特性检测
取传至 15 代的小鼠成纤维细胞形成的克隆 8-3、 8-4、 8-7、 8-9 进行以下检测， 以证 明其具备干细胞特性。
6.1、 碱性磷酸酶表达
使用 Chemicon Alkaline Phosphatase Detection Kit(Millipore 公司 ) 进行染 色， 具体步骤如下 ：
使用 PBS 清洗细胞两次， 4％ PFA( 多聚甲醛 ) 室温固定 1-2min， TBST 清洗一遍， AP 染料 ( 按试剂盒中注明的配制 ) 避光染色 15min， TBST 再清洗一遍后使细胞浸泡于 PBS 中。 显微镜检测， 结果如图 5 所示。
由图 5 可以看出， 细胞被染成紫红色， 而紫红色表示细胞具有碱性磷酸酶活性， 从 而说明反复挑克隆后的山羊 iPS 细胞具有很强的碱性磷酸酶活性， 进一步地说形成的山羊 iPS 克隆具有胚胎干细胞特性， 即表达碱性磷酸酶。
6.2、 山羊 iPS 细胞的未分化状态检测
用 realtime PCR 方法检测山羊 iPS 细胞与诱导前细胞山羊 PEF 进行对比， 分析其 未分化基因表达水平。
6.2.1、 引物设计
由于未分化的细胞会特异性表达以下基因， 包括 Oct4、 Sox2、 Nanog、 CDH1、 Dnmt3b、
TDGF、 Dax1、 Rex1、 Sall4， 所以可通过检测这些基因的表达情况得知所获得的山羊 iPS 细胞 的未分化状态。未分化 marker 引物序列设计如表 2 所示， 引物由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成 ( 其中 f 表示正向引物， r 表示反向引物 )。
表 2 未分化 marker 引物序列设计表
基因 Oct4 3’ UTR-f Oct4 3’ UTR-r Sox2 3’ UTR-f Sox2 3’ UTR-r Nanog 3’ UTR-f Nanog 3’ UTR-r CDH1-f CDH1-r Dnmt3b-f Dnmt3b-r TDGF-f TDGF-r Dax1-f Dax1-r Rex1-f Rex1-r Sall4-f Sall4-r GAPDH-f GAPDH-r 引物序列 GGGTTTGTACTAGGGCTTTGGG GCATCATTGAACTTCACCTTCCCT GCACGGCCATTAACGGCACAC CTCCATGCTGTTTCTTGCTGTCCTC TCTGTGTCAGTTTGAGGGACAGG AACAAGTAAAGCCTCCCTATCCCA CACTGCCCCACCCTATGACTCTCT ATACATGTCCGCCAGCTTCTTGAAG TTGGAATAGGAGATCTTGTGTGGGGA AGAACTTGCCATCACCAAACCACTG GATATCTCAGCAAACAAGTTTGCCA GGCAGGTCACTCAGGTTATTGTTGC AGTGCGTGAAGTACATCCAGGGACT CAGGGTGTTAGCGCTGATGAATCTC CACTGTCCTTCGATTACAACCCCAG CCACGTACTTACTGCTGGAGATGGG GGCTAGTTCAGAATCTCCCCTCGG GCGGTAGTGCATCTTGAGTGAGCTC ACGGGAAGCTCACTGGCATGG GCCAGCCCCAGCATCGAAG6.2.2、 PCR 扩增
使 用 Toyobo Syber green PCR Mix， 反 应 体 系 (15μl) ： 模 板 0.3μl， 引物 (5μM)1μl， Syber green Mix 7.5μl， ddH2O 6.2μl， 其中模板为抽提 iPS 细胞的 RNA 反 转得到的 cDNA。
反应条件 ： 94 ℃， 5min ； 94 ℃ 15sec， 66 ℃ 10sec， 72 ℃ 15sec， 循环 40 次 ； 72 ℃， 10min。
将所得 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 结果如图 6 所示， 其中阴性对照的模板为未 进行反转的 RNA。
由图 6 的结果可知， 山羊 iPS 细胞与诱导前的山羊 PEF 相比， 其干细胞相关的 marker， 即 Oct4、 Sox2、 Nanog、 CDH1、 Dnmt3b、 TDGF、 Dax1、 Rex1、 Sall4 均有高水平的表达。
6.2.3、 通过免疫荧光染色检测胚胎干细胞未分化相关 marker 是否表达 ( 包括 SSEA-1 和 Nanog)
使 用 PBS 清 洗 细 胞 两 次， 4 ％ PFA 室 温 固 定 30min， PBS 洗 三 次， 再 用 含 0.2 ％ BSA+0.1 ％ Triton-100 的 PBS 洗 两 次， 接 着 使 用 含 1 ％ BSA+4 ％ normal serum+0.1 ％ Triton-100 的 PBS 封闭细胞 1h， 再将一抗 (SSEA-1 和 Nanog) 稀释在含 0.2 ％ BSA+0.1 ％ Triton-100 的 PBS 中， 然后加到样品上， 室温 2h 或 4℃过夜， 然后用 PBT(0.1％ Triton-100 的 PBS) 洗涤细胞 3-5 次， 将二抗 (anti-mouse IgM 和 anti-rabbit IgG) 稀释在含 0.2％ BSA+0.1 ％ Triton-100 的 PBS 中， 然后加到样品上， 室温 1h， 再用 PBT 洗三次， 将 Hochest 母液以 1 ∶ 1000 用 PBS 稀释， 室温避光放置 5min， 然后 PBS 洗涤两次， 每次 5min， 再用 4％ PFA 室温固定 30min， 最后用 PBS 洗涤两次， 每次 5min。免疫荧光染色结果如图 7 所示。
由图 7 可以看出， 荧光镜检检测到山羊 iPS 细胞表达干细胞相关 marker SSEA-1 和 Rex1， Tra-1-60、 Tra-1-81、 E-Cadherin， 但是为 SSEA-3、 SSEA-4 阴性， 类似于小鼠胚胎肝 细胞， 以上说明山羊 iPS 克隆持续传代后， 仍能自我更新， 维持未分化的状态， 具有胚胎干 细胞能自我更新的特性。
6.3、 山羊 iPS 细胞内外源基因表达水平检测
6.3.1、 引物设计
由于使用人源的基因诱导山羊 PEF 重编程为山羊 iPS 细胞， 因此使用人源的引物 检测外源基因的表达情况， 使用山羊基因检测山羊 iPS 细胞内源基因的表达情况， 引物序 列如表 3 所示， 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成合成 ( 其中 f 表示正向引 物， r 表示反向引物 )。
6.3.2、 PCR 扩增
使 用 Toyobo Syber green PCR Mix 反 应 体 系 (15μl) ： 模 板 0.3μl， 引物 (5μM)1μl， Syber green Mix 7.5μl， ddH2O 6.2μl， 其中模板为抽提 iPS 细胞的 RNA 反 转得到的 cDNA。
反应条件 ： 94 ℃， 5min ； 94 ℃ 15sec， 66 ℃ 10sec， 72 ℃ 15sec， 循 环 40 次 ； 72 ℃， 10min。
根 据 定 量 PCR 原 理， 利 用 绝 对 定 量， 未知样品的量 ( 拷贝数 ) 可以通过从 已 知 量 的 标 准 品 的 范 围 中 推 算 得 出。 为 了 建 立 标 准 曲 线， 需要已知浓度的模板 ( 模 板 即 质 粒 载 体 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Oct4、 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Sox2、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - c M y c 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - K l f 4 、 L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - L i n 2 8 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - N a n o g 、 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-hTert、 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-SV40T)。模板稀释后， 用这些稀 释样品作为标准样品， 将未知的待测样本和标准样本置于同一次实验中进行反应， 用稀释 的样品标准样品构建标准曲线， 通过计算来确定未知样品中目的基因的量。
标准品基因 PCR 的 ct 值与起始量 ( 拷贝数 ) 的对数呈线性关系， 据此可作一条 ct 值对 log( 拷贝数 ) 的曲线， 得到线性相关得方程式， 样本基因的拷贝数可以通过对应的 ct 值利用方程式计算得出， 将结果绘制成图 7。 由图 7 结果可知， 得到的山羊 iPS 细胞， 其内源 的胚胎干细胞全能性相关 marker Oct4， Nanog， Sox2 均得到激活表达， 绝对数量达到人胚胎 肝细胞水平。
表 3 引物序列表
6.4、 干细胞特异启动子去甲基化程度检测
为检测得到的山羊 iPS 细胞的 Nanog 基因的启动子区域是否被去甲基化， 先使用 Bisulphite 处理 DNA， 具体步骤如下 ：
取每份样品 DNA210ng， 双蒸水稀释到 21μl， 每管加入新鲜配置的 2M 的 NaOH 4μl， 50 ℃反应 15min， 向该样品中加入 50 ℃的 50μl 2 ％的低熔点琼脂糖 ( 该琼脂糖预 先置于 100℃ 5min)， 混匀后取 10μl 于预冷的 300μl 液体石蜡中， 冰上至少放置 30min， 使 形 成 的 beads 坚 硬。 然 后 向 beads 中 加 入 500μl 新 配 的 2.5M 焦 亚 硫 酸 钠 (Sodium
metabisulphite) 摇匀， 使 beads 位于分层上， 离心甩一下， 然后 50℃避光反应 4h-12h( 不 超过 16-18h)。接着使用 1ml TE(pH8.0) 洗 3 次， 每次 10min， 0.5ml 0.2M NaOH 洗 2 次， 每 次 15min， 再用 1ml TE， 每次 10min， 然后每管加 100μl TE， 4℃保存。
在山羊目的基因 (Nanog)Promoter 区富含 CpG 区域的上下游设计引物， 将各富 含 CpG 区的 PCR 产物连接至 T 载体上， 转化后抽提质粒酶切鉴定送测序， 其中的 CG 区即为 甲基化位点， 而 TG 区为未甲基化位点， 绘制图谱 (Analysis of DNA methylation using bisulphate sequencing， contributed by Dr.Alexei Gratchev)， 结果见图 8。
由图 8 的结果可见， 诱导前的山羊 PEF 细胞， 其 Nanog 基因的启动子区域被高度甲 基化， 而诱导重编程得到的山羊 iPS 细胞的 Nanog 基因的启动子区域被高度去甲基化， 诱导 后的细胞山羊 PEF 细胞得到有效的重编程。
6.5、 撤 DOX 后外源基因的关闭情况监测
为了检测， 撤 DOX 后外源基因的关闭情况， 我们用实时定量 PCR 的方法检测， 撤去 DOX 2 天、 4 天、 6 天和 8 天的 iPS 细胞外源基因表达。将所得结果进行处理， 如图 9 所示。 由图 9 可见， 4 个山羊 iPS 克隆外源基因在撤去 DOX 后， 表达逐渐下降， 到第 8 天的时候， 基 本为零。证明 tet-on 系统很好的关闭了外源基因的表达。 6.5、 体外拟胚体向三个胚层及滋胚层的分化潜能
为了验证山羊 iPS 细胞的多能性， 使之自然分化形成胚状体 (EB)， 使用实时定量 PCR 的方法， 即在确保看家基因 Gapdh 表达水平基本一致的情况下， 比较各个样品， 其三个 胚层不同标记基因的表达水平间的差异。
将所得 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 结果如图 10 所示。由图 10 的结果可知， 山 羊 iPS 细胞能够表达外胚层 NeuroD、 Fibronectin， 中胚层 Myf5、 Enolse3、 VEGFR2 和内胚层 DCN1、 AFP 的分化基因， 证明山羊 iPS 细胞能够分化形成胚状体中所有三个胚层。
6.6、 体外随机分化能力检测
将自然分化的已培养 8 天的拟胚体传至已铺过明胶的六孔板上， 用 DMEM 培养基培 养， 每天换液， 8 天后孔板中的细胞呈现各种不同的形态， 随后进行免疫荧光染色。
免疫荧光检测结果如图 11 所示到外胚层 Tuj1、 GFAP， 中胚层 a-SMA、 Myotube， 内胚 层 FoxA2 等因子阳性。
6.5 和 6.6 的结果表明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性， 具有体外分化成不 同的组织细胞的潜能。
6.6、 体内畸胎瘤形成的检测
为了验证得到的克隆在体内具有多组织的分化能力， 用畸胎瘤石蜡切片， 苏木 精 - 伊红 (HE) 染色显示三个胚层组织细胞。
6.6.1、 畸胎瘤形成
将 8-4 号 iPS 细胞用 0.25％胰酶消化为单细胞， 将其铺于用于细胞培养的培养皿 中， 置于 37 ℃培养箱静置 45min， 取上层未贴壁的细胞 (feeder 贴壁快， 故可将 feeder 与 iPS 细胞分离 )。计数， 500 万 iPS 细胞悬浮于 300μl 10％ D-MEM 中， 对先天性免疫缺陷小 鼠 NOD-SCID 小鼠进行后腿肌肉注射。第 20 天观察到有瘤形成， 于第 25-30 天将其取出。
6.6.2、 石蜡切片及 HE 染色
畸胎瘤石蜡切片制作步骤 ： 将畸胎瘤用 4 ％ PFA 固定后， PBS 洗三次， 依次使用
30％、 50％、 70％、 80％、 90％、 95％、 100％乙醇脱水 1h， 继续使用 100％乙醇脱水 1h 后， 使用 100％乙醇脱水过夜， 接着用氯仿处理 1h， 处理三次， 之后浸没于石蜡中 2h， 随后包埋， 5μm 切片。
HE 染色步骤 ： 将石蜡切片用二甲苯 (Xylene) 洗四次， 每次 5min( 在脱色摇床上进 行 )， 无水乙醇洗两次， 每次 10min， 95％、 90％、 80％、 70％乙醇依次洗 5min， 再用蒸馏水洗 三次， 每次 5min， 苏木精染色 10min 后流水冲洗 15-30min 至适合的颜色， 接着再用蒸馏水 洗 5min， 伊红 A 液染 1min， 伊红 B 液染 5min， 再用蒸馏水洗， 接着用 70％乙醇涮洗， 90％乙 醇涮洗至适合颜色， 再用无水乙醇洗两次， 每次 10min， 最后用 Xylene 洗四次， 每次 5min 后 封片。
将玻片显微镜镜检， 结果如图 12 所示。由图 12 可以看到， 山羊 iPS 细胞能够在体 内分化形成三个胚层细胞， 包括， 内胚层的腺管结构， 中胚层的平滑肌和脂肪组织以及外胚 层的角化上皮组织。
由以上结果进一步证明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性， 具有在体内分化成 不同的组织细胞的潜能。
综上所述， 本发明山羊成体细胞重编程为类似胚胎干细胞的可诱导多能干细胞， 使用山羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF)， 已获得数株山羊 iPS 细胞， 并由碱性磷酸酶表达、 干 细胞表面特异标记 (SSEA-1， Rex1)， 干细胞特异启动子去甲基化程度、 端粒酶活性、 拟胚体 向三个胚层分化的潜能、 体外随机分化为三胚层细胞的潜能以及畸胎瘤形成， 确认其干细 胞特性。
本发明有助于确立山羊 ES 细胞建系的最适培养条件和方法 ； 山羊 iPS 细胞是山羊 基因打靶的良好载体， 山羊 iPS 细胞将利于揭示山羊各基因功能和复杂的发育事件 ； 此外， 本发明的山羊 iPS 是继猪的 iPS 成功诱导后第一项其它大型偶蹄目哺乳动物的 iPS， 这对于 其它大型动物 iPS 的诱导有着重大指导意义。14CN 102653774 A
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根据本发明的山羊可诱导多能干细胞的制备方法， 包括步骤 ：
A) 构建 tet-on 可诱导慢病毒载体系统， 所述转录因子选自 ： Oct4、 Sox2、 c-Myc、 Klf4、 Lin28、 Nanog、 SV40large T、 hTert ；
B) 采用步骤 A) 所得慢病毒载体将所述转录因子以组合形式感染山羊成体细胞， 挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养， 通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆， 得 到山羊 iPS 细胞。
根据本发明所述的方法， 所述山羊成体细胞为山羊原代耳尖成纤维细胞。
根据本发明所述的方法， 所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括 ： Oct4、 Sox2、 c-Myc、 Klf4、 Lin28、 Nanog、 SV40 largeT、 hTert。
根据本发明所述的方法， 所述步骤 B) 克隆的产生是在感染第 12 天消化为单细胞 按 1 ∶ 3 的比例传代至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上， 继续培养 14 天， 挑取克隆。
根据本发明所述的方法， 所述步骤 B) 的传代培养是将山羊 iPS 克隆按 1 ∶ 5 ～ 10 的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。
根据本发明所述的方法， 所述步骤 B) 的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细 胞。
C) 山羊 iPS 细胞的干细胞多能性鉴定
根据本发明所述的方法， 所述步骤 C) 山羊 iPS 细胞的多能性鉴定包括 ： 实时定 量 PCR 对山羊 iPSC 细胞系内源多能性基因的检测， 如 Oct4、 Sox2、 nanog 被诱导表达， 此外 CDH1、 Dnmt3b、 TDGF、 Dax1、 Rex1、 Sall4 等干细胞 marker 均被诱导表达 ；
指标为 ：
1) 碱性磷酸酶表达呈阳性 ；
2) 干 细 胞 表 面 特 异 标 记 SSEA-1(+)、 Rex1(+)、 SSEA-3(-)、 SSEA-4(-)、 Tra-1-60(+)、 Tra-1-81(+)、 E-Cadherin(+) ；
3)Nanog 基因的启动子区域被去甲基化 ；
4) 撤 DOX 后， 山羊外源基因的表达检测， 表明外源基因被有效关闭 ；
5) 自然分化形成胚状体后， 外胚层 NeuroD(+)、 Fibronectin(+)， 中胚层 Myf5(+)、 Enolse3(+)、 VEGFR2(+) 和内胚层 DCN1(+)、 AFP(+) ；
6) 体外随机分化， 免疫荧光检测到外胚层 Tuj1(+)、 GFAP(+)， 中胚层 a-SMA(+)、 Myotube(+)， 内胚层 FoxA2(+) ；
7) 山羊 iPS 细胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。
根据本发明所述的方法， 所述畸胎瘤具有外胚层、 中胚层和内胚层。
本发明有助于确立山羊 ES 细胞建系的最适培养条件和方法 ； 山羊 iPS 细胞是山羊 基因打靶的良好载体， 本发明的山羊 iPS 细胞将利于揭示山羊各基因功能和复杂的发育事 件； 此外， 山羊 iPS 是猪的 iPS 成功诱导后第一项其它大型偶蹄目物种的 iPS， 这对于其它 动物 iPS 的诱导有着重大指导意义。 附图说明
图 1 是病毒载体 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-cDNA 和 Lenti-EF1α-rtTA-IRES-EGFP结构图。 图 2 是山羊 iPS 细胞获得的实验流程图。
图 3 是不同转录因子组合情况下， 山羊 PEF 被诱导所产生的克隆数与碱性磷酸酶 检测阳性克隆数统计结果图。
图 4 是山羊 iPS 细胞形态荧光镜检结果图， 其中 A ： 山羊未完全重编程克隆形态 B ： 低倍镜下山羊的 ES-like 克隆 C ： ES-like 克隆形态 D ： 高倍镜下的山羊 iPS 细胞。
图 5 是山羊 iPS 细胞表面及多能型 marker 检测图， 其中 A ： 碱性磷酸酶、 B： SSEA-1、 C： SSEA-3、 D： SSEA-4、 E： Rex1、 F： Tra-1-60、 G： Tra-1-81、 H： E-Cadherin。
图 6 是 Realtime PCR 检测山羊 iPS 细胞多能性 Marker 表达情况电泳图， 从左到 右依次为 ： 山羊耳尖成纤维细胞， 山羊 iPS 细胞 8-3， 山羊 iPS 细胞 8-4， 山羊 iPS 细胞 8-7， 山羊 iPS 细胞 8-9， 阴性对照。其中， 山羊 iPS 细胞 8-3 为 8 个病毒因子诱导出的山羊可诱 导多能干细胞 3 号克隆， 其余同理。
图 7 是绝对定量检测山羊 iPS 细胞基因表达情况电泳图， 从左到右依次为 ： 山羊耳 尖成纤维细胞， 人胚胎干细胞， 山羊 iPS 细胞 8-3， 山羊 iPS 细胞 8-4， 山羊 iPS 细胞 8-7， 山 羊 iPS 细胞 8-9。
图 8 是 Nanog 启动子区去甲基化检测结果图， 分别为 ： 山羊耳尖成纤维细胞， 山羊 iPS 细胞 8-3， 山羊 iPS 细胞 8-4， 山羊 iPS 细胞 8-7， 山羊 iPS 细胞 8-9。
图 9 撤 DOX 后， 山羊外源基因的表达检测结果图， 分别为山羊 iPS 及撤 DOX 2 天、 4 天、 6 天、 8 天的外源基因表达检测。
图 10 是 Realtime PCR 检测山羊 iPS 细胞在体外向三个胚层的分化能力图， 从左 到右泳道依次是 ： 山羊 iPS 细胞 8-3， 山羊 iPS 细胞 8-4， 山羊 iPS 细胞 8-7， 山羊 iPS 细胞 8-9， 山羊 iPS 细胞 8-3 的 EB， 山羊 iPS 细胞 8-4 的 EB， 山羊 iPS 细胞 8-7 的 EB， 山羊 iPS 细 胞 8-9 的 EB 和阴性对照。
图 11 是山羊 iPS 细胞体外随机分化情况的免疫染色图。
图 12 是山羊 iPS 细胞畸胎瘤免疫组化图， 其中 A ： 角化上皮 ( 外胚层 )B ： 平滑肌 ( 中胚层 )C ： 脂肪组织 ( 中胚层 )D 腺管 ( 内胚层 )。
具体实施方式
以下结合具体实施例， 对本发明作进一步说明。 应理解， 以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
以下实施例中， 用到的培养基有 ：
山羊原代耳尖成纤维细胞的培养基， 具体组成为 ： 90 ％的 D-MEM 培养液 ( 购自 Invitrogen， 12571) ； 10％的胎牛血清 ( 购自 HyClone， SH30396.03)。
山羊 iPS 细胞的培养基， 具体组成为 ： 79％的 Knockout D-MEM/F12 培养液 ( 购自 Invitrogen， 12660) ； 20％的 Knockout SR( 购自 Invitrogen， 10828) ； 1mM L- 谷氨酸 ( 购自 Invitrogen， 25030) ； 1％的非必须氨基酸 ( 购自 Invitrogen， 11140050) ； 0.1mMβ- 巯基乙 醇 ( 购自 Sigma， M7522)。
以 下 实 施 例 中 所 使 用 的 原 始 慢 病 毒 载 体 Lenti-EFlα-IRES-EGFP 购 自 Invitrogen 公司， 具有氨苄抗性。以下实施例中， 通用的细胞培养产品均购自 Invitrogen 公司。
实施例 1、 慢病毒载体的构建
1.1、 从 NCBI 网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 查询干细胞中特异表达或高 表达的特定基因 (Oct4， Sox2， c-Myc， Klf4， Lin28， Nanog， hTert， SV40largeT antigen 和 rtTA) 的编码区， 根据编码区序列设计引物， 并引入酶切位点， 引物序列如表 1 所示 ( 其中 F 表示正向引物， R 表示反向引物 )。
表 1 引物序列表
注： 引物序列中大写的字母为引入的酶切位点。
1.2、 PCR 扩增
以人类总 cDNA 为模板， 利用表 1 中各基因引物进行 PCR 扩增， 具体如下 ：
反应体系 (25μl) ： 10×pfxMix 2.5μl， AccuPrime pfx 酶 0.2μl， 上下游引物 (50μM) 各 0.25μl， 模板 0.25μl， ddH2O 21.55μl。
反应条件： 95 ℃ 2min ； 95 ℃ 20sec， 66 ℃ 20sec， 68 ℃ 30sec， 循 环 35 次 ； 68℃ 10min。
1.3、 慢病毒载体的构建
将所得 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 使用天根公司的通用型 DNA 纯化回收试剂 盒 ( 离心柱型 ) 回收各基因片段， 分别利用各自酶切位点双酶切， 用相应的酶双酶切慢病毒 载体 LV-EF1α-EGFP-tetO-cDNA 和 Lenti-EF1α-cDNA-IRES-EGFP， 得到慢病毒载体的骨架 片段， 将慢病毒载体的骨架片段和各基因片段用 T4DNA 连接酶 (Fermentas 公司 ) 于 22℃连 接 3h。
将 连 接 产 物 转 化 GBE180 感 受 态 细 菌 ( 制 备 方 法 见 http://www.chem. uga.edu/scottgrp/GrpProtocols/Competent_cell_preparation.htm)， 在 琼 脂 平 板 上 ( 含 氨 苄 抗 生 素 )， 于 37 ℃ 培 养 12 小 时， 从 平 板 上 挑 取 阳 性 单 菌 落， 使用博大 泰 克 B 型 质 粒 小 量 快 速 提 取 试 剂 盒 提 取 质 粒， 经 测 序 鉴 定 为 正 确 方 可 使 用， 将所得 载 体 分 别 命 名 为 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Oct4、 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Sox2、 L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - c M y c 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - K l f 4 、 L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - L i n 2 8 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - N a n o g 、 L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - h T e r t 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - S V 4 0 T 和 Lenti-EF1α-rtTA-IRES-EGFP。 实施例 2、 细胞培养
2.1、 山羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF) 的培养
取山羊耳朵， 75 ％酒精清洗后剃毛， 浸泡于含双抗 ( 青霉素、 链霉素 ) 的 PBS 中 15min， 再依次使用 PBS， 无血清培养基 (D-MEM) 清洗耳朵数次， 然后将耳朵浸泡于少量含 30％ FBS 的 D-MEM 中， 同时使用无菌剪刀将其剪成小块， 移至培养瓶中， 小块之间保持较小 的距离， 培养瓶倒置。6-8 小时后， 补加含 30％ FBS 的 D-MEM， 正置， 此后每天补加少量该培 养基， 一般 3、 4 天后可明显观察到成纤维细胞， 约一周后传代， 传代时使用 PBS 清洗细胞 2 次， 37℃下 0.25％胰酶消化 5min， 以 10％ FBS 的 D-MEM 终止反应吹打。首次传代按 1 比 1 或 2 传 ( 视细胞量而定 )， 此后每 3 至 4 天传代， 按 1 比 3 或 4 传， 山羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF) 传 10 代以上依然有较好的增殖能力。
2.2、 其它细胞的培养
293T 细胞 ( 购自中科院上海生命科学研究院生化细胞所细胞库 ) 的培养 ： 传代时 37℃下 0.25％胰酶消化 5min， 使用 10％ FBS 的 D-MEM 终止反应， 吹打后按 1 比 8 ～ 10 传 代。
小 鼠 胚 胎 成 纤 维 (MEF) 细 胞 根 据 文 献 (Thomson JA.， Itskovitz-Eldor J.， Shapiro SS.， et al.Science.Nov 61998 ； 282(5391) ： 1145-1147 及 Xu， C.， et al.Nat Biotechnol.2001， 19(10) ： 971-4) 的方法制备， 作为滋养层细胞铺于平板备用。
实施例 3、 病毒包装
3.1、 包装质粒的扩增
将实施例 1 中得到的九种鉴定正确的载体转化感受态细菌以进行扩增， 经 Axygen TM AxyPrep plasmid Maxiprep Kit 试剂盒 (Axygen 公司 ) 中抽后， 在超净工作台中进行纯 化， 即用中抽后质粒的十分之一体积的 3M NaAC 和 2 倍体积的无水乙醇混匀后， 13000rpm 离 心 15min， 去上清， 使用 75％乙醇漂洗， 吸去上清， 于超净工作台中吹干后， 使用无菌去离子 蒸馏水溶解质粒， 最后使用分光光度计及凝胶电泳确定质粒的浓度。
3.2、 转染
按 照 Invitrogen 公 司 转 染 试 剂 盒 (ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems) 的说明书， 使用转染试剂 LipofectamineTM 2000 将步骤 3.1 中的六个慢病毒质粒 分别与包装质粒 ViraPowerTM Packaging Mix(Invitrogen 公司 ) 共同转染 293T 细胞。
具体步骤为 ： 转染实验前一天铺 293T 细胞， 使第二天细胞可生长至 90％满， 对于 TM 一个 T75 瓶， 取 9μg ViraPower Packaging Mix 和 3μg 病毒质粒于 1.5mL opti-MEM 中， 轻轻混匀， 另取已摇匀的 LipofectamineTM 2000 转染试剂 36μl 于另一份 1.5mL opti-MEM 中， 轻轻混匀后， 室温放置 5min， 将上述两份分别含 DNA 和转染试剂的 opti-MEM 轻轻混匀， 室温放置 20min 后将上述混合液至于 293T 细胞 90％满的 T75 培养瓶中。按相同的方法转 染其它五种慢病毒质粒。
3.3、 病毒滴度测定
将步骤 3.2 中转染获得的六种病毒分别在 24h 内更换培养基， 此后收集转染 48h， 72h 和 96h 的病毒上清， 一般无需进行病毒浓缩， 而直接取 5μl 和 1μl 上述六种病毒， 分别 于 24 孔板中悬浮感染 15 万 293T 细胞， 同时加入 polybrene， 由感染 48h 后六种病毒感染的 293T 细胞的 GFP 情况来确定病毒滴度， 可由视野中 GFP 阳性细胞所占比例估算 15 万细胞中 GFP 阳性总细胞数， 继而获知单位体积病毒上清中的病毒颗粒数， 即为相应病毒的滴度。 实施例 4、 病毒感染
将实施例 3 包装的慢病毒， 以 MOI 5 感染 5×104 个山羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF)， 所用病毒的滴度约为 5 ～ 8×106IU/mL，
实验分为 10 组 ：
a) 实验组 1 ： 8 个转录因子的全组合 ；
b) 实验组 2 ： 8 因子 -SV40large T(8 因子去掉 SV40large T) ；
c) 实验组 3 ： 8 因子 -hTert(8 因子去掉 hTert) ；
d) 实验组 4 ： 8 因子 -Oct4(8 因子去掉 Oct4) ；
e) 实验组 5 ： 8 因子 -Sox2(8 因子去掉 Sox2) ；
f) 实验组 6 ： 8 因子 -cMyc(8 因子去掉 cMyc) ；
g) 实验组 7 ： 8 因子 -Klf4(8 因子去掉 Klf4) ；
h) 实验组 8 ： 8 因子 -Lin28(8 因子去掉 Lin28) ；
i) 实验组 9 ： 8 因子 -Nanog(8 因子去掉 Nanog) ；
j) 空白对照组 ： 仅携带有绿色荧光蛋白 (GFP) 的慢病毒 ；
每组实验均有 6 个平行样， 其中 3 个用于碱性磷酸酶 (AP) 染色， 统计阳性克隆数， 另 3 个样用于克隆挑选。
感染 48 小时后， 将上述细胞用 0.25％胰酶， 37℃下消化 5min， 计数后传代转移至 铺好小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 的 6 孔板中， 传代后 24h 内改用加入 10000X DOX 的人胚胎 干细胞 (ES) 培养基， 隔天换液， 待出现克隆后每天换液。
在克隆出现 12 天后， 将上述细胞用 0.25％胰酶， 37℃下消化 5min， 计数后传代转 移至铺好小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 的 6 孔板中， 传代后 24h 内改用人胚胎干细胞 (ES) 培 养基， 持续天天换液， 直至 12 天左右， 形态好的克隆出现。
实施例 5、 转染后阳性细胞的筛选
5.1、 感染细胞的荧光镜检及碱性磷酸酶 (AP) 染色
用荧光显微镜观察实施例 4 感染后的细胞， 发现感染后 48 小时有绿色荧光表达。 感染 7 天后， 仅第 1 组和第 3 组有明显的细胞聚集， 克隆生长代谢很快， 形成很大的团块， 无法挑取克隆。在传代后 12 天， 将克隆用胰酶消化， 传代至新的辐照后的小鼠胚胎成纤维 细胞上。继续培养， 5 到 6 天之后， 圆形致密的克隆开始出现。显微镜观察的结果如图 4 所 示， 其形态主要有两种， 一类是小鼠胚胎干细胞类 (mES-like) 克隆， 其细胞致密， 克隆表面 光滑， 边缘平滑， 边界清晰光亮 ( 见转染山羊 PEF 所得图 4B) ； 另一类克隆中部明显突起， 细 胞相对松散， 边缘不够平滑， 边界相对模糊 ( 图 4A)， 为非 ES-like 克隆。
传代第 12 天对 10 组实验下 6 个平行样中的 3 个进行碱性磷酸酶 (AP) 染色， 统计 阳性克隆数， 结果如图 3 所示， 由图 3 可知， 仅第 1 组和第 3 组的病毒组合产生了 AP 阳性的 4 克隆， 两组的 5×10 个山羊 PEF 传代后分别形成 19±2 个和 2±0.4 个 AP 阳性的 iPS 细胞 集落。
由以上结果可知山羊要比小鼠、 大鼠、 人、 恒河猴、 和猪更难， 需要更多的外源转录 因子参与重编程的过程。SV40 大 T 抗原对于山羊的重编程是必需的， 没有 SV40 大 T 抗原的 参与， 甚至不会产生细胞聚集。 传代对编程完善克隆的释放十分重要， 没有经过传代的细胞 产生不了好的克隆。 5.2、 阳性细胞的筛选
在感染后 26 天随机挑选克隆， 使用 0.25％胰酶 37℃下消化 5min， 吹打为单细胞 后， 用含 10％ SR( 血清替代物 )+10％ FBS 的 D-MEM 的 Knock D-MEM/F12 培养液终止反应， 此 后每天更换该培养基， 此时细胞增殖很快， 每三天可传一代， 每三天按 1 ∶ 5 ～ 10 传代 ( 视 克隆总数而定 ) 至辐照过的滋养层细胞 MEF 上， 此后不断进行克隆挑选和 AP 检测。
山羊 iPS 细胞经多次挑克隆和传代， 其形态逐渐类似于小鼠胚胎干细胞。
实施例 6、 干细胞特性检测
取传至 15 代的小鼠成纤维细胞形成的克隆 8-3、 8-4、 8-7、 8-9 进行以下检测， 以证 明其具备干细胞特性。
6.1、 碱性磷酸酶表达
使用 Chemicon Alkaline Phosphatase Detection Kit(Millipore 公司 ) 进行染 色， 具体步骤如下 ：
使用 PBS 清洗细胞两次， 4％ PFA( 多聚甲醛 ) 室温固定 1-2min， TBST 清洗一遍， AP 染料 ( 按试剂盒中注明的配制 ) 避光染色 15min， TBST 再清洗一遍后使细胞浸泡于 PBS 中。 显微镜检测， 结果如图 5 所示。
由图 5 可以看出， 细胞被染成紫红色， 而紫红色表示细胞具有碱性磷酸酶活性， 从 而说明反复挑克隆后的山羊 iPS 细胞具有很强的碱性磷酸酶活性， 进一步地说形成的山羊 iPS 克隆具有胚胎干细胞特性， 即表达碱性磷酸酶。
6.2、 山羊 iPS 细胞的未分化状态检测
用 realtime PCR 方法检测山羊 iPS 细胞与诱导前细胞山羊 PEF 进行对比， 分析其 未分化基因表达水平。
6.2.1、 引物设计
由于未分化的细胞会特异性表达以下基因， 包括 Oct4、 Sox2、 Nanog、 CDH1、 Dnmt3b、
TDGF、 Dax1、 Rex1、 Sall4， 所以可通过检测这些基因的表达情况得知所获得的山羊 iPS 细胞 的未分化状态。未分化 marker 引物序列设计如表 2 所示， 引物由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成 ( 其中 f 表示正向引物， r 表示反向引物 )。
表 2 未分化 marker 引物序列设计表
基因 Oct4 3’ UTR-f Oct4 3’ UTR-r Sox2 3’ UTR-f Sox2 3’ UTR-r Nanog 3’ UTR-f Nanog 3’ UTR-r CDH1-f CDH1-r Dnmt3b-f Dnmt3b-r TDGF-f TDGF-r Dax1-f Dax1-r Rex1-f Rex1-r Sall4-f Sall4-r GAPDH-f GAPDH-r 引物序列 GGGTTTGTACTAGGGCTTTGGG GCATCATTGAACTTCACCTTCCCT GCACGGCCATTAACGGCACAC CTCCATGCTGTTTCTTGCTGTCCTC TCTGTGTCAGTTTGAGGGACAGG AACAAGTAAAGCCTCCCTATCCCA CACTGCCCCACCCTATGACTCTCT ATACATGTCCGCCAGCTTCTTGAAG TTGGAATAGGAGATCTTGTGTGGGGA AGAACTTGCCATCACCAAACCACTG GATATCTCAGCAAACAAGTTTGCCA GGCAGGTCACTCAGGTTATTGTTGC AGTGCGTGAAGTACATCCAGGGACT CAGGGTGTTAGCGCTGATGAATCTC CACTGTCCTTCGATTACAACCCCAG CCACGTACTTACTGCTGGAGATGGG GGCTAGTTCAGAATCTCCCCTCGG GCGGTAGTGCATCTTGAGTGAGCTC ACGGGAAGCTCACTGGCATGG GCCAGCCCCAGCATCGAAG6.2.2、 PCR 扩增
使 用 Toyobo Syber green PCR Mix， 反 应 体 系 (15μl) ： 模 板 0.3μl， 引物 (5μM)1μl， Syber green Mix 7.5μl， ddH2O 6.2μl， 其中模板为抽提 iPS 细胞的 RNA 反 转得到的 cDNA。
反应条件 ： 94 ℃， 5min ； 94 ℃ 15sec， 66 ℃ 10sec， 72 ℃ 15sec， 循环 40 次 ； 72 ℃， 10min。
将所得 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 结果如图 6 所示， 其中阴性对照的模板为未 进行反转的 RNA。
由图 6 的结果可知， 山羊 iPS 细胞与诱导前的山羊 PEF 相比， 其干细胞相关的 marker， 即 Oct4、 Sox2、 Nanog、 CDH1、 Dnmt3b、 TDGF、 Dax1、 Rex1、 Sall4 均有高水平的表达。
6.2.3、 通过免疫荧光染色检测胚胎干细胞未分化相关 marker 是否表达 ( 包括 SSEA-1 和 Nanog)
使 用 PBS 清 洗 细 胞 两 次， 4 ％ PFA 室 温 固 定 30min， PBS 洗 三 次， 再 用 含 0.2 ％ BSA+0.1 ％ Triton-100 的 PBS 洗 两 次， 接 着 使 用 含 1 ％ BSA+4 ％ normal serum+0.1 ％ Triton-100 的 PBS 封闭细胞 1h， 再将一抗 (SSEA-1 和 Nanog) 稀释在含 0.2 ％ BSA+0.1 ％ Triton-100 的 PBS 中， 然后加到样品上， 室温 2h 或 4℃过夜， 然后用 PBT(0.1％ Triton-100 的 PBS) 洗涤细胞 3-5 次， 将二抗 (anti-mouse IgM 和 anti-rabbit IgG) 稀释在含 0.2％ BSA+0.1 ％ Triton-100 的 PBS 中， 然后加到样品上， 室温 1h， 再用 PBT 洗三次， 将 Hochest 母液以 1 ∶ 1000 用 PBS 稀释， 室温避光放置 5min， 然后 PBS 洗涤两次， 每次 5min， 再用 4％ PFA 室温固定 30min， 最后用 PBS 洗涤两次， 每次 5min。免疫荧光染色结果如图 7 所示。
由图 7 可以看出， 荧光镜检检测到山羊 iPS 细胞表达干细胞相关 marker SSEA-1 和 Rex1， Tra-1-60、 Tra-1-81、 E-Cadherin， 但是为 SSEA-3、 SSEA-4 阴性， 类似于小鼠胚胎肝 细胞， 以上说明山羊 iPS 克隆持续传代后， 仍能自我更新， 维持未分化的状态， 具有胚胎干 细胞能自我更新的特性。
6.3、 山羊 iPS 细胞内外源基因表达水平检测
6.3.1、 引物设计
由于使用人源的基因诱导山羊 PEF 重编程为山羊 iPS 细胞， 因此使用人源的引物 检测外源基因的表达情况， 使用山羊基因检测山羊 iPS 细胞内源基因的表达情况， 引物序 列如表 3 所示， 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成合成 ( 其中 f 表示正向引 物， r 表示反向引物 )。
6.3.2、 PCR 扩增
使 用 Toyobo Syber green PCR Mix 反 应 体 系 (15μl) ： 模 板 0.3μl， 引物 (5μM)1μl， Syber green Mix 7.5μl， ddH2O 6.2μl， 其中模板为抽提 iPS 细胞的 RNA 反 转得到的 cDNA。
反应条件 ： 94 ℃， 5min ； 94 ℃ 15sec， 66 ℃ 10sec， 72 ℃ 15sec， 循 环 40 次 ； 72 ℃， 10min。
根 据 定 量 PCR 原 理， 利 用 绝 对 定 量， 未知样品的量 ( 拷贝数 ) 可以通过从 已 知 量 的 标 准 品 的 范 围 中 推 算 得 出。 为 了 建 立 标 准 曲 线， 需要已知浓度的模板 ( 模 板 即 质 粒 载 体 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Oct4、 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-Sox2、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - c M y c 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - K l f 4 、 L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - L i n 2 8 、L e n t i - E F 1 α - E G F P - t e t O - N a n o g 、 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-hTert、 Lenti-EF1α-EGFP-tetO-SV40T)。模板稀释后， 用这些稀 释样品作为标准样品， 将未知的待测样本和标准样本置于同一次实验中进行反应， 用稀释 的样品标准样品构建标准曲线， 通过计算来确定未知样品中目的基因的量。
标准品基因 PCR 的 ct 值与起始量 ( 拷贝数 ) 的对数呈线性关系， 据此可作一条 ct 值对 log( 拷贝数 ) 的曲线， 得到线性相关得方程式， 样本基因的拷贝数可以通过对应的 ct 值利用方程式计算得出， 将结果绘制成图 7。 由图 7 结果可知， 得到的山羊 iPS 细胞， 其内源 的胚胎干细胞全能性相关 marker Oct4， Nanog， Sox2 均得到激活表达， 绝对数量达到人胚胎 肝细胞水平。
表 3 引物序列表
6.4、 干细胞特异启动子去甲基化程度检测
为检测得到的山羊 iPS 细胞的 Nanog 基因的启动子区域是否被去甲基化， 先使用 Bisulphite 处理 DNA， 具体步骤如下 ：
取每份样品 DNA210ng， 双蒸水稀释到 21μl， 每管加入新鲜配置的 2M 的 NaOH 4μl， 50 ℃反应 15min， 向该样品中加入 50 ℃的 50μl 2 ％的低熔点琼脂糖 ( 该琼脂糖预 先置于 100℃ 5min)， 混匀后取 10μl 于预冷的 300μl 液体石蜡中， 冰上至少放置 30min， 使 形 成 的 beads 坚 硬。 然 后 向 beads 中 加 入 500μl 新 配 的 2.5M 焦 亚 硫 酸 钠 (Sodium
metabisulphite) 摇匀， 使 beads 位于分层上， 离心甩一下， 然后 50℃避光反应 4h-12h( 不 超过 16-18h)。接着使用 1ml TE(pH8.0) 洗 3 次， 每次 10min， 0.5ml 0.2M NaOH 洗 2 次， 每 次 15min， 再用 1ml TE， 每次 10min， 然后每管加 100μl TE， 4℃保存。
在山羊目的基因 (Nanog)Promoter 区富含 CpG 区域的上下游设计引物， 将各富 含 CpG 区的 PCR 产物连接至 T 载体上， 转化后抽提质粒酶切鉴定送测序， 其中的 CG 区即为 甲基化位点， 而 TG 区为未甲基化位点， 绘制图谱 (Analysis of DNA methylation using bisulphate sequencing， contributed by Dr.Alexei Gratchev)， 结果见图 8。
由图 8 的结果可见， 诱导前的山羊 PEF 细胞， 其 Nanog 基因的启动子区域被高度甲 基化， 而诱导重编程得到的山羊 iPS 细胞的 Nanog 基因的启动子区域被高度去甲基化， 诱导 后的细胞山羊 PEF 细胞得到有效的重编程。
6.5、 撤 DOX 后外源基因的关闭情况监测
为了检测， 撤 DOX 后外源基因的关闭情况， 我们用实时定量 PCR 的方法检测， 撤去 DOX 2 天、 4 天、 6 天和 8 天的 iPS 细胞外源基因表达。将所得结果进行处理， 如图 9 所示。 由图 9 可见， 4 个山羊 iPS 克隆外源基因在撤去 DOX 后， 表达逐渐下降， 到第 8 天的时候， 基 本为零。证明 tet-on 系统很好的关闭了外源基因的表达。 6.5、 体外拟胚体向三个胚层及滋胚层的分化潜能
为了验证山羊 iPS 细胞的多能性， 使之自然分化形成胚状体 (EB)， 使用实时定量 PCR 的方法， 即在确保看家基因 Gapdh 表达水平基本一致的情况下， 比较各个样品， 其三个 胚层不同标记基因的表达水平间的差异。
将所得 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 结果如图 10 所示。由图 10 的结果可知， 山 羊 iPS 细胞能够表达外胚层 NeuroD、 Fibronectin， 中胚层 Myf5、 Enolse3、 VEGFR2 和内胚层 DCN1、 AFP 的分化基因， 证明山羊 iPS 细胞能够分化形成胚状体中所有三个胚层。
6.6、 体外随机分化能力检测
将自然分化的已培养 8 天的拟胚体传至已铺过明胶的六孔板上， 用 DMEM 培养基培 养， 每天换液， 8 天后孔板中的细胞呈现各种不同的形态， 随后进行免疫荧光染色。
免疫荧光检测结果如图 11 所示到外胚层 Tuj1、 GFAP， 中胚层 a-SMA、 Myotube， 内胚 层 FoxA2 等因子阳性。
6.5 和 6.6 的结果表明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性， 具有体外分化成不 同的组织细胞的潜能。
6.6、 体内畸胎瘤形成的检测
为了验证得到的克隆在体内具有多组织的分化能力， 用畸胎瘤石蜡切片， 苏木 精 - 伊红 (HE) 染色显示三个胚层组织细胞。
6.6.1、 畸胎瘤形成
将 8-4 号 iPS 细胞用 0.25％胰酶消化为单细胞， 将其铺于用于细胞培养的培养皿 中， 置于 37 ℃培养箱静置 45min， 取上层未贴壁的细胞 (feeder 贴壁快， 故可将 feeder 与 iPS 细胞分离 )。计数， 500 万 iPS 细胞悬浮于 300μl 10％ D-MEM 中， 对先天性免疫缺陷小 鼠 NOD-SCID 小鼠进行后腿肌肉注射。第 20 天观察到有瘤形成， 于第 25-30 天将其取出。
6.6.2、 石蜡切片及 HE 染色
畸胎瘤石蜡切片制作步骤 ： 将畸胎瘤用 4 ％ PFA 固定后， PBS 洗三次， 依次使用
30％、 50％、 70％、 80％、 90％、 95％、 100％乙醇脱水 1h， 继续使用 100％乙醇脱水 1h 后， 使用 100％乙醇脱水过夜， 接着用氯仿处理 1h， 处理三次， 之后浸没于石蜡中 2h， 随后包埋， 5μm 切片。
HE 染色步骤 ： 将石蜡切片用二甲苯 (Xylene) 洗四次， 每次 5min( 在脱色摇床上进 行 )， 无水乙醇洗两次， 每次 10min， 95％、 90％、 80％、 70％乙醇依次洗 5min， 再用蒸馏水洗 三次， 每次 5min， 苏木精染色 10min 后流水冲洗 15-30min 至适合的颜色， 接着再用蒸馏水 洗 5min， 伊红 A 液染 1min， 伊红 B 液染 5min， 再用蒸馏水洗， 接着用 70％乙醇涮洗， 90％乙 醇涮洗至适合颜色， 再用无水乙醇洗两次， 每次 10min， 最后用 Xylene 洗四次， 每次 5min 后 封片。
将玻片显微镜镜检， 结果如图 12 所示。由图 12 可以看到， 山羊 iPS 细胞能够在体 内分化形成三个胚层细胞， 包括， 内胚层的腺管结构， 中胚层的平滑肌和脂肪组织以及外胚 层的角化上皮组织。
由以上结果进一步证明形成的克隆多具有胚胎干细胞的特性， 具有在体内分化成 不同的组织细胞的潜能。
综上所述， 本发明山羊成体细胞重编程为类似胚胎干细胞的可诱导多能干细胞， 使用山羊原代耳尖成纤维细胞 (PEF)， 已获得数株山羊 iPS 细胞， 并由碱性磷酸酶表达、 干 细胞表面特异标记 (SSEA-1， Rex1)， 干细胞特异启动子去甲基化程度、 端粒酶活性、 拟胚体 向三个胚层分化的潜能、 体外随机分化为三胚层细胞的潜能以及畸胎瘤形成， 确认其干细 胞特性。
本发明有助于确立山羊 ES 细胞建系的最适培养条件和方法 ； 山羊 iPS 细胞是山羊 基因打靶的良好载体， 山羊 iPS 细胞将利于揭示山羊各基因功能和复杂的发育事件 ； 此外， 本发明的山羊 iPS 是继猪的 iPS 成功诱导后第一项其它大型偶蹄目哺乳动物的 iPS， 这对于 其它大型动物 iPS 的诱导有着重大指导意义。14CN 102653774 A
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