稻瘟病抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记及其方法与应 用 技术领域 本发明属于农业生物技术领域， 特别涉及一种稻瘟病抗性基因 Pik-s 功能特异性 分子标记 PiksFNP 及其方法与应用。
背景技术 水稻是世界上最重要的粮食作物之一， 约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻 瘟病菌 (Magnapothe oryzae) 引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一， 每年都 造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看， 抗病品种的育成与利用 是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定， 这不仅要 求育种者必须具备丰富的接种、 调查经验， 而且还容易受到环境以及人为因素的影响， 鉴定 结果容易造成误差， 目标基因的选择效率往往较低。 随着分子标记技术的产生以及利用， 其 方便、 直接、 不受环境影响等优点使得该技术的应用价值及前景越来越受到关注。 在育种方 面， 通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记， 特别是在基因内部开发其功能特异性的分 子标记来对目标基因进行选择， 不仅选择可靠性高， 而且还大大加快了育种步伐。
由于位于第 11 染色体长臂端上的 Pik 位点含有 5 个具有不同抗谱以及小种特 异性的等位基因 Pik-m、 Pik、 Pik-p、 Pik-h 以及 Pik-s， 因此该位点一直是稻瘟病抗性 的 研 究 热 门。 其 中， Pik-m(Ashikawa et al.2008.Two adjacent nucleotide-binding site-leucine rich repeat class genes are required to confer Pikm-specific rice blast resistance.Genetics 180 ： 2267-2276)、 Pik(Zhai et al.2011.The isolation and characterization of Pik， a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication.New Phytologist 189 ： 321-334) 以及 Pik-p(Yuan et al.2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes.Theor Appl Genet 122 ： 1017-1028) 已被成功地鉴定并克隆。研究表 明， 这 3 个等位基因的稻瘟病抗性须由 2 个相邻的 NBS-LRR 类抗病基因共同介导。同时， 在 水稻群体中， 包含这 3 个等位基因的基因组区域存在着基因型的分化， 即当相邻的 2 个功能 性的 NBS-LRR 基因同时存在时， 该基因型被定义为 K 型 ； 而当相邻的 2 个功能性的 NBS-LRR 基因同时不存在时， 该基因型被定义为 N 型 ( 基因型与感病水稻参考品种日本晴的相同 )。
申请人在 Pik-s 的精细定位过程中发现， 在包含 Pik-s 位点的基因组区域中， Pik-s 供体品种 Shin 2(Wang et al.2009.Characterization of rice blast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus.Phytopathology 99 ： 900-905) 与 Pik-m， Pik 以及 Pik-p 的供体品种具有相似的基因组结构， 即与参考序列日本 晴之间存在着大片段的插入 / 缺失。进一步的功能互补实验结果证明了 Pik-s 与 Pik-m、 Pik、 Pik-p 是真正的等位基因 ( 申请人未发表数据 )。
为了加快 Pik-s 在抗病育种工作中的应用， 如在大量的水稻种质资源中筛选、 鉴 定该功能性抗性基因， 以及在分子标记辅助选择育种、 抗性基因 Pik-s 与其他功能基因的
聚合育种、 以及转基因育种中的应用， 开发出准确有效且区别于其它等位基因的 Pik-s 功 能特异性分子标记显得尤其重要。 发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点， 本发明的首要目的是提供一种稻瘟病抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记 PiksFNP。
本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记 PiksFNP 的检测方法。
本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记 PiksFNP 的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现 ：
一 种 稻 瘟 病 抗 性 基 因 Pik-s 功 能 特 异 性 分 子 标 记 PiksFNP， 它 由 Piks-1FNP、 Piks-2FNP 和 Piks-3FNP 组合而成， 分别由引物对 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2， SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4 以及 SEQ ID NO ： 5 和 SEQ ID NO ： 6 从水稻总 DNA 中扩增出来的核苷 酸序列， 并经特异性酶切之后， 与稻瘟病抗性基因 Pik-s 呈特异性带型的分子标记 ；
所述引物对的核苷酸序列如下所示 ： SEQ ID NO.1(5’ -3’ )： GTCCTACGACCTGGATGATG ； SEQ ID NO.2(5’ -3’ )： CAGAGAAGCGATTGGAGGCA ； SEQ ID NO.3(5’ -3’ )： TAGACGAGCAAGTCCCTGA ； SEQ ID NO.4(5’ -3’ )： GCAAAGTTTACTCCAATCGC ； SEQ ID NO.5(5’ -3’ )： TTTCTGGAGGTCAGCCGAT ； SEQ ID NO.6(5’ -3’ )： CAACCGTTGTTTTGCCTCC ； 优选的， 所述的水稻品种为 Shin 2 ； 所述的稻瘟病抗性基因 Pik-s 包括 2 个编码 NBS-LRR 类蛋白的基因 Piks-1 和Piks-2。 所述的特异性酶切指的是由引物对 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 扩增得到的 PCR 产物通过限制性内切酶 SphI 酶切 ； 由引物对 SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4 扩增得到的 PCR 产物通过限制性内切酶 Nco I 酶切 ； 由引物对 SEQ ID NO ： 5 和 SEQ ID NO ： 6 扩增得到的 PCR 产物通过限制性内切酶 Spe I 酶切。
所述的稻瘟病抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记 PiksFNP 的检测方法， 通过对 多个水稻稻瘟病抗性基因 Pik-s 的等位基因序列与 Piks-1 及 Piks-2 序列做比对的方法， 分析得到能区别于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的 Pik-s 功能特异性的 3 个 单碱基差异 (single nucleotide polymorphism， SNP)， 再通过设计分别得到 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2， SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 以及 SEQ ID NO ： 5 和 SEQ ID NO ： 6 引物， 对水稻 DNA 扩增， 并经特异性酶切之后， 分别得到 Pik-s 功能特异性分子标记 Piks-1FNP、 Piks-2FNP 和 Piks-3FNP， 优选包括以下步骤 ：
(1) 通过常规 PCR 法扩增， 获得多个 K 型水稻品种的 Pik-s 等位基因的编码区 DNA 序列 ；
(2) 将步骤 (1) 所获得的序列比对， 得到 Pik-s 抗性基因所特异的 3 个功能特异性
单碱基差异 Piks-1SNP、 Piks-2SNP 和 Piks-3SNP ；
(3) 根据步骤 (2) 所得到的 3 个 SNP， 分别设计出引物对 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2， SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 以及 SEQ ID NO ： 5 和 SEQ IDNO ： 6， 并用这 3 组引物对 稻瘟病抗性水稻总 DNA 进行 PCR 扩增反应， 分别得到扩增产物 A、 扩增产物 B 和扩增产物 C ； 然后分别对扩增产物进行酶切、 电泳， 比较验证， 分别得到与稻瘟病抗性基因 Piks 呈特异 性带型的核苷酸片段 Piks-1FNP、 Piks-2FNP 和 Piks-3FNP ；
(4) 对步骤 (3) 所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证， 从而确定 Pik-s 抗 性基因的功能特异性的分子标记 PiksFNP( 由 Piks-1FNP、 Piks-2FNP 和 Piks-3FNP 组合而 成 )。
更优选的，
步骤 (1) 所述的水稻品种为 Shin 2、 Tsuyuake、 Kusabue、 K3、 K60、 黑交 (Heijiao， HJ) 以及 Q1063。
步骤 (2) 中所述的序列比对优选为将核苷酸序列翻译成蛋白质序列后进行比对 ；
步骤 (3) 中所述的扩增产物 A 的大小为 124bp， 酶切后的大小为 103bp ；
步骤 (3) 中所述的扩增产物 B 的大小为 145bp， 酶切后的大小为 64bp 和 81bp ；
步骤 (3) 中所述的扩增产物 C 的大小为 139bp， 酶切后的大小为 119bp ；
步骤 (3) 中所述的引物是根据 dCAPS 标记原理， 在 Piks-1SNP 位点设计带有错配 碱基的功能特异性上游引物 Piks-1FNP-F， 而在其下游 100 ～ 200bp 处设计功能特异性下 游引物 Piks-1FNP-R， 分别如 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示 ； 根据 CAPS 标记原理， 在 Piks-2SNP 位点的上、 下游各 100bp 范围内设计功能特异性上、 下游引物 Piks-2FNP-F 及 Piks-2FNP-R， 分别如 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 所示 ； 根据 dCAPS 标记原理， 在 Piks-3SNP 位点设计带有错配碱基的功能特异性上游引物 Piks-3FNP-F， 而在其下游 100 ～ 200bp 处设 计功能特异性下游引物 Piks-3FNP-R， 分别如 SEQ ID NO.5 和 SEQ ID NO.6 所示 ；
步骤 (3) 所述的 PCR 扩增反应， 其中 Piks-1FNP 的 PCR 扩增反应体系如下 ：
扩增反应温度循环条件如下 ： 94℃ 3 分钟 ； 94℃ 30 秒、 58℃ 30 秒、 72℃ 1 分钟， 35 个循环 ； 72℃ 5 分钟 ； 10℃保存。PCR 反应结束后， 利用限制性内切酶 SphI 对所获得的 PCR 产物进行酶切， 反应体系如下 ：
在 37℃条件下酶切 3 小时后， 取适量酶切样品在 8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电 泳检测， 电泳条件为 90V， 2 小时 30 分钟。扩增所得到的 PCR 产物大小为 124bp， 酶切后所得 到的产物大小为 103bp， 前者 ( 不能被酶切 ) 即为抗性基因 Pik-s 的功能特异性分子标记 Piks-1FNP。
步骤 (3) 所述的 PCR 扩增反应， 其中 Piks-2FNP 的 PCR 扩增反应体系如下 ：
扩增反应温度循环条件如下 ： 94℃ 3 分钟 ； 94℃ 30 秒、 58℃ 30 秒、 72℃ 1 分钟， 35 个循环 ； 72℃ 5 分钟 ； 10℃保存。
PCR 反应结束后， 利用限制性内切酶 Nco I 对所获得的 PCR 产物进行酶切， 反应体 系如下 ：
在 37℃条件下酶切 3 小时后， 取适量酶切样品在 8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测， 电泳条件为 90V， 2 小时 30 分钟。扩增所得到的 PCR 产物大小为 145bp， 酶切后得到 的产物大小为 64bp 和 81bp， 前者 ( 不能被酶切 ) 即为抗性基因 Pik-s 的功能特异性分子标 记 Piks-2FNP。
步骤 (3) 所述的 PCR 扩增反应， 其中 Piks-3FNP 的 PCR 扩增反应体系如下 ：
扩增反应温度循环条件如下 ： 94℃ 3 分钟 ； 94℃ 30 秒、 58℃ 30 秒、 72℃ 1 分钟， 35 个循环 ； 72℃ 5 分钟 ； 10℃保存。
PCR 反应结束后， 利用限制性内切酶 Spe I 对所获得的 PCR 产物进行酶切， 反应体 系如下 ：
在 37℃条件下酶切 3 小时后， 取适量酶切样品在 8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电 泳检测， 电泳条件为 90V， 2 小时 30 分钟。扩增所得到的 PCR 产物大小为 139bp， 酶切后得 到的产物大小为 119bp， 前者 ( 不能被酶切 ) 即为抗性基因 pik-s 的功能特异性分子标记 Piks-3FNP。
一种稻瘟病抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记 PiksFNP 的应用， 包括在水稻种 质资源中快速、 直接地鉴定该抗性基因， 以及在分子标记辅助选择育种、 基因聚合育种以及 转基因育种中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ：
本发明的 Pik-s 功能特异性选择标记以 PCR 技术为基础， 不仅能区分水稻品种的 基因型， 而且能够方便、 快捷、 直接地实现了目标基因 Pik-s 在水稻种质资源中以及育种后 代中的鉴定， 特别是等位基因之间的鉴别， 且不受环境以及人为因素的影响。因此， 能够得
到广泛的应用， 对降低劳动成本， 提高育种工作效率起到积极重要的作用。 附图说明 图 1 是具有功能特异性 SNP 的水稻稻瘟病抗性基因 Pik-s 的组成基因之一 Piks-1 与 4 个 Pik 位点等位基因及 2 个感病等位基因的蛋白质序列比对图 ； 黑色星号表示由 Piks-1FNP 造成的功能特异性氨基酸的改变 ； 黑色三角号表示由 Piks-3FNP 造成的功能特 异性氨基酸的改变。
图 2 是具有功能特异性 SNP 的水稻稻瘟病抗性基因 Pik-s 的组成基因之一 Piks-2 与 4 个 Pik 位点等位基因及 2 个感病等位基因的蛋白质序列比对图 ； 黑色星号表示由 Piks-2FNP 造成的功能特异性氨基酸的改变。
图 3 是验证图， 其中 ：
图 (A) 为 Pik-s 功能特异性分子标记 Piks-1FNP 在 9 个水稻品种中的验证图， 其 中， 泳道 1 ： 抗性基因供体品种 Shin 2(Pik-s) ； 泳道 2 ： IRBLks-S(Pik-s 单基因系 ) ； 泳道 3： 抗性品种 K3(Pik-h) ； 泳道 4 ： IRBLkh-K3(Pik-h 单基因系 ) ； 泳道 5 ： IRBLk-Ka(Pik 单基 因系 ) ； 泳道 6 ： IRBLkm-TS(Pik-m 单基因系 ) ； 泳道 7 ： IRBLkp-K60(Pik-p 单基因系 ) ； 泳道 8： IRBL7-M(Pi7 单基因系 ) ； 泳道 9 ： IRBL1-CL(Pi1 单基因系 ) ； 泳道 M ： DNAladder ；
图 (B) 是 Pik-s 功能特异性分子标记 Piks-2FNP 在 9 个水稻品系中的验证及检测 图， 其中， 泳道 1 ： 抗性基因供体品种 Shin 2(Pik-s) ； 泳道 2 ： IRBLks-S(Pik-s 单基因系 ) ； 泳道 3 ： 抗性品种 K3(Pik-h) ； 泳道 4 ： IRBLkh-K3 ： (Pik-h 单基因系 ) ； 泳道 5 ： IRBLk-Ka(Pik 单基因系 ) ； 泳道 6 ： IRBLkm-TS(Pik-m 单基因系 ) ； 泳道 7 ： IRBLkp-K60(Pik-p 单基因系 ) ； 泳道 8 ： IRBL7-M(Pi7 单基因系 ) ； 泳道 9 ： IRBL1-CL(Pi1 单基因系 ) ； 泳道 M ： DNAladder ；
图 (C) 是 Pik-s 功能特异性分子标记 Piks-3FNP 在 9 个水稻品系中的验证及检测 图， 其中， 泳道 1 ： 抗性基因供体品种 Shin 2(Pik-s) ； 泳道 2 ： IRBLks-S(Pik-s 单基因系 ) ； 泳道 3 ： 抗性品种 K3(Pik-h) ； 泳道 4 ： IRBLkh-K3 ： (Pik-h 单基因系 ) ； 泳道 5 ： IRBLk-Ka(Pik 单基因系 ) ； 泳道 6 ： IRBLkm-TS(Pik-m 单基因系 ) ； 泳道 7 ： IRBLkp-K60(Pik-p 单基因系 ) ； 泳道 8 ： IRBL7-M(Pi7 单基因系 ) ； 泳道 9 ： IRBL1-CL(Pi1 单基因系 ) ； 泳道 M ： DNAladder。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。
实施例 1 ： Pik-s 等位基因编码区序列的比对及 SNP 的鉴定
通过常规的 PCR 扩增 (Yuan et al.2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NB S-LRR genes.Theor Appl Genet 122 ： 1017-1028 ； Zhai et al.2011.The isolation and characterization of Pik， a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication. New Phytologist 189 ： 321-334)、 测序 ( 上海英骏生物技术有限公司， 广州分公司 )， 从5 个抗病水稻品种 [Shin 2(Pik-s 供体品种 )， Tsuyuake(Pik-m 供体品种 )， Kusabue(Pik 供 体品种 )， K60(Pik-p 供体品种 ) ； Wang et al.2009.Characterization of rice blast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus.Phytopathology 99 ： 900-905]、 K3(Pik-h 供体品种 ； Xu et al.2008.Efficient authentic fine mapping of the rice blast resistance gene Pik-h in the Pik cluster， using new Pik-h-differentiating isolates.Molecular Breeding 22 ： 289-299) 以 及 2 个 K 型感病水稻品种黑交 (Heijiao， HJ) 和 Q1063(Zhai et al.2011.The isolation and characterization ofPik， a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication.New Phytologist 189 ： 321-334) 中获得相应的 Pik-s 等位基因编码区 DNA 序列 [Pik-s(HQ662329)， Pik-p(HM035369)， Pik(HM048900)， Pik-m (AB462256)， 已 经公开于 http://www.ncbi.nlm.nih.gov] ； 利用多序列比对软件工具 (http://multalin. toulouse.inra.fr/multalin/)， 通过对这些序列翻译后的蛋白质序列比对分析， 鉴定到存 在于 Piks-1 基因 cDNA 第 347 位点， 第 782 位点以及 Piks-2 基因 cDNA 第 1301 位点的功能 特异性 SNP。在 Piks-1 基因第 347 位点， Piks-1 编码的第 116 位点氨基酸为精氨酸 (R)， 而 Pikp-1、 Pikh-1 及 Pikl-63 编码的则为组氨酸 (H)， 因此， 该位点可以将 Piks-1 与等位基因 Pikp-l、 Pikh-1 及 Pikl-63 区分开 ( 图 1)。而在 Piks-1 基因第 782 位点， Piks-1 编码的 第 264 位点氨基酸为丙氨酸 (A)， 而等位基因 Pikm1-TS 和 Pik-1 编码的则为缬氨酸 (V)， 因 此， 该位点可以将 Piks-1 与 Pikm1-TS 及 Pik-1 区分开 ( 图 1)。而在 Piks-2 基因第 1301 位点， Piks-2 编码的第 434 位点氨基酸为丝氨酸 (S)， 而等位基因 Pikh-2 和 Pikp-2 编码的 则为苏氨酸 (T)， 因此， 该位点可以将 Piks-2 与 Pikh-2 和 Pikp-2 区分开 ( 图 2)。以上 3 个功能特异性 SNP 位点的组合使用则可以将 Pik-s 与 Pik-p、 Pikm-TS、 Pik、 Pikh、 及 Pik-63 等其他稻瘟病抗性基因区分开。
实施例 2 ： Pik-s 功能特异性分子标记及其引物设计与检测
根 据 dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences ； Neff et al.2002.Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis. Trends in Genetics 18 ： 613-615) 及 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences ； Konieczny and Ausubel， 2002.A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.Plant J 4 ： 403-410) 标记的设计 原理， 根据 dCAPS 标记原理， 在 Piks-1SNP 位点设计带有错配碱基的功能特异性上游引物 Piks-1FNP-F， 而在其下游 100 ～ 200bp 处设计功能特异性下游引物 Piks-1FNP-R， 分别如 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示 ； 根据 CAPS 标记原理， 在 Piks-2SNP 位点的上、 下游各 100bp 范围内设计功能特异性上、 下游引物 Piks-2FNP-F 及 Piks-2FNP-R， 分别如 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 所示 ； 根据 dCAPS 标记原理， 在 Piks-3SNP 位点设计带有错配碱基的 功能特异性上游引物 Piks-3FNP-F， 而在其下游 100 ～ 200bp 处设计功能特异性下游引物 Piks-3FNP-R， 分别如 SEQ ID NO.5 和 SEQ ID NO.6 所示。通过这 3 组引物对携带有 Pik-s 基因以及其他等位基因的品种 DNA 模板进行扩增， 分别得到扩增产物 A、 扩增产物 B 和扩增 产物 C ； 然后分别对扩增产物进行酶切、 电泳， 比较验证， 分别得到与稻瘟病抗性基因 Piks 呈特异性带型的核苷酸片段 Piks-1FNP、 Piks-2FNP 和 Piks-3FNP。
Piks-1FNP 的 PCR 扩增反应体系如下 ：
扩增反应温度循环条件如下 ： 94℃ 3 分钟 ； 94℃ 30 秒、 58℃ 30 秒、 72℃ 1 分钟， 35 个循环 ； 72℃ 5 分钟 ； 10℃保存。
PCR 反应结束后， 利用限制性内切酶 SphI 对所获得的 PCR 产物进行酶切， 反应体系 如下 ：
在 37℃条件下酶切 3 小时后， 取适量酶切样品在 8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电 泳检测， 电泳条件为 90V， 2 小时 30 分钟。扩增所得到的 PCR 产物大小为 124bp， 酶切后所得 到的产物大小为 103bp， 前者 ( 不能被酶切 ) 即为抗性基因 Pik-s 的功能特异性分子标记 Piks-1FNP。
步骤 3) 所述的 PCR 扩增反应， 其中 Piks-2FNP 的 PCR 扩增反应体系如下 ：
扩增反应温度循环条件如下 ： 94℃ 3 分钟 ； 94℃ 30 秒、 58℃ 30 秒、 72℃ 1 分钟， 35 个循环 ； 72℃ 5 分钟 ； 10℃保存。
PCR 反应结束后， 利用限制性内切酶 Nco I 对所获得的 PCR 产物进行酶切， 反应体 系如下 ：
在 37℃条件下酶切 3 小时后， 取适量酶切样品在 8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电 泳检测， 电泳条件为 90V， 2 小时 30 分钟。扩增所得到的 PCR 产物大小为 145bp， 酶切后得到 的产物大小为 64bp 和 81bp， 前者 ( 不能被酶切 ) 即为抗性基因 Pik-s 的功能特异性分子标 记 Piks-2FNP。
步骤 3) 所述的 PCR 扩增反应， 其中 Piks-3FNP 的 PCR 扩增反应体系如下 ：
扩增反应温度循环条件如下 ： 94℃ 3 分钟 ； 94℃ 30 秒、 58℃ 30 秒、 72℃ 1 分钟， 35 个循环 ； 72℃ 5 分钟 ； 10℃保存。
PCR 反应结束后， 利用限制性内切酶 Spe I 对所获得的 PCR 产物进行酶切， 反应体 系如下 ：
在 37℃条件下酶切 3 小时后， 取适量酶切样品在 8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电 泳检测， 电泳条件为 90V， 2 小时 30 分钟。扩增所得到的 PCR 产物大小为 139bp， 酶切后得 到的产物大小为 119bp， 前者 ( 不能被酶切 ) 即为抗性基因 Pik-s 的功能特异性分子标记 Piks-3FNP。
实施例 3 ： 抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记在鉴别不同稻瘟病抗性基因中的 应用
采集含有不同的稻瘟病抗性基因的 9 个水稻品系， 分别为 ： Shin 2(Pik-s 供体 品种 ； Wang et al.2009.Characterization of rice blast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus.Phytopathology 99 ： 900-905) ； K3(Pik-h 供体品种 ； Xu et al.2008.Efficient authentic fine mapping of the rice blast resistance gene Pik-h in the Pik cluster， using new Pik-h-differentiating isolates.Molecular Breeding 22 ： 289-299) ； IRBLkh-K3 ， IRBLk-Ka ， IRBLkm-TS ， IRBLkp-K60， IRBL7-M， IRBL 1-CL， IRBLks-S[Kobayashi et al.2007.Developmentof new sets of international standard differential varieties for blast resistance in rice (Oryza sativa L.).JARQ 41 ： 31-37] 的基因组 DNA， 并以此为模板， 利用实施例 2 中 描述的 Piks-1FNP、 Piks-2FNP 和 Piks-3FNP 的 PCR 扩增反应体系和反应条件， 对抗性基因
Pik-s 功能特异性的分子标记进行 PCR 扩增、 酶切及电泳检测。 电泳结果分别如图 3A、 图 3B 和图 3C 所示。
如附图说明的那样， 试验结果与设计分析的相吻合， 说明抗性基因 Pik-s 功能特 异性分子标记可在鉴别 Pik-s 基因与其他稻瘟病抗性基因得到应用。
背景技术 水稻是世界上最重要的粮食作物之一， 约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻 瘟病菌 (Magnapothe oryzae) 引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一， 每年都 造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看， 抗病品种的育成与利用 是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定， 这不仅要 求育种者必须具备丰富的接种、 调查经验， 而且还容易受到环境以及人为因素的影响， 鉴定 结果容易造成误差， 目标基因的选择效率往往较低。 随着分子标记技术的产生以及利用， 其 方便、 直接、 不受环境影响等优点使得该技术的应用价值及前景越来越受到关注。 在育种方 面， 通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记， 特别是在基因内部开发其功能特异性的分 子标记来对目标基因进行选择， 不仅选择可靠性高， 而且还大大加快了育种步伐。
由于位于第 11 染色体长臂端上的 Pik 位点含有 5 个具有不同抗谱以及小种特 异性的等位基因 Pik-m、 Pik、 Pik-p、 Pik-h 以及 Pik-s， 因此该位点一直是稻瘟病抗性 的 研 究 热 门。 其 中， Pik-m(Ashikawa et al.2008.Two adjacent nucleotide-binding site-leucine rich repeat class genes are required to confer Pikm-specific rice blast resistance.Genetics 180 ： 2267-2276)、 Pik(Zhai et al.2011.The isolation and characterization of Pik， a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication.New Phytologist 189 ： 321-334) 以及 Pik-p(Yuan et al.2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes.Theor Appl Genet 122 ： 1017-1028) 已被成功地鉴定并克隆。研究表 明， 这 3 个等位基因的稻瘟病抗性须由 2 个相邻的 NBS-LRR 类抗病基因共同介导。同时， 在 水稻群体中， 包含这 3 个等位基因的基因组区域存在着基因型的分化， 即当相邻的 2 个功能 性的 NBS-LRR 基因同时存在时， 该基因型被定义为 K 型 ； 而当相邻的 2 个功能性的 NBS-LRR 基因同时不存在时， 该基因型被定义为 N 型 ( 基因型与感病水稻参考品种日本晴的相同 )。
申请人在 Pik-s 的精细定位过程中发现， 在包含 Pik-s 位点的基因组区域中， Pik-s 供体品种 Shin 2(Wang et al.2009.Characterization of rice blast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus.Phytopathology 99 ： 900-905) 与 Pik-m， Pik 以及 Pik-p 的供体品种具有相似的基因组结构， 即与参考序列日本 晴之间存在着大片段的插入 / 缺失。进一步的功能互补实验结果证明了 Pik-s 与 Pik-m、 Pik、 Pik-p 是真正的等位基因 ( 申请人未发表数据 )。
为了加快 Pik-s 在抗病育种工作中的应用， 如在大量的水稻种质资源中筛选、 鉴 定该功能性抗性基因， 以及在分子标记辅助选择育种、 抗性基因 Pik-s 与其他功能基因的
聚合育种、 以及转基因育种中的应用， 开发出准确有效且区别于其它等位基因的 Pik-s 功 能特异性分子标记显得尤其重要。 发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点， 本发明的首要目的是提供一种稻瘟病抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记 PiksFNP。
本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记 PiksFNP 的检测方法。
本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记 PiksFNP 的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现 ：
一 种 稻 瘟 病 抗 性 基 因 Pik-s 功 能 特 异 性 分 子 标 记 PiksFNP， 它 由 Piks-1FNP、 Piks-2FNP 和 Piks-3FNP 组合而成， 分别由引物对 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2， SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4 以及 SEQ ID NO ： 5 和 SEQ ID NO ： 6 从水稻总 DNA 中扩增出来的核苷 酸序列， 并经特异性酶切之后， 与稻瘟病抗性基因 Pik-s 呈特异性带型的分子标记 ；
所述引物对的核苷酸序列如下所示 ： SEQ ID NO.1(5’ -3’ )： GTCCTACGACCTGGATGATG ； SEQ ID NO.2(5’ -3’ )： CAGAGAAGCGATTGGAGGCA ； SEQ ID NO.3(5’ -3’ )： TAGACGAGCAAGTCCCTGA ； SEQ ID NO.4(5’ -3’ )： GCAAAGTTTACTCCAATCGC ； SEQ ID NO.5(5’ -3’ )： TTTCTGGAGGTCAGCCGAT ； SEQ ID NO.6(5’ -3’ )： CAACCGTTGTTTTGCCTCC ； 优选的， 所述的水稻品种为 Shin 2 ； 所述的稻瘟病抗性基因 Pik-s 包括 2 个编码 NBS-LRR 类蛋白的基因 Piks-1 和Piks-2。 所述的特异性酶切指的是由引物对 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 扩增得到的 PCR 产物通过限制性内切酶 SphI 酶切 ； 由引物对 SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4 扩增得到的 PCR 产物通过限制性内切酶 Nco I 酶切 ； 由引物对 SEQ ID NO ： 5 和 SEQ ID NO ： 6 扩增得到的 PCR 产物通过限制性内切酶 Spe I 酶切。
所述的稻瘟病抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记 PiksFNP 的检测方法， 通过对 多个水稻稻瘟病抗性基因 Pik-s 的等位基因序列与 Piks-1 及 Piks-2 序列做比对的方法， 分析得到能区别于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的 Pik-s 功能特异性的 3 个 单碱基差异 (single nucleotide polymorphism， SNP)， 再通过设计分别得到 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2， SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 以及 SEQ ID NO ： 5 和 SEQ ID NO ： 6 引物， 对水稻 DNA 扩增， 并经特异性酶切之后， 分别得到 Pik-s 功能特异性分子标记 Piks-1FNP、 Piks-2FNP 和 Piks-3FNP， 优选包括以下步骤 ：
(1) 通过常规 PCR 法扩增， 获得多个 K 型水稻品种的 Pik-s 等位基因的编码区 DNA 序列 ；
(2) 将步骤 (1) 所获得的序列比对， 得到 Pik-s 抗性基因所特异的 3 个功能特异性
单碱基差异 Piks-1SNP、 Piks-2SNP 和 Piks-3SNP ；
(3) 根据步骤 (2) 所得到的 3 个 SNP， 分别设计出引物对 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2， SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 以及 SEQ ID NO ： 5 和 SEQ IDNO ： 6， 并用这 3 组引物对 稻瘟病抗性水稻总 DNA 进行 PCR 扩增反应， 分别得到扩增产物 A、 扩增产物 B 和扩增产物 C ； 然后分别对扩增产物进行酶切、 电泳， 比较验证， 分别得到与稻瘟病抗性基因 Piks 呈特异 性带型的核苷酸片段 Piks-1FNP、 Piks-2FNP 和 Piks-3FNP ；
(4) 对步骤 (3) 所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证， 从而确定 Pik-s 抗 性基因的功能特异性的分子标记 PiksFNP( 由 Piks-1FNP、 Piks-2FNP 和 Piks-3FNP 组合而 成 )。
更优选的，
步骤 (1) 所述的水稻品种为 Shin 2、 Tsuyuake、 Kusabue、 K3、 K60、 黑交 (Heijiao， HJ) 以及 Q1063。
步骤 (2) 中所述的序列比对优选为将核苷酸序列翻译成蛋白质序列后进行比对 ；
步骤 (3) 中所述的扩增产物 A 的大小为 124bp， 酶切后的大小为 103bp ；
步骤 (3) 中所述的扩增产物 B 的大小为 145bp， 酶切后的大小为 64bp 和 81bp ；
步骤 (3) 中所述的扩增产物 C 的大小为 139bp， 酶切后的大小为 119bp ；
步骤 (3) 中所述的引物是根据 dCAPS 标记原理， 在 Piks-1SNP 位点设计带有错配 碱基的功能特异性上游引物 Piks-1FNP-F， 而在其下游 100 ～ 200bp 处设计功能特异性下 游引物 Piks-1FNP-R， 分别如 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示 ； 根据 CAPS 标记原理， 在 Piks-2SNP 位点的上、 下游各 100bp 范围内设计功能特异性上、 下游引物 Piks-2FNP-F 及 Piks-2FNP-R， 分别如 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 所示 ； 根据 dCAPS 标记原理， 在 Piks-3SNP 位点设计带有错配碱基的功能特异性上游引物 Piks-3FNP-F， 而在其下游 100 ～ 200bp 处设 计功能特异性下游引物 Piks-3FNP-R， 分别如 SEQ ID NO.5 和 SEQ ID NO.6 所示 ；
步骤 (3) 所述的 PCR 扩增反应， 其中 Piks-1FNP 的 PCR 扩增反应体系如下 ：
扩增反应温度循环条件如下 ： 94℃ 3 分钟 ； 94℃ 30 秒、 58℃ 30 秒、 72℃ 1 分钟， 35 个循环 ； 72℃ 5 分钟 ； 10℃保存。PCR 反应结束后， 利用限制性内切酶 SphI 对所获得的 PCR 产物进行酶切， 反应体系如下 ：
在 37℃条件下酶切 3 小时后， 取适量酶切样品在 8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电 泳检测， 电泳条件为 90V， 2 小时 30 分钟。扩增所得到的 PCR 产物大小为 124bp， 酶切后所得 到的产物大小为 103bp， 前者 ( 不能被酶切 ) 即为抗性基因 Pik-s 的功能特异性分子标记 Piks-1FNP。
步骤 (3) 所述的 PCR 扩增反应， 其中 Piks-2FNP 的 PCR 扩增反应体系如下 ：
扩增反应温度循环条件如下 ： 94℃ 3 分钟 ； 94℃ 30 秒、 58℃ 30 秒、 72℃ 1 分钟， 35 个循环 ； 72℃ 5 分钟 ； 10℃保存。
PCR 反应结束后， 利用限制性内切酶 Nco I 对所获得的 PCR 产物进行酶切， 反应体 系如下 ：
在 37℃条件下酶切 3 小时后， 取适量酶切样品在 8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测， 电泳条件为 90V， 2 小时 30 分钟。扩增所得到的 PCR 产物大小为 145bp， 酶切后得到 的产物大小为 64bp 和 81bp， 前者 ( 不能被酶切 ) 即为抗性基因 Pik-s 的功能特异性分子标 记 Piks-2FNP。
步骤 (3) 所述的 PCR 扩增反应， 其中 Piks-3FNP 的 PCR 扩增反应体系如下 ：
扩增反应温度循环条件如下 ： 94℃ 3 分钟 ； 94℃ 30 秒、 58℃ 30 秒、 72℃ 1 分钟， 35 个循环 ； 72℃ 5 分钟 ； 10℃保存。
PCR 反应结束后， 利用限制性内切酶 Spe I 对所获得的 PCR 产物进行酶切， 反应体 系如下 ：
在 37℃条件下酶切 3 小时后， 取适量酶切样品在 8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电 泳检测， 电泳条件为 90V， 2 小时 30 分钟。扩增所得到的 PCR 产物大小为 139bp， 酶切后得 到的产物大小为 119bp， 前者 ( 不能被酶切 ) 即为抗性基因 pik-s 的功能特异性分子标记 Piks-3FNP。
一种稻瘟病抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记 PiksFNP 的应用， 包括在水稻种 质资源中快速、 直接地鉴定该抗性基因， 以及在分子标记辅助选择育种、 基因聚合育种以及 转基因育种中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ：
本发明的 Pik-s 功能特异性选择标记以 PCR 技术为基础， 不仅能区分水稻品种的 基因型， 而且能够方便、 快捷、 直接地实现了目标基因 Pik-s 在水稻种质资源中以及育种后 代中的鉴定， 特别是等位基因之间的鉴别， 且不受环境以及人为因素的影响。因此， 能够得
到广泛的应用， 对降低劳动成本， 提高育种工作效率起到积极重要的作用。 附图说明 图 1 是具有功能特异性 SNP 的水稻稻瘟病抗性基因 Pik-s 的组成基因之一 Piks-1 与 4 个 Pik 位点等位基因及 2 个感病等位基因的蛋白质序列比对图 ； 黑色星号表示由 Piks-1FNP 造成的功能特异性氨基酸的改变 ； 黑色三角号表示由 Piks-3FNP 造成的功能特 异性氨基酸的改变。
图 2 是具有功能特异性 SNP 的水稻稻瘟病抗性基因 Pik-s 的组成基因之一 Piks-2 与 4 个 Pik 位点等位基因及 2 个感病等位基因的蛋白质序列比对图 ； 黑色星号表示由 Piks-2FNP 造成的功能特异性氨基酸的改变。
图 3 是验证图， 其中 ：
图 (A) 为 Pik-s 功能特异性分子标记 Piks-1FNP 在 9 个水稻品种中的验证图， 其 中， 泳道 1 ： 抗性基因供体品种 Shin 2(Pik-s) ； 泳道 2 ： IRBLks-S(Pik-s 单基因系 ) ； 泳道 3： 抗性品种 K3(Pik-h) ； 泳道 4 ： IRBLkh-K3(Pik-h 单基因系 ) ； 泳道 5 ： IRBLk-Ka(Pik 单基 因系 ) ； 泳道 6 ： IRBLkm-TS(Pik-m 单基因系 ) ； 泳道 7 ： IRBLkp-K60(Pik-p 单基因系 ) ； 泳道 8： IRBL7-M(Pi7 单基因系 ) ； 泳道 9 ： IRBL1-CL(Pi1 单基因系 ) ； 泳道 M ： DNAladder ；
图 (B) 是 Pik-s 功能特异性分子标记 Piks-2FNP 在 9 个水稻品系中的验证及检测 图， 其中， 泳道 1 ： 抗性基因供体品种 Shin 2(Pik-s) ； 泳道 2 ： IRBLks-S(Pik-s 单基因系 ) ； 泳道 3 ： 抗性品种 K3(Pik-h) ； 泳道 4 ： IRBLkh-K3 ： (Pik-h 单基因系 ) ； 泳道 5 ： IRBLk-Ka(Pik 单基因系 ) ； 泳道 6 ： IRBLkm-TS(Pik-m 单基因系 ) ； 泳道 7 ： IRBLkp-K60(Pik-p 单基因系 ) ； 泳道 8 ： IRBL7-M(Pi7 单基因系 ) ； 泳道 9 ： IRBL1-CL(Pi1 单基因系 ) ； 泳道 M ： DNAladder ；
图 (C) 是 Pik-s 功能特异性分子标记 Piks-3FNP 在 9 个水稻品系中的验证及检测 图， 其中， 泳道 1 ： 抗性基因供体品种 Shin 2(Pik-s) ； 泳道 2 ： IRBLks-S(Pik-s 单基因系 ) ； 泳道 3 ： 抗性品种 K3(Pik-h) ； 泳道 4 ： IRBLkh-K3 ： (Pik-h 单基因系 ) ； 泳道 5 ： IRBLk-Ka(Pik 单基因系 ) ； 泳道 6 ： IRBLkm-TS(Pik-m 单基因系 ) ； 泳道 7 ： IRBLkp-K60(Pik-p 单基因系 ) ； 泳道 8 ： IRBL7-M(Pi7 单基因系 ) ； 泳道 9 ： IRBL1-CL(Pi1 单基因系 ) ； 泳道 M ： DNAladder。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。
实施例 1 ： Pik-s 等位基因编码区序列的比对及 SNP 的鉴定
通过常规的 PCR 扩增 (Yuan et al.2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NB S-LRR genes.Theor Appl Genet 122 ： 1017-1028 ； Zhai et al.2011.The isolation and characterization of Pik， a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication. New Phytologist 189 ： 321-334)、 测序 ( 上海英骏生物技术有限公司， 广州分公司 )， 从5 个抗病水稻品种 [Shin 2(Pik-s 供体品种 )， Tsuyuake(Pik-m 供体品种 )， Kusabue(Pik 供 体品种 )， K60(Pik-p 供体品种 ) ； Wang et al.2009.Characterization of rice blast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus.Phytopathology 99 ： 900-905]、 K3(Pik-h 供体品种 ； Xu et al.2008.Efficient authentic fine mapping of the rice blast resistance gene Pik-h in the Pik cluster， using new Pik-h-differentiating isolates.Molecular Breeding 22 ： 289-299) 以 及 2 个 K 型感病水稻品种黑交 (Heijiao， HJ) 和 Q1063(Zhai et al.2011.The isolation and characterization ofPik， a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication.New Phytologist 189 ： 321-334) 中获得相应的 Pik-s 等位基因编码区 DNA 序列 [Pik-s(HQ662329)， Pik-p(HM035369)， Pik(HM048900)， Pik-m (AB462256)， 已 经公开于 http://www.ncbi.nlm.nih.gov] ； 利用多序列比对软件工具 (http://multalin. toulouse.inra.fr/multalin/)， 通过对这些序列翻译后的蛋白质序列比对分析， 鉴定到存 在于 Piks-1 基因 cDNA 第 347 位点， 第 782 位点以及 Piks-2 基因 cDNA 第 1301 位点的功能 特异性 SNP。在 Piks-1 基因第 347 位点， Piks-1 编码的第 116 位点氨基酸为精氨酸 (R)， 而 Pikp-1、 Pikh-1 及 Pikl-63 编码的则为组氨酸 (H)， 因此， 该位点可以将 Piks-1 与等位基因 Pikp-l、 Pikh-1 及 Pikl-63 区分开 ( 图 1)。而在 Piks-1 基因第 782 位点， Piks-1 编码的 第 264 位点氨基酸为丙氨酸 (A)， 而等位基因 Pikm1-TS 和 Pik-1 编码的则为缬氨酸 (V)， 因 此， 该位点可以将 Piks-1 与 Pikm1-TS 及 Pik-1 区分开 ( 图 1)。而在 Piks-2 基因第 1301 位点， Piks-2 编码的第 434 位点氨基酸为丝氨酸 (S)， 而等位基因 Pikh-2 和 Pikp-2 编码的 则为苏氨酸 (T)， 因此， 该位点可以将 Piks-2 与 Pikh-2 和 Pikp-2 区分开 ( 图 2)。以上 3 个功能特异性 SNP 位点的组合使用则可以将 Pik-s 与 Pik-p、 Pikm-TS、 Pik、 Pikh、 及 Pik-63 等其他稻瘟病抗性基因区分开。
实施例 2 ： Pik-s 功能特异性分子标记及其引物设计与检测
根 据 dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences ； Neff et al.2002.Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis. Trends in Genetics 18 ： 613-615) 及 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences ； Konieczny and Ausubel， 2002.A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers.Plant J 4 ： 403-410) 标记的设计 原理， 根据 dCAPS 标记原理， 在 Piks-1SNP 位点设计带有错配碱基的功能特异性上游引物 Piks-1FNP-F， 而在其下游 100 ～ 200bp 处设计功能特异性下游引物 Piks-1FNP-R， 分别如 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示 ； 根据 CAPS 标记原理， 在 Piks-2SNP 位点的上、 下游各 100bp 范围内设计功能特异性上、 下游引物 Piks-2FNP-F 及 Piks-2FNP-R， 分别如 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 所示 ； 根据 dCAPS 标记原理， 在 Piks-3SNP 位点设计带有错配碱基的 功能特异性上游引物 Piks-3FNP-F， 而在其下游 100 ～ 200bp 处设计功能特异性下游引物 Piks-3FNP-R， 分别如 SEQ ID NO.5 和 SEQ ID NO.6 所示。通过这 3 组引物对携带有 Pik-s 基因以及其他等位基因的品种 DNA 模板进行扩增， 分别得到扩增产物 A、 扩增产物 B 和扩增 产物 C ； 然后分别对扩增产物进行酶切、 电泳， 比较验证， 分别得到与稻瘟病抗性基因 Piks 呈特异性带型的核苷酸片段 Piks-1FNP、 Piks-2FNP 和 Piks-3FNP。
Piks-1FNP 的 PCR 扩增反应体系如下 ：
扩增反应温度循环条件如下 ： 94℃ 3 分钟 ； 94℃ 30 秒、 58℃ 30 秒、 72℃ 1 分钟， 35 个循环 ； 72℃ 5 分钟 ； 10℃保存。
PCR 反应结束后， 利用限制性内切酶 SphI 对所获得的 PCR 产物进行酶切， 反应体系 如下 ：
在 37℃条件下酶切 3 小时后， 取适量酶切样品在 8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电 泳检测， 电泳条件为 90V， 2 小时 30 分钟。扩增所得到的 PCR 产物大小为 124bp， 酶切后所得 到的产物大小为 103bp， 前者 ( 不能被酶切 ) 即为抗性基因 Pik-s 的功能特异性分子标记 Piks-1FNP。
步骤 3) 所述的 PCR 扩增反应， 其中 Piks-2FNP 的 PCR 扩增反应体系如下 ：
扩增反应温度循环条件如下 ： 94℃ 3 分钟 ； 94℃ 30 秒、 58℃ 30 秒、 72℃ 1 分钟， 35 个循环 ； 72℃ 5 分钟 ； 10℃保存。
PCR 反应结束后， 利用限制性内切酶 Nco I 对所获得的 PCR 产物进行酶切， 反应体 系如下 ：
在 37℃条件下酶切 3 小时后， 取适量酶切样品在 8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电 泳检测， 电泳条件为 90V， 2 小时 30 分钟。扩增所得到的 PCR 产物大小为 145bp， 酶切后得到 的产物大小为 64bp 和 81bp， 前者 ( 不能被酶切 ) 即为抗性基因 Pik-s 的功能特异性分子标 记 Piks-2FNP。
步骤 3) 所述的 PCR 扩增反应， 其中 Piks-3FNP 的 PCR 扩增反应体系如下 ：
扩增反应温度循环条件如下 ： 94℃ 3 分钟 ； 94℃ 30 秒、 58℃ 30 秒、 72℃ 1 分钟， 35 个循环 ； 72℃ 5 分钟 ； 10℃保存。
PCR 反应结束后， 利用限制性内切酶 Spe I 对所获得的 PCR 产物进行酶切， 反应体 系如下 ：
在 37℃条件下酶切 3 小时后， 取适量酶切样品在 8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电 泳检测， 电泳条件为 90V， 2 小时 30 分钟。扩增所得到的 PCR 产物大小为 139bp， 酶切后得 到的产物大小为 119bp， 前者 ( 不能被酶切 ) 即为抗性基因 Pik-s 的功能特异性分子标记 Piks-3FNP。
实施例 3 ： 抗性基因 Pik-s 功能特异性分子标记在鉴别不同稻瘟病抗性基因中的 应用
采集含有不同的稻瘟病抗性基因的 9 个水稻品系， 分别为 ： Shin 2(Pik-s 供体 品种 ； Wang et al.2009.Characterization of rice blast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus.Phytopathology 99 ： 900-905) ； K3(Pik-h 供体品种 ； Xu et al.2008.Efficient authentic fine mapping of the rice blast resistance gene Pik-h in the Pik cluster， using new Pik-h-differentiating isolates.Molecular Breeding 22 ： 289-299) ； IRBLkh-K3 ， IRBLk-Ka ， IRBLkm-TS ， IRBLkp-K60， IRBL7-M， IRBL 1-CL， IRBLks-S[Kobayashi et al.2007.Developmentof new sets of international standard differential varieties for blast resistance in rice (Oryza sativa L.).JARQ 41 ： 31-37] 的基因组 DNA， 并以此为模板， 利用实施例 2 中 描述的 Piks-1FNP、 Piks-2FNP 和 Piks-3FNP 的 PCR 扩增反应体系和反应条件， 对抗性基因
Pik-s 功能特异性的分子标记进行 PCR 扩增、 酶切及电泳检测。 电泳结果分别如图 3A、 图 3B 和图 3C 所示。
如附图说明的那样， 试验结果与设计分析的相吻合， 说明抗性基因 Pik-s 功能特 异性分子标记可在鉴别 Pik-s 基因与其他稻瘟病抗性基因得到应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。14CN 102653760 A
序列表1/2 页
15CN 102653760 A序列表2/2 页