使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201080040214.1

申请日:

2010.09.09

公开号:

CN102482719A

公开日:

2012.05.30

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20100909|||公开

IPC分类号:

C12Q1/68; C12N15/09

主分类号:

C12Q1/68

申请人:

富士胶片株式会社

发明人:

仓光昌之; 岩木义英; 氏原大

地址:

日本国东京都

优先权:

2009.09.10 JP 2009-209578

专利代理机构:

中科专利商标代理有限责任公司 11021

代理人:

陈平

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内容摘要

本发明提供了使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法,所述方法减少了假阳性和假阴性并且改善了分析结果的可靠性。使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法包括:[步骤(a):使多个标记的样品核酸逐个与多个相同的探针核酸组接触以实现杂交],[步骤(b):获得已经杂交到样点X1至Xn的每个样点中的样品核酸的标记强度F1至Fn,所述样点已经杂交有相同的探针核酸],[步骤(c):确定从F1与F2的比较值至F1与Fn的比较值的n-1个比较值中的每个是否落入指定的数值范围],以及[步骤(d):比较已经确定为未落入指定的数值范围内的比较值的数目是否超过指定数目并且,在超过指定数目的情况中,判断样点X1为阳性]。n是3以上的整数。

权利要求书

1: 一种使用阵列比较基因组杂交技术来分析核酸突变的方法, 其包括 : 步骤 (a) : 使用 n 组相同的探针核酸组, 其中多个样点存在于一个核酸微阵列上并且彼 此不同的探针核酸已经被固定在多个所述样点上, 使 n 种标记的样品核酸 S1 至 Sn 逐个地 与 n 组所述探针核酸组接触以实现杂交, 步骤 (b) : 选择已经固定有相同探针核酸的 n 个样点 X1 至 Xn, 所述样点 X1 至 Xn 选自 n 组所述探针核酸组, 并且获得已经被杂交到 n 个相应的样点 X1 至 Xn 中的样品核酸的标记 强度 F1 至 Fn, 步骤 (c) : 将所述样点 X1 的标记值 F1 与所述标记值 F2 至 Fn 中的每个比较, 由此获得 n-1 个比较值 C2 至 Cn, 并且确定所述比较值中的每个是否落入指定的数值范围内, 以及 步骤 (d) : 确定在 n-1 个所述比较值中在所述步骤 (c) 中已经确定为未落入所述指定 的数值范围内的比较值的数目是否超过指定数目, 并且在超过所述指定数目的情况下, 判 断所述样点 X1 为阳性, n 是 3 以上的整数, 所述样品核酸是分析物核酸或标准核酸, 至少 S1 是分析物核酸, 而 X1 是已经与 S1 接触的样点。
2: 根据权利要求 1 的分析核酸突变的方法, 其中在 n 种所述样品核酸中至少两种是分 析物核酸。
3: 根据权利要求 1 或 2 的分析核酸突变的方法, 所述方法进一步包括 : 步骤 (c′ ) : 确定从 F2 与 F1 的比较值至 F2 与 Fn 的比较值的 n-1 个比较值中的每个 是否落入指定的数值范围, 以及 步骤 (d′ ) : 确定 n-1 个比较值中在所述步骤 (c′ ) 中已经确定为未落入所述指定的 数值范围内的比较值的数目是否超过所述指定数目, 并且在超过所述指定数目的情况下, 判断样点 X2 为阳性, 样点 X2 是已经与不同于以上 S1 的样品核酸 S2 接触的样点。
4: 根据权利要求 1 至 3 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中在 n 种所述样品核酸中 至少一种是标准核酸。
5: 根据权利要求 1 至 3 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 n 种所述样品核酸都是 分析物核酸。
6: 根据权利要求 1 至 5 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 n 种所述样品核酸是来 源于属于分类学上相同物种的不同个体的核酸。
7: 根据权利要求 1 至 6 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 提供 n 个相同的探针核酸组 NS1 至 NSn, 各探针核酸组 NSi 被提供在具有 p 个样点 ti1 至 tip 的核酸微阵列上, i 是整数并且满 足 1 ≤ i ≤ n 而 p 是整数并且满足 2 ≤ p, 将彼此不同的探针核酸固定在各探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点 ti1 至 tip 上, 各探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点中的一个是样点 Xi, 将相同的探针核酸固定到样点 tij 至 tnj 上, j 是整数并且满足 1 ≤ j ≤ p, 步骤 (a) 包括使所述标记的样品核酸 Si 与所述探针核酸组 NSi 接触, 从而将所述样品 核酸 Si 杂交到已经固定在所述探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点上的核酸, 步骤 (b) 包括获得已经杂交到各探针核酸组 NSi 的所述样点 ti1 至 tip 中的样品核酸的 标记值 Fi1 至 Fip, 2 NS1 和 NSm 选自所述探针核酸组 NS1 至 NSn 并且 m 是整数并且满足 2 ≤ m ≤ n, 所述步骤 (c) 包括以下步骤 : (c1) 比较所述标记值 F1j 和 Fmj 以确定 p 个比较值 C1″至 Cp″, (c2) 计算所述比较值 C1″至 Cp″的平均值或中央值, 以及 (c3) 基于在所述步骤 (c2) 中获得的平均值或中央值, 设定指定的数值范围并且判断 所述比较值 C1″至 Cp″是否落入所述指定的数值范围内。
8: 根据权利要求 1 至 7 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中所述样品核酸都用相同 的标记物标记。
9: 根据权利要求 1 至 8 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中步骤 (b) 中的所述标记 强度 F1 至 Fn 是校正值。
10: 用于在根据权利要求 1 至 9 中任一项的分析核酸突变的方法中执行数据处理的程 序, 所述程序执行以下进程 (I) 和 (II) : [ 进程 (I) : 比较从 F1 与 F2 至 F1 与 Fn 的 n-1 个比较值是否落入指定的数值范围 ] [ 进程 (II) : 在以下情况下判断样点 X1 为阳性 : 在以上 (I) 中临时确定的所有 n-1 个 比较值中, 存在的已经通过进程 (I) 确定为未落入所述指定的数值范围内的比较值的数目 超过指定数目 ]。
11: 根据权利要求 10 的程序, 其中所述进程 (i) 包括以下进程 (i) 至 (v) : [ 进程 (i) : 在存在于 n 组所述探针核酸组的每个中的 p 个样点中, 从 n 组所述探针核酸组中选择一对两个探针核酸组, 所述一对两个探针核酸组被这样 选择以致包含样点 X1, 以及 在所述两个探针核酸组之间, 计算已经固定有所述相同的探针核酸的成对的样点的标 记强度的比较值 ] [ 进程 (ii) : 对所述探针核酸组中的 p 个成对的样点中的每个进行在进程 (i) 中的比 较值计算 ], [ 进程 (iii) : 计算在进程 (ii) 中获得的 p 个比较值的平均值或中央值 ], 以及 [ 进程 (iv) : 从在进程 (iii) 中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围, 并且比较 p 个比较值中的每个是否超过所述指定的数值 ]。
12: 一种诊断源于基因突变的疾病的方法, 所述方法使用根据权利要求 1 至 9 中任一项 的分析核酸突变的方法。

说明书


使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法

    技术领域 本发明涉及使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法, 所述方法降低来 自分析结果的假阳性等的影响并且改善分析结果的可靠性。
     背景技术 阵列比较基因组杂交 (CGH) 技术已知为这样的方法, 其用于在短时间内检测发生 在数 10kb 至数 Mb 水平上的基因组结构异常, 诸如基因组拷贝数异常 ( 见, 例如, 非专利文 件 1 和 2)。
     在使用阵列 CGH 的用于遗传性疾病等的诊断阵列的情况中, 变得必要的是精确地 诊断与病理状况直接相关的拷贝数异常。因此, 作为标准的核酸必定不具有拷贝数变异 (CNV) 并且因此应当进行小心的选择和确认包括稀有 CNV 的情况, 以致总是存在麻烦的并 且需要复查的情况。
     此外, 在包括用于全基因组分析的阵列、 检查出拷贝数异常的情况中, 因为难以获 得已被证明为对于目标基因组是正常的标准核酸, 所以必需对双亲和同胞进行连续检查并 且进行重复地复查以确认所述情况是否是假阳性或假阴性或新发生 (de novo) 拷贝数异 常, 并且用正常分析物的分析实例和公用数据库验证 ( 见, 例如, 非专利文件 1)。在判断出 是假阳性或假阴性的情况中, 复查变得必要并且产生这样的问题, 即利用一次检查不能做 出诊断。
     背景技术文件
     非专利文件
     非 专 利 文 件 1: “Arei CGH Shindan Katsuyo Gaido Bukku Shitte Okitai Senshokutai Bisaikozo Ijosho(Arrey CGH Diagnosis Utilization Guidebook , Chromosome Fine Structure Disorder Which Is Need To Know)( 阵列 CGH 诊断使用指南, 需要了解的染色体精细结构异常 )” 由 Joji Inazawa 等编辑, Iyaku(Medicine and Drug( 医 学和药物 ))Journal Co., Ltd.
     非专利文件 2 : Issei Imoto, Joji Inazawa“Maikuro Arei Gijusu wo Mochiita CGH Kaiseki : CGH Arei Hou(CGH Analysis Using Microarray Technology : CGH Array Method( 使用微阵列技术的 CGH 分析 : CGH 阵列方法 ))” , Saibo Kogaku( 细胞技术 ), 卷 23, No.03, 355-361(2004)。
     发明概述
     本发明要解决的问题
     鉴于背景技术的以上问题, 本发明的一个目的是提供分析核酸突变的方法以及用 于执行数据处理的程序, 所述方法减小分析结果中假阳性和假阴性的影响, 尤其是, 减小由 于标准核酸的 CNV 所导致的影响 ( 其为常规阵列比较基因组杂交技术中的问题 ), 并且改善 分析结果的可靠性而不需要复查。
     此外, 本发明的另一个目的是提供使用分析核酸突变的方法来诊断源于基因突变
     的疾病的方法。
     解决所述问题的方式
     以上问题已经由以下方法解决。
     1. 一种使用阵列比较基因组杂交技术来分析核酸突变的方法, 其包括 :
     步骤 (a) : 使用 n 组相同的探针核酸组, 其中多个样点存在于一个核酸微阵列上并 且彼此不同的探针核酸已经被固定在多个所述样点上, 使 n 种标记的样品核酸 S1 至 Sn 逐 个地与 n 组所述探针核酸组接触以实现杂交,
     步骤 (b) : 选择已经固定有相同探针核酸的 n 个样点 X1 至 Xn, 所述样点 X1 至 Xn 选自 n 组所述探针核酸组, 并且获得已经被杂交到 n 个相应的样点 X1 至 Xn 中的样品核酸 的标记强度 F1 至 Fn,
     步骤 (c) : 将所述样点 X1 的标记值 F1 与所述标记值 F2 至 Fn 中的每个比较, 由此 获得 n-1 个比较值 C2 至 Cn, 并且确定所述比较值中的每个是否落入指定的数值范围内, 以 及
     步骤 (d) : 确定在 n-1 个所述比较值中在所述步骤 (c) 中已经确定为未落入所述 指定的数值范围内的比较值的数目是否超过指定数目, 并且在超过所述指定数目的情况 下, 判断所述样点 X1 为阳性, n 是 3 以上的整数, 所述样品核酸是分析物核酸或标准核酸, 至少 S1 是分析物核 酸, 而 X1 是已经与 S1 接触的样点。
     2. 根据以上 1 的分析核酸突变的方法, 其中在 n 种所述样品核酸中至少两种是分 析物核酸。
     3. 根据以上 1 或 2 的分析核酸突变的方法, 所述方法进一步包括 :
     步骤 (c′ ) : 确定从 F2 与 F1 的比较值至 F2 与 Fn 的比较值的 n-1 个比较值中的 每个是否落入指定的数值范围, 以及
     步骤 (d′ ) : 确定 n-1 个比较值中在所述步骤 (c′ ) 中已经确定为未落入所述指 定的数值范围内的比较值的数目是否超过所述指定数目, 并且在超过所述指定数目的情况 下, 判断样点 X2 为阳性, 样点 X2 是已经与不同于以上 S1 的样品核酸 S2 接触的样点。
     4. 根据以上 1 至 3 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中在 n 种所述样品核酸中 至少一种是标准核酸。
     5. 根据以上 1 至 3 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 n 种所述样品核酸都是 分析物核酸。
     6. 根据以上 1 至 5 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 n 种所述样品核酸是来 源于属于分类学上相同物种的不同个体的核酸。
     7. 根据以上 1 至 6 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中
     提供 n 个相同的探针核酸组 NS1 至 NSn,
     各探针核酸组 NSi 被提供在具有 p 个样点 ti1 至 tip 的核酸微阵列上, i 是整数并 且满足 1 ≤ i ≤ n 而 p 是整数并且满足 2 ≤ p,
     将彼此不同的探针核酸固定在各探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点 ti1 至 tip 上,
     各探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点中的一个是样点 Xi,
     将相同的探针核酸固定到样点 tij 至 tnj 上, j 是整数并且满足 1 ≤ j ≤ p,
     步骤 (a) 包括使所述标记的样品核酸 Si 与所述探针核酸组 NSi 接触, 从而将所述 样品核酸 Si 杂交到已经固定在所述探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点上的核酸上,
     步骤 (b) 包括获得已经杂交到各探针核酸组 NSi 的所述样点 ti1 至 tip 中的样品核 酸的标记值 Fi1 至 Fip,
     NS1 和 NSm 选自所述探针核酸组 NS1 至 NSn 并且 m 是整数并且满足 2 ≤ m ≤ n,
     所述步骤 (c) 包括以下步骤 :
     (c1) 比较所述标记值 F1j 和 Fmj 以确定 p 个比较值 C1″至 Cp″,
     (c2) 计算所述比较值 C1″至 Cp″的平均值或中央值, 以及
     (c3) 基于在所述步骤 (c2) 中获得的平均值或中央值, 设定指定的数值范围, 并且 判断所述比较值 C1″至 Cp″是否落入所述指定的数值范围内。
     8. 根据以上 1 至 7 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中所述样品核酸都用相同 的标记物标记。
     9. 根据以上 1 至 8 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中步骤 (b) 中的所述标记 强度 F1 至 Fn 是校正值。
     10. 用于在根据以上 1 至 9 中任一项的分析核酸突变的方法中执行数据处理的程 序, 所述程序执行以下进程 (I) 和 (II) :
     [ 进程 (I) : 比较从 F1 与 F2 的比较值至 F1 与 Fn 的比较值的 n-1 个比较值是否落 入指定的数值范围 ]
     [ 进程 (II) : 在以下情况下判断样点 X1 为阳性 : 在以上 (I) 中临时确定的所有 n-1 个比较值中, 存在的已经通过进程 (I) 确定为未落入所述指定的数值范围内的比较值的数 目超过指定数目 ]。
     11. 根据以上 10 的程序, 其中所述进程 (i) 包括以下进程 (i) 至 (v) :
     [ 进程 (i) : 在存在于 n 组所述探针核酸组的每个中的 p 个样点中,
     从 n 组所述探针核酸组中选择一对两个探针核酸组, 所述一对两个探针核酸组被 这样选择以致包含样点 X1, 以及
     在所述两个探针核酸组之间, 计算已经固定有所述相同的探针核酸的成对的样点 的标记强度的比较值 ]
     [ 进程 (ii) : 对所述探针核酸组中的 p 个成对的样点中的每个进行在进程 (i) 中 的比较值的计算 ],
     [ 进程 (iii) : 计算在进程 (ii) 中获得的 p 个比较值的平均值或中央值 ], 以及
     [ 进程 (iv) : 从在进程 (iii) 中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围, 并且 比较 p 个比较值中的每个是否超过所述指定的数值 ]。
     12. 一种诊断源于基因突变的疾病的方法, 所述方法使用根据以上 1 至 9 中任一项 的分析核酸突变的方法。
     本发明的优势
     根据本发明的分析核酸突变的方法可以降低假阳性和假阴性在分析结果中的影 响, 尤其是, 降低由于标准核酸的 CNV 所导致的影响 ( 其为常规阵列比较基因组杂交技术中 的问题 ), 并且可以改善分析结果的可靠性。更具体地, 即使对于在常规阵列比较基因组杂 交技术中由于假阳性和假阴性的影响而需要复查的分析物, 根据本发明的分析核酸突变的方法不需要复查。
     因为本发明的程序在以上分析核酸突变的方法中执行数据处理, 所以可以降低在 分析结果中假阳性和假阴性的影响, 尤其是由于 CNV 所导致的影响, 并且可以改善分析结 果的可靠性。
     因为根据本发明的用于诊断来源于基团突变的疾病的方法包括使用以上分析核 酸突变的方法, 所以可以在降低假阳性和假阴性影响的情况下做出诊断。
     附图简述
     图 1 是流程图, 其显示作为本发明的一个实施方案的分析核酸突变的方法。
     图 2 是部分示意图, 其显示作为本发明的一个实施方案的分析核酸突变的方法的 一个实施方案的部分。
     图 3 是这样的图, 其显示分析物 DNA No.1 与作为标准的男性基因组 DNA 的荧光强 度比的对数坐标图的结果。
     图 4 是这样的图, 其显示分析物 DNA No.1 与分析物 DNA No.2 的荧光强度比的对 数坐标图的结果。
     图 5 是这样的图, 其显示分析物 DNA No.1 与分析物 DNA No.3 的荧光强度比的对 数坐标图的结果。 图 6 是这样的图, 其显示分析物 DNA No.1 与分析物 DNA No.4 的荧光强度比的对 数坐标图的结果。
     实施本发明的方式
     在本说明书中, 表示范围的 “至” 显示这样的范围, 所述范围包含分别在词的前后 作为最小值和最大值描述的数值。
     根据本实施方案的分析核酸突变的方法是使用阵列比较基因组杂交技术的分析 方法, 所述方法包括以下步骤 (a) 至 (d)。
     图 1 和图 2 是示意图, 其显示根据本发明的分析核酸突变的方法的一个优选实施 方案。在这样点上, 在图 1 中作为步骤 (d) 中判断标准的样点的数目是一半而在图 2 中例 举了 n 是 4 的情况, 但是本实施方案不限于此。
     首先, 在步骤 (a) 中, 使用 n 组相同的探针核酸组, 其中彼此不同的探针核酸已经 被固定到核酸微阵列上的 p 个以上的样点, 使 S1 至 Sn 的 n 种样品核酸逐个与所述探针核 酸组接触从而实现杂交。下文中, p 是 2 以上的整数而 n 是 3 以上的整数。
     然后, 选择已经固定有所述相同的探针核酸的 n 个样点 X1 至 Xn, 所述样点 X1 至 Xn 选自 n 组探针核酸组中的每个, 并且获得已经杂交到相应的样点中的样品核酸的标记强 度 F1 至 Fn( 样点 X1 : F1 的标记强度, 样点 X2 : F2 的标记强度 ... 样点 Xn : Fn 的标记强度 ) ( 步骤 (b))。
     接下来, 确定从 F2 与 F1 的比较值至 F1 与 Fn 的比较值的 n-1 个比较值中的每个 是否落入指定的数值范围 ( 步骤 (c))。在图 2 中, 在步骤 3 中 F1 与 F2 的比较值 C2 显示为 F1/F2 而 F1 与 F3 的比较值 C3 显示为 F1/F3, 但是如以下所述比较值的计算方法不限于此。
     然后, 在 n-1 个比较值中, 当在步骤 (c) 中已经确定为未落入指定的数值范围内的 比较值的数目超过指定数目时, 样点 X1 被确定为阳性 ( 步骤 (d))。
     顺便提及, 此处集中于任意的样点 X1 以进行说明, 但是也可以用其他样点代替所
     述样点来进行说明。优选的是用阵列中已经杂交有样品核酸 S1 的所有样点代替以上 X1 来 进行分析。
     此处, 阵列比较基因组杂交技术 ( 下文中有时也称为阵列 CGH 技术 ) 是指其中比 较基因组杂交技术在核酸微阵列上进行的技术。例如, 该技术已经准确地描述于由 Joji Inazawa 等编辑的 “Arei CGH Shindan Katsuyo Gaido Bukku Shitte Okitai Senshokutai Bisaikozo Ijosho” (Iyaku(Medicine and Drug( 医学和药物 ))Journal Co., Ltd) 等中。
     在常规阵列 CGH 技术中, 已知有使用两色法的技术, 其中不同种类的标记化合物 被用于标准核酸和分析物并且同时杂交到相同的样点中。
     在两色法中, 在相同的阵列中同时评价标准物和分析物, 但是, 在标准核酸的 CNV 未知的情况中, 难以确定作为测量结果出现的增加或减小是否是标准物的增加或减小或分 析物影响下的增大或减小 ( 所谓假阳性 / 假阴性 )。为避免这种问题, 在两色法中, 事先对 标准物的 CNV 进行确认。然而, 在标准物的 CNV 未知的情况中, 需要很多样品和实验以评价 标准物的 CNV。
     另一方面, 在本实施方案的方法中, 作为分析物的核酸和作为对照的一个核酸各 自杂交到已经固定有相同种类的核酸的不同的样点并且将测量值彼此比较。然而, 甚至在 此方法中, 当分析物核酸添加到阵列 1, 作为对照的分析物核酸添加到阵列 2, 各自杂交时, 比较样点 X1 和样点 X2( 它们是已经固定有相同的探针核酸的样点 ) 的标记强度由此获得 一个比较值, 并且基于它判断阳性或阴性, 尤其在对照包含 CNV( 拷贝数变异 ) 的情况中, 产 生由于对照的影响所导致的增加或减小 ( 所谓假阳性 / 假阴性 ) 并且因此存在需要复查的 情况或发生判断错误的情况。 因此, 在本实施方案中, 使用 n 种标记的样品核酸。n 是 3 以上的整数。具体地, 在 n 种样品核酸中集中于一种作为判断目标, 使用剩下的 n-1 种作为对照获得关于该判断 目标的 n-1 个比较值, 并且进行对比较值阳性或阴性的临时判断。然后, 在 n-1 个临时判断 的结果中, 指定数目以上的结果是临时阳性的情况被判断为真阳性, 而判断为临时阳性的 结果的数目小于指定数目的情况被判断为真阴性。
     至于指定数目, 优选使用临时判断结果总数目的 30 %至 70 %范围内的数目, 而 40%至 60%的数目是更优选使用的。
     此处, 阳性 / 阴性与在常规阵列 CGH 技术中是相同的, 并且以下情况被称为阳性 : 与标准核酸相比在鉴定核酸中已经被固定到目标样点的核酸序列以更大的量存在, 或者以 更小的量存在或者不存在 ; 而量相等的情况被称为阴性。
     通常, 在某个样点中, 在分析物核酸与一种对照核酸的比较中, 产生假阳性和假阴 性 ( 下文中简称为假阳性等 ) 的可能性最多是大约 1/10, 通常是 1/100 以下。因此, 使用 n-1 种对照核酸, 并且在所得的 n-1 个临时判断的结果中, 指定数目以上的结果是临时阳性 的情况被判断为真阳性, 由此很大程度上减小了产生以上假阳性的可能性。
     如上, 通过根据本实施方案的分析核酸突变的方法, 假阳性等可以从测量结果中 减少。
     此外, 因为在本实施方案中以上产生比率变得很低, 所以可能不使用标准核酸。
     用于本实施方案中的样品核酸的种类 n 是 3 以上并且优选地是 4 以上。
     如上所述, 所述效果随 n 增加而变高并且 n 的上限不受限制, 但是, 为快速获得数
     据或从简化计算的观点来看, n 优选 100 以下。最优选地 n 是 4 至 100。
     下文中, 标记的 n 种样品核酸也被显示为样品核酸 S1、 S2、 ...Sn-1, Sn(n 是 3 以 上的整数 )。
     下文中, 当确认样点 (X1) 中的标记是否为阳性时, 即当确认核酸突变 (S1) 在与样 点 (X1) 接触的标记的样品核酸中是否出现时, 集中于样点 (X1) 进行说明, 而样点 (X1) 是 任意的样点。通常, 集中于阵列上的 p 个以上的样点 (p 是 2 以上的整数 ) 中的每个样点以 进行实施方案的方法, 并且优选地, 集中于已经杂交有样品核酸的阵列上的所有样点以进 行确认。
     此外, 在所述样品核酸中, 集中的核酸被用作待判断的核酸而待比较的相对的一 个被用作对照核酸, 但是可以集中于任何样品核酸并且将其用作待判断的核酸。优选的是 至少两种所述样品核酸是分析物核酸。即, 以上核酸如 S1 可以任意选自 n 种所述核酸, 并 且通过施行本实施方案使用顺序地包含在 n 种核酸中的所有分析物核酸如 S1 可以对核酸 突变进行高度可靠的分析。
     通过比较关于样品核酸的对应样点的标记强度, 可以判断多个分析物核酸的真阳 性或阴性。 此外, 对于阵列上的所有样点中的每个, 进行杂交的步骤和获得标记强度的步骤 通常执行一次。
     在这样点上, 也可能的是关于其中之前已经获得了杂交后的标记强度的数据, 通 过所述实施方案的方法进行确认。
     步骤 (a)
     在步骤 (a) 中, 使 S1 至 Sn 的 n 种标记的样品核酸逐个与已经固定有相同的探针 核酸的 n 个样点 X1 至 Xn 接触, 由此将样品核酸杂交到以上被固定的核酸。
     核酸微阵列是指探针核酸高密度地结合到固体基底的阵列。 用于以上固体基底的 固体材料不受特殊限制, 只要它是探针核酸可以结合的材料, 例如, 玻璃材料诸如通常使用 的载玻片以及塑料材料。
     作为用于本实施方案的核酸微阵列, 可以提及 BAC-DNA 阵列、 寡核苷酸微阵列、 c-DNA 微阵列等。
     在根据本实施方案的分析核酸突变的方法中, 可以使用市售的核酸微阵列或者可 以使用通过通常方法制备的核酸微阵列。
     所述样点是指已经大量地高密度地固定有探针核酸的区域并且多个样点存在于 以上的核酸微阵列上。
     以上在核酸微阵列上的样点的数目不受特殊限制, 只要该数目是 p 个以上, 但是 通常, 5 个至 1,000,000 个的数目是优选的而 300 个至 5,000 个的数目是优选的。
     所述样点在以上核酸微阵列上的布置不受特殊的限制, 并且可以提及在多个区域 中具有阵列并且能够在一个基底上测量多个样品核酸的多分析物阵列, 在一个基底上组合 多个阵列并且复制大量样点的带环 (tie ring) 阵列等。
     探针核酸是指这样的核酸, 所述核酸已经固定在核酸微阵列的基底上 ( 优选地以 多个样点的形式 ) 并且优选地是包含已知序列的核酸。
     探针核酸的大小优选地是 10 个碱基 (b) 至 10kb, 更优选 50b 至 5kb, 并且进一步
     优选 100b 至 2kb。
     “相同的探针核酸” 也包括在严格条件下和与以上探针核酸互补的核酸杂交的核 酸。
     在本实施方案中, 分别用在已经固定有相同的探针核酸的 n 个样点中的不同样品 核酸进行杂交。此处, 已经固定有相同的探针核酸的样点被表示为样点 X1、 X2、 ...Xn-1、 Xn(n 是 3 以上的整数 )。
     n 个样点 X1、 X2、 ...Xn-1、 Xn 可以存在于相同的核酸微阵列上但是优选地存在于 n 个不同的核酸微阵列上。 例如, 在 n 个样点分别存在于 n 个相同种类的核酸微阵列上的情 况中, 优选的是使用具有相同区编号 (block number)、 列编号或行编号的样点作为 n 个以 上的样点。
     待固定的探针核酸的量优选为每样点 0.8 至 5μg, 更优选为 1.0 至 2.0μg。
     在步骤 (a) 中, “探针核酸组” 是指一组编码特定转录产物的基因的探针核酸。在 本实施方案中, 探针核酸组的数目通常对应阵列上的样点的数目。
     对于一个探针核酸组, 在每个样点上可以固定一种探针核酸或者可以固定多个探 针核酸, 只要在单独的样点之间固定的探针核酸的种类是不同的。 通常, 一个探针核酸组固 定在一个阵列上。
     在步骤 (a) 中, n 组探针核酸组是指 n 组相同的探针核酸组并且也可以包括在严 格条件下和与特定探针核酸组互补的探针核酸组杂交的探针核酸组。
     以上相同的探针核酸组对应于样品核酸的种类并且是 n 组。
     至于以上的探针核酸, 可以提及化学合成的核酸、 cDNA、 BAC( 细菌人工染色体 )、 YAC( 酵母人工染色体 )、 PAC( 来源于 P1 的人工染色体 )、 通过使用基因工程技术扩增它们 获得的那些。
     此外, 通过化学修饰天然核酸诸如 DNA 和 RNA 获得的核酸可以用作探针核酸。可 以使用例如, PNA( 肽核酸 )、 BNA( 桥接核酸 )、 膦酸甲酯类 DNA、 硫代磷酸酯类 DNA、 氨基磷酸 酯类 DNA、 硼烷磷酸酯 (boranophosphate) 类 DNA 等。此外, 也可以采用嵌合体类核酸。
     至于将探针核酸结合到固体基底上的方法, 可以提及使用已经结合有由基因芯片 (Gene Chip) 代表的发光基团的亚酰胺 (amidite) 单体以及使用掩膜逐个化学合成核苷酸 的方法, 或者通过喷墨方法将亚酰胺单体点样于固体基底上从而化学合成所需的序列的方 法, 通过改变电极上溶液的 pH 并且利用 pH 改变除去保护基团而在基底上合成核酸的方法, 纯化之前化学合成的核酸并将其点样在基底上的方法, 使用点样仪 (spotter) 点样 cDNA 的 方法等。至于点样方法, 可以提及喷墨法、 插针 (pin) 阵列法等。
     样品核酸是指用于根据本实施方案的分析核酸突变的方法的单链或双链核酸并 且可以是 DNA、 RNA 等中的任何一个。
     样品核酸的来源不受特殊限制并且, 例如, 可以提及分析目标诸如包含样品核酸 的细胞, 使用核酸微阵列对其核酸的表达量和现有量、 基因组中的拷贝数等进行测量 ; 或对 其进行评价诸如诊断的细胞, 并且也可以提及组织、 器官、 一个个体等, 并且所述来源不限 于细胞自身。
     尤其地, 样品核酸的来源优选能够从被认为具有特定疾病的人类患者、 动物等获 得的细胞等。 至于疾病, 可以包括所有疾病, 诸如癌症、 遗传疾病和传染性疾病, 核酸可以具有关于所述疾病的某些信息, 并且所述疾病不受特殊的限制。本实施方案的方法适于检查 突变数目相对小的先天遗传疾病。 非入侵性位点诸如粘膜、 毛发和指甲以及体液诸如血液、 淋巴、 骨髓、 精子和羊水优选地用作样品。
     n 种样品核酸优选地是来源于分类上属于相同物种的不同个体的核酸或来源于相 同个体的不同细胞的核酸, 更优选来源于人类不同个体的核酸或来源于相同人类个体的不 同细胞 ( 例如, 正常细胞和癌细胞 ) 的核酸。来源于人类不同个体的核酸是最优选的。
     此外, 本实施方案的方法优选地用于检查这样的个体, 所述个体不是根据患有特 定遗传疾病的可能性等选择的 ( 对新生儿等的全数检查 )。
     在样品核酸的制备 ( 例如, 纯化、 断裂 ) 方面, 优选的是通过纯化处理除去溶于细 胞的物质诸如蛋白质和脂质。 这是因为在用荧光等标记时发生不同副反应并且当不进行纯 化时溶于细胞的物质诸如蛋白质和脂质很大程度上也影响背景噪音, 以致核酸微阵列的性 能显著降低。
     至于用于纯化的方法, 可以提及使用用二氧化硅、 纤维素化合物等的核酸吸附膜 支撑的柱体 (cartridge) 的方法, 用乙醇沉淀或用异丙醇沉淀, 用酚氯仿萃取等。此外, 可 以提及以下方法 : 使用离子交换树脂的固相萃取柱、 色谱等, 与疏水取代基诸如十八烷基键 合的二氧化硅支持物 (support), 具有尺寸排阻作用的树脂。 样品核酸的长度不受特殊限制 并且, 例如, 可以是全基因组, 但是可以在以下的断裂处理后进行以上的纯化处理。 在这样点上, 标记的样品核酸的长度不受特殊限制, 但是通过标记 / 断裂处理, 所 述核酸通常被断裂为 1,000 个碱基 (1kb) 或碱基对 (bp) 至 5,000b 或 bp。
     至于断裂处理, 可以提及酶处理、 超声处理、 机械破碎处理、 化学处理等。 至于用于 酶处理的酶, 优选使用限制酶或核酸酶。至于限制酶的种类, 也可能使用多个酶。
     至于机械破碎处理, 可以提及使用玻璃球、 不锈钢球、 氧化锆球等裂开核酸的方 法。
     以上核酸可以经受扣除法 (subtraction method) 的处理。扣除法是指这样的方 法: 在目标基因的拷贝数或表达存在差异的情况中, 通过以扣除的方式扣除存在于基因中 的差异来有效地分离基因。 可以采用例如, PCR 选择法、 RDA( 代表性差别分析 ) 法、 DsDD( 双 链特异性直接消化 ) 法等。
     尤其, 在本实施方案中, 在使用来源于癌细胞的样品核酸的情况中, 因为大量正常 细胞与癌细胞一起包含在癌组织中, 所以存在这样的情况, 其中核酸微阵列的性能显著下 降, 但是可以通过所述扣除法在一定程度上防止所述性能下降。
     至于 n 种样品核酸, 其优选包括至少多种分析物核酸和至少一种、 优选两种以上 的标准核酸。
     此外, 作为本实施方案的另一个实施方案, 可能不使用样品核酸, 即, 所有的 n 种 样品核酸都可以是分析物核酸。
     分析物核酸是所谓获得自分析物的核酸, 即, 核酸突变未知并且所述核酸突变由 本实施方案分析的目标核酸。例如, 提取自正常细胞 ( 非癌化细胞 ) 的核酸或提取自异常 细胞 ( 例如, 癌细胞 ) 的核酸可以用作分析物核酸。
     标准核酸是在上面用于与分析物核酸比较的核酸, 并且是使用者 ( 分析核酸突变 的方法的实施者 ) 事先在某种程度上掌握其关于突变等的一些信息的核酸。具体地, 关于
     拷贝数变异 (CNV) 等, 优选拷贝数变异的位置和数目已知的核酸并且更优选碱基序列已知 的核酸。
     此外, 例如, 当癌症在具有 CNV 或某些嵌合体的患者体内产生时, 在获得自癌细胞 的核酸和获得自相同患者的不同于所述癌细胞的正常细胞的核酸的情况中, 所述 CNV 或某 些嵌合体被抵消, 以致在获得自正常细胞的核酸作为标准核酸的使用中不出现问题。 因此, 即使当基因组中的拷贝数不同于它在该生物物种中通常存在的量时, 所述核酸可以用作标 准核酸, 只要可以从与分析物核酸的比较中获得信息, 例如, 在相同固体的情况中。
     各以上样品核酸优选地标记以相同的标记。
     标记是指结合到核酸的可检测物质。 所述可检测物质不受特殊限制并且可以提及 荧光物质、 酶、 放射性同位素、 诱发 FRET( 荧光共振能量转移 ) 的化合物等。优选的是具有 荧光物质的荧光标记物。
     所述荧光物质不受特殊限制并且可以使用异硫氰酸荧光素 (FITC)、 Cy 染料、 Alexa、 绿色荧光蛋白 (GFP)、 蓝色荧光蛋白 (BFP)、 黄色荧光蛋白 (YFP)、 红色荧光蛋白 (RFP)、 吖啶、 DAPI、 溴化乙锭、 SYBR 绿、 德克萨斯红、 稀土荧光标记试剂、 TAMRA、 ROX 等。优 选用 Cy 染料诸如 Cy-3 或 Cy-5 进行荧光标记。 此外, 关于标记, 可以使用地高辛 (Digoxigein)(DIG)、 生物素等。 作为使用生物素 的实例, 当抗生物素蛋白与已经结合到探针的生物素结合时, 已经结合有生物素的碱性磷 酸酶结合于其上, 并且添加碱性磷酸酶的底物氮蓝四唑和 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚磷酸酯, 观 察到紫色显色并且因此可以用于检测。
     此外, 可以以非酶的方式进行标记。也可以使用例如, ULS 阵列 CGH 标记试剂盒 ( 由 Kreatech Biotechnology BV 公司生产 ) 等。
     至于用于荧光标记的方法, 可以使用直接标记法和间接标记法中的任一标记方 法。直接标记方法是指这样的方法, 其中将核酸转变为单链核酸, 将短链核酸杂交于其上, 并且将已经结合有荧光物质 ( 例如, Cy 染料 ) 的核苷酸化合物与核苷酸混合, 由此在一步 中标记核酸。 间接标记法是指这样的方法, 其中将核酸转变为单链核酸, 将短链核酸杂交于 其上, 将具有能够结合荧光物质 ( 例如, Cy 染料 ) 的取代基的核苷酸化合物 ( 例如, 具有氨 基烯丙基的核苷酸化合物 ) 与天然核苷酸混合在一起, 首先合成具有取代基的核酸, 然后 经由氨基烯丙基结合荧光物质 ( 例如, Cy 染料 ), 由此核酸得到标记。
     至于用于将标记化合物诸如荧光物质引入到核酸中的方法, 可以使用随机引物法 ( 引物延伸法 )、 切口平移法、 PCR( 聚合酶链反应 ) 法、 末端标记法等。尤其, 在本实施方案 中, 可以合适地使用随机引物法。
     随机引物法是这样的方法, 其中杂交几 bp( 碱基对 ) 至超过 10bp 的随机引物核酸 并且使用聚合酶同时进行扩增和标记, 由此合成标记的核酸。 切口平移法是这样的方法, 其 中, 例如, 使已经用 DnaseI 引入切口的双链核酸经受 DNA 聚合酶的作用以分解 DNA 并且通 过聚合酶的活性同时合成标记的核酸。 PCR 法是这样的方法, 其中制备两种引物并且使用所 述引物进行 PCR 反应, 由此同时进行扩增和标记从而获得标记的核酸。末端标记法是这样 的方法, 其中, 在标记 5′端的方法中, 通过与 T4 多核苷酸激酶的磷酸化反应将标记化合物 诸如荧光物质结合到用碱性磷酸酶去磷酸化的核酸的 5′端。标记 3′端的方法是这样的 方法, 其中用末端转移酶将标记化合物诸如荧光物质加到核酸的 3′端。
     至于标记的样品核酸等, 也可能使用含有标记的样品核酸等的未纯化溶液。在使 用这种未纯化溶液的情况中, 酶等仍然保留在所述溶液中并且因此, 在制备后, 优选使留在 所述溶液中的酶活性失活。这是基于避免影响数据再现性的观点。
     至于使酶失活的方法, 任何方法都是可能的, 只要它们能够使酶失活, 但是优选进 行添加螯合剂或 60℃以上热处理的方法中的任一种或两种。加热温度优选 60℃以上, 更优 选 63℃以上。充分的加热时间是 1 分钟以上并且更优选地, 优选在 65℃以上进行 5 分钟以 上的热处理。
     此外, 在使用克列诺片段 (klenow fragment) 的标记方法的情况中, 也可能使用涡 旋混合器等使酶的活性丧失。
     杂交
     在步骤 (a) 中, 为了将 n 种标记的样品核酸 S1 至 Sn 逐个地提供给以上 n 组探针 核酸组中的每个, 作为用于使样品核酸逐个结合到以上各样点中的方法, 可以使用任何方 法诸如吸管吸移。
     在步骤 (a) 中, 探针核酸和样品核酸可以通过将它们在杂交溶液中孵育来杂交。
     孵育条件不受特殊限制但是孵育优选在 25 至 50℃进行, 更优选在 30 至 45℃进 行, 并且进一步优选在 37 至 42℃进行。此外, 用于杂交的时间优选 8 至 96 小时, 更优选 12 至 72 小时, 并且进一步优选 16 至 48 小时。 对于用于步骤 (a) 中的杂交的杂交溶液, 没有特殊的限制, 只要探针核酸和样品 核酸在所述溶液中杂交。 优选具有这样性质的溶液 : 探针核酸和样品核酸合适地杂交, 并且 更优选具有这样作用的溶液 : 加速探针核酸和样品核酸的序列之间高符合度的杂交, 并且 另一方面抑制所述序列之间低符合度的杂交。
     杂交溶液优选包含具有排除体积效应 (extruded volume effect) 的物质, 用于降 低样品核酸熔点的物质和用于调节离子强度的溶液。
     作 为 具 有 排 除 体 积 效 应 的 物 质, 可 以 提 及 聚 乙 二 醇 (PEG, 见, 例 如, JP-A-2000-325099)、 葡聚糖硫酸酯等。
     作为用于降低样品核酸熔点的物质, 可以提及甲酰胺、 甘油、 甲醛、 二甲亚砜 (DMSO)、 N, N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、 硫氰酸胍 (GuSCN)、 碘等。
     作为用于调节离子强度的溶液, 可以提及 SSC(150mM NaCl、 15mM 柠檬酸钠 )、 SSPE(150mM NaCl、 10mM NaH2PO4.H2O、 1mM EDTA pH7.4)、 MES 杂交缓冲液等。
     在所述杂交溶液中, 可以加入封闭剂 (blocking agent)、 表面活性剂等。
     作为表面活性剂, 可以提及阳离子表面活性剂、 阴离子表面活性剂、 非离子表面活 性剂等。作为阴离子表面活性剂, 可以提及十二烷基硫酸钠 (SDS) 等。作为非离子表面活 性剂, 可以提及 Tween( 注册商标 )、 Triton X( 注册商标 ) 等。
     以上封闭剂用于在杂交时减少对非特异性杂交的检测。例如, 可以提及 tRNA( 转 移 RNA)、 经修饰的鲑鱼精子 DNA、 聚 A( 聚腺苷酸 )、 聚 dA( 聚脱氧腺苷酸 )、 脱脂乳等, 其主 要具有减少核酸微阵列的背景噪音的作用。同样, 可以使用通常市售的封闭剂。
     此外, 在本实施方案中, 如在 JP-A-2005-087109 中描述的, 作为杂交溶液的一种组 成, 也可以使用磷脂、 Denhardt 溶液 ( 包含聚蔗糖 (ficoll)、 聚乙烯吡咯烷酮和牛血清清蛋 白作为主要组分的溶液 )、 季铵盐甜菜碱 (Biochemistry( 生物化学 )32, 137-144(1993))、
     TMAC( 氯化四甲铵 )(Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国科学院院刊 ), 82, 1585-1588(1985))、 市售杂交溶液, 例如 ExpressHyb( 由 Clontech 公司制造 )、 PerfectHyb( 由 TOYOBO Co., Ltd. 制造 )、 ULTRAhyb( 由 Ambion 公司制造 ) 等。
     对于杂交, 优选在严格条件下使得目标核酸和探针核酸杂交。作为具体的杂交条 件, 例如, 在 37℃进行 16 小时的杂交反应后, 作为洗涤条件, 可以提及 (1) 用 5mL 2×SSC 溶 液在室温洗涤 30 秒, (2) 用 5mL 50%甲醛 /2×SSC(pH7.0) 溶液在 50℃洗涤 15 分钟, (3) 用 5mL 2×SSC/0.1% SDS(pH7.0) 溶液在 50℃洗涤 30 分钟, (4) 用 5mL 2×SSC 溶液在室 温洗涤 5 分钟。
     步骤 (b)
     在步骤 (b) 中, 获得在 n 个样点 X1 至 Xn 中杂交的样品核酸的标记值 F1 至 Fn。
     在步骤 (b) 中, 用于在杂交后在核酸微阵列上获得标记强度的方法不受特殊限 制, 只要标记强度可以得到测量。
     在步骤 (b) 中, 样点 X1 的标记强度显示为 F1, 样点 X2 的标记强度显示为 F2, ... 样 点 Xn-1 的标记强度显示为 Fn-1, 而样点 Xn 的标记强度显示为 Fn。n 是 3 以上的整数。
     例如, 在放射性同位素的情况中, 可以使用 X 射线胶片、 BASS( 由 FUJIFILM 公司生 产 ) 等。
     在荧光物质用作标记物质的情况中, 优选使用荧光扫描仪。作为荧光扫描仪, 例 如, 可以提及 FLA 系列 ( 由 FUJIFILM 公司生产 )、 GenePix 系列 ( 由 Axon Instruments Inc. 生产 )、 LS Reloaded( 由 TECAN 公司生产 ) 等。步骤 (c)
     在步骤 (c) 中, 将样点 X1 的标记值 F1 与标记值 F2 至 Fn 中的每个相比, 由此获得 n-1 个比较值 C2 至 Cn, 并且进行确定各比较值是否落入指定的数值范围。 换言之, 进行临时 确定各比较值的大小是否对应阳性。不包括步骤 (d) 的常规方法中的阳性 / 阴性 ( 尤其是 与 S2 至 Sn 中的标准核酸的比较值的确定结果 ) 对应于本文中的临时确定的阳性 / 阴性。
     比较值是通过彼此比较相同种类的两个样点的标记强度获得的数值, 并且可以提 及标记强度比、 标记强度之间的差等。 比较值优选标记强度比, 更优选标记强度比的对数值 (Log 值 ), 并且进一步优选以 2 为底的标记强度比的对数值 (Log2 值 )。
     用于临时判断各比较值阳性或阴性的标准, 即, 指定的数值范围可以与常规阵列 比较基因组杂交技术的标准相等并且, 例如, 准备已知为阳性的样品核酸 ( 阳性对照 ) 和已 知为阴性的样品核酸 ( 阴性对照 ) 并且可以使用它们的中间值作为阈值进行判断。
     此外, 因为可能用于杂交的 n 种样品核酸的量彼此不同, 所以优选包括用于校正 样品核酸的量的步骤。这种步骤不受特殊限制, 并且可以应用在比较不同探针核酸组中获 得的标记强度的单色法杂交中通常使用的归一化。例如, 可以使用整体归一化等。
     例如, 可以提及这样的方法 : 使每个阵列中的 p 个样点的标记强度的平均值, 或如 之后在步骤 (c2) 中描述的, 中央值在待比较的阵列中相等, 以及这样的方法 : 在获得一对 阵列间的每个样点的每个比较值后, 使所述一对阵列间的 p 个比较值的平均值或中央值等 于另一对阵列间的 p 个比较值的平均值或中央值。 具体地, 可以提及这样的方法 : 用通过用 单个标记强度或比较值除以各阵列内的 p 个样点的标记强度的平均值或中央值获得的比 率, 通过减去标记强度的平均值或中央值获得的值, 或偏差值表示。
     通过包括这种步骤, 可以校正如上所述的由样品核酸的量引起的差异。 此处, 用于校正的方法不受特殊限制并且, 例如, 可以提及这样的方法 : 使标记强度乘以和除以平均值 或中央值, 排除与平均值或中央值偏离一定值以上的值。
     此外, 在以上的校正步骤中, 在通过除以平均值或中央值获得的比率的情况中, 所 得的值是对应于拷贝数的值。至于前述步骤 (c) 中的指定的数值范围, 可以根据各测量值 ( 尤其是获得自对已知突变测量的值 ) 设定这样的值, 所述值能够排除突变明显发生的区 域, 或者可能基于可能作为理论拷贝数的数值设定值。对于后者, 具体地, 在存在于不含异 常的常染色体上的特定核酸区域的数目是 1 个拷贝而一对的以上染色体对的拷贝数是 1 的 情况中, 理论上可能的拷贝数是间隔 0.5 的值, 诸如 0、 0.5、 1、 1.5、 2..。 因此, 对于用于在以 上步骤 (c) 中进行确定的标准, 可能使用以上间隔的一半 ( 即 0.25) 作为阈值来判断临时 阳性或阴性, 或者排除中间值 ( 例如, 0.2 至 0.3) 而不像以前那样作为假阳性进行判断。
     可以与在常规阵列比较基因组杂交中阳性判断标准相似地设定比较值的指定的 数值范围。例如, 在使用荧光强度比的情况中, 理论上, 可以提及诸如 0.8 至 1.2 的值, 但是 考虑到序列的鉴定等, 所述值可以任意设定。例如, 在进行之后要提及的修正的情况中, 可 以在这种程度上进行乘或除。
     即, 在本实施方案中, 以上步骤 (c) 优选对存在于 n 组探针核酸组中的每个中的 p 个样点进行以下步骤 (c1) 至 (c3) 的步骤。即, 总共计算 (n-1)×p 个比较值。
     [ 步骤 (c1) : 从以上 n 组探针核酸组中选择一对两个探针核酸组, 这样选择以致其 包括样点 X1, 以及
     在所述两个探针核酸组之间比较 p 对固定有相同的探针核酸的样点的每对的标 记强度, 以计算 p 个比较值 ]
     [ 步骤 (c2) : 计算步骤 (c1) 中获得的 p 个比较值的平均值或中央值 ]
     [ 步骤 (c3) : 基于步骤 (c2) 中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围并且确 定 p 个比较值中的每个是否超过指定的数值范围 ]
     更具体地, 本实施方案包括以下步骤 :
     提供 n 个相同的探针核酸组 NS1 至 NSn,
     各探针核酸组 NSi 提供具有 p 个样点 ti1 至 tip 的核酸微阵列, i 是整数并且满足 1 ≤ i ≤ n 而 p 是整数并且满足 2 ≤ p,
     将彼此不同的探针核酸固定在各探针核酸组 NSi 的 p 个样点 ti1 至 tip 上。
     各探针核酸组 NSi 的 p 个样点中的一个是样点 Xi,
     将相同的探针核酸固定到所述样点 tij 至 tnj 上, j 是整数并且满足 1 ≤ j ≤ p,
     步骤 (a) 包括使标记的样品核酸 Si 与探针核酸组 NSi 接触从而将样品核酸 Si 杂 交到已经固定在探针核酸组 NSi 的 p 个样点上的核酸,
     步骤 (b) 包括获得已经杂交到各探针核酸组 NSi 的样点 ti1 至 tip 中的样品核酸的 标记值 Fi1 至 Fip,
     NS1 和 NSm 选自探针核酸组 NS1 至 NSn 并且 m 是整数并且满足 2 ≤ m ≤ n,
     步骤 (c) 包括以下步骤 :
     (c1) 比较标记值 F1j 与 Fmj 以确定 p 个比较值 C1″至 Cp″,
     (c2) 计算比较值 C1″至 Cp″的平均值或中央值, 以及
     (c3) 基于在步骤 (c2) 中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围并且判断比较值 C1″至 Cp″是否落入指定的数值范围。
     在步骤 (c3) 中, 优选的是比较值是标记强度比并且根据标记强度比的平均值或 中央值的偏差进行对阳性或阴性的临时判断。例如, 基于平均值或中央值的偏差设定阈值 ( 指定的数值范围 ), 并且与平均值或中央值的偏差超过以上阈值的情况可以临时地被判 断为阳性 ( 或阴性 )。
     在获得如上所述的比较值前, 也可以通过计算各探针核酸组中的 p 个样点的单个 标记强度的平均值或中央值并且将它与单个的标记强度相比来实施计算比较值的平均值 或中央值的步骤以及将它与步骤 (c2) 和 (c3) 中的单个的比较值比较的步骤。即, 在本实 施方案中, 以上步骤 (c) 可以是以下步骤 :
     [ 步骤 (cc) : 计算 n 组探针核酸组中的单个样点的标记强度的平均值或中央值,
     在 n 组探针核酸组的每个中, 基于所述平均值或中央值计算单个样点的偏差值 (F′ 1、 F′ 2...F′ n),
     计算在 n 组探针核酸组中的一对两个组之间相同种类的成对的样点的标记强度 的比较值, 并且根据 n 组的平均值或中央值, 确定从成对的 F′ 1 和 F′ 2 的比较值至成对 的 F′ 1 和 F′ n 的比较值的 n-1 个比较值中的每个是否落入指定的数值范围 ]。 顺便提及, 在本实施方案中, 为了说明的缘故, 将单个的步骤编号成不同的数以进 行说明, 但是所述编号不限制其次序并且也不排除同时处理。
     步骤 (d)
     在步骤 (d) 中, 在已经确定为未落在指定的数值范围的数目超过 n-1 中的指定数 目的情况中, 样点 X1 被确定成阳性。指定数目优选地是 n-1 的一半并且 n 是 4 以上和指定 数目是 n-1 的 70%的情况是更优选的。此外, 确定的数目是某个数目以下的情况优选地被 确定为阴性, 但是同样优选的是限定特定的范围而落入限定范围内的情况被判断为假阳性 并且进行复查。 甚至在进行复查的情况中, 与常规方法相比, 预期在很大程度上减小需要复 查的可能性。此外, 在进行复查的情况中, 优选改变比较主体来进行复查。
     在这样点上, 在步骤 (d) 中, 在比较值已经被确定为未落入指定的数值范围的情 况的数目没有超过 n-1 中的指定数目的情况中, 可以判断样点 X1 中的数据缺少可靠性并且 可以进行处理诸如复查。
     此外, 样点 (X1) 是任意样点并且通常, 在包含样点 X1 的相同的阵列中的多个样点 ( 优选地所有样点 ) 中, 在替换以上 (X1) 的情况下进行与本实施方案的步骤 (a) 至 (d) 相 同的步骤或处理 (i) 至 (iii)。
     标记强度校正
     以上在步骤 (b) 中获得的标记强度优选为经校正的值。
     具体地, 在步骤 (b) 中获得的标记强度优选获得自以下步骤的值。
     优选的是包括这样的步骤 : 使标记的样品核酸与某个样点上的固定的探针核酸杂 交,
     加入标记的鉴定核酸并且将加入的核酸杂交到探针核酸的步骤, 所述标记的鉴定 核酸具有可以杂交到以上探针核酸的至少一部分的序列并且标记以不同于标记的样品核 酸的标记物的标记物,
     获得以上样点中杂交的经标记的样品核酸的标记强度的步骤,
     测量所述样点中杂交的经标记的样品核酸的标记强度的步骤, 以及
     基于鉴定核酸的标记强度检测所述样点中固定的探针核酸的量并且通过检测的 量校正样品核酸的标记强度的步骤。
     校正方法可以使用描述于例如 JP-A-2010-004873 中的方法。
     此处, 优选的是使得标记的样品核酸杂交的步骤和使得标记的鉴定核酸 (B) 杂交 的步骤同时进行, 并且
     测量经杂交的标记的样品核酸的量的步骤和测量经杂交的鉴定核酸的量的步骤 同时进行。
     此处, 鉴定核酸是指具有可以杂交到探针核酸的至少一部分的序列的核酸, 并且 可以用于检测由多个样点杂交能力 ( 具体地固定在每个样点的探针核酸的量 ) 的不均导致 的变化, 并且可以进一步用于校正样点之间的探针核酸的量的变化。因此, 充分地, 鉴定核 酸是可以杂交到固定在核酸微阵列上的所有样点中的探针核酸的核酸并且可以具有任何 序列和链长度。此处, 所有的样点表示可能使相同溶液中的分析物或标准物起反应的所有 样点, 并且通常是单一核酸微阵列上的所有样点但是不限于此。
     此外, 鉴定核酸可以是任何核酸, 只要它可杂交并且可以是天然核酸诸如 DNA 和 RNA 以及同样地通过对天然核酸诸如 DNA 和 RNA 进行化学修饰获得的核酸。 例如, 可以使用 PNA、 甲基磷酸酯类 DNA、 硫代磷酸酯类 DNA、 嵌合体类核酸等。
     至于优选作为鉴定核酸的序列, 可以提及重复性序列。重复性序列也被称为重复 序列, 并且是每隔某一数目的碱基就重复出现的序列, 诸如限制酶识别位点。 可以提及其中 短的碱基序列的模式重复多次的序列, 例如, 聚 d(AT) 和聚 d(GC), 以及其中长序列 ( 一个单 元可以达到数千个碱基对 ) 重复多次的序列, 并且已知在高等动物诸如人中这种序列以高 频率出现在基因组中。在本实施方案中, 例如, 可以合适地使用从 Invitrogen 公司商业获 取的 Cot-1DNA。
     已知 Cot-1DNA 是这样的核酸, 其在核酸微阵列测量中用于封闭获得自哺乳动物 的分析物的重复序列。
     通过标记至少一部分的 Cot-1DNA 并且将标记的 Cot-1DNA 与未标记的 Cot-1DNA 一起使用, 也可能加强对特异性杂交的检测灵敏度并且减小样点间的差异。
     作为鉴定核酸, 与分析物核酸不同, 同样优选使用不同于分析物核酸并且具有所 有探针核酸组通常具有的序列的核酸。
     例如, 也可能使用这样的合成寡核苷酸作为鉴定核酸, 所述合成寡核苷酸具有与 通常存在于探针核酸中的核酸序列部分基本互补的核酸序列。
     此外, 也可能使用具有被认为在阵列的制备中存在于所有样点中的序列的核酸作 为鉴定核酸, 诸如在阵列的制备中使用的载体 ( 质粒、 BAC、 YAC、 PAC、 粘粒、 病毒等 ) 的核酸, 大肠杆菌的基因组等。
     在本实施方案中, 优选地以与样品核酸的摩尔比为 1 以上的量使用鉴定核酸。通 过以 1 以上的摩尔比使用它, 核酸微阵列的性能得到改善。
     鉴定核酸的大小优选 20bp 以上, 更优选 20bp 至 1Mbp, 并且进一步优选 100bp 至 500kb。
     使用的鉴定核酸的量与分析物或标准核酸的摩尔比优选地在 0.5 至 2 的范围内。
     自动化
     根据本实施方案的分析核酸突变的方法的所有步骤可以手工进行或者所述步骤 可以借助部分自动的机器进行或者所有步骤可以借助全自动机器进行。
     通过自动化, 工人免于繁重的工作, 人员经费可以得到减小, 由熟练程度的差异导 致的结果的差异可以降低, 并且可以避免人为失误。
     程序
     以下将说明本实施方案的程序。
     实施方案的程序是在以上说明的分析核酸突变的方法中用于执行数据处理的程 序, 其执行以下进程 (I) 和 (II) :
     [ 进程 (I) : 比较从 F1 与 F2 至 F1 与 Fn 的 n-1 个比较值是否落入指定的数值范 围]
     [ 进程 (II) : 在以下情况中判断样点 X1 为阳性 : 在以上 (I) 中临时确定的所有 n-1 个比较值中, 已经由进程 (I) 确定为未落入指定的数值范围内的比较值的数目超过指定数 目 ]。
     进程 (I) 优选地包括以下进程 (i) 至 (v) :
     [ 进程 (i) : 在存在于 n 组探针核酸组的每个中的 p 个样点中,
     从 n 组探针核酸组中选择一对两个探针核酸组, 所述一对两个探针核酸组被这样 选择以致包含样点 X1, 以及
     在所述两个探针核酸组之间, 计算已经固定有相同的探针核酸的成对的样点的标 记强度的比较值 ]
     [ 进程 (ii) : 对探针核酸组中 p 个成对的样点中的每个进行进程 (i) 中的比较值 计算 ],
     [ 进程 (iii) : 计算在进程 (ii) 中获得的 p 个比较值的平均值或中央值 ], 以及
     [ 进程 (iv) : 从在进程 (iii) 中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围并且 比较 p 个比较值中的每个是否超过指定的数值 ]。
     通过使用本实施方案的程序, 在对通过测量上述标记强度获得的数据的处理中可 以有效地进行数据处理。
     所述程序通常以这样的方式提供 : 它被记录在可在计算机上读取的记录介质上。 记录介质不受特殊限制, 只要它在计算机上可读。本实施方案的记录介质包括便携的记录 介质和固定类型的记录介质两者, 并且可以提及高密度磁盘 (CD)、 软盘 (FD)、 硬盘、 半导体 存储器等。
     可以通过将本实施方案的程序记录在以上的记录介质上来传送它, 或者可以以下 述形式传送它 : 它被记录在计算机的存储设备上并且经由网络传递到另一个计算机。
     以下将说明用于根据本实施方案诊断来源于基因突变的疾病的方法。
     用于根据本实施方案诊断来源于基因突变的疾病的方法使用以上说明的分析核 酸突变的方法。 作为以上的诊断目标疾病, 可以包括所有疾病诸如癌症、 遗传疾病和传染性 疾病, 对于所述疾病核酸可以具有某些信息, 并且所述疾病不受特殊的限制。
     在根据实施方案的诊断方法中, 通过将提取自正常细胞 ( 非癌化细胞 ) 的核酸作 为标准核酸而提取自异常细胞 ( 例如来源于癌症患者、 遗传性疾病患者或传染性疾病患者的细胞 ) 的核酸作为分析物核酸应用于以上说明的分析核酸突变的方法, 可以诊断提供分 析物的患者或者被用作分析物的细胞的病变, 而不受由 CNV 等所导致的假阳性和假阴性的 影响。 实施例 以下将根据实施例说明本发明。 显示于以下实施例中的材料、 试剂、 物质的量和比 率、 操作等可以适当地改变, 只要它们不偏离本发明的本质。因此, 本发明的范围不限于以 下具体的实施例。
     在以下实施例中, Cy3 男性表示通过用 Cy3 标记男性 DNA 获得的样品。 相似地, Cy5 男性表示通过用 Cy5 标记男性 DNA 获得的样品。此外, Cy5-Cot-1DNA 等相似地表示标记有 相应标记化合物的核酸。
     [ 实施例 1]
     1. 制备标记的样品核酸
     向微管中放入 3μL(0.75μg)Human Genomic DNA male( 人男性基因组 DNA)( 由 Promega 公司生产, 货号 G152 ; 下文中称为男性基因组 DNA), 8μL 水 ( 不含 DNAse、 Rnase 的 蒸馏水, GIBCO), 20μL 用于阵列 CGH(BioPrime( 注册商标 )Array CGH Genomic Labeling System( 阵列 CGH 基因组标记系统 )(invitrogen)) 的标记系统的 2.5×Random Primers Solution( 随机引物溶液 )(Invitrogen 公司 ), 接着使用块型孵育器 (block incubator) 在 95℃热处理 5 分钟并且在 37℃静置 15 分钟。
     向其中加入 5μL 的以上标记系统的 10×dCTP Nucleotide Mix( 核苷酸混合物 ) (Invitrogen 公司 ), 3μL Cy3-dCTP Bulk Pack 250nmol( 由 GEHealthcare Bioscience 公 司生产 ), 1μL BioPrime( 注册商标 )Array CGH Genomic Labeling System( 阵列 CGH 基 因组标记系统 ) 的 Exo-Klenow Fragment(Invitrogen 公司 ), 接着使用块型孵育器在 37℃ 与标记反应同时地进行 2 小时扩增反应。然后, 使用块型孵育器整体加热到 65℃以使包含 在反应溶液中的 Exo-Klenow Fragment 失活。
     以上操作, 遵从 puregene(QIAgen 公司 ) 的实验方法从 Coriell 医学研究所的 细胞株 GM07189( 下文中称为分析物核酸 No.1)、 细胞株 GM07189( 下文中称作分析物核酸 No.2)、 细胞株 GM13451( 下文中称作分析物核酸 No.3) 和细胞株 GM13451( 下文中称作分析 物核酸 No.4) 实施基因组提取。对于提取的 DNA, 使用 NanoDrop(Scrum Inc.) 测量 OD。在 因此获得的基因组上, 进行与在以上人男性基因组 DNA 的情况中相同的操作, 以获得未纯 化的标记的样品核酸。同样, 对于这些, 使用 Cy3-dCTP( 由 GE Healthcare Bioscience 公 司生产 ) 作为标记化合物。
     2.1. 制备标记的鉴定核酸
     除了将 3μg(13μL)Cot-1DNA( 由 Invitrogen 公司生产, 货号 15279-011) 用于微 管中和使用 3μL Cy5-dCTP Bulk Pack 250nmol( 由 GE Healthcare Bioscience 公司生 产 ) 作为标记化合物外, 以相同的方式获得标记的鉴定核酸 ( 未纯化的 )。
     2.2 制备包含标记的鉴定核酸的杂交溶液
     向微管加入 21μL 标记的核酸 Cy5-Cot-1DNA, 62μL 未标记的 Cot-1DNA(62μg, 由 Invitrogen 公司生产 ), 0.3μg 酵母 tRNA, 以及 9μL 3M 醋酸钠 (pH 5.2), 并且向其中
     加入 -20℃ 360μL 99.5% (v/v) 乙醇, 以实现乙醇沉淀。干燥后, 添加 8.7μL 水、 6.5μL 甲醛以及 16.8μL 20% SDS。向其中加入 32μL 葡聚糖 - 甲酰胺溶液, 所述葡聚糖 - 甲酰 胺溶液通过将水加入 1g 葡聚糖、 5mL 甲酰胺和 1mL 20×SSC 至 7mL 的体积而获得, 接着将全 部完全溶解。之后, 收集到一个管中, 并且将各 30μL 分散在多个管中。
     向其加入 10μL 的以上标记的样品核酸的基因组中的每个, 并且将整体充分搅 拌。然后, 在 75℃孵育 15 分钟后, 使产物在 42℃保持 30 分钟以上。
     3. 制备 BAC 阵列载玻片
     从已经插入人基因组的 BAC 文库, 每个染色体随机选择包含被认为是含有先天性 异常的基因区域的 BAC, 并且在 50mL LB 培养基 (+ 氯霉素 ) 中培养过夜。选择每个染色体 具有特定长度的以上 BAC, 并且最终制成 340 个样点。
     遵从所附实验方法使用 QIAGEN 公司的质粒中提试剂盒 (plasmid midi kit) 提 取它。在调节到 1.5μg/16μL TE 后, 分别使用限制酶 RsaI、 DpnI 和 HaeIII 进行 2 小 时的消化, 然后在 80 ℃持续 20 分钟使所述酶失活, 并且将这三种消化物混合。此外, 加 入 序 列 为 SEQ No.1 : 5 ′ -aattccggcggccgcccgatg-3 ′的 衔接 子和 序列 为 SEQ No.2 : 5 ′ -P-catcgggcggccgcgg-3 ′ (5 ′ 端 磷 酸 化 ) 的 它 的 互 补 链, 在 95 ℃、 5 分 钟, 70 ℃、 15 分钟, 65 ℃、 15 分钟, 60 ℃、 15 分钟, 55 ℃、 15 分钟, 50 ℃、 15 分钟, 45 ℃、 15 分钟, 40 ℃、 15 分 钟, 35 ℃、 15 分 钟, 30 ℃、 15 分 钟, 25 ℃、 15 分 钟 的 限 制 酶 消 化 后, 所述衔接子连接 到 DNA 片段上, 并且加入 5μL10×T4 连接酶缓冲液和 2.5μL T4 连接酶, 以使限制酶处 理后的 DNA 片段与衔接子结合。然后, 使用 Nucleospin 试剂盒 ( 由 MACHEREY-NAGEL 公 司生产 ) 纯化 DNA 片段。使用 EX-Taq( 由 Takara Bio Inc. 生产 ) 和序列为 SEQ No.3 : 5′ -NH2-ggaattccgcggccgcccgatg-3′的 5′端胺化引物进行 PCR。PCR 进行 15 个循环作 为第一次 PCR 并且 10 个循环作为第二次 PCR。通过在 MICROCON 柱上进行超滤来纯化产物 到 1μg/μL 的终浓度, 其被用作探针核酸。将它送至 NGK Insulators Ltd. 并且通过压电 法在 Matsunami Glass Ind. 的载玻片上进行点样, 以形成 BAC 阵列。
     此外, 根据 JP-A-2002-176977 中描述的方法使 BAC 阵列经历封闭和热变性。
     4, 杂交
     使用 ALOKA Co., Ltd 的 HYBRIMASTER HS300 进行杂交。
     放置 BAC 阵列载玻片, 将温度设定为 37℃并且, 在加入杂交溶液后, 在搅拌下进行 16 小时的杂交。 在此情况下, 使用 50%甲酰胺 /2×SSC 作为湿润液体。 之后, 在 25℃用 5mL 2×SSC 进行漂洗 5 分钟并且用 10mL2×SSC 漂洗 5 分钟, 在 50℃用 5mL 50%甲酰胺 /2×SSC 漂洗 14 分钟并且用 5mL 0.1% SDS/2×SSC 漂洗 30 分钟, 并且在 25℃用 2×SSC 漂洗 5 分 钟。
     5. 荧光图像的加载和数据处理
     使用 genepix 4000B( 由 axon Inc. 生产 ) 加载荧光图像。基于其中图像被数字 化的 gpr 文件进行计算。关于计算方法, 使用 cy5 即 Cot-1DNA 的荧光值作为校正的指标, 对用 cy3 标记的标记的基因组的荧光强度进行校正, 然后完成比较。使用减去背景荧光值 后的值作为荧光值。
     计算方法 : log2( 基因组分析物核酸的荧光强度 / 标记的 cot-1( 分析物 )/ 基因 组标准核酸的荧光强度 × 标记的 cot-1( 标准 ))对由此与分析物核酸 No.1 杂交的所有成对的所有样点以及与标准人男性基因组 DNA 杂交的所有样点中相同类型的样点进行此计算。
     对于通过以上计算获得的所有样品对的值, 通过除以所有样点对的中央值进行整 体归一化。
     因此, 进行分析物核酸 No.1 与标准人男性基因组 DNA 的比较。然而, 因为标准核 酸的 CNV 是未知的, 有可能比较结果可以包含假阳性和假阴性。
     因此, 分别使用分析物核酸 No.2、 No.3 和 No.4 代替标准人男性基因组 DNA 进行与 分析物核酸 No.1 的比较。
     6. 结果
     图 3 至图 6 显示以上计算的结果。纵坐标轴表示荧光强度比而横坐标轴表示样点 编号 ( 探针核酸编号 )。在图 3 至图 6 中, ◆表示落入阈值内的数据, □表示落在阈值外的 数据 ( 在正向上偏离的数据 ), 而△表示落在阈值外的数据 ( 在负向上偏离的数据 )。阈值 设为 0.8 和 1.2。
     图 3 是这样的图, 其显示分析物 DNANo.1 与作为标准核酸的男性基因组 DNA 的荧 光强度比的对数坐标图的结果。
     图 4 是这样的图, 其显示分析物 DNANo.1 与分析物 DNANo.2 的荧光强度比的对数 坐标图的结果。
     图 5 是这样的图, 其显示分析物 DNANo.1 与分析物 DNANo.3 的荧光强度比的对数 坐标图的结果。
     图 6 是这样的图, 其显示分析物 DNANo.1 与分析物 DNANo.4 的荧光强度比的对数 坐标图的结果。
     在各个图中, 对应于常染色体并且落在阈值外的样点是以下样点。
     图 3: 4、 17、 81、 111、 127、 135、 145、 146、 147、 163、 197、 202、 221、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 244、 245、 264、 310、 328
     图 4: 31、 181、 197、 219、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 281、 291、 314、 318、 319、 320、 321、 322
     图 5: 1、 6、 10、 13、 15、 19、 20、 21、 27、 29、 30、 35、 36、 44、 47、 51、 52、 55、 57、 59、 64、 66、 72、 80、 86、 94、 96、 113、 137、 141、 157、 167、 174、 178、 181、 185、 204、 215、 216、 217、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 236、 256、 267、 269、 278、 279、 287、 290、 291、 299、 305、 307、 334
     图 6: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 10、 17、 29、 31、 52、 86、 111、 113、 163、 174、 197、 216、 217、 226、 227、 228、 230、 231、 232、 236、 245、 273、 287、 290、 306、 342
     结果, 在 197 以及 225 至 232 的每个样点中, 所述比率超出了图 3 至图 6 中的多数 结果中的阈值, 所以所述样点可以判断为是阳性。超过以上阈值的其他样点可以被判断为 是假阳性或假阴性。
     以上可见, 发现 No.1 样品具有异常 : 拷贝数在对应于固定在样点 197 以及 225 至 232 中的核酸的基因中增加。
     此外, 对于 No.2 至 No.4 样品以及作为标准的男性, 通过用其代替以上的 No.1 样 品进行类似测量, 可以测量它们的拷贝数变异。
     顺便提及, 尽管在本实施例中没有相关的实例, 但是在阵列之间的某个样点的比较结果中出现值在正向上落在阈值外和值在负向上落在阈值外的两种结果的情况 ( 例如, No.n 样点在图 3 和图 4 中是□并且 No.n 样点在图 5 和图 6 中是△的情况 ) 中, 优选不判断 所述样点为阳性。
     从以上结果可见, 应当理解可以通过本发明的方法确定阳性或阴性而不受假阳性 等的影响。
     工业实用性
     根据本发明的分析核酸突变的方法、 程序以及诊断方法可以降低分析结果中假阳 性和假阴性的影响, 尤其是, 降低由于标准核酸的 CNV 所导致的影响 ( 其为常规阵列比较基 因组杂交技术中的问题 ), 并且能够改善分析结果的可靠性。
     虽然已经详细地并且根据其具体实施方案描述了本发明, 但是对于本领域技术人 员明显的是可以在其中进行各种改变和改良而不背离它的精神和范围。
     背景技术 阵列比较基因组杂交 (CGH) 技术已知为这样的方法, 其用于在短时间内检测发生 在数 10kb 至数 Mb 水平上的基因组结构异常, 诸如基因组拷贝数异常 ( 见, 例如, 非专利文 件 1 和 2)。
     在使用阵列 CGH 的用于遗传性疾病等的诊断阵列的情况中, 变得必要的是精确地 诊断与病理状况直接相关的拷贝数异常。因此, 作为标准的核酸必定不具有拷贝数变异 (CNV) 并且因此应当进行小心的选择和确认包括稀有 CNV 的情况, 以致总是存在麻烦的并 且需要复查的情况。
     此外, 在包括用于全基因组分析的阵列、 检查出拷贝数异常的情况中, 因为难以获 得已被证明为对于目标基因组是正常的标准核酸, 所以必需对双亲和同胞进行连续检查并 且进行重复地复查以确认所述情况是否是假阳性或假阴性或新发生 (de novo) 拷贝数异 常, 并且用正常分析物的分析实例和公用数据库验证 ( 见, 例如, 非专利文件 1)。在判断出 是假阳性或假阴性的情况中, 复查变得必要并且产生这样的问题, 即利用一次检查不能做 出诊断。
     背景技术文件
     非专利文件
     非 专 利 文 件 1: “Arei CGH Shindan Katsuyo Gaido Bukku Shitte Okitai Senshokutai Bisaikozo Ijosho(Arrey CGH Diagnosis Utilization Guidebook , Chromosome Fine Structure Disorder Which Is Need To Know)( 阵列 CGH 诊断使用指南, 需要了解的染色体精细结构异常 )” 由 Joji Inazawa 等编辑, Iyaku(Medicine and Drug( 医 学和药物 ))Journal Co., Ltd.
     非专利文件 2 : Issei Imoto, Joji Inazawa“Maikuro Arei Gijusu wo Mochiita CGH Kaiseki : CGH Arei Hou(CGH Analysis Using Microarray Technology : CGH Array Method( 使用微阵列技术的 CGH 分析 : CGH 阵列方法 ))” , Saibo Kogaku( 细胞技术 ), 卷 23, No.03, 355-361(2004)。
     发明概述
     本发明要解决的问题
     鉴于背景技术的以上问题, 本发明的一个目的是提供分析核酸突变的方法以及用 于执行数据处理的程序, 所述方法减小分析结果中假阳性和假阴性的影响, 尤其是, 减小由 于标准核酸的 CNV 所导致的影响 ( 其为常规阵列比较基因组杂交技术中的问题 ), 并且改善 分析结果的可靠性而不需要复查。
     此外, 本发明的另一个目的是提供使用分析核酸突变的方法来诊断源于基因突变
     的疾病的方法。
     解决所述问题的方式
     以上问题已经由以下方法解决。
     1. 一种使用阵列比较基因组杂交技术来分析核酸突变的方法, 其包括 :
     步骤 (a) : 使用 n 组相同的探针核酸组, 其中多个样点存在于一个核酸微阵列上并 且彼此不同的探针核酸已经被固定在多个所述样点上, 使 n 种标记的样品核酸 S1 至 Sn 逐 个地与 n 组所述探针核酸组接触以实现杂交,
     步骤 (b) : 选择已经固定有相同探针核酸的 n 个样点 X1 至 Xn, 所述样点 X1 至 Xn 选自 n 组所述探针核酸组, 并且获得已经被杂交到 n 个相应的样点 X1 至 Xn 中的样品核酸 的标记强度 F1 至 Fn,
     步骤 (c) : 将所述样点 X1 的标记值 F1 与所述标记值 F2 至 Fn 中的每个比较, 由此 获得 n-1 个比较值 C2 至 Cn, 并且确定所述比较值中的每个是否落入指定的数值范围内, 以 及
     步骤 (d) : 确定在 n-1 个所述比较值中在所述步骤 (c) 中已经确定为未落入所述 指定的数值范围内的比较值的数目是否超过指定数目, 并且在超过所述指定数目的情况 下, 判断所述样点 X1 为阳性, n 是 3 以上的整数, 所述样品核酸是分析物核酸或标准核酸, 至少 S1 是分析物核 酸, 而 X1 是已经与 S1 接触的样点。
     2. 根据以上 1 的分析核酸突变的方法, 其中在 n 种所述样品核酸中至少两种是分 析物核酸。
     3. 根据以上 1 或 2 的分析核酸突变的方法, 所述方法进一步包括 :
     步骤 (c′ ) : 确定从 F2 与 F1 的比较值至 F2 与 Fn 的比较值的 n-1 个比较值中的 每个是否落入指定的数值范围, 以及
     步骤 (d′ ) : 确定 n-1 个比较值中在所述步骤 (c′ ) 中已经确定为未落入所述指 定的数值范围内的比较值的数目是否超过所述指定数目, 并且在超过所述指定数目的情况 下, 判断样点 X2 为阳性, 样点 X2 是已经与不同于以上 S1 的样品核酸 S2 接触的样点。
     4. 根据以上 1 至 3 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中在 n 种所述样品核酸中 至少一种是标准核酸。
     5. 根据以上 1 至 3 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 n 种所述样品核酸都是 分析物核酸。
     6. 根据以上 1 至 5 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 n 种所述样品核酸是来 源于属于分类学上相同物种的不同个体的核酸。
     7. 根据以上 1 至 6 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中
     提供 n 个相同的探针核酸组 NS1 至 NSn,
     各探针核酸组 NSi 被提供在具有 p 个样点 ti1 至 tip 的核酸微阵列上, i 是整数并 且满足 1 ≤ i ≤ n 而 p 是整数并且满足 2 ≤ p,
     将彼此不同的探针核酸固定在各探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点 ti1 至 tip 上,
     各探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点中的一个是样点 Xi,
     将相同的探针核酸固定到样点 tij 至 tnj 上, j 是整数并且满足 1 ≤ j ≤ p,
     步骤 (a) 包括使所述标记的样品核酸 Si 与所述探针核酸组 NSi 接触, 从而将所述 样品核酸 Si 杂交到已经固定在所述探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点上的核酸上,
     步骤 (b) 包括获得已经杂交到各探针核酸组 NSi 的所述样点 ti1 至 tip 中的样品核 酸的标记值 Fi1 至 Fip,
     NS1 和 NSm 选自所述探针核酸组 NS1 至 NSn 并且 m 是整数并且满足 2 ≤ m ≤ n,
     所述步骤 (c) 包括以下步骤 :
     (c1) 比较所述标记值 F1j 和 Fmj 以确定 p 个比较值 C1″至 Cp″,
     (c2) 计算所述比较值 C1″至 Cp″的平均值或中央值, 以及
     (c3) 基于在所述步骤 (c2) 中获得的平均值或中央值, 设定指定的数值范围, 并且 判断所述比较值 C1″至 Cp″是否落入所述指定的数值范围内。
     8. 根据以上 1 至 7 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中所述样品核酸都用相同 的标记物标记。
     9. 根据以上 1 至 8 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中步骤 (b) 中的所述标记 强度 F1 至 Fn 是校正值。
     10. 用于在根据以上 1 至 9 中任一项的分析核酸突变的方法中执行数据处理的程 序, 所述程序执行以下进程 (I) 和 (II) :
     [ 进程 (I) : 比较从 F1 与 F2 的比较值至 F1 与 Fn 的比较值的 n-1 个比较值是否落 入指定的数值范围 ]
     [ 进程 (II) : 在以下情况下判断样点 X1 为阳性 : 在以上 (I) 中临时确定的所有 n-1 个比较值中, 存在的已经通过进程 (I) 确定为未落入所述指定的数值范围内的比较值的数 目超过指定数目 ]。
     11. 根据以上 10 的程序, 其中所述进程 (i) 包括以下进程 (i) 至 (v) :
     [ 进程 (i) : 在存在于 n 组所述探针核酸组的每个中的 p 个样点中,
     从 n 组所述探针核酸组中选择一对两个探针核酸组, 所述一对两个探针核酸组被 这样选择以致包含样点 X1, 以及
     在所述两个探针核酸组之间, 计算已经固定有所述相同的探针核酸的成对的样点 的标记强度的比较值 ]
     [ 进程 (ii) : 对所述探针核酸组中的 p 个成对的样点中的每个进行在进程 (i) 中 的比较值的计算 ],
     [ 进程 (iii) : 计算在进程 (ii) 中获得的 p 个比较值的平均值或中央值 ], 以及
     [ 进程 (iv) : 从在进程 (iii) 中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围, 并且 比较 p 个比较值中的每个是否超过所述指定的数值 ]。
     12. 一种诊断源于基因突变的疾病的方法, 所述方法使用根据以上 1 至 9 中任一项 的分析核酸突变的方法。
     本发明的优势
     根据本发明的分析核酸突变的方法可以降低假阳性和假阴性在分析结果中的影 响, 尤其是, 降低由于标准核酸的 CNV 所导致的影响 ( 其为常规阵列比较基因组杂交技术中 的问题 ), 并且可以改善分析结果的可靠性。更具体地, 即使对于在常规阵列比较基因组杂 交技术中由于假阳性和假阴性的影响而需要复查的分析物, 根据本发明的分析核酸突变的方法不需要复查。
     因为本发明的程序在以上分析核酸突变的方法中执行数据处理, 所以可以降低在 分析结果中假阳性和假阴性的影响, 尤其是由于 CNV 所导致的影响, 并且可以改善分析结 果的可靠性。
     因为根据本发明的用于诊断来源于基团突变的疾病的方法包括使用以上分析核 酸突变的方法, 所以可以在降低假阳性和假阴性影响的情况下做出诊断。
     附图简述
     图 1 是流程图, 其显示作为本发明的一个实施方案的分析核酸突变的方法。
     图 2 是部分示意图, 其显示作为本发明的一个实施方案的分析核酸突变的方法的 一个实施方案的部分。
     图 3 是这样的图, 其显示分析物 DNA No.1 与作为标准的男性基因组 DNA 的荧光强 度比的对数坐标图的结果。
     图 4 是这样的图, 其显示分析物 DNA No.1 与分析物 DNA No.2 的荧光强度比的对 数坐标图的结果。
     图 5 是这样的图, 其显示分析物 DNA No.1 与分析物 DNA No.3 的荧光强度比的对 数坐标图的结果。 图 6 是这样的图, 其显示分析物 DNA No.1 与分析物 DNA No.4 的荧光强度比的对 数坐标图的结果。
     实施本发明的方式
     在本说明书中, 表示范围的 “至” 显示这样的范围, 所述范围包含分别在词的前后 作为最小值和最大值描述的数值。
     根据本实施方案的分析核酸突变的方法是使用阵列比较基因组杂交技术的分析 方法, 所述方法包括以下步骤 (a) 至 (d)。
     图 1 和图 2 是示意图, 其显示根据本发明的分析核酸突变的方法的一个优选实施 方案。在这样点上, 在图 1 中作为步骤 (d) 中判断标准的样点的数目是一半而在图 2 中例 举了 n 是 4 的情况, 但是本实施方案不限于此。
     首先, 在步骤 (a) 中, 使用 n 组相同的探针核酸组, 其中彼此不同的探针核酸已经 被固定到核酸微阵列上的 p 个以上的样点, 使 S1 至 Sn 的 n 种样品核酸逐个与所述探针核 酸组接触从而实现杂交。下文中, p 是 2 以上的整数而 n 是 3 以上的整数。
     然后, 选择已经固定有所述相同的探针核酸的 n 个样点 X1 至 Xn, 所述样点 X1 至 Xn 选自 n 组探针核酸组中的每个, 并且获得已经杂交到相应的样点中的样品核酸的标记强 度 F1 至 Fn( 样点 X1 : F1 的标记强度, 样点 X2 : F2 的标记强度 ... 样点 Xn : Fn 的标记强度 ) ( 步骤 (b))。
     接下来, 确定从 F2 与 F1 的比较值至 F1 与 Fn 的比较值的 n-1 个比较值中的每个 是否落入指定的数值范围 ( 步骤 (c))。在图 2 中, 在步骤 3 中 F1 与 F2 的比较值 C2 显示为 F1/F2 而 F1 与 F3 的比较值 C3 显示为 F1/F3, 但是如以下所述比较值的计算方法不限于此。
     然后, 在 n-1 个比较值中, 当在步骤 (c) 中已经确定为未落入指定的数值范围内的 比较值的数目超过指定数目时, 样点 X1 被确定为阳性 ( 步骤 (d))。
     顺便提及, 此处集中于任意的样点 X1 以进行说明, 但是也可以用其他样点代替所
     述样点来进行说明。优选的是用阵列中已经杂交有样品核酸 S1 的所有样点代替以上 X1 来 进行分析。
     此处, 阵列比较基因组杂交技术 ( 下文中有时也称为阵列 CGH 技术 ) 是指其中比 较基因组杂交技术在核酸微阵列上进行的技术。例如, 该技术已经准确地描述于由 Joji Inazawa 等编辑的 “Arei CGH Shindan Katsuyo Gaido Bukku Shitte Okitai Senshokutai Bisaikozo Ijosho” (Iyaku(Medicine and Drug( 医学和药物 ))Journal Co., Ltd) 等中。
     在常规阵列 CGH 技术中, 已知有使用两色法的技术, 其中不同种类的标记化合物 被用于标准核酸和分析物并且同时杂交到相同的样点中。
     在两色法中, 在相同的阵列中同时评价标准物和分析物, 但是, 在标准核酸的 CNV 未知的情况中, 难以确定作为测量结果出现的增加或减小是否是标准物的增加或减小或分 析物影响下的增大或减小 ( 所谓假阳性 / 假阴性 )。为避免这种问题, 在两色法中, 事先对 标准物的 CNV 进行确认。然而, 在标准物的 CNV 未知的情况中, 需要很多样品和实验以评价 标准物的 CNV。
     另一方面, 在本实施方案的方法中, 作为分析物的核酸和作为对照的一个核酸各 自杂交到已经固定有相同种类的核酸的不同的样点并且将测量值彼此比较。然而, 甚至在 此方法中, 当分析物核酸添加到阵列 1, 作为对照的分析物核酸添加到阵列 2, 各自杂交时, 比较样点 X1 和样点 X2( 它们是已经固定有相同的探针核酸的样点 ) 的标记强度由此获得 一个比较值, 并且基于它判断阳性或阴性, 尤其在对照包含 CNV( 拷贝数变异 ) 的情况中, 产 生由于对照的影响所导致的增加或减小 ( 所谓假阳性 / 假阴性 ) 并且因此存在需要复查的 情况或发生判断错误的情况。 因此, 在本实施方案中, 使用 n 种标记的样品核酸。n 是 3 以上的整数。具体地, 在 n 种样品核酸中集中于一种作为判断目标, 使用剩下的 n-1 种作为对照获得关于该判断 目标的 n-1 个比较值, 并且进行对比较值阳性或阴性的临时判断。然后, 在 n-1 个临时判断 的结果中, 指定数目以上的结果是临时阳性的情况被判断为真阳性, 而判断为临时阳性的 结果的数目小于指定数目的情况被判断为真阴性。
     至于指定数目, 优选使用临时判断结果总数目的 30 %至 70 %范围内的数目, 而 40%至 60%的数目是更优选使用的。
     此处, 阳性 / 阴性与在常规阵列 CGH 技术中是相同的, 并且以下情况被称为阳性 : 与标准核酸相比在鉴定核酸中已经被固定到目标样点的核酸序列以更大的量存在, 或者以 更小的量存在或者不存在 ; 而量相等的情况被称为阴性。
     通常, 在某个样点中, 在分析物核酸与一种对照核酸的比较中, 产生假阳性和假阴 性 ( 下文中简称为假阳性等 ) 的可能性最多是大约 1/10, 通常是 1/100 以下。因此, 使用 n-1 种对照核酸, 并且在所得的 n-1 个临时判断的结果中, 指定数目以上的结果是临时阳性 的情况被判断为真阳性, 由此很大程度上减小了产生以上假阳性的可能性。
     如上, 通过根据本实施方案的分析核酸突变的方法, 假阳性等可以从测量结果中 减少。
     此外, 因为在本实施方案中以上产生比率变得很低, 所以可能不使用标准核酸。
     用于本实施方案中的样品核酸的种类 n 是 3 以上并且优选地是 4 以上。
     如上所述, 所述效果随 n 增加而变高并且 n 的上限不受限制, 但是, 为快速获得数
     据或从简化计算的观点来看, n 优选 100 以下。最优选地 n 是 4 至 100。
     下文中, 标记的 n 种样品核酸也被显示为样品核酸 S1、 S2、 ...Sn-1, Sn(n 是 3 以 上的整数 )。
     下文中, 当确认样点 (X1) 中的标记是否为阳性时, 即当确认核酸突变 (S1) 在与样 点 (X1) 接触的标记的样品核酸中是否出现时, 集中于样点 (X1) 进行说明, 而样点 (X1) 是 任意的样点。通常, 集中于阵列上的 p 个以上的样点 (p 是 2 以上的整数 ) 中的每个样点以 进行实施方案的方法, 并且优选地, 集中于已经杂交有样品核酸的阵列上的所有样点以进 行确认。
     此外, 在所述样品核酸中, 集中的核酸被用作待判断的核酸而待比较的相对的一 个被用作对照核酸, 但是可以集中于任何样品核酸并且将其用作待判断的核酸。优选的是 至少两种所述样品核酸是分析物核酸。即, 以上核酸如 S1 可以任意选自 n 种所述核酸, 并 且通过施行本实施方案使用顺序地包含在 n 种核酸中的所有分析物核酸如 S1 可以对核酸 突变进行高度可靠的分析。
     通过比较关于样品核酸的对应样点的标记强度, 可以判断多个分析物核酸的真阳 性或阴性。 此外, 对于阵列上的所有样点中的每个, 进行杂交的步骤和获得标记强度的步骤 通常执行一次。
     在这样点上, 也可能的是关于其中之前已经获得了杂交后的标记强度的数据, 通 过所述实施方案的方法进行确认。
     步骤 (a)
     在步骤 (a) 中, 使 S1 至 Sn 的 n 种标记的样品核酸逐个与已经固定有相同的探针 核酸的 n 个样点 X1 至 Xn 接触, 由此将样品核酸杂交到以上被固定的核酸。
     核酸微阵列是指探针核酸高密度地结合到固体基底的阵列。 用于以上固体基底的 固体材料不受特殊限制, 只要它是探针核酸可以结合的材料, 例如, 玻璃材料诸如通常使用 的载玻片以及塑料材料。
     作为用于本实施方案的核酸微阵列, 可以提及 BAC-DNA 阵列、 寡核苷酸微阵列、 c-DNA 微阵列等。
     在根据本实施方案的分析核酸突变的方法中, 可以使用市售的核酸微阵列或者可 以使用通过通常方法制备的核酸微阵列。
     所述样点是指已经大量地高密度地固定有探针核酸的区域并且多个样点存在于 以上的核酸微阵列上。
     以上在核酸微阵列上的样点的数目不受特殊限制, 只要该数目是 p 个以上, 但是 通常, 5 个至 1,000,000 个的数目是优选的而 300 个至 5,000 个的数目是优选的。
     所述样点在以上核酸微阵列上的布置不受特殊的限制, 并且可以提及在多个区域 中具有阵列并且能够在一个基底上测量多个样品核酸的多分析物阵列, 在一个基底上组合 多个阵列并且复制大量样点的带环 (tie ring) 阵列等。
     探针核酸是指这样的核酸, 所述核酸已经固定在核酸微阵列的基底上 ( 优选地以 多个样点的形式 ) 并且优选地是包含已知序列的核酸。
     探针核酸的大小优选地是 10 个碱基 (b) 至 10kb, 更优选 50b 至 5kb, 并且进一步
     优选 100b 至 2kb。
     “相同的探针核酸” 也包括在严格条件下和与以上探针核酸互补的核酸杂交的核 酸。
     在本实施方案中, 分别用在已经固定有相同的探针核酸的 n 个样点中的不同样品 核酸进行杂交。此处, 已经固定有相同的探针核酸的样点被表示为样点 X1、 X2、 ...Xn-1、 Xn(n 是 3 以上的整数 )。
     n 个样点 X1、 X2、 ...Xn-1、 Xn 可以存在于相同的核酸微阵列上但是优选地存在于 n 个不同的核酸微阵列上。 例如, 在 n 个样点分别存在于 n 个相同种类的核酸微阵列上的情 况中, 优选的是使用具有相同区编号 (block number)、 列编号或行编号的样点作为 n 个以 上的样点。
     待固定的探针核酸的量优选为每样点 0.8 至 5μg, 更优选为 1.0 至 2.0μg。
     在步骤 (a) 中, “探针核酸组” 是指一组编码特定转录产物的基因的探针核酸。在 本实施方案中, 探针核酸组的数目通常对应阵列上的样点的数目。
     对于一个探针核酸组, 在每个样点上可以固定一种探针核酸或者可以固定多个探 针核酸, 只要在单独的样点之间固定的探针核酸的种类是不同的。 通常, 一个探针核酸组固 定在一个阵列上。
     在步骤 (a) 中, n 组探针核酸组是指 n 组相同的探针核酸组并且也可以包括在严 格条件下和与特定探针核酸组互补的探针核酸组杂交的探针核酸组。
     以上相同的探针核酸组对应于样品核酸的种类并且是 n 组。
     至于以上的探针核酸, 可以提及化学合成的核酸、 cDNA、 BAC( 细菌人工染色体 )、 YAC( 酵母人工染色体 )、 PAC( 来源于 P1 的人工染色体 )、 通过使用基因工程技术扩增它们 获得的那些。
     此外, 通过化学修饰天然核酸诸如 DNA 和 RNA 获得的核酸可以用作探针核酸。可 以使用例如, PNA( 肽核酸 )、 BNA( 桥接核酸 )、 膦酸甲酯类 DNA、 硫代磷酸酯类 DNA、 氨基磷酸 酯类 DNA、 硼烷磷酸酯 (boranophosphate) 类 DNA 等。此外, 也可以采用嵌合体类核酸。
     至于将探针核酸结合到固体基底上的方法, 可以提及使用已经结合有由基因芯片 (Gene Chip) 代表的发光基团的亚酰胺 (amidite) 单体以及使用掩膜逐个化学合成核苷酸 的方法, 或者通过喷墨方法将亚酰胺单体点样于固体基底上从而化学合成所需的序列的方 法, 通过改变电极上溶液的 pH 并且利用 pH 改变除去保护基团而在基底上合成核酸的方法, 纯化之前化学合成的核酸并将其点样在基底上的方法, 使用点样仪 (spotter) 点样 cDNA 的 方法等。至于点样方法, 可以提及喷墨法、 插针 (pin) 阵列法等。
     样品核酸是指用于根据本实施方案的分析核酸突变的方法的单链或双链核酸并 且可以是 DNA、 RNA 等中的任何一个。
     样品核酸的来源不受特殊限制并且, 例如, 可以提及分析目标诸如包含样品核酸 的细胞, 使用核酸微阵列对其核酸的表达量和现有量、 基因组中的拷贝数等进行测量 ; 或对 其进行评价诸如诊断的细胞, 并且也可以提及组织、 器官、 一个个体等, 并且所述来源不限 于细胞自身。
     尤其地, 样品核酸的来源优选能够从被认为具有特定疾病的人类患者、 动物等获 得的细胞等。 至于疾病, 可以包括所有疾病, 诸如癌症、 遗传疾病和传染性疾病, 核酸可以具有关于所述疾病的某些信息, 并且所述疾病不受特殊的限制。本实施方案的方法适于检查 突变数目相对小的先天遗传疾病。 非入侵性位点诸如粘膜、 毛发和指甲以及体液诸如血液、 淋巴、 骨髓、 精子和羊水优选地用作样品。
     n 种样品核酸优选地是来源于分类上属于相同物种的不同个体的核酸或来源于相 同个体的不同细胞的核酸, 更优选来源于人类不同个体的核酸或来源于相同人类个体的不 同细胞 ( 例如, 正常细胞和癌细胞 ) 的核酸。来源于人类不同个体的核酸是最优选的。
     此外, 本实施方案的方法优选地用于检查这样的个体, 所述个体不是根据患有特 定遗传疾病的可能性等选择的 ( 对新生儿等的全数检查 )。
     在样品核酸的制备 ( 例如, 纯化、 断裂 ) 方面, 优选的是通过纯化处理除去溶于细 胞的物质诸如蛋白质和脂质。 这是因为在用荧光等标记时发生不同副反应并且当不进行纯 化时溶于细胞的物质诸如蛋白质和脂质很大程度上也影响背景噪音, 以致核酸微阵列的性 能显著降低。
     至于用于纯化的方法, 可以提及使用用二氧化硅、 纤维素化合物等的核酸吸附膜 支撑的柱体 (cartridge) 的方法, 用乙醇沉淀或用异丙醇沉淀, 用酚氯仿萃取等。此外, 可 以提及以下方法 : 使用离子交换树脂的固相萃取柱、 色谱等, 与疏水取代基诸如十八烷基键 合的二氧化硅支持物 (support), 具有尺寸排阻作用的树脂。 样品核酸的长度不受特殊限制 并且, 例如, 可以是全基因组, 但是可以在以下的断裂处理后进行以上的纯化处理。 在这样点上, 标记的样品核酸的长度不受特殊限制, 但是通过标记 / 断裂处理, 所 述核酸通常被断裂为 1,000 个碱基 (1kb) 或碱基对 (bp) 至 5,000b 或 bp。
     至于断裂处理, 可以提及酶处理、 超声处理、 机械破碎处理、 化学处理等。 至于用于 酶处理的酶, 优选使用限制酶或核酸酶。至于限制酶的种类, 也可能使用多个酶。
     至于机械破碎处理, 可以提及使用玻璃球、 不锈钢球、 氧化锆球等裂开核酸的方 法。
     以上核酸可以经受扣除法 (subtraction method) 的处理。扣除法是指这样的方 法: 在目标基因的拷贝数或表达存在差异的情况中, 通过以扣除的方式扣除存在于基因中 的差异来有效地分离基因。 可以采用例如, PCR 选择法、 RDA( 代表性差别分析 ) 法、 DsDD( 双 链特异性直接消化 ) 法等。
     尤其, 在本实施方案中, 在使用来源于癌细胞的样品核酸的情况中, 因为大量正常 细胞与癌细胞一起包含在癌组织中, 所以存在这样的情况, 其中核酸微阵列的性能显著下 降, 但是可以通过所述扣除法在一定程度上防止所述性能下降。
     至于 n 种样品核酸, 其优选包括至少多种分析物核酸和至少一种、 优选两种以上 的标准核酸。
     此外, 作为本实施方案的另一个实施方案, 可能不使用样品核酸, 即, 所有的 n 种 样品核酸都可以是分析物核酸。
     分析物核酸是所谓获得自分析物的核酸, 即, 核酸突变未知并且所述核酸突变由 本实施方案分析的目标核酸。例如, 提取自正常细胞 ( 非癌化细胞 ) 的核酸或提取自异常 细胞 ( 例如, 癌细胞 ) 的核酸可以用作分析物核酸。
     标准核酸是在上面用于与分析物核酸比较的核酸, 并且是使用者 ( 分析核酸突变 的方法的实施者 ) 事先在某种程度上掌握其关于突变等的一些信息的核酸。具体地, 关于
     拷贝数变异 (CNV) 等, 优选拷贝数变异的位置和数目已知的核酸并且更优选碱基序列已知 的核酸。
     此外, 例如, 当癌症在具有 CNV 或某些嵌合体的患者体内产生时, 在获得自癌细胞 的核酸和获得自相同患者的不同于所述癌细胞的正常细胞的核酸的情况中, 所述 CNV 或某 些嵌合体被抵消, 以致在获得自正常细胞的核酸作为标准核酸的使用中不出现问题。 因此, 即使当基因组中的拷贝数不同于它在该生物物种中通常存在的量时, 所述核酸可以用作标 准核酸, 只要可以从与分析物核酸的比较中获得信息, 例如, 在相同固体的情况中。
     各以上样品核酸优选地标记以相同的标记。
     标记是指结合到核酸的可检测物质。 所述可检测物质不受特殊限制并且可以提及 荧光物质、 酶、 放射性同位素、 诱发 FRET( 荧光共振能量转移 ) 的化合物等。优选的是具有 荧光物质的荧光标记物。
     所述荧光物质不受特殊限制并且可以使用异硫氰酸荧光素 (FITC)、 Cy 染料、 Alexa、 绿色荧光蛋白 (GFP)、 蓝色荧光蛋白 (BFP)、 黄色荧光蛋白 (YFP)、 红色荧光蛋白 (RFP)、 吖啶、 DAPI、 溴化乙锭、 SYBR 绿、 德克萨斯红、 稀土荧光标记试剂、 TAMRA、 ROX 等。优 选用 Cy 染料诸如 Cy-3 或 Cy-5 进行荧光标记。 此外, 关于标记, 可以使用地高辛 (Digoxigein)(DIG)、 生物素等。 作为使用生物素 的实例, 当抗生物素蛋白与已经结合到探针的生物素结合时, 已经结合有生物素的碱性磷 酸酶结合于其上, 并且添加碱性磷酸酶的底物氮蓝四唑和 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚磷酸酯, 观 察到紫色显色并且因此可以用于检测。
     此外, 可以以非酶的方式进行标记。也可以使用例如, ULS 阵列 CGH 标记试剂盒 ( 由 Kreatech Biotechnology BV 公司生产 ) 等。
     至于用于荧光标记的方法, 可以使用直接标记法和间接标记法中的任一标记方 法。直接标记方法是指这样的方法, 其中将核酸转变为单链核酸, 将短链核酸杂交于其上, 并且将已经结合有荧光物质 ( 例如, Cy 染料 ) 的核苷酸化合物与核苷酸混合, 由此在一步 中标记核酸。 间接标记法是指这样的方法, 其中将核酸转变为单链核酸, 将短链核酸杂交于 其上, 将具有能够结合荧光物质 ( 例如, Cy 染料 ) 的取代基的核苷酸化合物 ( 例如, 具有氨 基烯丙基的核苷酸化合物 ) 与天然核苷酸混合在一起, 首先合成具有取代基的核酸, 然后 经由氨基烯丙基结合荧光物质 ( 例如, Cy 染料 ), 由此核酸得到标记。
     至于用于将标记化合物诸如荧光物质引入到核酸中的方法, 可以使用随机引物法 ( 引物延伸法 )、 切口平移法、 PCR( 聚合酶链反应 ) 法、 末端标记法等。尤其, 在本实施方案 中, 可以合适地使用随机引物法。
     随机引物法是这样的方法, 其中杂交几 bp( 碱基对 ) 至超过 10bp 的随机引物核酸 并且使用聚合酶同时进行扩增和标记, 由此合成标记的核酸。 切口平移法是这样的方法, 其 中, 例如, 使已经用 DnaseI 引入切口的双链核酸经受 DNA 聚合酶的作用以分解 DNA 并且通 过聚合酶的活性同时合成标记的核酸。 PCR 法是这样的方法, 其中制备两种引物并且使用所 述引物进行 PCR 反应, 由此同时进行扩增和标记从而获得标记的核酸。末端标记法是这样 的方法, 其中, 在标记 5′端的方法中, 通过与 T4 多核苷酸激酶的磷酸化反应将标记化合物 诸如荧光物质结合到用碱性磷酸酶去磷酸化的核酸的 5′端。标记 3′端的方法是这样的 方法, 其中用末端转移酶将标记化合物诸如荧光物质加到核酸的 3′端。
     至于标记的样品核酸等, 也可能使用含有标记的样品核酸等的未纯化溶液。在使 用这种未纯化溶液的情况中, 酶等仍然保留在所述溶液中并且因此, 在制备后, 优选使留在 所述溶液中的酶活性失活。这是基于避免影响数据再现性的观点。
     至于使酶失活的方法, 任何方法都是可能的, 只要它们能够使酶失活, 但是优选进 行添加螯合剂或 60℃以上热处理的方法中的任一种或两种。加热温度优选 60℃以上, 更优 选 63℃以上。充分的加热时间是 1 分钟以上并且更优选地, 优选在 65℃以上进行 5 分钟以 上的热处理。
     此外, 在使用克列诺片段 (klenow fragment) 的标记方法的情况中, 也可能使用涡 旋混合器等使酶的活性丧失。
     杂交
     在步骤 (a) 中, 为了将 n 种标记的样品核酸 S1 至 Sn 逐个地提供给以上 n 组探针 核酸组中的每个, 作为用于使样品核酸逐个结合到以上各样点中的方法, 可以使用任何方 法诸如吸管吸移。
     在步骤 (a) 中, 探针核酸和样品核酸可以通过将它们在杂交溶液中孵育来杂交。
     孵育条件不受特殊限制但是孵育优选在 25 至 50℃进行, 更优选在 30 至 45℃进 行, 并且进一步优选在 37 至 42℃进行。此外, 用于杂交的时间优选 8 至 96 小时, 更优选 12 至 72 小时, 并且进一步优选 16 至 48 小时。 对于用于步骤 (a) 中的杂交的杂交溶液, 没有特殊的限制, 只要探针核酸和样品 核酸在所述溶液中杂交。 优选具有这样性质的溶液 : 探针核酸和样品核酸合适地杂交, 并且 更优选具有这样作用的溶液 : 加速探针核酸和样品核酸的序列之间高符合度的杂交, 并且 另一方面抑制所述序列之间低符合度的杂交。
     杂交溶液优选包含具有排除体积效应 (extruded volume effect) 的物质, 用于降 低样品核酸熔点的物质和用于调节离子强度的溶液。
     作 为 具 有 排 除 体 积 效 应 的 物 质, 可 以 提 及 聚 乙 二 醇 (PEG, 见, 例 如, JP-A-2000-325099)、 葡聚糖硫酸酯等。
     作为用于降低样品核酸熔点的物质, 可以提及甲酰胺、 甘油、 甲醛、 二甲亚砜 (DMSO)、 N, N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、 硫氰酸胍 (GuSCN)、 碘等。
     作为用于调节离子强度的溶液, 可以提及 SSC(150mM NaCl、 15mM 柠檬酸钠 )、 SSPE(150mM NaCl、 10mM NaH2PO4.H2O、 1mM EDTA pH7.4)、 MES 杂交缓冲液等。
     在所述杂交溶液中, 可以加入封闭剂 (blocking agent)、 表面活性剂等。
     作为表面活性剂, 可以提及阳离子表面活性剂、 阴离子表面活性剂、 非离子表面活 性剂等。作为阴离子表面活性剂, 可以提及十二烷基硫酸钠 (SDS) 等。作为非离子表面活 性剂, 可以提及 Tween( 注册商标 )、 Triton X( 注册商标 ) 等。
     以上封闭剂用于在杂交时减少对非特异性杂交的检测。例如, 可以提及 tRNA( 转 移 RNA)、 经修饰的鲑鱼精子 DNA、 聚 A( 聚腺苷酸 )、 聚 dA( 聚脱氧腺苷酸 )、 脱脂乳等, 其主 要具有减少核酸微阵列的背景噪音的作用。同样, 可以使用通常市售的封闭剂。
     此外, 在本实施方案中, 如在 JP-A-2005-087109 中描述的, 作为杂交溶液的一种组 成, 也可以使用磷脂、 Denhardt 溶液 ( 包含聚蔗糖 (ficoll)、 聚乙烯吡咯烷酮和牛血清清蛋 白作为主要组分的溶液 )、 季铵盐甜菜碱 (Biochemistry( 生物化学 )32, 137-144(1993))、
     TMAC( 氯化四甲铵 )(Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美国科学院院刊 ), 82, 1585-1588(1985))、 市售杂交溶液, 例如 ExpressHyb( 由 Clontech 公司制造 )、 PerfectHyb( 由 TOYOBO Co., Ltd. 制造 )、 ULTRAhyb( 由 Ambion 公司制造 ) 等。
     对于杂交, 优选在严格条件下使得目标核酸和探针核酸杂交。作为具体的杂交条 件, 例如, 在 37℃进行 16 小时的杂交反应后, 作为洗涤条件, 可以提及 (1) 用 5mL 2×SSC 溶 液在室温洗涤 30 秒, (2) 用 5mL 50%甲醛 /2×SSC(pH7.0) 溶液在 50℃洗涤 15 分钟, (3) 用 5mL 2×SSC/0.1% SDS(pH7.0) 溶液在 50℃洗涤 30 分钟, (4) 用 5mL 2×SSC 溶液在室 温洗涤 5 分钟。
     步骤 (b)
     在步骤 (b) 中, 获得在 n 个样点 X1 至 Xn 中杂交的样品核酸的标记值 F1 至 Fn。
     在步骤 (b) 中, 用于在杂交后在核酸微阵列上获得标记强度的方法不受特殊限 制, 只要标记强度可以得到测量。
     在步骤 (b) 中, 样点 X1 的标记强度显示为 F1, 样点 X2 的标记强度显示为 F2, ... 样 点 Xn-1 的标记强度显示为 Fn-1, 而样点 Xn 的标记强度显示为 Fn。n 是 3 以上的整数。
     例如, 在放射性同位素的情况中, 可以使用 X 射线胶片、 BASS( 由 FUJIFILM 公司生 产 ) 等。
     在荧光物质用作标记物质的情况中, 优选使用荧光扫描仪。作为荧光扫描仪, 例 如, 可以提及 FLA 系列 ( 由 FUJIFILM 公司生产 )、 GenePix 系列 ( 由 Axon Instruments Inc. 生产 )、 LS Reloaded( 由 TECAN 公司生产 ) 等。步骤 (c)
     在步骤 (c) 中, 将样点 X1 的标记值 F1 与标记值 F2 至 Fn 中的每个相比, 由此获得 n-1 个比较值 C2 至 Cn, 并且进行确定各比较值是否落入指定的数值范围。 换言之, 进行临时 确定各比较值的大小是否对应阳性。不包括步骤 (d) 的常规方法中的阳性 / 阴性 ( 尤其是 与 S2 至 Sn 中的标准核酸的比较值的确定结果 ) 对应于本文中的临时确定的阳性 / 阴性。
     比较值是通过彼此比较相同种类的两个样点的标记强度获得的数值, 并且可以提 及标记强度比、 标记强度之间的差等。 比较值优选标记强度比, 更优选标记强度比的对数值 (Log 值 ), 并且进一步优选以 2 为底的标记强度比的对数值 (Log2 值 )。
     用于临时判断各比较值阳性或阴性的标准, 即, 指定的数值范围可以与常规阵列 比较基因组杂交技术的标准相等并且, 例如, 准备已知为阳性的样品核酸 ( 阳性对照 ) 和已 知为阴性的样品核酸 ( 阴性对照 ) 并且可以使用它们的中间值作为阈值进行判断。
     此外, 因为可能用于杂交的 n 种样品核酸的量彼此不同, 所以优选包括用于校正 样品核酸的量的步骤。这种步骤不受特殊限制, 并且可以应用在比较不同探针核酸组中获 得的标记强度的单色法杂交中通常使用的归一化。例如, 可以使用整体归一化等。
     例如, 可以提及这样的方法 : 使每个阵列中的 p 个样点的标记强度的平均值, 或如 之后在步骤 (c2) 中描述的, 中央值在待比较的阵列中相等, 以及这样的方法 : 在获得一对 阵列间的每个样点的每个比较值后, 使所述一对阵列间的 p 个比较值的平均值或中央值等 于另一对阵列间的 p 个比较值的平均值或中央值。 具体地, 可以提及这样的方法 : 用通过用 单个标记强度或比较值除以各阵列内的 p 个样点的标记强度的平均值或中央值获得的比 率, 通过减去标记强度的平均值或中央值获得的值, 或偏差值表示。
     通过包括这种步骤, 可以校正如上所述的由样品核酸的量引起的差异。 此处, 用于校正的方法不受特殊限制并且, 例如, 可以提及这样的方法 : 使标记强度乘以和除以平均值 或中央值, 排除与平均值或中央值偏离一定值以上的值。
     此外, 在以上的校正步骤中, 在通过除以平均值或中央值获得的比率的情况中, 所 得的值是对应于拷贝数的值。至于前述步骤 (c) 中的指定的数值范围, 可以根据各测量值 ( 尤其是获得自对已知突变测量的值 ) 设定这样的值, 所述值能够排除突变明显发生的区 域, 或者可能基于可能作为理论拷贝数的数值设定值。对于后者, 具体地, 在存在于不含异 常的常染色体上的特定核酸区域的数目是 1 个拷贝而一对的以上染色体对的拷贝数是 1 的 情况中, 理论上可能的拷贝数是间隔 0.5 的值, 诸如 0、 0.5、 1、 1.5、 2..。 因此, 对于用于在以 上步骤 (c) 中进行确定的标准, 可能使用以上间隔的一半 ( 即 0.25) 作为阈值来判断临时 阳性或阴性, 或者排除中间值 ( 例如, 0.2 至 0.3) 而不像以前那样作为假阳性进行判断。
     可以与在常规阵列比较基因组杂交中阳性判断标准相似地设定比较值的指定的 数值范围。例如, 在使用荧光强度比的情况中, 理论上, 可以提及诸如 0.8 至 1.2 的值, 但是 考虑到序列的鉴定等, 所述值可以任意设定。例如, 在进行之后要提及的修正的情况中, 可 以在这种程度上进行乘或除。
     即, 在本实施方案中, 以上步骤 (c) 优选对存在于 n 组探针核酸组中的每个中的 p 个样点进行以下步骤 (c1) 至 (c3) 的步骤。即, 总共计算 (n-1)×p 个比较值。
     [ 步骤 (c1) : 从以上 n 组探针核酸组中选择一对两个探针核酸组, 这样选择以致其 包括样点 X1, 以及
     在所述两个探针核酸组之间比较 p 对固定有相同的探针核酸的样点的每对的标 记强度, 以计算 p 个比较值 ]
     [ 步骤 (c2) : 计算步骤 (c1) 中获得的 p 个比较值的平均值或中央值 ]
     [ 步骤 (c3) : 基于步骤 (c2) 中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围并且确 定 p 个比较值中的每个是否超过指定的数值范围 ]
     更具体地, 本实施方案包括以下步骤 :
     提供 n 个相同的探针核酸组 NS1 至 NSn,
     各探针核酸组 NSi 提供具有 p 个样点 ti1 至 tip 的核酸微阵列, i 是整数并且满足 1 ≤ i ≤ n 而 p 是整数并且满足 2 ≤ p,
     将彼此不同的探针核酸固定在各探针核酸组 NSi 的 p 个样点 ti1 至 tip 上。
     各探针核酸组 NSi 的 p 个样点中的一个是样点 Xi,
     将相同的探针核酸固定到所述样点 tij 至 tnj 上, j 是整数并且满足 1 ≤ j ≤ p,
     步骤 (a) 包括使标记的样品核酸 Si 与探针核酸组 NSi 接触从而将样品核酸 Si 杂 交到已经固定在探针核酸组 NSi 的 p 个样点上的核酸,
     步骤 (b) 包括获得已经杂交到各探针核酸组 NSi 的样点 ti1 至 tip 中的样品核酸的 标记值 Fi1 至 Fip,
     NS1 和 NSm 选自探针核酸组 NS1 至 NSn 并且 m 是整数并且满足 2 ≤ m ≤ n,
     步骤 (c) 包括以下步骤 :
     (c1) 比较标记值 F1j 与 Fmj 以确定 p 个比较值 C1″至 Cp″,
     (c2) 计算比较值 C1″至 Cp″的平均值或中央值, 以及
     (c3) 基于在步骤 (c2) 中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围并且判断比较值 C1″至 Cp″是否落入指定的数值范围。
     在步骤 (c3) 中, 优选的是比较值是标记强度比并且根据标记强度比的平均值或 中央值的偏差进行对阳性或阴性的临时判断。例如, 基于平均值或中央值的偏差设定阈值 ( 指定的数值范围 ), 并且与平均值或中央值的偏差超过以上阈值的情况可以临时地被判 断为阳性 ( 或阴性 )。
     在获得如上所述的比较值前, 也可以通过计算各探针核酸组中的 p 个样点的单个 标记强度的平均值或中央值并且将它与单个的标记强度相比来实施计算比较值的平均值 或中央值的步骤以及将它与步骤 (c2) 和 (c3) 中的单个的比较值比较的步骤。即, 在本实 施方案中, 以上步骤 (c) 可以是以下步骤 :
     [ 步骤 (cc) : 计算 n 组探针核酸组中的单个样点的标记强度的平均值或中央值,
     在 n 组探针核酸组的每个中, 基于所述平均值或中央值计算单个样点的偏差值 (F′ 1、 F′ 2...F′ n),
     计算在 n 组探针核酸组中的一对两个组之间相同种类的成对的样点的标记强度 的比较值, 并且根据 n 组的平均值或中央值, 确定从成对的 F′ 1 和 F′ 2 的比较值至成对 的 F′ 1 和 F′ n 的比较值的 n-1 个比较值中的每个是否落入指定的数值范围 ]。 顺便提及, 在本实施方案中, 为了说明的缘故, 将单个的步骤编号成不同的数以进 行说明, 但是所述编号不限制其次序并且也不排除同时处理。
     步骤 (d)
     在步骤 (d) 中, 在已经确定为未落在指定的数值范围的数目超过 n-1 中的指定数 目的情况中, 样点 X1 被确定成阳性。指定数目优选地是 n-1 的一半并且 n 是 4 以上和指定 数目是 n-1 的 70%的情况是更优选的。此外, 确定的数目是某个数目以下的情况优选地被 确定为阴性, 但是同样优选的是限定特定的范围而落入限定范围内的情况被判断为假阳性 并且进行复查。 甚至在进行复查的情况中, 与常规方法相比, 预期在很大程度上减小需要复 查的可能性。此外, 在进行复查的情况中, 优选改变比较主体来进行复查。
     在这样点上, 在步骤 (d) 中, 在比较值已经被确定为未落入指定的数值范围的情 况的数目没有超过 n-1 中的指定数目的情况中, 可以判断样点 X1 中的数据缺少可靠性并且 可以进行处理诸如复查。
     此外, 样点 (X1) 是任意样点并且通常, 在包含样点 X1 的相同的阵列中的多个样点 ( 优选地所有样点 ) 中, 在替换以上 (X1) 的情况下进行与本实施方案的步骤 (a) 至 (d) 相 同的步骤或处理 (i) 至 (iii)。
     标记强度校正
     以上在步骤 (b) 中获得的标记强度优选为经校正的值。
     具体地, 在步骤 (b) 中获得的标记强度优选获得自以下步骤的值。
     优选的是包括这样的步骤 : 使标记的样品核酸与某个样点上的固定的探针核酸杂 交,
     加入标记的鉴定核酸并且将加入的核酸杂交到探针核酸的步骤, 所述标记的鉴定 核酸具有可以杂交到以上探针核酸的至少一部分的序列并且标记以不同于标记的样品核 酸的标记物的标记物,
     获得以上样点中杂交的经标记的样品核酸的标记强度的步骤,
     测量所述样点中杂交的经标记的样品核酸的标记强度的步骤, 以及
     基于鉴定核酸的标记强度检测所述样点中固定的探针核酸的量并且通过检测的 量校正样品核酸的标记强度的步骤。
     校正方法可以使用描述于例如 JP-A-2010-004873 中的方法。
     此处, 优选的是使得标记的样品核酸杂交的步骤和使得标记的鉴定核酸 (B) 杂交 的步骤同时进行, 并且
     测量经杂交的标记的样品核酸的量的步骤和测量经杂交的鉴定核酸的量的步骤 同时进行。
     此处, 鉴定核酸是指具有可以杂交到探针核酸的至少一部分的序列的核酸, 并且 可以用于检测由多个样点杂交能力 ( 具体地固定在每个样点的探针核酸的量 ) 的不均导致 的变化, 并且可以进一步用于校正样点之间的探针核酸的量的变化。因此, 充分地, 鉴定核 酸是可以杂交到固定在核酸微阵列上的所有样点中的探针核酸的核酸并且可以具有任何 序列和链长度。此处, 所有的样点表示可能使相同溶液中的分析物或标准物起反应的所有 样点, 并且通常是单一核酸微阵列上的所有样点但是不限于此。
     此外, 鉴定核酸可以是任何核酸, 只要它可杂交并且可以是天然核酸诸如 DNA 和 RNA 以及同样地通过对天然核酸诸如 DNA 和 RNA 进行化学修饰获得的核酸。 例如, 可以使用 PNA、 甲基磷酸酯类 DNA、 硫代磷酸酯类 DNA、 嵌合体类核酸等。
     至于优选作为鉴定核酸的序列, 可以提及重复性序列。重复性序列也被称为重复 序列, 并且是每隔某一数目的碱基就重复出现的序列, 诸如限制酶识别位点。 可以提及其中 短的碱基序列的模式重复多次的序列, 例如, 聚 d(AT) 和聚 d(GC), 以及其中长序列 ( 一个单 元可以达到数千个碱基对 ) 重复多次的序列, 并且已知在高等动物诸如人中这种序列以高 频率出现在基因组中。在本实施方案中, 例如, 可以合适地使用从 Invitrogen 公司商业获 取的 Cot-1DNA。
     已知 Cot-1DNA 是这样的核酸, 其在核酸微阵列测量中用于封闭获得自哺乳动物 的分析物的重复序列。
     通过标记至少一部分的 Cot-1DNA 并且将标记的 Cot-1DNA 与未标记的 Cot-1DNA 一起使用, 也可能加强对特异性杂交的检测灵敏度并且减小样点间的差异。
     作为鉴定核酸, 与分析物核酸不同, 同样优选使用不同于分析物核酸并且具有所 有探针核酸组通常具有的序列的核酸。
     例如, 也可能使用这样的合成寡核苷酸作为鉴定核酸, 所述合成寡核苷酸具有与 通常存在于探针核酸中的核酸序列部分基本互补的核酸序列。
     此外, 也可能使用具有被认为在阵列的制备中存在于所有样点中的序列的核酸作 为鉴定核酸, 诸如在阵列的制备中使用的载体 ( 质粒、 BAC、 YAC、 PAC、 粘粒、 病毒等 ) 的核酸, 大肠杆菌的基因组等。
     在本实施方案中, 优选地以与样品核酸的摩尔比为 1 以上的量使用鉴定核酸。通 过以 1 以上的摩尔比使用它, 核酸微阵列的性能得到改善。
     鉴定核酸的大小优选 20bp 以上, 更优选 20bp 至 1Mbp, 并且进一步优选 100bp 至 500kb。
     使用的鉴定核酸的量与分析物或标准核酸的摩尔比优选地在 0.5 至 2 的范围内。
     自动化
     根据本实施方案的分析核酸突变的方法的所有步骤可以手工进行或者所述步骤 可以借助部分自动的机器进行或者所有步骤可以借助全自动机器进行。
     通过自动化, 工人免于繁重的工作, 人员经费可以得到减小, 由熟练程度的差异导 致的结果的差异可以降低, 并且可以避免人为失误。
     程序
     以下将说明本实施方案的程序。
     实施方案的程序是在以上说明的分析核酸突变的方法中用于执行数据处理的程 序, 其执行以下进程 (I) 和 (II) :
     [ 进程 (I) : 比较从 F1 与 F2 至 F1 与 Fn 的 n-1 个比较值是否落入指定的数值范 围]
     [ 进程 (II) : 在以下情况中判断样点 X1 为阳性 : 在以上 (I) 中临时确定的所有 n-1 个比较值中, 已经由进程 (I) 确定为未落入指定的数值范围内的比较值的数目超过指定数 目 ]。
     进程 (I) 优选地包括以下进程 (i) 至 (v) :
     [ 进程 (i) : 在存在于 n 组探针核酸组的每个中的 p 个样点中,
     从 n 组探针核酸组中选择一对两个探针核酸组, 所述一对两个探针核酸组被这样 选择以致包含样点 X1, 以及
     在所述两个探针核酸组之间, 计算已经固定有相同的探针核酸的成对的样点的标 记强度的比较值 ]
     [ 进程 (ii) : 对探针核酸组中 p 个成对的样点中的每个进行进程 (i) 中的比较值 计算 ],
     [ 进程 (iii) : 计算在进程 (ii) 中获得的 p 个比较值的平均值或中央值 ], 以及
     [ 进程 (iv) : 从在进程 (iii) 中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围并且 比较 p 个比较值中的每个是否超过指定的数值 ]。
     通过使用本实施方案的程序, 在对通过测量上述标记强度获得的数据的处理中可 以有效地进行数据处理。
     所述程序通常以这样的方式提供 : 它被记录在可在计算机上读取的记录介质上。 记录介质不受特殊限制, 只要它在计算机上可读。本实施方案的记录介质包括便携的记录 介质和固定类型的记录介质两者, 并且可以提及高密度磁盘 (CD)、 软盘 (FD)、 硬盘、 半导体 存储器等。
     可以通过将本实施方案的程序记录在以上的记录介质上来传送它, 或者可以以下 述形式传送它 : 它被记录在计算机的存储设备上并且经由网络传递到另一个计算机。
     以下将说明用于根据本实施方案诊断来源于基因突变的疾病的方法。
     用于根据本实施方案诊断来源于基因突变的疾病的方法使用以上说明的分析核 酸突变的方法。 作为以上的诊断目标疾病, 可以包括所有疾病诸如癌症、 遗传疾病和传染性 疾病, 对于所述疾病核酸可以具有某些信息, 并且所述疾病不受特殊的限制。
     在根据实施方案的诊断方法中, 通过将提取自正常细胞 ( 非癌化细胞 ) 的核酸作 为标准核酸而提取自异常细胞 ( 例如来源于癌症患者、 遗传性疾病患者或传染性疾病患者的细胞 ) 的核酸作为分析物核酸应用于以上说明的分析核酸突变的方法, 可以诊断提供分 析物的患者或者被用作分析物的细胞的病变, 而不受由 CNV 等所导致的假阳性和假阴性的 影响。 实施例 以下将根据实施例说明本发明。 显示于以下实施例中的材料、 试剂、 物质的量和比 率、 操作等可以适当地改变, 只要它们不偏离本发明的本质。因此, 本发明的范围不限于以 下具体的实施例。
     在以下实施例中, Cy3 男性表示通过用 Cy3 标记男性 DNA 获得的样品。 相似地, Cy5 男性表示通过用 Cy5 标记男性 DNA 获得的样品。此外, Cy5-Cot-1DNA 等相似地表示标记有 相应标记化合物的核酸。
     [ 实施例 1]
     1. 制备标记的样品核酸
     向微管中放入 3μL(0.75μg)Human Genomic DNA male( 人男性基因组 DNA)( 由 Promega 公司生产, 货号 G152 ; 下文中称为男性基因组 DNA), 8μL 水 ( 不含 DNAse、 Rnase 的 蒸馏水, GIBCO), 20μL 用于阵列 CGH(BioPrime( 注册商标 )Array CGH Genomic Labeling System( 阵列 CGH 基因组标记系统 )(invitrogen)) 的标记系统的 2.5×Random Primers Solution( 随机引物溶液 )(Invitrogen 公司 ), 接着使用块型孵育器 (block incubator) 在 95℃热处理 5 分钟并且在 37℃静置 15 分钟。
     向其中加入 5μL 的以上标记系统的 10×dCTP Nucleotide Mix( 核苷酸混合物 ) (Invitrogen 公司 ), 3μL Cy3-dCTP Bulk Pack 250nmol( 由 GEHealthcare Bioscience 公 司生产 ), 1μL BioPrime( 注册商标 )Array CGH Genomic Labeling System( 阵列 CGH 基 因组标记系统 ) 的 Exo-Klenow Fragment(Invitrogen 公司 ), 接着使用块型孵育器在 37℃ 与标记反应同时地进行 2 小时扩增反应。然后, 使用块型孵育器整体加热到 65℃以使包含 在反应溶液中的 Exo-Klenow Fragment 失活。
     以上操作, 遵从 puregene(QIAgen 公司 ) 的实验方法从 Coriell 医学研究所的 细胞株 GM07189( 下文中称为分析物核酸 No.1)、 细胞株 GM07189( 下文中称作分析物核酸 No.2)、 细胞株 GM13451( 下文中称作分析物核酸 No.3) 和细胞株 GM13451( 下文中称作分析 物核酸 No.4) 实施基因组提取。对于提取的 DNA, 使用 NanoDrop(Scrum Inc.) 测量 OD。在 因此获得的基因组上, 进行与在以上人男性基因组 DNA 的情况中相同的操作, 以获得未纯 化的标记的样品核酸。同样, 对于这些, 使用 Cy3-dCTP( 由 GE Healthcare Bioscience 公 司生产 ) 作为标记化合物。
     2.1. 制备标记的鉴定核酸
     除了将 3μg(13μL)Cot-1DNA( 由 Invitrogen 公司生产, 货号 15279-011) 用于微 管中和使用 3μL Cy5-dCTP Bulk Pack 250nmol( 由 GE Healthcare Bioscience 公司生 产 ) 作为标记化合物外, 以相同的方式获得标记的鉴定核酸 ( 未纯化的 )。
     2.2 制备包含标记的鉴定核酸的杂交溶液
     向微管加入 21μL 标记的核酸 Cy5-Cot-1DNA, 62μL 未标记的 Cot-1DNA(62μg, 由 Invitrogen 公司生产 ), 0.3μg 酵母 tRNA, 以及 9μL 3M 醋酸钠 (pH 5.2), 并且向其中
     加入 -20℃ 360μL 99.5% (v/v) 乙醇, 以实现乙醇沉淀。干燥后, 添加 8.7μL 水、 6.5μL 甲醛以及 16.8μL 20% SDS。向其中加入 32μL 葡聚糖 - 甲酰胺溶液, 所述葡聚糖 - 甲酰 胺溶液通过将水加入 1g 葡聚糖、 5mL 甲酰胺和 1mL 20×SSC 至 7mL 的体积而获得, 接着将全 部完全溶解。之后, 收集到一个管中, 并且将各 30μL 分散在多个管中。
     向其加入 10μL 的以上标记的样品核酸的基因组中的每个, 并且将整体充分搅 拌。然后, 在 75℃孵育 15 分钟后, 使产物在 42℃保持 30 分钟以上。
     3. 制备 BAC 阵列载玻片
     从已经插入人基因组的 BAC 文库, 每个染色体随机选择包含被认为是含有先天性 异常的基因区域的 BAC, 并且在 50mL LB 培养基 (+ 氯霉素 ) 中培养过夜。选择每个染色体 具有特定长度的以上 BAC, 并且最终制成 340 个样点。
     遵从所附实验方法使用 QIAGEN 公司的质粒中提试剂盒 (plasmid midi kit) 提 取它。在调节到 1.5μg/16μL TE 后, 分别使用限制酶 RsaI、 DpnI 和 HaeIII 进行 2 小 时的消化, 然后在 80 ℃持续 20 分钟使所述酶失活, 并且将这三种消化物混合。此外, 加 入 序 列 为 SEQ No.1 : 5 ′ -aattccggcggccgcccgatg-3 ′的 衔接 子和 序列 为 SEQ No.2 : 5 ′ -P-catcgggcggccgcgg-3 ′ (5 ′ 端 磷 酸 化 ) 的 它 的 互 补 链, 在 95 ℃、 5 分 钟, 70 ℃、 15 分钟, 65 ℃、 15 分钟, 60 ℃、 15 分钟, 55 ℃、 15 分钟, 50 ℃、 15 分钟, 45 ℃、 15 分钟, 40 ℃、 15 分 钟, 35 ℃、 15 分 钟, 30 ℃、 15 分 钟, 25 ℃、 15 分 钟 的 限 制 酶 消 化 后, 所述衔接子连接 到 DNA 片段上, 并且加入 5μL10×T4 连接酶缓冲液和 2.5μL T4 连接酶, 以使限制酶处 理后的 DNA 片段与衔接子结合。然后, 使用 Nucleospin 试剂盒 ( 由 MACHEREY-NAGEL 公 司生产 ) 纯化 DNA 片段。使用 EX-Taq( 由 Takara Bio Inc. 生产 ) 和序列为 SEQ No.3 : 5′ -NH2-ggaattccgcggccgcccgatg-3′的 5′端胺化引物进行 PCR。PCR 进行 15 个循环作 为第一次 PCR 并且 10 个循环作为第二次 PCR。通过在 MICROCON 柱上进行超滤来纯化产物 到 1μg/μL 的终浓度, 其被用作探针核酸。将它送至 NGK Insulators Ltd. 并且通过压电 法在 Matsunami Glass Ind. 的载玻片上进行点样, 以形成 BAC 阵列。
     此外, 根据 JP-A-2002-176977 中描述的方法使 BAC 阵列经历封闭和热变性。
     4, 杂交
     使用 ALOKA Co., Ltd 的 HYBRIMASTER HS300 进行杂交。
     放置 BAC 阵列载玻片, 将温度设定为 37℃并且, 在加入杂交溶液后, 在搅拌下进行 16 小时的杂交。 在此情况下, 使用 50%甲酰胺 /2×SSC 作为湿润液体。 之后, 在 25℃用 5mL 2×SSC 进行漂洗 5 分钟并且用 10mL2×SSC 漂洗 5 分钟, 在 50℃用 5mL 50%甲酰胺 /2×SSC 漂洗 14 分钟并且用 5mL 0.1% SDS/2×SSC 漂洗 30 分钟, 并且在 25℃用 2×SSC 漂洗 5 分 钟。
     5. 荧光图像的加载和数据处理
     使用 genepix 4000B( 由 axon Inc. 生产 ) 加载荧光图像。基于其中图像被数字 化的 gpr 文件进行计算。关于计算方法, 使用 cy5 即 Cot-1DNA 的荧光值作为校正的指标, 对用 cy3 标记的标记的基因组的荧光强度进行校正, 然后完成比较。使用减去背景荧光值 后的值作为荧光值。
     计算方法 : log2( 基因组分析物核酸的荧光强度 / 标记的 cot-1( 分析物 )/ 基因 组标准核酸的荧光强度 × 标记的 cot-1( 标准 ))对由此与分析物核酸 No.1 杂交的所有成对的所有样点以及与标准人男性基因组 DNA 杂交的所有样点中相同类型的样点进行此计算。
     对于通过以上计算获得的所有样品对的值, 通过除以所有样点对的中央值进行整 体归一化。
     因此, 进行分析物核酸 No.1 与标准人男性基因组 DNA 的比较。然而, 因为标准核 酸的 CNV 是未知的, 有可能比较结果可以包含假阳性和假阴性。
     因此, 分别使用分析物核酸 No.2、 No.3 和 No.4 代替标准人男性基因组 DNA 进行与 分析物核酸 No.1 的比较。
     6. 结果
     图 3 至图 6 显示以上计算的结果。纵坐标轴表示荧光强度比而横坐标轴表示样点 编号 ( 探针核酸编号 )。在图 3 至图 6 中, ◆表示落入阈值内的数据, □表示落在阈值外的 数据 ( 在正向上偏离的数据 ), 而△表示落在阈值外的数据 ( 在负向上偏离的数据 )。阈值 设为 0.8 和 1.2。
     图 3 是这样的图, 其显示分析物 DNANo.1 与作为标准核酸的男性基因组 DNA 的荧 光强度比的对数坐标图的结果。
     图 4 是这样的图, 其显示分析物 DNANo.1 与分析物 DNANo.2 的荧光强度比的对数 坐标图的结果。
     图 5 是这样的图, 其显示分析物 DNANo.1 与分析物 DNANo.3 的荧光强度比的对数 坐标图的结果。
     图 6 是这样的图, 其显示分析物 DNANo.1 与分析物 DNANo.4 的荧光强度比的对数 坐标图的结果。
     在各个图中, 对应于常染色体并且落在阈值外的样点是以下样点。
     图 3: 4、 17、 81、 111、 127、 135、 145、 146、 147、 163、 197、 202、 221、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 244、 245、 264、 310、 328
     图 4: 31、 181、 197、 219、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 281、 291、 314、 318、 319、 320、 321、 322
     图 5: 1、 6、 10、 13、 15、 19、 20、 21、 27、 29、 30、 35、 36、 44、 47、 51、 52、 55、 57、 59、 64、 66、 72、 80、 86、 94、 96、 113、 137、 141、 157、 167、 174、 178、 181、 185、 204、 215、 216、 217、 225、 226、 227、 228、 229、 230、 231、 232、 236、 256、 267、 269、 278、 279、 287、 290、 291、 299、 305、 307、 334
     图 6: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 10、 17、 29、 31、 52、 86、 111、 113、 163、 174、 197、 216、 217、 226、 227、 228、 230、 231、 232、 236、 245、 273、 287、 290、 306、 342
     结果, 在 197 以及 225 至 232 的每个样点中, 所述比率超出了图 3 至图 6 中的多数 结果中的阈值, 所以所述样点可以判断为是阳性。超过以上阈值的其他样点可以被判断为 是假阳性或假阴性。
     以上可见, 发现 No.1 样品具有异常 : 拷贝数在对应于固定在样点 197 以及 225 至 232 中的核酸的基因中增加。
     此外, 对于 No.2 至 No.4 样品以及作为标准的男性, 通过用其代替以上的 No.1 样 品进行类似测量, 可以测量它们的拷贝数变异。
     顺便提及, 尽管在本实施例中没有相关的实例, 但是在阵列之间的某个样点的比较结果中出现值在正向上落在阈值外和值在负向上落在阈值外的两种结果的情况 ( 例如, No.n 样点在图 3 和图 4 中是□并且 No.n 样点在图 5 和图 6 中是△的情况 ) 中, 优选不判断 所述样点为阳性。
     从以上结果可见, 应当理解可以通过本发明的方法确定阳性或阴性而不受假阳性 等的影响。
     工业实用性
     根据本发明的分析核酸突变的方法、 程序以及诊断方法可以降低分析结果中假阳 性和假阴性的影响, 尤其是, 降低由于标准核酸的 CNV 所导致的影响 ( 其为常规阵列比较基 因组杂交技术中的问题 ), 并且能够改善分析结果的可靠性。
     虽然已经详细地并且根据其具体实施方案描述了本发明, 但是对于本领域技术人 员明显的是可以在其中进行各种改变和改良而不背离它的精神和范围。
     本申请基于在 2009 年 9 月 10 提交的日本专利申请号 2009-209578, 并且其内容通 过引用结合于此。22CN 102482719 A
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1、(10)申请公布号 CN 102482719 A (43)申请公布日 2012.05.30 CN 102482719 A *CN102482719A* (21)申请号 201080040214.1 (22)申请日 2010.09.09 2009-209578 2009.09.10 JP C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/09(2006.01) (71)申请人 富士胶片株式会社 地址 日本国东京都 (72)发明人 仓光昌之 岩木义英 氏原大 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 陈平 (54) 发明名称 使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突。

2、变 的方法 (57) 摘要 本发明提供了使用阵列比较基因组杂交技术 分析核酸突变的方法, 所述方法减少了假阳性和 假阴性并且改善了分析结果的可靠性。使用阵列 比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法包括 : 步骤 (a) : 使多个标记的样品核酸逐个与多个相 同的探针核酸组接触以实现杂交, 步骤(b) : 获 得已经杂交到样点 X1 至 Xn 的每个样点中的样品 核酸的标记强度F1至Fn, 所述样点已经杂交有相 同的探针核酸 , 步骤 (c) : 确定从 F1 与 F2 的比 较值至 F1 与 Fn 的比较值的 n-1 个比较值中的每 个是否落入指定的数值范围 , 以及 步骤 (d) : 比较已经。

3、确定为未落入指定的数值范围内的比较 值的数目是否超过指定数目并且, 在超过指定数 目的情况中, 判断样点 X1 为阳性 。n 是 3 以上的 整数。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.03.09 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2010/065562 2010.09.09 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/030838 JA 2011.03.17 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 19 页 序列表 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 19 页 序列表 2。

4、 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 一种使用阵列比较基因组杂交技术来分析核酸突变的方法, 其包括 : 步骤 (a) : 使用 n 组相同的探针核酸组, 其中多个样点存在于一个核酸微阵列上并且彼 此不同的探针核酸已经被固定在多个所述样点上, 使 n 种标记的样品核酸 S1 至 Sn 逐个地 与 n 组所述探针核酸组接触以实现杂交, 步骤 (b) : 选择已经固定有相同探针核酸的 n 个样点 X1 至 Xn, 所述样点 X1 至 Xn 选自 n组所述探针核酸组, 并且获得已经被杂交到n个相应的样点X1至Xn中的样品核酸的标记 强度 F1 至 Fn, 步骤 (c) : 将所述样点 X1 的标记。

5、值 F1 与所述标记值 F2 至 Fn 中的每个比较, 由此获得 n-1 个比较值 C2 至 Cn, 并且确定所述比较值中的每个是否落入指定的数值范围内, 以及 步骤 (d) : 确定在 n-1 个所述比较值中在所述步骤 (c) 中已经确定为未落入所述指定 的数值范围内的比较值的数目是否超过指定数目, 并且在超过所述指定数目的情况下, 判 断所述样点 X1 为阳性, n 是 3 以上的整数, 所述样品核酸是分析物核酸或标准核酸, 至少 S1 是分析物核酸, 而 X1 是已经与 S1 接触的样点。 2. 根据权利要求 1 的分析核酸突变的方法, 其中在 n 种所述样品核酸中至少两种是分 析物核酸。

6、。 3. 根据权利要求 1 或 2 的分析核酸突变的方法, 所述方法进一步包括 : 步骤 (c ) : 确定从 F2 与 F1 的比较值至 F2 与 Fn 的比较值的 n-1 个比较值中的每个 是否落入指定的数值范围, 以及 步骤 (d ) : 确定 n-1 个比较值中在所述步骤 (c ) 中已经确定为未落入所述指定的 数值范围内的比较值的数目是否超过所述指定数目, 并且在超过所述指定数目的情况下, 判断样点 X2 为阳性, 样点 X2 是已经与不同于以上 S1 的样品核酸 S2 接触的样点。 4. 根据权利要求 1 至 3 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中在 n 种所述样品核酸中 至少一。

7、种是标准核酸。 5. 根据权利要求 1 至 3 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 n 种所述样品核酸都是 分析物核酸。 6. 根据权利要求 1 至 5 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 n 种所述样品核酸是来 源于属于分类学上相同物种的不同个体的核酸。 7. 根据权利要求 1 至 6 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 提供 n 个相同的探针核酸组 NS1 至 NSn, 各探针核酸组 NSi 被提供在具有 p 个样点 ti1至 tip的核酸微阵列上, i 是整数并且满 足 1 i n 而 p 是整数并且满足 2 p, 将彼此不同的探针核酸固定在各探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点。

8、 ti1至 tip上, 各探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点中的一个是样点 Xi, 将相同的探针核酸固定到样点 tij至 tnj上, j 是整数并且满足 1 j p, 步骤 (a) 包括使所述标记的样品核酸 Si 与所述探针核酸组 NSi 接触, 从而将所述样品 核酸 Si 杂交到已经固定在所述探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点上的核酸, 步骤(b)包括获得已经杂交到各探针核酸组NSi的所述样点ti1至tip中的样品核酸的 标记值 Fi1至 Fip, 权 利 要 求 书 CN 102482719 A 2 2/2 页 3 NS1 和 NSm 选自所述探针核酸组 NS1 至 NSn 并且 。

9、m 是整数并且满足 2 m n, 所述步骤 (c) 包括以下步骤 : (c1) 比较所述标记值 F1j 和 Fmj 以确定 p 个比较值 C1至 Cp, (c2) 计算所述比较值 C1至 Cp的平均值或中央值, 以及 (c3) 基于在所述步骤 (c2) 中获得的平均值或中央值, 设定指定的数值范围并且判断 所述比较值 C1至 Cp是否落入所述指定的数值范围内。 8. 根据权利要求 1 至 7 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中所述样品核酸都用相同 的标记物标记。 9. 根据权利要求 1 至 8 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中步骤 (b) 中的所述标记 强度 F1 至 Fn 是校正值。 。

10、10. 用于在根据权利要求 1 至 9 中任一项的分析核酸突变的方法中执行数据处理的程 序, 所述程序执行以下进程 (I) 和 (II) : 进程 (I) : 比较从 F1 与 F2 至 F1 与 Fn 的 n-1 个比较值是否落入指定的数值范围 进程 (II) : 在以下情况下判断样点 X1 为阳性 : 在以上 (I) 中临时确定的所有 n-1 个 比较值中, 存在的已经通过进程 (I) 确定为未落入所述指定的数值范围内的比较值的数目 超过指定数目 。 11. 根据权利要求 10 的程序, 其中所述进程 (i) 包括以下进程 (i) 至 (v) : 进程 (i) : 在存在于 n 组所述探针。

11、核酸组的每个中的 p 个样点中, 从 n 组所述探针核酸组中选择一对两个探针核酸组, 所述一对两个探针核酸组被这样 选择以致包含样点 X1, 以及 在所述两个探针核酸组之间, 计算已经固定有所述相同的探针核酸的成对的样点的标 记强度的比较值 进程 (ii) : 对所述探针核酸组中的 p 个成对的样点中的每个进行在进程 (i) 中的比 较值计算 , 进程 (iii) : 计算在进程 (ii) 中获得的 p 个比较值的平均值或中央值 , 以及 进程(iv) : 从在进程(iii)中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围, 并且比较 p 个比较值中的每个是否超过所述指定的数值 。 12.一种诊断源于。

12、基因突变的疾病的方法, 所述方法使用根据权利要求1至9中任一项 的分析核酸突变的方法。 权 利 要 求 书 CN 102482719 A 3 1/19 页 4 使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法 技术领域 0001 本发明涉及使用阵列比较基因组杂交技术分析核酸突变的方法, 所述方法降低来 自分析结果的假阳性等的影响并且改善分析结果的可靠性。 背景技术 0002 阵列比较基因组杂交 (CGH) 技术已知为这样的方法, 其用于在短时间内检测发生 在数 10kb 至数 Mb 水平上的基因组结构异常, 诸如基因组拷贝数异常 ( 见, 例如, 非专利文 件 1 和 2)。 0003 在使用阵列。

13、 CGH 的用于遗传性疾病等的诊断阵列的情况中, 变得必要的是精确地 诊断与病理状况直接相关的拷贝数异常。因此, 作为标准的核酸必定不具有拷贝数变异 (CNV) 并且因此应当进行小心的选择和确认包括稀有 CNV 的情况, 以致总是存在麻烦的并 且需要复查的情况。 0004 此外, 在包括用于全基因组分析的阵列、 检查出拷贝数异常的情况中, 因为难以获 得已被证明为对于目标基因组是正常的标准核酸, 所以必需对双亲和同胞进行连续检查并 且进行重复地复查以确认所述情况是否是假阳性或假阴性或新发生 (de novo) 拷贝数异 常, 并且用正常分析物的分析实例和公用数据库验证 ( 见, 例如, 非专利。

14、文件 1)。在判断出 是假阳性或假阴性的情况中, 复查变得必要并且产生这样的问题, 即利用一次检查不能做 出诊断。 0005 背景技术文件 0006 非专利文件 0007 非 专 利 文 件 1 :“Arei CGH Shindan Katsuyo Gaido Bukku Shitte Okitai Senshokutai Bisaikozo Ijosho(Arrey CGH Diagnosis Utilization Guidebook, Chromosome Fine Structure Disorder Which Is Need To Know)(阵列CGH诊断使用指南, 需要了解的染。

15、色体精细结构异常)” 由Joji Inazawa等编辑, Iyaku(Medicine and Drug(医 学和药物 )Journal Co., Ltd. 0008 非专利文件 2 : Issei Imoto, Joji Inazawa“Maikuro Arei Gijusu wo Mochiita CGH Kaiseki : CGH Arei Hou(CGH Analysis Using Microarray Technology : CGH Array Method( 使用微阵列技术的 CGH 分析 : CGH 阵列方法 )” , Saibo Kogaku( 细胞技术 ), 卷 23, 。

16、No.03, 355-361(2004)。 0009 发明概述 0010 本发明要解决的问题 0011 鉴于背景技术的以上问题, 本发明的一个目的是提供分析核酸突变的方法以及用 于执行数据处理的程序, 所述方法减小分析结果中假阳性和假阴性的影响, 尤其是, 减小由 于标准核酸的CNV所导致的影响(其为常规阵列比较基因组杂交技术中的问题), 并且改善 分析结果的可靠性而不需要复查。 0012 此外, 本发明的另一个目的是提供使用分析核酸突变的方法来诊断源于基因突变 说 明 书 CN 102482719 A 4 2/19 页 5 的疾病的方法。 0013 解决所述问题的方式 0014 以上问题已经。

17、由以下方法解决。 0015 1. 一种使用阵列比较基因组杂交技术来分析核酸突变的方法, 其包括 : 0016 步骤 (a) : 使用 n 组相同的探针核酸组, 其中多个样点存在于一个核酸微阵列上并 且彼此不同的探针核酸已经被固定在多个所述样点上, 使 n 种标记的样品核酸 S1 至 Sn 逐 个地与 n 组所述探针核酸组接触以实现杂交, 0017 步骤 (b) : 选择已经固定有相同探针核酸的 n 个样点 X1 至 Xn, 所述样点 X1 至 Xn 选自 n 组所述探针核酸组, 并且获得已经被杂交到 n 个相应的样点 X1 至 Xn 中的样品核酸 的标记强度 F1 至 Fn, 0018 步骤 。

18、(c) : 将所述样点 X1 的标记值 F1 与所述标记值 F2 至 Fn 中的每个比较, 由此 获得 n-1 个比较值 C2 至 Cn, 并且确定所述比较值中的每个是否落入指定的数值范围内, 以 及 0019 步骤 (d) : 确定在 n-1 个所述比较值中在所述步骤 (c) 中已经确定为未落入所述 指定的数值范围内的比较值的数目是否超过指定数目, 并且在超过所述指定数目的情况 下, 判断所述样点 X1 为阳性, 0020 n 是 3 以上的整数, 所述样品核酸是分析物核酸或标准核酸, 至少 S1 是分析物核 酸, 而 X1 是已经与 S1 接触的样点。 0021 2. 根据以上 1 的分析。

19、核酸突变的方法, 其中在 n 种所述样品核酸中至少两种是分 析物核酸。 0022 3. 根据以上 1 或 2 的分析核酸突变的方法, 所述方法进一步包括 : 0023 步骤 (c ) : 确定从 F2 与 F1 的比较值至 F2 与 Fn 的比较值的 n-1 个比较值中的 每个是否落入指定的数值范围, 以及 0024 步骤 (d ) : 确定 n-1 个比较值中在所述步骤 (c ) 中已经确定为未落入所述指 定的数值范围内的比较值的数目是否超过所述指定数目, 并且在超过所述指定数目的情况 下, 判断样点 X2 为阳性, 样点 X2 是已经与不同于以上 S1 的样品核酸 S2 接触的样点。 00。

20、25 4. 根据以上 1 至 3 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中在 n 种所述样品核酸中 至少一种是标准核酸。 0026 5. 根据以上 1 至 3 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 n 种所述样品核酸都是 分析物核酸。 0027 6. 根据以上 1 至 5 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 n 种所述样品核酸是来 源于属于分类学上相同物种的不同个体的核酸。 0028 7. 根据以上 1 至 6 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中 0029 提供 n 个相同的探针核酸组 NS1 至 NSn, 0030 各探针核酸组 NSi 被提供在具有 p 个样点 ti1至 tip的核酸微阵列。

21、上, i 是整数并 且满足 1 i n 而 p 是整数并且满足 2 p, 0031 将彼此不同的探针核酸固定在各探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点 ti1至 tip上, 0032 各探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点中的一个是样点 Xi, 0033 将相同的探针核酸固定到样点 tij至 tnj上, j 是整数并且满足 1 j p, 说 明 书 CN 102482719 A 5 3/19 页 6 0034 步骤 (a) 包括使所述标记的样品核酸 Si 与所述探针核酸组 NSi 接触, 从而将所述 样品核酸 Si 杂交到已经固定在所述探针核酸组 NSi 的 p 个所述样点上的核酸上, 00。

22、35 步骤(b)包括获得已经杂交到各探针核酸组NSi的所述样点ti1至tip中的样品核 酸的标记值 Fi1至 Fip, 0036 NS1 和 NSm 选自所述探针核酸组 NS1 至 NSn 并且 m 是整数并且满足 2 m n, 0037 所述步骤 (c) 包括以下步骤 : 0038 (c1) 比较所述标记值 F1j 和 Fmj 以确定 p 个比较值 C1至 Cp, 0039 (c2) 计算所述比较值 C1至 Cp的平均值或中央值, 以及 0040 (c3) 基于在所述步骤 (c2) 中获得的平均值或中央值, 设定指定的数值范围, 并且 判断所述比较值 C1至 Cp是否落入所述指定的数值范围内。

23、。 0041 8. 根据以上 1 至 7 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中所述样品核酸都用相同 的标记物标记。 0042 9. 根据以上 1 至 8 中任一项的分析核酸突变的方法, 其中步骤 (b) 中的所述标记 强度 F1 至 Fn 是校正值。 0043 10. 用于在根据以上 1 至 9 中任一项的分析核酸突变的方法中执行数据处理的程 序, 所述程序执行以下进程 (I) 和 (II) : 0044 进程 (I) : 比较从 F1 与 F2 的比较值至 F1 与 Fn 的比较值的 n-1 个比较值是否落 入指定的数值范围 0045 进程(II) : 在以下情况下判断样点X1为阳性 : 在。

24、以上(I)中临时确定的所有n-1 个比较值中, 存在的已经通过进程 (I) 确定为未落入所述指定的数值范围内的比较值的数 目超过指定数目 。 0046 11. 根据以上 10 的程序, 其中所述进程 (i) 包括以下进程 (i) 至 (v) : 0047 进程 (i) : 在存在于 n 组所述探针核酸组的每个中的 p 个样点中, 0048 从 n 组所述探针核酸组中选择一对两个探针核酸组, 所述一对两个探针核酸组被 这样选择以致包含样点 X1, 以及 0049 在所述两个探针核酸组之间, 计算已经固定有所述相同的探针核酸的成对的样点 的标记强度的比较值 0050 进程 (ii) : 对所述探针。

25、核酸组中的 p 个成对的样点中的每个进行在进程 (i) 中 的比较值的计算 , 0051 进程 (iii) : 计算在进程 (ii) 中获得的 p 个比较值的平均值或中央值 , 以及 0052 进程(iv) : 从在进程(iii)中获得的平均值或中央值设定指定的数值范围, 并且 比较 p 个比较值中的每个是否超过所述指定的数值 。 0053 12.一种诊断源于基因突变的疾病的方法, 所述方法使用根据以上1至9中任一项 的分析核酸突变的方法。 0054 本发明的优势 0055 根据本发明的分析核酸突变的方法可以降低假阳性和假阴性在分析结果中的影 响, 尤其是, 降低由于标准核酸的CNV所导致的影。

26、响(其为常规阵列比较基因组杂交技术中 的问题 ), 并且可以改善分析结果的可靠性。更具体地, 即使对于在常规阵列比较基因组杂 交技术中由于假阳性和假阴性的影响而需要复查的分析物, 根据本发明的分析核酸突变的 说 明 书 CN 102482719 A 6 4/19 页 7 方法不需要复查。 0056 因为本发明的程序在以上分析核酸突变的方法中执行数据处理, 所以可以降低在 分析结果中假阳性和假阴性的影响, 尤其是由于 CNV 所导致的影响, 并且可以改善分析结 果的可靠性。 0057 因为根据本发明的用于诊断来源于基团突变的疾病的方法包括使用以上分析核 酸突变的方法, 所以可以在降低假阳性和假阴。

27、性影响的情况下做出诊断。 0058 附图简述 0059 图 1 是流程图, 其显示作为本发明的一个实施方案的分析核酸突变的方法。 0060 图 2 是部分示意图, 其显示作为本发明的一个实施方案的分析核酸突变的方法的 一个实施方案的部分。 0061 图 3 是这样的图, 其显示分析物 DNA No.1 与作为标准的男性基因组 DNA 的荧光强 度比的对数坐标图的结果。 0062 图 4 是这样的图, 其显示分析物 DNA No.1 与分析物 DNA No.2 的荧光强度比的对 数坐标图的结果。 0063 图 5 是这样的图, 其显示分析物 DNA No.1 与分析物 DNA No.3 的荧光强。

28、度比的对 数坐标图的结果。 0064 图 6 是这样的图, 其显示分析物 DNA No.1 与分析物 DNA No.4 的荧光强度比的对 数坐标图的结果。 0065 实施本发明的方式 0066 在本说明书中, 表示范围的 “至” 显示这样的范围, 所述范围包含分别在词的前后 作为最小值和最大值描述的数值。 0067 根据本实施方案的分析核酸突变的方法是使用阵列比较基因组杂交技术的分析 方法, 所述方法包括以下步骤 (a) 至 (d)。 0068 图 1 和图 2 是示意图, 其显示根据本发明的分析核酸突变的方法的一个优选实施 方案。在这样点上, 在图 1 中作为步骤 (d) 中判断标准的样点的。

29、数目是一半而在图 2 中例 举了 n 是 4 的情况, 但是本实施方案不限于此。 0069 首先, 在步骤 (a) 中, 使用 n 组相同的探针核酸组, 其中彼此不同的探针核酸已经 被固定到核酸微阵列上的 p 个以上的样点, 使 S1 至 Sn 的 n 种样品核酸逐个与所述探针核 酸组接触从而实现杂交。下文中, p 是 2 以上的整数而 n 是 3 以上的整数。 0070 然后, 选择已经固定有所述相同的探针核酸的 n 个样点 X1 至 Xn, 所述样点 X1 至 Xn 选自 n 组探针核酸组中的每个, 并且获得已经杂交到相应的样点中的样品核酸的标记强 度 F1 至 Fn( 样点 X1 : F。

30、1 的标记强度, 样点 X2 : F2 的标记强度 . 样点 Xn : Fn 的标记强度 ) ( 步骤 (b)。 0071 接下来, 确定从 F2 与 F1 的比较值至 F1 与 Fn 的比较值的 n-1 个比较值中的每个 是否落入指定的数值范围 ( 步骤 (c)。在图 2 中, 在步骤 3 中 F1 与 F2 的比较值 C2 显示为 F1/F2 而 F1 与 F3 的比较值 C3 显示为 F1/F3, 但是如以下所述比较值的计算方法不限于此。 0072 然后, 在n-1个比较值中, 当在步骤(c)中已经确定为未落入指定的数值范围内的 比较值的数目超过指定数目时, 样点 X1 被确定为阳性 (。

31、 步骤 (d)。 0073 顺便提及, 此处集中于任意的样点 X1 以进行说明, 但是也可以用其他样点代替所 说 明 书 CN 102482719 A 7 5/19 页 8 述样点来进行说明。优选的是用阵列中已经杂交有样品核酸 S1 的所有样点代替以上 X1 来 进行分析。 0074 此处, 阵列比较基因组杂交技术 ( 下文中有时也称为阵列 CGH 技术 ) 是指其中比 较基因组杂交技术在核酸微阵列上进行的技术。例如, 该技术已经准确地描述于由 Joji Inazawa等编辑的 “Arei CGH Shindan Katsuyo Gaido Bukku Shitte Okitai Sensho。

32、kutai Bisaikozo Ijosho” (Iyaku(Medicine and Drug( 医学和药物 )Journal Co., Ltd) 等中。 0075 在常规阵列 CGH 技术中, 已知有使用两色法的技术, 其中不同种类的标记化合物 被用于标准核酸和分析物并且同时杂交到相同的样点中。 0076 在两色法中, 在相同的阵列中同时评价标准物和分析物, 但是, 在标准核酸的 CNV 未知的情况中, 难以确定作为测量结果出现的增加或减小是否是标准物的增加或减小或分 析物影响下的增大或减小 ( 所谓假阳性 / 假阴性 )。为避免这种问题, 在两色法中, 事先对 标准物的 CNV 进行确认。

33、。然而, 在标准物的 CNV 未知的情况中, 需要很多样品和实验以评价 标准物的 CNV。 0077 另一方面, 在本实施方案的方法中, 作为分析物的核酸和作为对照的一个核酸各 自杂交到已经固定有相同种类的核酸的不同的样点并且将测量值彼此比较。然而, 甚至在 此方法中, 当分析物核酸添加到阵列 1, 作为对照的分析物核酸添加到阵列 2, 各自杂交时, 比较样点 X1 和样点 X2( 它们是已经固定有相同的探针核酸的样点 ) 的标记强度由此获得 一个比较值, 并且基于它判断阳性或阴性, 尤其在对照包含CNV(拷贝数变异)的情况中, 产 生由于对照的影响所导致的增加或减小 ( 所谓假阳性 / 假阴。

34、性 ) 并且因此存在需要复查的 情况或发生判断错误的情况。 0078 因此, 在本实施方案中, 使用 n 种标记的样品核酸。n 是 3 以上的整数。具体地, 在 n 种样品核酸中集中于一种作为判断目标, 使用剩下的 n-1 种作为对照获得关于该判断 目标的 n-1 个比较值, 并且进行对比较值阳性或阴性的临时判断。然后, 在 n-1 个临时判断 的结果中, 指定数目以上的结果是临时阳性的情况被判断为真阳性, 而判断为临时阳性的 结果的数目小于指定数目的情况被判断为真阴性。 0079 至于指定数目, 优选使用临时判断结果总数目的 30至 70范围内的数目, 而 40至 60的数目是更优选使用的。。

35、 0080 此处, 阳性 / 阴性与在常规阵列 CGH 技术中是相同的, 并且以下情况被称为阳性 : 与标准核酸相比在鉴定核酸中已经被固定到目标样点的核酸序列以更大的量存在, 或者以 更小的量存在或者不存在 ; 而量相等的情况被称为阴性。 0081 通常, 在某个样点中, 在分析物核酸与一种对照核酸的比较中, 产生假阳性和假阴 性 ( 下文中简称为假阳性等 ) 的可能性最多是大约 1/10, 通常是 1/100 以下。因此, 使用 n-1 种对照核酸, 并且在所得的 n-1 个临时判断的结果中, 指定数目以上的结果是临时阳性 的情况被判断为真阳性, 由此很大程度上减小了产生以上假阳性的可能性。。

36、 0082 如上, 通过根据本实施方案的分析核酸突变的方法, 假阳性等可以从测量结果中 减少。 0083 此外, 因为在本实施方案中以上产生比率变得很低, 所以可能不使用标准核酸。 0084 用于本实施方案中的样品核酸的种类 n 是 3 以上并且优选地是 4 以上。 0085 如上所述, 所述效果随 n 增加而变高并且 n 的上限不受限制, 但是, 为快速获得数 说 明 书 CN 102482719 A 8 6/19 页 9 据或从简化计算的观点来看, n 优选 100 以下。最优选地 n 是 4 至 100。 0086 下文中, 标记的 n 种样品核酸也被显示为样品核酸 S1、 S2、 .S。

37、n-1, Sn(n 是 3 以 上的整数 )。 0087 下文中, 当确认样点(X1)中的标记是否为阳性时, 即当确认核酸突变(S1)在与样 点 (X1) 接触的标记的样品核酸中是否出现时, 集中于样点 (X1) 进行说明, 而样点 (X1) 是 任意的样点。通常, 集中于阵列上的 p 个以上的样点 (p 是 2 以上的整数 ) 中的每个样点以 进行实施方案的方法, 并且优选地, 集中于已经杂交有样品核酸的阵列上的所有样点以进 行确认。 0088 此外, 在所述样品核酸中, 集中的核酸被用作待判断的核酸而待比较的相对的一 个被用作对照核酸, 但是可以集中于任何样品核酸并且将其用作待判断的核酸。。

38、优选的是 至少两种所述样品核酸是分析物核酸。即, 以上核酸如 S1 可以任意选自 n 种所述核酸, 并 且通过施行本实施方案使用顺序地包含在 n 种核酸中的所有分析物核酸如 S1 可以对核酸 突变进行高度可靠的分析。 0089 通过比较关于样品核酸的对应样点的标记强度, 可以判断多个分析物核酸的真阳 性或阴性。 0090 此外, 对于阵列上的所有样点中的每个, 进行杂交的步骤和获得标记强度的步骤 通常执行一次。 0091 在这样点上, 也可能的是关于其中之前已经获得了杂交后的标记强度的数据, 通 过所述实施方案的方法进行确认。 0092 步骤 (a) 0093 在步骤 (a) 中, 使 S1 。

39、至 Sn 的 n 种标记的样品核酸逐个与已经固定有相同的探针 核酸的 n 个样点 X1 至 Xn 接触, 由此将样品核酸杂交到以上被固定的核酸。 0094 核酸微阵列是指探针核酸高密度地结合到固体基底的阵列。 用于以上固体基底的 固体材料不受特殊限制, 只要它是探针核酸可以结合的材料, 例如, 玻璃材料诸如通常使用 的载玻片以及塑料材料。 0095 作为用于本实施方案的核酸微阵列, 可以提及 BAC-DNA 阵列、 寡核苷酸微阵列、 c-DNA 微阵列等。 0096 在根据本实施方案的分析核酸突变的方法中, 可以使用市售的核酸微阵列或者可 以使用通过通常方法制备的核酸微阵列。 0097 所述样。

40、点是指已经大量地高密度地固定有探针核酸的区域并且多个样点存在于 以上的核酸微阵列上。 0098 以上在核酸微阵列上的样点的数目不受特殊限制, 只要该数目是 p 个以上, 但是 通常, 5 个至 1,000,000 个的数目是优选的而 300 个至 5,000 个的数目是优选的。 0099 所述样点在以上核酸微阵列上的布置不受特殊的限制, 并且可以提及在多个区域 中具有阵列并且能够在一个基底上测量多个样品核酸的多分析物阵列, 在一个基底上组合 多个阵列并且复制大量样点的带环 (tie ring) 阵列等。 0100 探针核酸是指这样的核酸, 所述核酸已经固定在核酸微阵列的基底上 ( 优选地以 多。

41、个样点的形式 ) 并且优选地是包含已知序列的核酸。 0101 探针核酸的大小优选地是 10 个碱基 (b) 至 10kb, 更优选 50b 至 5kb, 并且进一步 说 明 书 CN 102482719 A 9 7/19 页 10 优选 100b 至 2kb。 0102 “相同的探针核酸” 也包括在严格条件下和与以上探针核酸互补的核酸杂交的核 酸。 0103 在本实施方案中, 分别用在已经固定有相同的探针核酸的 n 个样点中的不同样品 核酸进行杂交。此处, 已经固定有相同的探针核酸的样点被表示为样点 X1、 X2、 .Xn-1、 Xn(n 是 3 以上的整数 )。 0104 n 个样点 X1、。

42、 X2、 .Xn-1、 Xn 可以存在于相同的核酸微阵列上但是优选地存在于 n个不同的核酸微阵列上。 例如, 在n个样点分别存在于n个相同种类的核酸微阵列上的情 况中, 优选的是使用具有相同区编号 (block number)、 列编号或行编号的样点作为 n 个以 上的样点。 0105 待固定的探针核酸的量优选为每样点 0.8 至 5g, 更优选为 1.0 至 2.0g。 0106 在步骤 (a) 中,“探针核酸组” 是指一组编码特定转录产物的基因的探针核酸。在 本实施方案中, 探针核酸组的数目通常对应阵列上的样点的数目。 0107 对于一个探针核酸组, 在每个样点上可以固定一种探针核酸或者可。

43、以固定多个探 针核酸, 只要在单独的样点之间固定的探针核酸的种类是不同的。 通常, 一个探针核酸组固 定在一个阵列上。 0108 在步骤 (a) 中, n 组探针核酸组是指 n 组相同的探针核酸组并且也可以包括在严 格条件下和与特定探针核酸组互补的探针核酸组杂交的探针核酸组。 0109 以上相同的探针核酸组对应于样品核酸的种类并且是 n 组。 0110 至于以上的探针核酸, 可以提及化学合成的核酸、 cDNA、 BAC( 细菌人工染色体 )、 YAC( 酵母人工染色体 )、 PAC( 来源于 P1 的人工染色体 )、 通过使用基因工程技术扩增它们 获得的那些。 0111 此外, 通过化学修饰天。

44、然核酸诸如 DNA 和 RNA 获得的核酸可以用作探针核酸。可 以使用例如, PNA( 肽核酸 )、 BNA( 桥接核酸 )、 膦酸甲酯类 DNA、 硫代磷酸酯类 DNA、 氨基磷酸 酯类 DNA、 硼烷磷酸酯 (boranophosphate) 类 DNA 等。此外, 也可以采用嵌合体类核酸。 0112 至于将探针核酸结合到固体基底上的方法, 可以提及使用已经结合有由基因芯片 (Gene Chip) 代表的发光基团的亚酰胺 (amidite) 单体以及使用掩膜逐个化学合成核苷酸 的方法, 或者通过喷墨方法将亚酰胺单体点样于固体基底上从而化学合成所需的序列的方 法, 通过改变电极上溶液的pH并。

45、且利用pH改变除去保护基团而在基底上合成核酸的方法, 纯化之前化学合成的核酸并将其点样在基底上的方法, 使用点样仪(spotter)点样cDNA的 方法等。至于点样方法, 可以提及喷墨法、 插针 (pin) 阵列法等。 0113 样品核酸是指用于根据本实施方案的分析核酸突变的方法的单链或双链核酸并 且可以是 DNA、 RNA 等中的任何一个。 0114 样品核酸的来源不受特殊限制并且, 例如, 可以提及分析目标诸如包含样品核酸 的细胞, 使用核酸微阵列对其核酸的表达量和现有量、 基因组中的拷贝数等进行测量 ; 或对 其进行评价诸如诊断的细胞, 并且也可以提及组织、 器官、 一个个体等, 并且所。

46、述来源不限 于细胞自身。 0115 尤其地, 样品核酸的来源优选能够从被认为具有特定疾病的人类患者、 动物等获 得的细胞等。 至于疾病, 可以包括所有疾病, 诸如癌症、 遗传疾病和传染性疾病, 核酸可以具 说 明 书 CN 102482719 A 10 8/19 页 11 有关于所述疾病的某些信息, 并且所述疾病不受特殊的限制。本实施方案的方法适于检查 突变数目相对小的先天遗传疾病。 非入侵性位点诸如粘膜、 毛发和指甲以及体液诸如血液、 淋巴、 骨髓、 精子和羊水优选地用作样品。 0116 n 种样品核酸优选地是来源于分类上属于相同物种的不同个体的核酸或来源于相 同个体的不同细胞的核酸, 更优。

47、选来源于人类不同个体的核酸或来源于相同人类个体的不 同细胞 ( 例如, 正常细胞和癌细胞 ) 的核酸。来源于人类不同个体的核酸是最优选的。 0117 此外, 本实施方案的方法优选地用于检查这样的个体, 所述个体不是根据患有特 定遗传疾病的可能性等选择的 ( 对新生儿等的全数检查 )。 0118 在样品核酸的制备 ( 例如, 纯化、 断裂 ) 方面, 优选的是通过纯化处理除去溶于细 胞的物质诸如蛋白质和脂质。 这是因为在用荧光等标记时发生不同副反应并且当不进行纯 化时溶于细胞的物质诸如蛋白质和脂质很大程度上也影响背景噪音, 以致核酸微阵列的性 能显著降低。 0119 至于用于纯化的方法, 可以提。

48、及使用用二氧化硅、 纤维素化合物等的核酸吸附膜 支撑的柱体 (cartridge) 的方法, 用乙醇沉淀或用异丙醇沉淀, 用酚氯仿萃取等。此外, 可 以提及以下方法 : 使用离子交换树脂的固相萃取柱、 色谱等, 与疏水取代基诸如十八烷基键 合的二氧化硅支持物(support), 具有尺寸排阻作用的树脂。 样品核酸的长度不受特殊限制 并且, 例如, 可以是全基因组, 但是可以在以下的断裂处理后进行以上的纯化处理。 0120 在这样点上, 标记的样品核酸的长度不受特殊限制, 但是通过标记 / 断裂处理, 所 述核酸通常被断裂为 1,000 个碱基 (1kb) 或碱基对 (bp) 至 5,000b 或 bp。 0121 至于断裂处理, 可以提及酶处理、 超声处理、 机械破碎处理、 化学处理等。 至于用于 酶处理的酶, 优选使用限制酶或核酸酶。至于限制酶的种类, 也可能使用多个酶。 0122 至于机械破碎处理, 可以提及使用玻璃球、 不锈钢球、 氧化锆球等裂开核酸的方 法。 0123 以上核酸可以经受扣除法 (subtraction method) 的处理。扣除法是指这样的方 法 : 在目标基因的拷贝数或表达存在差异的情况中, 通过以扣除的方式扣除存在于基因中 的差异来有效地分离基因。 。

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