一种大丽轮枝菌基因敲除的方法 【技术领域】
本发明涉及一种大丽轮枝菌基因敲除的方法。背景技术 我国是农业大国， 作为仅次于粮食的第二大农作物的棉花是关系国计民生的战略 物资， 也是涉及农业和纺织工业两大产业的商品， 是全国 1 亿多棉农收入的主要来源， 是纺 织工业的主要原料， 也是广大人民的生活必需品， 棉纱及棉布还是出口创汇的重要商品。 因 此， 棉花的生产、 流通、 加工和消费， 与人民群众的生活和广大棉农的利益息息相关， 对国民 经济的发展也有着重要影响。
由大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae) 引起的黄萎病是棉花的主要病害， 严重影 响棉花的生产， 因此黄萎病的防治对于棉花生产的重要性不言而喻， 其中， 研究大丽轮枝菌 中各个基因的功能， 尤其是寻找致病相关基因是重要研究课题， 而基因敲除技术是研究基 因功能最有效的手段。
现有技术中大丽轮枝菌基因敲除的方法主要包括载体构建， 农杆菌介导的转 化和转化子筛选三个关键步骤， 其中转化子筛选是一个难点， 人们往往要筛选大量的转 化子， 以期得到需要的基因敲除的阳性转化子。这是因为将同源重组 DNA 片段克隆进 T-DNA(transfer DNA) 后， 借助农杆菌介导的转化方法虽然极大地提高了同源重组片段的 转化效率， 但是由于 T-DNA 自身的性质， 它会随机整合到该菌基因组的某一区段， 造成了 T-DNA 的随机插入转化子和同源双交换产生的基因敲除的阳性转化子都带有同样的抗生素 选择标签而难于区分， 而同源重组的效率相对随机插入的效率要低很多， 因此， 基因敲除的 转化子数量要远远少于随机插入的转化子， 从而使得阳性转化子的筛选方法繁琐、 费时， 同 时浪费大量的人力、 物力和财力。因此， 是一种效率低下的基因敲除体系。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的缺陷， 提供一种简便、 高效的筛选阳性转 化子的大丽轮枝菌基因敲除的方法。
本发明提供了一种大丽轮枝菌基因敲除的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步 骤： 构建用于同源重组的重组质粒， 该重组质粒由载体和同源重组 DNA 片段组成， 所述同源 重组 DNA 片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于该外源抗性基因两侧的满 足同源重组要求的侧翼序列， 所述载体含有外源条件致死基因 ； 通过农杆菌介导的方法， 将 所述重组质粒转化至大丽轮枝菌中进行同源重组， 得到转化子， 并筛选出阳性转化子。
通过上述方法分别对大丽轮枝菌的 ADE4 基因和 ChsV 基因进行敲除， 在随机挑选 的 15 个 ADE4 基因敲除的候选转化子中有 13 个是阳性转化子， 基因敲除转化子在总的转 化子中所占比例高达 87％ ； 在随机挑选的 16 个 ChsV 基因敲除的候选转化子中有 7 个是阳 性转化子， 基因敲除转化子在总的转化子中所占比例为 44％ ； 而林春花 ( 林春花、 郑服丛， 2008) 使用传统的转化子筛选方法构建了稻瘟病 MgORP1 基因敲除突变株， 基因敲除转化子在总的转化子中所占比例仅为 1.8％。 由此可见， 本发明的方法相对现有技术的大丽轮枝菌 的基因敲除方法的效率大大提高了。 附图说明
图 1 为构建用于同源重组的重组质粒的过程图 ； 图 2 为构建用于同源重组的重组质粒的各步骤反应的产物的琼脂糖凝胶电泳图 ； 图 3 显示了 ADE4 基因敲除的候选转化子的筛选结果 ； 图 4 显示了 ChsV 基因敲除的候选转化子的筛选结果。具体实施方式
本发明提供了一种大丽轮枝菌基因敲除的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步 骤： 构建用于同源重组的重组质粒， 该重组质粒由载体和同源重组 DNA 片段组成， 所述同源 重组 DNA 片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于该外源抗性基因两侧的满 足同源重组要求的侧翼序列， 所述载体含有外源条件致死基因 ； 通过农杆菌介导的方法， 将 所述重组质粒转化至大丽轮枝菌中进行同源重组， 得到转化子， 并筛选出阳性转化子。
术语 “基因敲除” 为将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。包括 去除原核生物细胞、 真核生物的生殖细胞、 体细胞或干细胞基因组中的基因等。 广义的基因 敲除包括某个或某些基因的完全敲除、 部分敲除、 基因调控序列的敲除以及成段基因组序 列的敲除。本发明中所述基因敲除指广义的基因敲除。
所述外源条件致死基因指非大丽轮枝菌内源性的条件致死基因， 术语 “条件致死 基因” 指在特定条件下导致个体或细胞死亡的基因。 根据本发明， 所述外源条件致死基因优 选为 HSVtk 基因， 即单纯疱疹病毒胸苷激酶基因， 其作用原理， 是因为酶蛋白基因 HSV-TK 编 码的酶蛋白， 可以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质， 所述外源条件致死基 因优选为含有 SEQ ID NO ： 1 所示序列的 DNA 片段， 进一步优选为具有 SEQ ID NO ： 1 所示序 列的 DNA 片段， 并且与其相对应的， 所述筛选出阳性转化子的方法包括， 向体系中加入与外 源抗性基因相对应的抗生素和条件致死基因所对应的 5’ - 氟脱氧尿苷 (F2dU)， 一般地， 所 述体系通常指筛选阳性转化子的固体和 / 或液体培养基， 且发明人在研究中发现， 5’ - 氟脱 氧尿苷对表达了 HSV-TK 编码的酶蛋白的大丽轮枝菌的最佳致死浓度为 40-60μM， 优选为 45-55μM， 最优选为 50μM， 此时， 基因敲除转化子在总的转化子中所占比例 ( 即基因敲除 效率 ) 非常高。所述与外源抗性基因相对应的抗生素也可以为多种， 当所述外源抗性基因 为潮霉素抗性基因时， 所述抗生素为潮霉素， 所述潮霉素加入的浓度可以为常规的浓度值， 如 20-40μg/mL， 优选为 30μg/mL。
根据本发明的宗旨， 所述外源条件致死基因的作用是用于去除至少部分假阳性的 转化子， 因此， 在利用农杆菌进行同源重组的基因敲除体系中， 优选地， 所述外源条件致死 为 基因位于用于转化的重组质粒的 T-DNA 内， 所述 T-DNA， 即转移 DNA(transferred DNA)， 农杆菌 Ti(tumor inducing) 或 Ri(root inducing) 质粒中的一段 DNA 序列， 可以从农杆菌 中转移并稳定整合到植物核基因组中。
根据本发明， 所述载体为各种能够用于农杆菌转化的载体， 优选地， 所述载体 的 T-DNA 序列中含有条件致死基因， 并且适用于 Gateway 连接反应， 所述载体可以通过商购得到， 也可以通过基因工程制备得到 ； 所述载体可含有如 SEQ ID NO ： 2 所示序列的 DNA 片段， 进一步优选为具有 SEQ ID NO ： 2 所示序列的 DNA 片段， 本文中， 该载体命名为 pGKO2-Gateway 载体。
根据本发明， 所述外源抗性基因指非大丽轮枝菌内源性的抗性基因， 术语 “抗性基 因” 指一类能阻止抗生素或除草剂等药物作用的基因或营养补偿性基因， 如某些氨基酸合 成酶的基因等。这些基因的表达能赋予生物抵抗药物等毒害或营养缺陷的环境， 常用做选 择性遗传标志。 根据本发明， 所述外源抗性基因可以为任何适用于大丽轮枝菌的抗性基因， 但是考虑到基因操作的优势， 本发明中所述抗性基因优选为潮霉素抗性基因 (Hyg)， 实际应 用中， 引入所述潮霉素抗性基因具体指引入包含上游启动子和终止子的 Hyg 抗性基因盒， 本发明中所述潮霉素抗性基因也指包括上游启动子和终止子的 Hyg 抗性基因盒， 其基因序 列为 SEQ ID NO ： 25 中的 429-2537 位所示的序列。
根据同源重组的原理， 所述位于该外源抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼 序列指的是与待敲除基因两侧的侧翼序列相同的基因序列， 所述侧翼序列的选择为本领域 的常规方法， 为了达到较高的同源重组的效率， 所述侧翼序列的长度优选为 1000-1500 个 核苷酸。 根据本发明的原理， 所述方法可以用于任何大丽轮枝菌， 如中国常见的导致棉花 黄萎病的大丽轮枝菌 VD991， 以及美国 Broad 研究所的大丽轮枝菌 VDLs.17， 也包括其他类 型的大丽轮枝菌， 如从 ATCC 商购的大丽轮枝菌， 大丽轮枝菌的菌株类型并不影响本发明的 实施。
根据本发明的原理， 所述大丽轮枝菌中的任何基因及其它们的组合都可以成为待 敲除基因， 示例地， 所述待敲除基因为大丽轮枝菌的 ADE4 基因和 / 或 ChsV 基因。
根据本发明， 构建所述同源重组 DNA 片段的方法可以为本领域各种方法， 本发明 中优选为融合 PCR 法， 构建所述重组质粒的方法可以为各种常规的外源片段与载体连接的 克隆方法， 如酶切 - 连接的克隆方法， 本发明中构建所述重组质粒的方法优选为 Gateway 克 隆法。
所述融合 PCR 法为本领域公知的采用具有互补末端的引物， 形成具有重叠链的 PCR 产物， 通过 PCR 产物重叠链的延伸， 从而将不同来源的任意 DNA 片段连接起来的方法， 此 技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现 DNA 片段的体外连接， 为同源重组片 段的构建提供了快速简捷的途径。根据本发明， 用于融合 PCR 的 DNA 片段有三段， 包括待敲 除基因上游侧翼序列的 DNA 片段， 待敲除基因下游侧翼序列的 DNA 片段和外源抗性基因盒 的 DNA 片段， 三者之间的摩尔比例可以为 1 ∶ 0.8-1.2 ∶ 2-4， 最优选地， 三者之间的摩尔比 例为 1 ∶ 1 ∶ 3， 其中待敲除基因上游侧翼序列的 DNA 片段的 3’ 端部分序列与外源抗性基 因盒的 DNA 片段的 5’ 端部分序列互补， 外源抗性基因盒的 DNA 片段的 3’ 端部分序列与待 敲除基因下游侧翼序列的 DNA 片段的 5’ 端部分序列互补， 如图 1 所示， 互补部分的序列来 自于 PCR 的引物， 本文中， 称其为融合 PCR 的接头序列。
所述 Gateway 克隆法是本领域公知的克隆技术， 它是利用 λ 噬菌体与大肠杆菌的 染色体之间发生的位点特异性的重组整合 (integrative recombination reaction) 与切 出 (excisive recombination reaction) 反应。整合反应是由整合酶 Int(integrase) 和 整合宿主因子 IHF(Integration Host Factor) 催化的。attB 和 attP 之间的重组整合的
噬菌体基因组 DNA 的 5’ 和 3’ 端含有 attL 和 attR 位点。切出的重组反应需要 IHF、 Int 和 Xis 蛋白的参与。在插入 E.coli 基因组 DNA 的噬菌体基因组 DNA 的 5’ 和 3’ 端的 attL 和 attR 位点发生位点特异性的重组， 重新在形成 λDNA 的 attP 位点和 E.coli 基因组 DNA 的 attB 位点。 通过 BP 和 LR 反应就可实现把 PCR 产物定向转入克隆质粒和表达质粒， 实现 PCR 产物在各种质粒间的转移。Gateway 克隆法相对酶切构建载体来说， 具有需时短、 操作简单 的特点， 因此缩短了载体构建的时间。
根据本发明， 构建所述重组质粒的方法包括在融合 PCR 步骤之前， 通过常规 PCR 的 方法分别获得用于融合 PCR 的各段 DNA 片段， 即， 待敲除基因上游侧翼序列的 DNA 片段、 外 源抗性基因序列的 DNA 片段和待敲除基因下游侧翼序列的 DNA 片段， 根据本发明， 优选地， 得到所述外源抗性基因的 DNA 片段的方法可以包括， 以带有外源抗性基因的质粒 (pUCHyg) 为模板， 以 Hyg-F 和 Hyg-R 为上下游引物的 PCR( 其中， 引物中的 F 表示上游引物， R 表示下 游引物， 本说明书中均如此表示 ) ； 得到所述待敲除基因上游侧翼序列的 DNA 片段的方法可 以包括， 以大丽轮枝菌的基因组 DNA 或 cDNA 为模板， 以 5F 和 5R 为引物进行的 PCR ； 得到 所述待敲除基因下游侧翼序列的 DNA 片段的方法可以包括， 以大丽轮枝菌的基因组 DNA 或 cDNA 为模板， 以 3F 和 3R 为引物进行的 PCR， 其中， 5R 的 5’ 端与 Hyg-F 完全互补配对， 3F 的 5’ 端与 Hyg-R 完全互补配对， 以满足融合 PCR 的要求。根据本发明， 对所述用于扩增三段 DNA 片段的引物序列没有特别的限定， 优选地， 用于获得待敲除基因上游侧翼序列的 DNA 片 段的下游引物的核酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示， 用于获得待敲除基因下游侧翼序列的 DNA 片段的上游引物的核酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示， 或者如 SEQ ID NO ： 14 和 SEQ ID NO ： 15 所示序列的引物。 本发明的发明人在研究中发现， 与其他引物序列相比， 使用上述序列的引 物能够大大提高融合 PCR 的成功率。
根据本发明， 优选地， 构建所述重组质粒的方法包括在融合 PCR 步骤之后， 以融 合 PCR 得到的产物为模板， 以 5’端分别带有 Gateway BP 反应的接头的引物为引物， 进 行 PCR( 巢式 PCR)， 得到带有接头的同源重组 DNA 片段， 用于下一步与载体的连接， 所述 Gateway BP 反应的接头可以根据不同的载体进行选择， 如本发明中所用载体为商购的 pGKO2-Gateway 载体时， 所述接头也相应的采用与上述载体相匹配的 DNA 序列， 如 SEQ ID NO ： 7 和 SEQ ID NO ： 8 所示。
根据本发明， 所述农杆菌介导的转化方法可以为本领域公知的方法， 包括将重组 质粒转化至农杆菌感受态细胞中， 并将转化后的农杆菌感受态细胞与大丽轮枝菌共培养， 本发明的发明人在研究中发现， 所述共培养在微孔滤膜上进行时， 重组质粒的转化效率较 6 高， 且成本较低， 并且， 当所述大丽轮枝菌的孢子浓度为 4×10 -6×106 个 / 毫升， 最优选为 6 5×10 个 / 毫升时， 能够进一步的提高重组质粒的转化效率。
根据本发明， 所述方法还包括对筛选得到的阳性转化子的验证， 一般地， 对于筛选 得到的转化子首先通过 PCR 的方法进行验证， 所述 PCR 的引物根据待敲除基因进行设计， 如果不能扩增出目的条带， 则可能为阳性转化子， 如果能够扩增出目的条带， 则为阴性转化 子， 但是即使不能扩增出目的条带， 也不保证一定为阳性转化子， 因此这样的 PCR 验证方法 会得到一些假阳性的结果， 本发明的发明人在研究中发现， 如果将引物设计在与侧翼序列 相对应的位置， 则可以更精确的判断转化子是否为阳性转化子， 能够进一步提高筛选的效 率。例如， 用于验证的引物为 test-1 和 test-2， 二者分别于待敲除基因上下游侧翼序列完全相同或完全互补配对。当然， 为了精确的验证， 仍需要进行测序。
下面， 通过以下实施例对本发明做更详细的说明。
DNA 序列委托上海生工公司合成， 测序委托中国农业科学院作物科学研究所公司 进行 ； 带有外源抗性基因的质粒 pUCHyg 是将 Hyg 基因通过 SalI/XbaI 酶切位点连入 pUC19 质粒中得到的重组质粒， 其序列如 SEQ IDNO ： 25 所示 ； 5’ - 氟脱氧尿苷购自 sigma 公司 ； 遗 传转化所用农杆菌菌株为 AGL-1( 购自 Biovector 中国质粒载体菌株基因库 ) ； 落叶型棉花 TM 黄萎病菌株大丽轮枝菌购自 ATCC( 商品号为 26289 ) ； PCR 仪型号为 Biometra PCR ； 测定孢 子浓度使用血球计数板计数 ； Gateway 连接中使用的试剂 ( 如酶等 ) 均购自 Invitrogen 公 司， Gateway 连接步骤按照 Invitrogen 公司试剂手册的方法进行， 所用微孔滤膜为上海新 亚净化材料厂生产， 孔径为 0.45μm， 所述三轮 PCR 反应中所用的 DNA 聚合酶、 dNTP， 提取基 因组的试剂盒和 PCR 产物纯化的试剂盒等分子生物学常规试剂均购自上海生工公司， 相应 的分子生物学操作按照商品试剂说明书和 《分子克隆》 ( 第三版 ) 进行。
实施例 1
(1) 构建用于同源重组的重组质粒， 过程图如图 1 所示， 包括三轮 PCR 过程 ：
第 一 轮 PCR ： 以 大 丽 轮 枝 菌 的 基 因 组 DNA( 完 整 的 基 因 序 列 参 见 数 据 库 网 站 http://www.broadinstitute.org/) 为 模 板， 以 5F-ADE4 和 5R-ADE4 为 引 物， 通 过 PCR 得 到基因 ADE4( 基因序列编号为 VDAG_00128， Broad 研究所 ) 上游侧翼序列的 DNA 片段， 约 1000bp， 并以 3F-ADE4 和 3R-ADE4 为引物， 通过 PCR 得到基因 ADE4 下游侧翼序列的 DNA 片 段， 约 1000bp ； 以 pUCHyg 为模板， 以 Hyg-F 和 Hyg-R 为引物， 进行 PCR 反应， 扩增得到长度 为 1.8kb 的潮霉素抗性基因盒的 DNA 片段 ； 所述引物序列如表 1 所示， 所述 PCR 的条件如 表 2 所示 ； 对得到的三个片段的 PCR 产物进行纯化并进行琼脂糖凝胶电泳检测， 如图 2 所 示， 其中， 第一泳道为 ADE4 基因下游侧翼序列的 DNA 片段， 第二泳道为潮霉素抗性基因盒的 DNA 片段， 第三泳道为 ADE4 基因上游侧翼序列的 DNA 片段， 最后一个泳道 M 为 Marker， 其中， 1kb， 2kb 和 4kb 的位置已经标识出来， 图 1 中 ADE4ORF 表示 ADE4 基因的开放阅读框 ；
第二轮 PCR ： 利用融合 PCR 方法， 以纯化后的潮霉素抗性基因盒的 DNA 片段， ADE4 基因上、 下游侧翼序列的 DNA 片段为模板进行扩增， 融合 PCR 的条件如表 2 所示 ； 从而将上 述三片段首尾相接， 得到潮霉素抗性基因盒两侧各与 ADE4 基因上下游 1kb 片段相连接的 3.8kb 的同源重组 DNA 片段 ； 对融合 PCR 的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 如图 2 第四泳道 所示 ； 由图 2 可以看出， 融合 PCR 的产物中同源重组 DNA 片段的比例很低 ；
第三轮 PCR ： 以第二轮 PCR 的产物为模板， 以 Nest-F-ADE4 和 Nest-R-ADE4 为 “巢 式” 引物， 通过 PCR 获得 3.8kb 融合片段的特异性扩增产物， 即两侧带有 Gateway BP 反应 接头的同源重组 DNA 片段， 如图 1 所示， Nest-F-ADE4 和 Nest-R-ADE4 中黑色并标识为 attB 的部分， 引物序列如表 1 所示， 各 PCR 反应的条件如表 2 所示， 对第三轮 PCR 的产物进行琼 脂糖凝胶电泳检测， 如图 2 第五泳道所示， 可以看出， 第三轮 PCR 的产物绝大多数为同源重 组 DNA 片段。
表1
其中， 下划线 “_” 表示与 HygF 和 HygR 互补的序列 ( 融合 PCR 的接头序列 ) ； 波浪 表示用于 Gateway BP 反应的接头序列。线
将构建好的同源重组 DNA 片段与 pGKO2-Gateway 载体进行 GatewayBP 反应， 得到 重组质粒 pKO-ADE4。其具体步骤如下 ：
(1)PEG 纯化 ： 向第三轮 PCR 的产物中加入等体积的 TE 缓冲溶液 (PH8.0) 和等体积 的 PEG(30％的 PEG8000/30mM 的 MgCl2) 溶液进行稀释， 涡旋混匀， 在 12000rpm 离心 15min， 弃去上清液， 向沉淀中加入一定体积的 TE 缓冲溶液 (PH 8.0) 将其溶解， 使产物的终浓度大 于＞ 10ng/μl ；
(2)Gateway 连接反应 ： 将 1-7μl 的 PEG 纯化后的第三轮 PCR 的产物 (15-150ng， 带有接头序列的 PCR 产物 )、 1μl(150μg/μl) 的 pGKO2-Gateway 载体与 TE 缓冲溶液 (PH 8.0) 混合， 使总体积达到 8μl。然后加入 2μl 的 BPClonaseTMII 酶， 在 25℃反应 1h， 加入 1μl 蛋白酶 K 涡旋混匀， 在 37℃反应 10min 后终止反应 ；
(3) 转 化 ： 将 1μl 的 Gateway 连 接 反 应 的 产 物 加 入 到 50μl 的 One TM OmniMAX 2T1 噬菌体抗性细胞 (Invitrogen 商品号 C8540-03) 中， 在冰上孵育 30 分钟， 将 热击的细胞在 40℃孵育 30s， 然后加入 250μl 的 SOC 培养基， 并在 37℃震荡孵育 1 小时， 取 100μl 的转化物涂布于选择性平板上， 并注意， 任何感受态细胞的转化效率都要大于 8 1.0×10 转化子 / 微克 ；
(4) 挑取阳性菌落， 培养并提取重组质粒 pKO-ADE4。
表2
表 2 显示了三轮 PCR 的引物、 模板和反应条件， 以及反应产物。
(2) 农杆菌介导的转化 ：
(i) 制备感受态细胞
从新鲜的 YEP 平板上挑取农杆菌 AGL-1 的单菌落， 接种于液体 YEP 培养基 ( 含利 福平 Rif50mg/ml) 中， 28℃， 200rpm 振荡培养过夜 ； 取 1ml 菌液接种于 50ml 液体 YEP 液体 培养基 ( 含 Rif 50mg/ml) 中扩大培养， 28℃， 200rpm 振荡培养至 OD600 值为 0.5 ； 冰浴 30min 后， 在 4 ℃， 5000rpm 条件下离心收集菌体， 重悬于冰冻的 10ml 的 0.15mol/L 的 NaCl 溶液 中； 在 4℃， 5000rpm 条件下再次离心收集菌体， 重悬于 1ml 的 20mmol/L 的 CaCl2 溶液中， 按 200μl/ 管分装 ； 制备好的感受态细胞置液氮中速冻 1min 后， 放于 -70℃冰箱保存， 半年内 使用 ；
(ii) 重组质粒的转化
向每管感受态细胞中加入大约 1μg 的重组质粒 pKO-ADE4， 冰浴 30min， 液氮速冻 1min， 37℃融化 3min ； 加入 800μl 的 YEP 液体培养基， 于 28℃、 150rpm 恢复培养 3h 后， 在 5000rpm 离心 1min 收集菌体 ； 将收集到的农杆菌菌体涂布于 YEP 平板上， 在 28℃培养 2-3 天， 挑取长出的单菌落 ；
(iii) 大丽轮枝菌的准备
取 100ml 三角瓶一个， 加入 CM 液体培养基 20ml， 接种平板或离心管保存的大丽轮 枝菌 ； 在 25℃， 150rpm 摇床中培养 2-3 天， 取少量菌液， 用无菌水稀释 10 倍后镜检， 计算孢
子数量 ； 根据检测结果， 用无菌水稀释至孢子浓度为 5×106cfu/ml ；
(iv) 共培养
制备 IM( 诱导培养基 ) 平板数块， 其中每块平板 (25ml) 含 50μL， 20mM 的 AS( 乙 酰丁香酮 )， 小心将灭菌的微孔滤膜放在平板上， 尽量不产生气泡 ； 分别吸取准备好的农杆 菌和大丽轮枝菌孢子悬浮液各 100μL 混匀 ； 将 200μL 农杆菌和大丽轮枝菌混合液均匀涂 布于微孔滤膜上， 在超净台内吹干， 并置于 25℃恒温培养箱中培养 48h。
(3) 阳性转化子的筛选和验证
将共培养后的农杆菌和大丽轮枝菌混合液均匀的涂布在同时添加有潮霉素 ( 浓 度 30μg/mL) 和 50μM 的 F2dU 的平板上， 在 25℃培养 5 天后， 平板上出现菌斑， 挑选 15 个 ADE4 基因敲除的候选转化子后， 对其进行分子生物学验证， 即以候选转化子的基因组 DNA 为模板， 以 Test-1 和 Test-2 为引物进行 PCR 扩增， PCR 的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 结果如图 3 所示。以野生型菌株基因组作为模板， 以 test-1 和 test-2 作为引物， 扩增出了 预期的 1.2kb 的 DNA 片段 ； 同样条件下以 15 个候选转化子的基因组 DNA 做模板， 其中 13 个 (1， 2， 3， 4， 5， 7， 8， 9， 10， 12， 13， 14， 15， 16 号 ) 扩增出了单一的 1.8kb 的 DNA 片段。 说明这 13 个转化子中 ADE4 基因成功地被 1.8kb 的潮霉素抗性基因同源重组所替代， 使引物 test-1 和 test-2 之间的距离增大到 1.8kb。而其余 2 个转化子 (6， 11 号 ) 被鉴定为 T-DNA 随机插 入的假阳性转化子， 显示了 1.2kb(ADE4 基因的 PCR 条带 ) 和 1.8kb( 随机插入的 T-DNA 中 同源重组片段的 PCR 条带 ) 的双电泳条带 ； 然后对这 15 个候选转化子进行了测序验证， 与 PCR 验证的结果相同。这两方面都说明 ΔADE4 突变体 ( 即缺失 ADE4 基因的转化子 ) 的构 建是成功的， 基因敲除转化子在总的转化子中所占比例为 13/15 ＝ 87％。
实施例 2
(1) 构建用于同源重组的重组质粒， 过程与实施例 1 相同， 包括三轮 PCR 过程 ：
第一轮 PCR ： 以大丽轮枝菌的基因组 DNA 为模板， 以 5F-ChsV 和 5R-ChsV 为引物， 通过 PCR 得到 ChsV 基因 (VDAG 00420， Broad 研究所 ) 上游侧翼序列的 DNA 片段， 约为 1000bp， 以 3F-ChsV 和 3R-ChsV 为引物， 通过 PCR 得到 ChsV 基因下游侧翼序列的 DNA 片段， 约为 1000bp ； 以 pUCHyg 为模板， 以 Hyg-F 和 Hyg-R 为引物， 进行 PCR 反应， 扩增得到长度为 1.8kb 的潮霉素抗性基因盒的 DNA 片段 ； 所述引物序列如表 3 所示， 所述 PCR 的条件与实施 例 1 相同， 如表 4 所示 ；
第二轮 PCR ： 利用融合 PCR 方法， 将潮霉素抗性基因盒的 DNA 片段， ChsV 基因上、 下 游侧翼序列的 DNA 片段为模板进行扩增， 所述融合 PCR 的条件如表 4 所示 ； 从而将上述三片 段首尾相接， 得到潮霉素抗性基因盒两侧各与 ChsV 基因上下游 1kb 片段相连接的 3.8kb 的 同源重组 DNA 片段， 所述 PCR 的条件如表 4 所示 ；
第 三 轮 PCR ： 以 第 二 轮 PCR 的 产 物 为 模 板， 以 Nest-F-ChsV 和 Nest-R-ChsV 为 “巢式” 引物， 通过 PCR 获得 3.8kb 融合片段的特异性扩增产物， 同时使该融合体两侧带有 Gateway BP 反应的接头， 引物序列如表 3 所示， 各 PCR 反应的条件如表 4 所示。
将构建好的同源重组 DNA 片段与 pGKO2-Gateway 载体进行 GatewayBP 反应， 得到 重组质粒 pKO-ChsV。具体步骤与实施例 1 相同。
表3
其中， 下划线 “_” 表示与 HygF 和 HygR 互补的序列 ； 波浪线表示用于 GatewayBP 反应的接头序列。
表4
表 4 显示了三轮 PCR 的引物、 模板和反应条件， 以及每轮 PCR 的反应产物。 (2) 农杆菌介导的转化 ： 按照实施例 1 的方法 (i) 制备感受态细胞 ； (ii) 重组质粒转化 ； (iii) 大丽轮枝菌的准备 ； (iv) 共培养。
(3) 阳性转化子的筛选和验证
将共培养后的农杆菌和大丽轮枝菌混合液均匀的涂布在同时添加有潮霉素 ( 终 浓度为 30μg/mL) 和 55μM 的 F2dU 的平板上， 在 25℃培养 2 天后， 平板上出现挑选 16 个 ChsV 基因敲除的候选转化子后， 对其进行了分子生物学验证， 即以候选转化子的基因组 DNA 为模板， 以 Test-3 和 Test-4 为引物进行 PCR 扩增， PCR 的产物进行琼脂糖凝胶电泳检 测， 结果如图 4 所示。以野生型菌株的基因组作为模板， 以 test-3 和 test-4 作为引物， 扩 增出了预期的 1.2kb 的 DNA 片段 ； 同样条件下以 16 个候选转化子的基因组 DNA 做模板， 其 中 7 个 (3， 4， 6， 8， 9， 13， 16 号 ) 扩增出了单一的 1.8kb 的 DNA 片段。说明这 16 个转化子中 ChsV 基因成功地被 1.8kb 的潮霉素抗性基因的同源重组所替代， 使引物 test-3 和 test-4 之间的距离增大到 1.8kb。然后对这 16 个候选转化子进行了测序验证， 与 PCR 验证的结果 相同。这两方面都说明 ChsV 缺失的突变体的构建是成功的， 基因敲除转化子在总的转化子 中所占比例为 7/16 ＝ 44％。
实施例 3
按照实施例 1 的方法进行大丽轮枝菌 ADE4 基因的敲除。 不同的是， 用于筛选的 F2dU 的终浓度为 0.5μM， 从平板上挑选 53 个 ADE4 基因敲 除的候选转化子进行验证， 只有 2 个为阳性转化子， 基因敲除转化子在总的转化子中所占 比例仅为 3.8％。
实施例 4
按照实施例 1 的方法进行大丽轮枝菌 ADE4 基因的敲除， 不同的是， 引物 5R-ADE4 分别换为 5R-2 和 5R-3， 同时引物 3F-ADE4 相应的换为 3F-2 和 3F-3， 引物序列如下所示，
5R-2 ： 5’ -TGG ACG ACT AAA CCA AAA TAG TTG ACG CTC ATC GACAGA-3’ (SEQ ID NO ： 21) ；
3F-2 ： 5’ -GAC TAT GAA AAT TCC GTC ACT AGG TTT CCG ACT CCGATG C-3’ (SEQ ID NO ： 22) ；
5R-3 ： 5’ -AAC GAC ACA AAT TTT GTG ATG TTG ACG CTC ATC GACAGA-3’ (SEQ ID NO ： 23) ；
3F-3 ： 5’ -CTT CAG GCT CCG GCG AAG AGT AGG TTT CCG ACT CCGATG C-3’ (SEQ ID NO ： 24) ；
按照实施例 1 的方法， 用上述两组引物 (5R-2 和 3F-2， 5R-3 和 3F-3) 进行 PCR， 然 后将得到的三段 PCR 产物进行融合 PCR， 用琼脂糖凝胶电泳进行检测融合 PCR 的产物， 几乎 观察不到明显的同源重组 DNA 片段的条带， 而从图 2 中第 5 泳道可以观察到非常明显的同 源重组 DNA 片段的条带。说明使用实施例 1 的引物中的融合 PCR 的接头序列与待敲除基因 片段之间的连接效率很高。
比较实施例 1 和实施例 3 的结果， 可以看出， 实施例 1 中阳性转化子在总的转化 子中的比例高达 87％， 而当使用的 F2dU 的浓度过低时 ( 即现有技术中所使用的浓度 )， 基 因敲除效率大大降低了， 仅为 3.8％， 但仍高于现有技术 1.8％的基因敲除效率。这说明本 发明的方法是一种高效的筛选阳性转化子的大丽轮枝菌基因敲除的方法， 同时说明使用的 F2dU 的浓度在 40-60μM， 进一步优选在 45-55μM 时能够得到最高的基因敲除效率。
本发明涉及一种大丽轮枝菌基因敲除的方法。背景技术 我国是农业大国， 作为仅次于粮食的第二大农作物的棉花是关系国计民生的战略 物资， 也是涉及农业和纺织工业两大产业的商品， 是全国 1 亿多棉农收入的主要来源， 是纺 织工业的主要原料， 也是广大人民的生活必需品， 棉纱及棉布还是出口创汇的重要商品。 因 此， 棉花的生产、 流通、 加工和消费， 与人民群众的生活和广大棉农的利益息息相关， 对国民 经济的发展也有着重要影响。
由大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae) 引起的黄萎病是棉花的主要病害， 严重影 响棉花的生产， 因此黄萎病的防治对于棉花生产的重要性不言而喻， 其中， 研究大丽轮枝菌 中各个基因的功能， 尤其是寻找致病相关基因是重要研究课题， 而基因敲除技术是研究基 因功能最有效的手段。
现有技术中大丽轮枝菌基因敲除的方法主要包括载体构建， 农杆菌介导的转 化和转化子筛选三个关键步骤， 其中转化子筛选是一个难点， 人们往往要筛选大量的转 化子， 以期得到需要的基因敲除的阳性转化子。这是因为将同源重组 DNA 片段克隆进 T-DNA(transfer DNA) 后， 借助农杆菌介导的转化方法虽然极大地提高了同源重组片段的 转化效率， 但是由于 T-DNA 自身的性质， 它会随机整合到该菌基因组的某一区段， 造成了 T-DNA 的随机插入转化子和同源双交换产生的基因敲除的阳性转化子都带有同样的抗生素 选择标签而难于区分， 而同源重组的效率相对随机插入的效率要低很多， 因此， 基因敲除的 转化子数量要远远少于随机插入的转化子， 从而使得阳性转化子的筛选方法繁琐、 费时， 同 时浪费大量的人力、 物力和财力。因此， 是一种效率低下的基因敲除体系。
由大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae) 引起的黄萎病是棉花的主要病害， 严重影 响棉花的生产， 因此黄萎病的防治对于棉花生产的重要性不言而喻， 其中， 研究大丽轮枝菌 中各个基因的功能， 尤其是寻找致病相关基因是重要研究课题， 而基因敲除技术是研究基 因功能最有效的手段。
现有技术中大丽轮枝菌基因敲除的方法主要包括载体构建， 农杆菌介导的转 化和转化子筛选三个关键步骤， 其中转化子筛选是一个难点， 人们往往要筛选大量的转 化子， 以期得到需要的基因敲除的阳性转化子。这是因为将同源重组 DNA 片段克隆进 T-DNA(transfer DNA) 后， 借助农杆菌介导的转化方法虽然极大地提高了同源重组片段的 转化效率， 但是由于 T-DNA 自身的性质， 它会随机整合到该菌基因组的某一区段， 造成了 T-DNA 的随机插入转化子和同源双交换产生的基因敲除的阳性转化子都带有同样的抗生素 选择标签而难于区分， 而同源重组的效率相对随机插入的效率要低很多， 因此， 基因敲除的 转化子数量要远远少于随机插入的转化子， 从而使得阳性转化子的筛选方法繁琐、 费时， 同 时浪费大量的人力、 物力和财力。因此， 是一种效率低下的基因敲除体系。
【发明内容】
本发明的目的是克服上述现有技术中的缺陷， 提供一种简便、 高效的筛选阳性转 化子的大丽轮枝菌基因敲除的方法。
本发明提供了一种大丽轮枝菌基因敲除的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步 骤： 构建用于同源重组的重组质粒， 该重组质粒由载体和同源重组 DNA 片段组成， 所述同源 重组 DNA 片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于该外源抗性基因两侧的满 足同源重组要求的侧翼序列， 所述载体含有外源条件致死基因 ； 通过农杆菌介导的方法， 将 所述重组质粒转化至大丽轮枝菌中进行同源重组， 得到转化子， 并筛选出阳性转化子。
通过上述方法分别对大丽轮枝菌的 ADE4 基因和 ChsV 基因进行敲除， 在随机挑选 的 15 个 ADE4 基因敲除的候选转化子中有 13 个是阳性转化子， 基因敲除转化子在总的转 化子中所占比例高达 87％ ； 在随机挑选的 16 个 ChsV 基因敲除的候选转化子中有 7 个是阳 性转化子， 基因敲除转化子在总的转化子中所占比例为 44％ ； 而林春花 ( 林春花、 郑服丛， 2008) 使用传统的转化子筛选方法构建了稻瘟病 MgORP1 基因敲除突变株， 基因敲除转化子在总的转化子中所占比例仅为 1.8％。 由此可见， 本发明的方法相对现有技术的大丽轮枝菌 的基因敲除方法的效率大大提高了。 附图说明
图 1 为构建用于同源重组的重组质粒的过程图 ； 图 2 为构建用于同源重组的重组质粒的各步骤反应的产物的琼脂糖凝胶电泳图 ； 图 3 显示了 ADE4 基因敲除的候选转化子的筛选结果 ； 图 4 显示了 ChsV 基因敲除的候选转化子的筛选结果。具体实施方式
本发明提供了一种大丽轮枝菌基因敲除的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步 骤： 构建用于同源重组的重组质粒， 该重组质粒由载体和同源重组 DNA 片段组成， 所述同源 重组 DNA 片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于该外源抗性基因两侧的满 足同源重组要求的侧翼序列， 所述载体含有外源条件致死基因 ； 通过农杆菌介导的方法， 将 所述重组质粒转化至大丽轮枝菌中进行同源重组， 得到转化子， 并筛选出阳性转化子。
术语 “基因敲除” 为将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。包括 去除原核生物细胞、 真核生物的生殖细胞、 体细胞或干细胞基因组中的基因等。 广义的基因 敲除包括某个或某些基因的完全敲除、 部分敲除、 基因调控序列的敲除以及成段基因组序 列的敲除。本发明中所述基因敲除指广义的基因敲除。
所述外源条件致死基因指非大丽轮枝菌内源性的条件致死基因， 术语 “条件致死 基因” 指在特定条件下导致个体或细胞死亡的基因。 根据本发明， 所述外源条件致死基因优 选为 HSVtk 基因， 即单纯疱疹病毒胸苷激酶基因， 其作用原理， 是因为酶蛋白基因 HSV-TK 编 码的酶蛋白， 可以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质， 所述外源条件致死基 因优选为含有 SEQ ID NO ： 1 所示序列的 DNA 片段， 进一步优选为具有 SEQ ID NO ： 1 所示序 列的 DNA 片段， 并且与其相对应的， 所述筛选出阳性转化子的方法包括， 向体系中加入与外 源抗性基因相对应的抗生素和条件致死基因所对应的 5’ - 氟脱氧尿苷 (F2dU)， 一般地， 所 述体系通常指筛选阳性转化子的固体和 / 或液体培养基， 且发明人在研究中发现， 5’ - 氟脱 氧尿苷对表达了 HSV-TK 编码的酶蛋白的大丽轮枝菌的最佳致死浓度为 40-60μM， 优选为 45-55μM， 最优选为 50μM， 此时， 基因敲除转化子在总的转化子中所占比例 ( 即基因敲除 效率 ) 非常高。所述与外源抗性基因相对应的抗生素也可以为多种， 当所述外源抗性基因 为潮霉素抗性基因时， 所述抗生素为潮霉素， 所述潮霉素加入的浓度可以为常规的浓度值， 如 20-40μg/mL， 优选为 30μg/mL。
根据本发明的宗旨， 所述外源条件致死基因的作用是用于去除至少部分假阳性的 转化子， 因此， 在利用农杆菌进行同源重组的基因敲除体系中， 优选地， 所述外源条件致死 为 基因位于用于转化的重组质粒的 T-DNA 内， 所述 T-DNA， 即转移 DNA(transferred DNA)， 农杆菌 Ti(tumor inducing) 或 Ri(root inducing) 质粒中的一段 DNA 序列， 可以从农杆菌 中转移并稳定整合到植物核基因组中。
根据本发明， 所述载体为各种能够用于农杆菌转化的载体， 优选地， 所述载体 的 T-DNA 序列中含有条件致死基因， 并且适用于 Gateway 连接反应， 所述载体可以通过商购得到， 也可以通过基因工程制备得到 ； 所述载体可含有如 SEQ ID NO ： 2 所示序列的 DNA 片段， 进一步优选为具有 SEQ ID NO ： 2 所示序列的 DNA 片段， 本文中， 该载体命名为 pGKO2-Gateway 载体。
根据本发明， 所述外源抗性基因指非大丽轮枝菌内源性的抗性基因， 术语 “抗性基 因” 指一类能阻止抗生素或除草剂等药物作用的基因或营养补偿性基因， 如某些氨基酸合 成酶的基因等。这些基因的表达能赋予生物抵抗药物等毒害或营养缺陷的环境， 常用做选 择性遗传标志。 根据本发明， 所述外源抗性基因可以为任何适用于大丽轮枝菌的抗性基因， 但是考虑到基因操作的优势， 本发明中所述抗性基因优选为潮霉素抗性基因 (Hyg)， 实际应 用中， 引入所述潮霉素抗性基因具体指引入包含上游启动子和终止子的 Hyg 抗性基因盒， 本发明中所述潮霉素抗性基因也指包括上游启动子和终止子的 Hyg 抗性基因盒， 其基因序 列为 SEQ ID NO ： 25 中的 429-2537 位所示的序列。
根据同源重组的原理， 所述位于该外源抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼 序列指的是与待敲除基因两侧的侧翼序列相同的基因序列， 所述侧翼序列的选择为本领域 的常规方法， 为了达到较高的同源重组的效率， 所述侧翼序列的长度优选为 1000-1500 个 核苷酸。 根据本发明的原理， 所述方法可以用于任何大丽轮枝菌， 如中国常见的导致棉花 黄萎病的大丽轮枝菌 VD991， 以及美国 Broad 研究所的大丽轮枝菌 VDLs.17， 也包括其他类 型的大丽轮枝菌， 如从 ATCC 商购的大丽轮枝菌， 大丽轮枝菌的菌株类型并不影响本发明的 实施。
根据本发明的原理， 所述大丽轮枝菌中的任何基因及其它们的组合都可以成为待 敲除基因， 示例地， 所述待敲除基因为大丽轮枝菌的 ADE4 基因和 / 或 ChsV 基因。
根据本发明， 构建所述同源重组 DNA 片段的方法可以为本领域各种方法， 本发明 中优选为融合 PCR 法， 构建所述重组质粒的方法可以为各种常规的外源片段与载体连接的 克隆方法， 如酶切 - 连接的克隆方法， 本发明中构建所述重组质粒的方法优选为 Gateway 克 隆法。
所述融合 PCR 法为本领域公知的采用具有互补末端的引物， 形成具有重叠链的 PCR 产物， 通过 PCR 产物重叠链的延伸， 从而将不同来源的任意 DNA 片段连接起来的方法， 此 技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现 DNA 片段的体外连接， 为同源重组片 段的构建提供了快速简捷的途径。根据本发明， 用于融合 PCR 的 DNA 片段有三段， 包括待敲 除基因上游侧翼序列的 DNA 片段， 待敲除基因下游侧翼序列的 DNA 片段和外源抗性基因盒 的 DNA 片段， 三者之间的摩尔比例可以为 1 ∶ 0.8-1.2 ∶ 2-4， 最优选地， 三者之间的摩尔比 例为 1 ∶ 1 ∶ 3， 其中待敲除基因上游侧翼序列的 DNA 片段的 3’ 端部分序列与外源抗性基 因盒的 DNA 片段的 5’ 端部分序列互补， 外源抗性基因盒的 DNA 片段的 3’ 端部分序列与待 敲除基因下游侧翼序列的 DNA 片段的 5’ 端部分序列互补， 如图 1 所示， 互补部分的序列来 自于 PCR 的引物， 本文中， 称其为融合 PCR 的接头序列。
所述 Gateway 克隆法是本领域公知的克隆技术， 它是利用 λ 噬菌体与大肠杆菌的 染色体之间发生的位点特异性的重组整合 (integrative recombination reaction) 与切 出 (excisive recombination reaction) 反应。整合反应是由整合酶 Int(integrase) 和 整合宿主因子 IHF(Integration Host Factor) 催化的。attB 和 attP 之间的重组整合的
噬菌体基因组 DNA 的 5’ 和 3’ 端含有 attL 和 attR 位点。切出的重组反应需要 IHF、 Int 和 Xis 蛋白的参与。在插入 E.coli 基因组 DNA 的噬菌体基因组 DNA 的 5’ 和 3’ 端的 attL 和 attR 位点发生位点特异性的重组， 重新在形成 λDNA 的 attP 位点和 E.coli 基因组 DNA 的 attB 位点。 通过 BP 和 LR 反应就可实现把 PCR 产物定向转入克隆质粒和表达质粒， 实现 PCR 产物在各种质粒间的转移。Gateway 克隆法相对酶切构建载体来说， 具有需时短、 操作简单 的特点， 因此缩短了载体构建的时间。
根据本发明， 构建所述重组质粒的方法包括在融合 PCR 步骤之前， 通过常规 PCR 的 方法分别获得用于融合 PCR 的各段 DNA 片段， 即， 待敲除基因上游侧翼序列的 DNA 片段、 外 源抗性基因序列的 DNA 片段和待敲除基因下游侧翼序列的 DNA 片段， 根据本发明， 优选地， 得到所述外源抗性基因的 DNA 片段的方法可以包括， 以带有外源抗性基因的质粒 (pUCHyg) 为模板， 以 Hyg-F 和 Hyg-R 为上下游引物的 PCR( 其中， 引物中的 F 表示上游引物， R 表示下 游引物， 本说明书中均如此表示 ) ； 得到所述待敲除基因上游侧翼序列的 DNA 片段的方法可 以包括， 以大丽轮枝菌的基因组 DNA 或 cDNA 为模板， 以 5F 和 5R 为引物进行的 PCR ； 得到 所述待敲除基因下游侧翼序列的 DNA 片段的方法可以包括， 以大丽轮枝菌的基因组 DNA 或 cDNA 为模板， 以 3F 和 3R 为引物进行的 PCR， 其中， 5R 的 5’ 端与 Hyg-F 完全互补配对， 3F 的 5’ 端与 Hyg-R 完全互补配对， 以满足融合 PCR 的要求。根据本发明， 对所述用于扩增三段 DNA 片段的引物序列没有特别的限定， 优选地， 用于获得待敲除基因上游侧翼序列的 DNA 片 段的下游引物的核酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示， 用于获得待敲除基因下游侧翼序列的 DNA 片段的上游引物的核酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示， 或者如 SEQ ID NO ： 14 和 SEQ ID NO ： 15 所示序列的引物。 本发明的发明人在研究中发现， 与其他引物序列相比， 使用上述序列的引 物能够大大提高融合 PCR 的成功率。
根据本发明， 优选地， 构建所述重组质粒的方法包括在融合 PCR 步骤之后， 以融 合 PCR 得到的产物为模板， 以 5’端分别带有 Gateway BP 反应的接头的引物为引物， 进 行 PCR( 巢式 PCR)， 得到带有接头的同源重组 DNA 片段， 用于下一步与载体的连接， 所述 Gateway BP 反应的接头可以根据不同的载体进行选择， 如本发明中所用载体为商购的 pGKO2-Gateway 载体时， 所述接头也相应的采用与上述载体相匹配的 DNA 序列， 如 SEQ ID NO ： 7 和 SEQ ID NO ： 8 所示。
根据本发明， 所述农杆菌介导的转化方法可以为本领域公知的方法， 包括将重组 质粒转化至农杆菌感受态细胞中， 并将转化后的农杆菌感受态细胞与大丽轮枝菌共培养， 本发明的发明人在研究中发现， 所述共培养在微孔滤膜上进行时， 重组质粒的转化效率较 6 高， 且成本较低， 并且， 当所述大丽轮枝菌的孢子浓度为 4×10 -6×106 个 / 毫升， 最优选为 6 5×10 个 / 毫升时， 能够进一步的提高重组质粒的转化效率。
根据本发明， 所述方法还包括对筛选得到的阳性转化子的验证， 一般地， 对于筛选 得到的转化子首先通过 PCR 的方法进行验证， 所述 PCR 的引物根据待敲除基因进行设计， 如果不能扩增出目的条带， 则可能为阳性转化子， 如果能够扩增出目的条带， 则为阴性转化 子， 但是即使不能扩增出目的条带， 也不保证一定为阳性转化子， 因此这样的 PCR 验证方法 会得到一些假阳性的结果， 本发明的发明人在研究中发现， 如果将引物设计在与侧翼序列 相对应的位置， 则可以更精确的判断转化子是否为阳性转化子， 能够进一步提高筛选的效 率。例如， 用于验证的引物为 test-1 和 test-2， 二者分别于待敲除基因上下游侧翼序列完全相同或完全互补配对。当然， 为了精确的验证， 仍需要进行测序。
下面， 通过以下实施例对本发明做更详细的说明。
DNA 序列委托上海生工公司合成， 测序委托中国农业科学院作物科学研究所公司 进行 ； 带有外源抗性基因的质粒 pUCHyg 是将 Hyg 基因通过 SalI/XbaI 酶切位点连入 pUC19 质粒中得到的重组质粒， 其序列如 SEQ IDNO ： 25 所示 ； 5’ - 氟脱氧尿苷购自 sigma 公司 ； 遗 传转化所用农杆菌菌株为 AGL-1( 购自 Biovector 中国质粒载体菌株基因库 ) ； 落叶型棉花 TM 黄萎病菌株大丽轮枝菌购自 ATCC( 商品号为 26289 ) ； PCR 仪型号为 Biometra PCR ； 测定孢 子浓度使用血球计数板计数 ； Gateway 连接中使用的试剂 ( 如酶等 ) 均购自 Invitrogen 公 司， Gateway 连接步骤按照 Invitrogen 公司试剂手册的方法进行， 所用微孔滤膜为上海新 亚净化材料厂生产， 孔径为 0.45μm， 所述三轮 PCR 反应中所用的 DNA 聚合酶、 dNTP， 提取基 因组的试剂盒和 PCR 产物纯化的试剂盒等分子生物学常规试剂均购自上海生工公司， 相应 的分子生物学操作按照商品试剂说明书和 《分子克隆》 ( 第三版 ) 进行。
实施例 1
(1) 构建用于同源重组的重组质粒， 过程图如图 1 所示， 包括三轮 PCR 过程 ：
第 一 轮 PCR ： 以 大 丽 轮 枝 菌 的 基 因 组 DNA( 完 整 的 基 因 序 列 参 见 数 据 库 网 站 http://www.broadinstitute.org/) 为 模 板， 以 5F-ADE4 和 5R-ADE4 为 引 物， 通 过 PCR 得 到基因 ADE4( 基因序列编号为 VDAG_00128， Broad 研究所 ) 上游侧翼序列的 DNA 片段， 约 1000bp， 并以 3F-ADE4 和 3R-ADE4 为引物， 通过 PCR 得到基因 ADE4 下游侧翼序列的 DNA 片 段， 约 1000bp ； 以 pUCHyg 为模板， 以 Hyg-F 和 Hyg-R 为引物， 进行 PCR 反应， 扩增得到长度 为 1.8kb 的潮霉素抗性基因盒的 DNA 片段 ； 所述引物序列如表 1 所示， 所述 PCR 的条件如 表 2 所示 ； 对得到的三个片段的 PCR 产物进行纯化并进行琼脂糖凝胶电泳检测， 如图 2 所 示， 其中， 第一泳道为 ADE4 基因下游侧翼序列的 DNA 片段， 第二泳道为潮霉素抗性基因盒的 DNA 片段， 第三泳道为 ADE4 基因上游侧翼序列的 DNA 片段， 最后一个泳道 M 为 Marker， 其中， 1kb， 2kb 和 4kb 的位置已经标识出来， 图 1 中 ADE4ORF 表示 ADE4 基因的开放阅读框 ；
第二轮 PCR ： 利用融合 PCR 方法， 以纯化后的潮霉素抗性基因盒的 DNA 片段， ADE4 基因上、 下游侧翼序列的 DNA 片段为模板进行扩增， 融合 PCR 的条件如表 2 所示 ； 从而将上 述三片段首尾相接， 得到潮霉素抗性基因盒两侧各与 ADE4 基因上下游 1kb 片段相连接的 3.8kb 的同源重组 DNA 片段 ； 对融合 PCR 的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 如图 2 第四泳道 所示 ； 由图 2 可以看出， 融合 PCR 的产物中同源重组 DNA 片段的比例很低 ；
第三轮 PCR ： 以第二轮 PCR 的产物为模板， 以 Nest-F-ADE4 和 Nest-R-ADE4 为 “巢 式” 引物， 通过 PCR 获得 3.8kb 融合片段的特异性扩增产物， 即两侧带有 Gateway BP 反应 接头的同源重组 DNA 片段， 如图 1 所示， Nest-F-ADE4 和 Nest-R-ADE4 中黑色并标识为 attB 的部分， 引物序列如表 1 所示， 各 PCR 反应的条件如表 2 所示， 对第三轮 PCR 的产物进行琼 脂糖凝胶电泳检测， 如图 2 第五泳道所示， 可以看出， 第三轮 PCR 的产物绝大多数为同源重 组 DNA 片段。
表1
其中， 下划线 “_” 表示与 HygF 和 HygR 互补的序列 ( 融合 PCR 的接头序列 ) ； 波浪 表示用于 Gateway BP 反应的接头序列。线
将构建好的同源重组 DNA 片段与 pGKO2-Gateway 载体进行 GatewayBP 反应， 得到 重组质粒 pKO-ADE4。其具体步骤如下 ：
(1)PEG 纯化 ： 向第三轮 PCR 的产物中加入等体积的 TE 缓冲溶液 (PH8.0) 和等体积 的 PEG(30％的 PEG8000/30mM 的 MgCl2) 溶液进行稀释， 涡旋混匀， 在 12000rpm 离心 15min， 弃去上清液， 向沉淀中加入一定体积的 TE 缓冲溶液 (PH 8.0) 将其溶解， 使产物的终浓度大 于＞ 10ng/μl ；
(2)Gateway 连接反应 ： 将 1-7μl 的 PEG 纯化后的第三轮 PCR 的产物 (15-150ng， 带有接头序列的 PCR 产物 )、 1μl(150μg/μl) 的 pGKO2-Gateway 载体与 TE 缓冲溶液 (PH 8.0) 混合， 使总体积达到 8μl。然后加入 2μl 的 BPClonaseTMII 酶， 在 25℃反应 1h， 加入 1μl 蛋白酶 K 涡旋混匀， 在 37℃反应 10min 后终止反应 ；
(3) 转 化 ： 将 1μl 的 Gateway 连 接 反 应 的 产 物 加 入 到 50μl 的 One TM OmniMAX 2T1 噬菌体抗性细胞 (Invitrogen 商品号 C8540-03) 中， 在冰上孵育 30 分钟， 将 热击的细胞在 40℃孵育 30s， 然后加入 250μl 的 SOC 培养基， 并在 37℃震荡孵育 1 小时， 取 100μl 的转化物涂布于选择性平板上， 并注意， 任何感受态细胞的转化效率都要大于 8 1.0×10 转化子 / 微克 ；
(4) 挑取阳性菌落， 培养并提取重组质粒 pKO-ADE4。
表2
表 2 显示了三轮 PCR 的引物、 模板和反应条件， 以及反应产物。
(2) 农杆菌介导的转化 ：
(i) 制备感受态细胞
从新鲜的 YEP 平板上挑取农杆菌 AGL-1 的单菌落， 接种于液体 YEP 培养基 ( 含利 福平 Rif50mg/ml) 中， 28℃， 200rpm 振荡培养过夜 ； 取 1ml 菌液接种于 50ml 液体 YEP 液体 培养基 ( 含 Rif 50mg/ml) 中扩大培养， 28℃， 200rpm 振荡培养至 OD600 值为 0.5 ； 冰浴 30min 后， 在 4 ℃， 5000rpm 条件下离心收集菌体， 重悬于冰冻的 10ml 的 0.15mol/L 的 NaCl 溶液 中； 在 4℃， 5000rpm 条件下再次离心收集菌体， 重悬于 1ml 的 20mmol/L 的 CaCl2 溶液中， 按 200μl/ 管分装 ； 制备好的感受态细胞置液氮中速冻 1min 后， 放于 -70℃冰箱保存， 半年内 使用 ；
(ii) 重组质粒的转化
向每管感受态细胞中加入大约 1μg 的重组质粒 pKO-ADE4， 冰浴 30min， 液氮速冻 1min， 37℃融化 3min ； 加入 800μl 的 YEP 液体培养基， 于 28℃、 150rpm 恢复培养 3h 后， 在 5000rpm 离心 1min 收集菌体 ； 将收集到的农杆菌菌体涂布于 YEP 平板上， 在 28℃培养 2-3 天， 挑取长出的单菌落 ；
(iii) 大丽轮枝菌的准备
取 100ml 三角瓶一个， 加入 CM 液体培养基 20ml， 接种平板或离心管保存的大丽轮 枝菌 ； 在 25℃， 150rpm 摇床中培养 2-3 天， 取少量菌液， 用无菌水稀释 10 倍后镜检， 计算孢
子数量 ； 根据检测结果， 用无菌水稀释至孢子浓度为 5×106cfu/ml ；
(iv) 共培养
制备 IM( 诱导培养基 ) 平板数块， 其中每块平板 (25ml) 含 50μL， 20mM 的 AS( 乙 酰丁香酮 )， 小心将灭菌的微孔滤膜放在平板上， 尽量不产生气泡 ； 分别吸取准备好的农杆 菌和大丽轮枝菌孢子悬浮液各 100μL 混匀 ； 将 200μL 农杆菌和大丽轮枝菌混合液均匀涂 布于微孔滤膜上， 在超净台内吹干， 并置于 25℃恒温培养箱中培养 48h。
(3) 阳性转化子的筛选和验证
将共培养后的农杆菌和大丽轮枝菌混合液均匀的涂布在同时添加有潮霉素 ( 浓 度 30μg/mL) 和 50μM 的 F2dU 的平板上， 在 25℃培养 5 天后， 平板上出现菌斑， 挑选 15 个 ADE4 基因敲除的候选转化子后， 对其进行分子生物学验证， 即以候选转化子的基因组 DNA 为模板， 以 Test-1 和 Test-2 为引物进行 PCR 扩增， PCR 的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 结果如图 3 所示。以野生型菌株基因组作为模板， 以 test-1 和 test-2 作为引物， 扩增出了 预期的 1.2kb 的 DNA 片段 ； 同样条件下以 15 个候选转化子的基因组 DNA 做模板， 其中 13 个 (1， 2， 3， 4， 5， 7， 8， 9， 10， 12， 13， 14， 15， 16 号 ) 扩增出了单一的 1.8kb 的 DNA 片段。 说明这 13 个转化子中 ADE4 基因成功地被 1.8kb 的潮霉素抗性基因同源重组所替代， 使引物 test-1 和 test-2 之间的距离增大到 1.8kb。而其余 2 个转化子 (6， 11 号 ) 被鉴定为 T-DNA 随机插 入的假阳性转化子， 显示了 1.2kb(ADE4 基因的 PCR 条带 ) 和 1.8kb( 随机插入的 T-DNA 中 同源重组片段的 PCR 条带 ) 的双电泳条带 ； 然后对这 15 个候选转化子进行了测序验证， 与 PCR 验证的结果相同。这两方面都说明 ΔADE4 突变体 ( 即缺失 ADE4 基因的转化子 ) 的构 建是成功的， 基因敲除转化子在总的转化子中所占比例为 13/15 ＝ 87％。
实施例 2
(1) 构建用于同源重组的重组质粒， 过程与实施例 1 相同， 包括三轮 PCR 过程 ：
第一轮 PCR ： 以大丽轮枝菌的基因组 DNA 为模板， 以 5F-ChsV 和 5R-ChsV 为引物， 通过 PCR 得到 ChsV 基因 (VDAG 00420， Broad 研究所 ) 上游侧翼序列的 DNA 片段， 约为 1000bp， 以 3F-ChsV 和 3R-ChsV 为引物， 通过 PCR 得到 ChsV 基因下游侧翼序列的 DNA 片段， 约为 1000bp ； 以 pUCHyg 为模板， 以 Hyg-F 和 Hyg-R 为引物， 进行 PCR 反应， 扩增得到长度为 1.8kb 的潮霉素抗性基因盒的 DNA 片段 ； 所述引物序列如表 3 所示， 所述 PCR 的条件与实施 例 1 相同， 如表 4 所示 ；
第二轮 PCR ： 利用融合 PCR 方法， 将潮霉素抗性基因盒的 DNA 片段， ChsV 基因上、 下 游侧翼序列的 DNA 片段为模板进行扩增， 所述融合 PCR 的条件如表 4 所示 ； 从而将上述三片 段首尾相接， 得到潮霉素抗性基因盒两侧各与 ChsV 基因上下游 1kb 片段相连接的 3.8kb 的 同源重组 DNA 片段， 所述 PCR 的条件如表 4 所示 ；
第 三 轮 PCR ： 以 第 二 轮 PCR 的 产 物 为 模 板， 以 Nest-F-ChsV 和 Nest-R-ChsV 为 “巢式” 引物， 通过 PCR 获得 3.8kb 融合片段的特异性扩增产物， 同时使该融合体两侧带有 Gateway BP 反应的接头， 引物序列如表 3 所示， 各 PCR 反应的条件如表 4 所示。
将构建好的同源重组 DNA 片段与 pGKO2-Gateway 载体进行 GatewayBP 反应， 得到 重组质粒 pKO-ChsV。具体步骤与实施例 1 相同。
表3
其中， 下划线 “_” 表示与 HygF 和 HygR 互补的序列 ； 波浪线表示用于 GatewayBP 反应的接头序列。
表4
表 4 显示了三轮 PCR 的引物、 模板和反应条件， 以及每轮 PCR 的反应产物。 (2) 农杆菌介导的转化 ： 按照实施例 1 的方法 (i) 制备感受态细胞 ； (ii) 重组质粒转化 ； (iii) 大丽轮枝菌的准备 ； (iv) 共培养。
(3) 阳性转化子的筛选和验证
将共培养后的农杆菌和大丽轮枝菌混合液均匀的涂布在同时添加有潮霉素 ( 终 浓度为 30μg/mL) 和 55μM 的 F2dU 的平板上， 在 25℃培养 2 天后， 平板上出现挑选 16 个 ChsV 基因敲除的候选转化子后， 对其进行了分子生物学验证， 即以候选转化子的基因组 DNA 为模板， 以 Test-3 和 Test-4 为引物进行 PCR 扩增， PCR 的产物进行琼脂糖凝胶电泳检 测， 结果如图 4 所示。以野生型菌株的基因组作为模板， 以 test-3 和 test-4 作为引物， 扩 增出了预期的 1.2kb 的 DNA 片段 ； 同样条件下以 16 个候选转化子的基因组 DNA 做模板， 其 中 7 个 (3， 4， 6， 8， 9， 13， 16 号 ) 扩增出了单一的 1.8kb 的 DNA 片段。说明这 16 个转化子中 ChsV 基因成功地被 1.8kb 的潮霉素抗性基因的同源重组所替代， 使引物 test-3 和 test-4 之间的距离增大到 1.8kb。然后对这 16 个候选转化子进行了测序验证， 与 PCR 验证的结果 相同。这两方面都说明 ChsV 缺失的突变体的构建是成功的， 基因敲除转化子在总的转化子 中所占比例为 7/16 ＝ 44％。
实施例 3
按照实施例 1 的方法进行大丽轮枝菌 ADE4 基因的敲除。 不同的是， 用于筛选的 F2dU 的终浓度为 0.5μM， 从平板上挑选 53 个 ADE4 基因敲 除的候选转化子进行验证， 只有 2 个为阳性转化子， 基因敲除转化子在总的转化子中所占 比例仅为 3.8％。
实施例 4
按照实施例 1 的方法进行大丽轮枝菌 ADE4 基因的敲除， 不同的是， 引物 5R-ADE4 分别换为 5R-2 和 5R-3， 同时引物 3F-ADE4 相应的换为 3F-2 和 3F-3， 引物序列如下所示，
5R-2 ： 5’ -TGG ACG ACT AAA CCA AAA TAG TTG ACG CTC ATC GACAGA-3’ (SEQ ID NO ： 21) ；
3F-2 ： 5’ -GAC TAT GAA AAT TCC GTC ACT AGG TTT CCG ACT CCGATG C-3’ (SEQ ID NO ： 22) ；
5R-3 ： 5’ -AAC GAC ACA AAT TTT GTG ATG TTG ACG CTC ATC GACAGA-3’ (SEQ ID NO ： 23) ；
3F-3 ： 5’ -CTT CAG GCT CCG GCG AAG AGT AGG TTT CCG ACT CCGATG C-3’ (SEQ ID NO ： 24) ；
按照实施例 1 的方法， 用上述两组引物 (5R-2 和 3F-2， 5R-3 和 3F-3) 进行 PCR， 然 后将得到的三段 PCR 产物进行融合 PCR， 用琼脂糖凝胶电泳进行检测融合 PCR 的产物， 几乎 观察不到明显的同源重组 DNA 片段的条带， 而从图 2 中第 5 泳道可以观察到非常明显的同 源重组 DNA 片段的条带。说明使用实施例 1 的引物中的融合 PCR 的接头序列与待敲除基因 片段之间的连接效率很高。
比较实施例 1 和实施例 3 的结果， 可以看出， 实施例 1 中阳性转化子在总的转化 子中的比例高达 87％， 而当使用的 F2dU 的浓度过低时 ( 即现有技术中所使用的浓度 )， 基 因敲除效率大大降低了， 仅为 3.8％， 但仍高于现有技术 1.8％的基因敲除效率。这说明本 发明的方法是一种高效的筛选阳性转化子的大丽轮枝菌基因敲除的方法， 同时说明使用的 F2dU 的浓度在 40-60μM， 进一步优选在 45-55μM 时能够得到最高的基因敲除效率。
比较实施例 1 和实施例 4 的结果可以看出， 使用其他融合 PCR 的接头序列得到同 源重组 DNA 片段的效率非常低， 几乎观察不到阳性连接片段， 说明实施例 1 中使用的三轮 PCR 的引物序列尤其是引物中用于融合 PCR 的接头序列， 能够极大的提高同源重组 DNA 片段 的构建成功率， 从而便利了整个基因敲除的过程， 提高整体基因敲除方法的成功率。13CN 102653755 A
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