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1、(10)申请公布号 CN 102648924 A (43)申请公布日 2012.08.29 CN 102648924 A *CN102648924A* (21)申请号 201210137064.7 (22)申请日 2012.05.04 A61K 36/07(2006.01) C12N 1/14(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (71)申请人 包海鹰 地址 130118 吉林省长春市南关区新城大街 2888 号吉林农业大学中药材学院 (72)发明人 包海鹰 孙雪 (54) 发明名称 红缘拟层孔菌发酵产物的抗肿瘤和增强免疫 活性 (。
2、57) 摘要 本发明公开了红缘拟层孔菌发酵菌丝体的抗 肿瘤和免疫增强活性， 并提供其发酵制备方法及 条件， 研究表明红缘拟层孔菌发酵菌丝体对肝癌 H22荷瘤具有较好的抑制作用， 且能明显的增强小 鼠的免疫活性。该研究属于菌物生药发酵产物的 制备及其在医药与保健品领域的应用方法， 并为 预防及治疗肿瘤药开发提供依据。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 1/1 页 2 1. 红缘拟层孔菌的发酵菌丝体在制备、 抑制肿瘤和增强免疫力药物中的用途及其相关 应用。所述的药物剂型是指药剂。
3、学上所说的任何剂型， 如片剂、 注射剂、 胶囊剂、 胶浆剂、 涂 膜剂、 乳剂、 混悬剂、 合剂、 散剂、 颗粒剂等。 2. 根据权利要求 1 所述， 红缘拟层孔菌的发酵菌丝体的制备方法， 其特征包括如下步 骤 ： （1） 最适基础培养基为 ： 马铃薯200 g/L， 葡萄糖20 g/L， 磷酸二氢钾1 g/L， 硫酸镁1.5 g/L， 维生素 B1 0.4 g/L。 （2） 各级种子的制备 ： 用接种环将红缘拟层孔菌母种斜面培养基上的菌丝接在两个 500ml 摇瓶内， 每个摇瓶装有筛选出的最佳培养基 100ml， 置于 28的恒温振荡器中， 转速 130r/min， PH 自然， 发酵周期为。
4、 80 小时， 作为一级液种。将这 200ml 一级液种分成四等份 后转接入四瓶 2000ml 摇瓶中， 每瓶装有 200ml 培养液， 同一级液种的培养条件培养 64 小时 作为二级液种。 （3） 升罐培养实验 ： 将 35L 筛选出的最佳培养基装入 50L 的发酵罐中， 在 121条件下 对发酵罐内的培养基进行灭菌 25min 后将培养好的红缘拟层孔菌的二级液种在火焰下转 接入 50L 发酵罐中， 在 28的条件下培养 96 小时， 初始搅拌数为 150rpm， 罐压 0.05Mpa， 起 始溶氧为 100， 通气量 1 ： 0.5， PH 自然。最佳发酵周期为 5664h， 在此条件下菌。
5、丝体湿重 达到 6.8901g/L， 胞外粗多糖含量达到 0.2965g/L。 3.由权利要求2的制备得到红缘拟层孔菌的发酵菌丝体具有一定的抗肿瘤活性， 对H22 荷瘤小鼠的抑制率达到极显著水平 （p0.01） 。并具有明显的增强小鼠免疫水平的作用。 权 利 要 求 书 CN 102648924 A 2 1/6 页 3 红缘拟层孔菌发酵产物的抗肿瘤和增强免疫活性 技术领域 ： 0001 本发明公开了红缘拟层孔菌发酵菌丝体的抗肿瘤和免疫增强活性， 并提供其发酵 制备方法及条件， 研究表明红缘拟层孔菌发酵菌丝体对肝癌 H22荷瘤具有较好的抑制作用， 且能明显的增强小鼠的免疫活性。 该研究属于菌物生。
6、药发酵产物的制备及其在医药与保健 品领域的应用方法， 并为预防及治疗肿瘤药开发提供依据。 背景技术 ： 0002 癌症， 医学术语又称恶性肿瘤， 是控制细胞生长增殖机制的失常而引起的疾病， 是 目前危害人类健康和生命的重要疾病之一。近些年来肿瘤的发病率在不断上升， 已经成为 人类的头号杀手。 0003 随着天然产物化学的发展， 真菌作为自然界中的一大生物类群， 以其药理活性好， 副作用较小， 并且并可通过发酵手段大量获得， 越来越被人们所重视。 多孔菌科真菌是担子 菌中的一大类群， 例如中药灵芝、 猪苓、 茯苓等都属于这一类群， 多孔菌类的抗肿瘤活性也 多有研究报道， 被称为桑黄的菌类以及灵芝。
7、和桦褐孔菌的抗肿瘤活性都很好， 因此研究真 菌中抗肿瘤成分并将其开发成药品或保健品的需求是十分迫切的。 0004 红缘拟层孔菌 Fomitopsis pinicola (Sw.:Fr.)P. Karst.， 又名 “红缘层孔 菌”等。隶属于担子菌纲 （Basidiomycetes）非褶菌目 （Aphyllophorales）多孔菌科 (Polyporaceae)， 拟层孔菌属 (Fomes)。红缘拟层孔菌是世界性分布的木腐性真菌， 它大多 生长在阔叶树活立木、 针叶树、 腐朽木以及倒木上， 对很多种类的阔叶树木具有很强的危害 性。红缘拟层孔菌具祛风除湿， 强心， 解热， 滋补强壮， 扶正培本、。
8、 补肺益肾， 安神定志、 和胃 健脾等作用， 对癌症、 心脏病、 脑溢血、 贫血、 糖尿病、 肾炎和支气管炎等疾病有很好的治疗 效果。民间用其治疗矿工的 “寒腿” 病。在中国东北长白山地区为常见种类， 在春季、 夏季和 秋季均会出现。味微苦、 性平。有研究表明， 红缘拟层孔菌提取物具有抗肿瘤、 抑菌、 抗炎、 抗氧化、 抑制肥胖、 保护肝脏、 抑制水肿并能清除游离基、 调节中枢神经系统、 治疗糖尿病、 增强人体免疫力。 发明内容 ： 0005 本发明公开了红缘拟层孔菌发酵菌丝体的制备方法， 具体如下 ： 0006 （1） 最适基础培养基为 ： 马铃薯 200g/L， 葡萄糖 20g/L， 磷酸。
9、二氢钾 1g/L， 硫酸镁 1.5g/L， 维生素 B1 0.4g/L。 0007 （2） 各级种子的制备 ： 用接种环将红缘拟层孔菌母种斜面培养基上的菌丝接在两 个 500ml 摇瓶内， 每个摇瓶装有筛选出的最佳培养基 100ml， 置于 28的恒温振荡器中， 转 速 130r/min， PH 自然， 发酵周期为 80 小时， 作为一级液种。将这 200ml 一级液种分成四等 份后转接入四瓶 2000ml 摇瓶中， 每瓶装有 200ml 培养液， 同一级液种的培养条件培养 64 小 时作为二级液种。 0008 （3） 升罐培养实验 ： 将 35L 筛选出的最佳培养基装入 50L 的发酵罐中，。
10、 在 121 说 明 书 CN 102648924 A 3 2/6 页 4 条件下对发酵罐内的培养基进行灭菌 25min 后将培养好的红缘拟层孔菌的二级液种在 火焰下转接入 50L 发酵罐中， 在 28的条件下培养 96 小时， 初始搅拌数为 150rpm， 罐压 0.05Mpa， 起始溶氧为 100， 通气量 1 ： 0.5， PH 自然。最佳发酵周期为 5664h， 在此条件下 菌丝体湿重达到 6.8901g/L， 胞外粗多糖含量达到 0.2965g/L。 0009 本发明公开了红缘拟层孔菌发酵菌丝体的小鼠抗肿瘤活性的研究， 方法与结果如 下 ： 0010 无菌条件下， 取接种 7d 的种。
11、鼠腹水肝癌 H22细胞， 用生理盐水制成细胞个数为 1106-5106/mL 的细胞悬液， 以每鼠 0.1mL 接种于小鼠左后肢腋窝皮下， 随机分组， 每组 10只。 次日开始给药， 阳性药组隔天腹腔注射环磷酰胺 （25mg/kg） ， 体积为0.2mL/10g， 受试 药组 （100mg/kg， 200mg/kg） 和对照组 （生理盐水） 灌胃给药， 体积为 0.2mL/10g， 连续 10d， 第 11 天处死小鼠， 摘取瘤块、 胸腺和脾脏， 分别称重。肿瘤抑制率 =（对照组平均瘤重给药 组平均瘤重） / 对照组平均瘤重 100%。胸腺指数为每 g 体重中胸腺的 mg 数， 脾指数为每 g。
12、 体重中脾脏的 mg 数， 各数值均以平均值 标准差 （） 来表示。通过软件 spss 18.0 统计分析数据的代表性， p0.05 说明在统计学上差异显著， p0.01 说明在统计学上差异极 显著。 0011 发酵产物组的体内抗肿瘤作用如表 1 所示。除了 CTX 组对小鼠移植瘤的抑制率达 到 80.59% 之外， 发酵产物组对小鼠的移植瘤具有极明显的抑制作用， 但不存在量效关系， 在剂量为 100mg/kg/d 时的抑制率达到 62.54%， 同对照组相比存在显著性差异 （P 0.01） 。 0012 表 1 红缘拟层孔菌的发酵产物对荷瘤小鼠肿瘤的影响 0013 0014 注 ： 与对照组。
13、相比 ： * P0.05 ； * P0.01 ； 0015 发酵产物组对小荷瘤鼠免疫系统的影响如表 2 所示。从表中可知， 除了 CTX 组明 显低于对照组外 （P 0.01） ， 各提取物给药组脾脏指数均明显高于正常组 （P 0.01） ， 与 对照组相比并无显著性差异 （P0.05） ； 除正常组外， 其他各组的脾脏指数均高于CTX组 （P 0.01） 。另外各组小鼠的胸腺指数均低于正常组， 对照组、 正常组和发酵产物高剂量组的 胸腺指数均高于 CTX 组 （P 0.01） 。说明红缘拟层孔菌发酵产物组作用后， 荷瘤小鼠的胸 腺指数发生了改变， 荷瘤小鼠的胸腺指数升高， 说明红缘拟层孔菌发。
14、酵产物和单体化合物 说 明 书 CN 102648924 A 4 3/6 页 5 具有一定的调节小鼠免疫活性的作用。 0016 表 2 红缘拟层孔菌的发酵产物对荷瘤小鼠免疫器官的影响 0017 0018 注 ： 与对照组相比 ： * P0.05 ； * P0.01 ； 与正常组相比， # P0.05 ；# P0.01 ； 与 阳性组相比 ： P0.01 , P0.05. 0019 本发明公开了红缘拟层孔菌发酵菌丝体的小鼠免疫增强活性的研究， 方法与结果 如下 ： 0020 1. 实验方法 0021 试验动物 4-6 周龄昆明系小鼠 20 只， 全部为雌鼠， 体重 (202)g。将小鼠按随机 分。
15、为 2 组， 分别为阴性对照组和实验组， 每组 10 只小鼠。受试药组 （200mg/kg） 灌胃给予小 鼠， 按 0.2ml/10g 的剂量开始给药， 对照组动物给予生理盐水， 自由取食饮水。每天观察记 录小鼠状态， 连续 7d。 0022 （1） 器官免疫指数测定实验 ： 试验结束后， 小鼠称重， 然后颈椎脱臼处死， 完 0023 整摘取肝脏和脾脏， 用滤纸吸干脏器表面血污， 分别称重， 计算器官免疫指数。 0024 （2）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 将 1mL 的 20% (v/v) 鸡红细胞 ( 2000rpm, 10min ) 悬混液注射于实验小鼠的腹腔内， 注射完成后轻揉小鼠。
16、的腹部保证鸡 血球悬混液均匀的分布于小鼠的腹腔。等待 30min 之后处死动物并将动物固定在鼠板上， 注射 2ml 生理盐水于小鼠的腹腔内。之后摇动鼠板使生理盐水在小鼠体内混合均匀后吸取 小鼠的腹腔洗液 1ml 滴在载玻片上， 将载玻片放于垫有湿纱布的瓷盘内， 在 37的恒温箱 内放置 30min 后用生理盐水清洗， 干燥后取一滴甲醇滴在涂片上再自然干燥， 用以固定血 液。取 2 滴瑞氏染液和两滴纯净水于玻片上均匀的涂开， 等待 1-2 分钟之后用清水冲洗染 液， 然后用吸水纸吸干载玻片上的液体。之后在油镜下观察并计数， 每片统计 100 个巨噬细 胞。记录吞噬细菌的巨噬细胞数。 0025 （。
17、3） 血清溶血素实验 受试小鼠眼球采血， 分离血清， 每只取 100uL ； 心脏采豚鼠 说 明 书 CN 102648924 A 5 4/6 页 6 血 （要求豚鼠体重 250g 以上， 心脏采血后待其凝固， 将三角烧瓶的血置 37温箱 1 小时， 再 将其放于 4的冰箱内三到四小时。在血液凝固， 血块收缩时 , 用毛细滴管吸取血清。于 3000rpm 离心 15 分钟， 分装后置 4冰箱中保存备用， 即为补体。取 100 倍稀释的小鼠血清 1mL加入5% 鸡红细胞， 再加10% 补体， 以不加补体的做空白对照， 37， 作用30min， 取出后 用冰水中止反应， 然后取出， 1000rpm。
18、离心5min， 在540nm处比色， 采用分光光度法测定吸光 度值， 并计算出溶血素水平 （HC） 。 0026 （4） ConA 诱导小鼠脾脏淋巴细胞转化实验 （体内法） 给实验每只小鼠注射配置好 的ConA， 每只小鼠注射0.3mg。 注射完后在室温下饲养小鼠三天， 自由饮食饮水。 三天之后， 对实验小鼠采取眼静脉取血， 将取出的血液加入装有抗凝剂的试管中混匀。取一滴抗凝血 处理后的血液滴在载玻片上均匀的推开之后干燥。 干燥后取一滴甲醇滴在涂片上再自然干 燥， 用以固定血液。取 2 滴瑞氏染液和两滴纯净水于玻片上均匀的涂开， 等待 1-2 分钟之后 用清水冲洗染液， 然后用吸水纸吸干载玻片。
19、上的液体。 之后在显微镜下观察， 计算淋巴细胞 的转化率。 （5） 小鼠碳廓清实验 于末次给药 1 h 后 , 各组小鼠按体重尾静脉注射 100ml/ kg印度墨汁生理盐水液， 于注射墨汁后2min及10min, 用毛细玻璃管从小鼠眼眶后静脉丛 取血 20 l, 之后将其立即加入 2ml 的 0.1% Na2CO3溶液中 , 摇匀 , 于分光光度计 600 nm 波长处测吸光度 (OD ) 值 , 以 Na2CO3溶液作为空白对照溶液。之后将小鼠处死， 取脾脏和 肝脏， 用滤纸吸取脏器表面的血污， 分别称重并记录。 0027 （6） 胸腺指数 = 胸腺重 （mg） / 体重 （g） ， 脾脏指。
20、数 = 脾脏重 （mg） / 体重 （g） 。 0028 吞噬率 (%)= 吞噬细菌的巨噬细胞数 /100 个巨噬细胞 100% 0029 分光光度法测定溶血素水平 （HC） 公式 ： 样品 （HC） = 样品吸光度值 / 鸡红细胞半数 溶血时吸光度值 稀释倍数 0030 转化率=转化的淋巴细胞数/ （转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数） 100%， 在淋巴细胞的转化过程当中， 可见核分裂相细胞、 过度型淋巴母细胞、 淋巴母细胞和成熟淋 巴细胞等几种常见的类型。在统计转化率时， 转化的细胞也包括核分裂相细胞和过度型淋 巴母细胞。 0031 廓清指数 :K = ( logOD 2 - logO。
21、D10 ) / ( t10 - t2 ) 0032 吞噬指数 :a= 体重 /（肝重 + 脾重） 3 K 0033 实验数据用表示， 并采用 SPSS18.0 for Windows 统计软件进行分析。P 0.05 说明在统计学上呈显著差异， P 0.01 说明在统计学上呈极显著差异。 0034 2. 结果与分析 0035 （1） 各组小鼠的状态观察 ： 实验组小鼠和对照组小鼠均生长良好， 两组小鼠在饲养 的前三天未见异常， 之后开始给药。给药后， 前两天未发现两组小鼠有明显的区别。第三天 之后， 实验组小鼠比较对照组小鼠出现活动多， 觅食积极， 被毛光泽的现象。 0036 （2） 器官免疫指。
22、数测定实验 ： 从实验结果可以看出， 在注射 conA 之前实验组和对 照组的动物体重、 脾指数和肝脏指数没有显著性差别， 在注射 conA 之后， 小鼠的脾指数上 升， 肝脏指数下降， 推断是注射了 conA 的结果 （表 3） 。 0037 表 3 红缘拟层孔菌的发酵产物对小鼠免疫器官指数的影响 0038 说 明 书 CN 102648924 A 6 5/6 页 7 0039 注 ： 与对照组相比， * P0.05 ； * P0.01 0040 （3） 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 ： 实验结果 （表 4） 表明， 实验组小鼠的吞 噬率达到了 72.8%， 明显高于阴性对照组的 51%。
23、 （P 0.01） ， 说明实验组药物有增强小鼠非 特异性免疫的作用。 0041 （4） 血清溶血素实验 ： 实验结果 （表 4） 表明， 实验组溶血素水平达到了 54.678， 明 显高于阴性对照组的 37.532（P 0.01） ， 说明实验组有增强小鼠体液免疫的作用。 0042 （5） ConA诱导小鼠脾脏淋巴细胞转化实验 （体内法） ： 在ConA的诱导作用完成之后， 采取外周血图片染色在显微镜下观察统计 100 个淋巴细胞并计算淋巴细胞的转化率， 实验 结果表明 （表 4） ， 实验组淋巴细胞转化率高达 55.333%， 明显高于阴性对照组的 35.501%（P 0.01） ， 说明。
24、红缘拟层孔菌的菌丝体具有增强小鼠细胞免疫的功能。 0043 表 4 红缘拟层孔菌的发酵产物对小鼠吞噬率， 溶血素水平、 淋巴细胞转化率和 DTH 的影响 0044 0045 注 ： 与对照组相比， * P0.05 ； * P0.01 0046 （6） 小鼠碳廓清实验 0047 在一定的范围内， 小鼠体内碳颗粒被清除的数率与血碳浓度呈现指函数关系。本 实验选用小鼠炭粒廓清实验 , 观察红缘拟层孔菌菌丝体对正常小鼠非特异性免疫的影响。 印度墨汁作为颗粒状异物静脉注射进入血循环, 能迅速被单核吞噬细胞清除。 本实验结果 表明 （表 5） , 药物作用后小鼠的吞噬指数显著增加 , 即单核吞噬细胞功能明显增强， 发酵 说 明 书 CN 102648924 A 7 6/6 页 8 产物高剂量组和低剂量组的吞噬指数分别达到 7.523 和 6.968， 都与对照组有显著差异 （P 0.05） ， 不存在明显的剂量关系， 实验结果说明红缘拟层孔菌菌丝体能增强机体的非特异 性免疫功能。 0048 表 5 红缘拟层孔菌的发酵产物对小鼠吞噬指数影响 0049 0050 注 ： 与对照组相比， *P 0.05 ； *P 0.01 说 明 书 CN 102648924 A 8 。