一种丹参有效组分及制备方法和应用.pdf

本发明提供一种丹参有效组分，主要含有化合物A：TrijuganoneC、化合物B：7-Hydroxy-8，13-abietadiene-11，12-dione和化合物C：DihydrotanshinoneI，含量分别为40～50％、30～40％和3～10％。通过加热提取，浓缩，硅胶柱分离，洗脱，洗脱液浓缩干燥，再用液相色谱继续分离，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到该有效组分。本发明提供的丹参有效组分可在制备治疗、预防肿瘤的药物中应用。本发明方法设计合理，能快速准确的得到有效成分，在生产中更易于药物的质量控制。

权利要求书
1.  一种丹参有效组分，其特征是：该有效组分含有化合物A：TrijuganoneC，化合物B：7-Hydroxy-8，13-abietadiene-11，12-dione，化合物C：Dihydrotanshinone I，其中化合物A的含量为40～50％，化合物B的含量为30～40％，化合物C的含量为3～10％，
化合物A的结构式为：

化合物B的结构式为：

化合物C的结构式为：


2.  根据权利要求1所述的一种丹参有效组分的制备方法，其特征是通过以下步骤实现：将丹参药材粉碎后加入1∶0.8～1.2的乙酸乙酯和乙醇，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用47～53∶1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，再用8～13∶1的氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的目的物；制备色谱的分离条件为：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9～11ml/min，柱温为室温，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到丹参有效组分。

3.  根据权利要求2所述的一种丹参有效组分的制备方法，其特征是：所述梯度洗脱程序为：0分钟时，流动相为50％的水溶液和50％的乙腈溶液；35分钟时，流动相为20％的水溶液和80％的乙腈溶液；45分钟时，流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液；55分钟时，流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液。

4.  根据权利要求2所述的一种丹参有效组分的制备方法，其特征是：色谱分离后，在18.2～27.1分钟时间段收集溶液。

5.  根据权利要求1所述的一种丹参有效组分在制备治疗、预防肿瘤的药物中应用。

6.  根据权利要求5所述的一种丹参有效组分的应用，其特征是：所制备的药物还含有制剂允许的药物赋形剂或载体。

7.  根据权利要求5所述的一种丹参有效组分的应用，其特征是：所制备的药物还含有其他抗肿瘤药物。

8.  根据权利要求5所述的一种丹参有效组分的应用，其特征是：所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、胶囊剂、胶丸剂。

9.  根据权利要求8所述的一种丹参有效组分的应用，其特征是：所述药物的给药方式包括口服给药或注射给药。

说明书一种丹参有效组分及制备方法和应用
技术领域
本发明属中药提取物，具体地说涉及从丹参中提取的有效组分，及其制备方法，以及该有效组分在制备治疗、预防肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。目前业内对恶性肿瘤的治疗主要还是以手术、放疗、化疗为主，但许多化学抗癌药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞，造成严重的副反应。植物药的遗传毒性不明显，中草药在抗癌抗突变方面有独特的优势和广阔的应用前景，而且中药在对肿瘤的辅助治疗中也起到不容忽视的作用。紫杉醇即是典型的从植物中获得的具有良好抗癌活性的天然化合物，现已开发为抗肿瘤药物。目前我国危害性最为严重的肿瘤为肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病及淋巴瘤等。特别是肝癌的发生率近年来有所增加。值得重视，这些肿瘤的病因学、发病学及其防治，均为我国肿瘤研究的重点。寻找高效低毒的抗癌药物以及抗癌辅助药物是当前肿瘤研究的重要内容。
我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药先导化学物，开发新药的天然宝库。目前，我国从天然产物中提取活性物质，用于开发成治疗肿瘤疾病、安全性好、毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活性物质，开发成具有抗肿瘤疗效的新药，具有重要应用价值和广阔发展前景。
丹参，别名血生根、赤根、血参、红根。丹参来自植物Salvia miltiorrhiza的根茎。丹参入药始载于汉代的《神农本草经》。中医认为，其味苦性微寒，具有活血通经、祛淤止痛、清心除烦、凉血消痈之功效，适用于治疗月经不调，冠心病，动脉硬化症，高血脂，心绞痛，痛经，经闭，崩漏，带下，跌打瘀血，失眠，乙肝，神经衰弱，血吸虫病肝脾肿大，骨节疼痛等疾病，尤为妇科、内科及外伤科证属血淤兼热者所常用。现代研究表明，丹参中主要含丹参酮类化合物及丹酚酸类化合物等。
发明内容
本发明的目的是提供一种丹参有效组分，该有效组分主要含有化合物A(Trijuganone C)，化合物B(7-Hydroxy-8，13-abietadiene-11，12-dione)，化合物C(Dihydrotanshinone I)，其中化合物A的含量为40～50％，化合物B的含量为30～40％，化合物C的含量为3～10％。
优选化合物A的含量为43～48％，化合物B的含量为33～38％，化合物C的含量为5～8％。
本发明中，化合物A的结构式为：

本发明中，化合物B的结构式为：

本发明中，化合物C的结构式为：

本发明的另一目的是提供该丹参有效组分的制备方法，通过以下步骤实现：将丹参药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。
优选的丹参有效组分制备方法，包括下列步骤：将丹参药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(47～53∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(8～13∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9～11ml/min，柱温为室温，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。
最佳的丹参有效组分制备方法，包括下列步骤：将丹参药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液；将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(10∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱(ZorbaxSB-C18；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相为50％的水溶液和50％的乙腈溶液；35分钟时，流动相为20％的水溶液和80％的乙腈溶液；45分钟时，流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液；55分钟时，流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液；流速为10ml/min，柱温为室温；样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段18.2～27.1min收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。
本发明的再一个目的是提供该丹参有效组分在制备治疗、预防肿瘤的药物中的应用。
本发明的丹参有效组分可以作为活性成分，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。
本发明的丹参有效组分还可以作为活性成分之一，还含有其他抗肿瘤药物，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。
所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、胶囊剂、胶丸剂。包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。
本发明的有益效果为：
1.本发明的提取分离工艺中使用了正相硅胶柱，能有效地除去糖、蛋白质、氨基酸等杂质，提高有效成分的含量，同时采用了制备色谱，能快速准确的得到有效成分。
2.本发明提供的丹参有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。
3.本发明提供的方法首次从丹参中得到A、B、C等几个成分的组合物，并首次将其在多种肿瘤细胞株上进行药效筛选，得到较好的药理活性。
具体实施方式
本发明结合附图和下面实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
实施例一丹参有效组分的制备
将200g丹参药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏4.6g，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品1.5g；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段18.2～27.1min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分0.26g。
实施例二丹参有效组分的制备
将500g丹参药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏9.0g，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(47～53∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(8～13∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品3.1g；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9～11ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段18.2～27.1min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分0.50g。
实施例三丹参有效组分的制备
取丹参药材250g，将其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液。将提取液浓缩成浸膏得4.8g，将浸膏和硅胶拌样，用正相硅胶柱进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作为流动相，得洗脱液I，然后改换氯仿和甲醇(10∶1)作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得1.6g样品。用制备液相色谱继续分离得到的样品。制备色谱的分离条件：色谱柱为Agient制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相A为80％的水溶液、流动相B为20％的乙腈溶液；45分钟时，流动相A为5％的水溶液、流动相B为95％的乙腈溶液；50分钟时，流动相A为5％的水溶液、流动相B为95％的乙腈溶液；流速为10ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段18.2～27.1min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分0.28g。
实施例四丹参有效组分HPLC-ELSD分析
色谱条件 色谱柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；采用梯度洗脱，流动相A相为0.2％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.2％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相A为90％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为10％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；10分钟时，流动相A为50％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为50％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；30分钟时，流动相A为5％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为95％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；35分钟时，流动相A为5％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为95％的0.2％冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mL·min-1；检测波长全波长；柱温30℃。
ELSD参数  氮气流速：2.0L/min；漂移管温度105℃。
供试品溶液的制备  称取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。
测定方法  精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，依色谱分析条件测定，即得。
本发明中，化合物A的结构式为：

本发明中，化合物B的结构式为：

本发明中，化合物C的结构式为：

实施例五丹参有效组分制剂
取实施例三的丹参有效组分0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。
实施例六丹参有效组分制剂
取实施例三的丹参有效组分0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1ml，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装500支，即得。
实施例七丹参有效组分制剂
取降香油1.5g，加入到13ml饱和的羟丙基β-环糊精中，搅拌溶解，滤过，滤叶低温干燥，的降香油和羟丙基β-环糊精的包合物粉末。除上述降香油合羟丙基β-环糊精的包合物粉末外，再取实施例三的丹参提取物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，分装300支，即得。
实施例八丹参有效组分的药理实验
药理模型：HL 60肿瘤细胞
细胞培养与种板  细胞培养：使用RPMI 1640(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90％，胎牛血清(四季青)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养HL60细胞，密度需低于106个/mL。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL-1×VT(ρ＝2×104个/mL)，其中VT＝0.1mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL，加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2 mL加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT-V2mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μL PBS，以减少培养液的蒸发。
给药方案丹参有效组分用DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50ng/mL。孵育48h。每个浓度设4个平行复孔，每板设空白组(blank，只加培养液，不含细胞)，及阴性对照组(negative，细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200μL的培养液，将吸取0.88μLDMSO加入混匀)。SRB染色：细胞培养结束后，取出培养板，每孔加入40％(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)100μL固定细胞，室温放置5min，4℃冰箱中放置1h。培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去除TCA。在空气中干燥后，每孔加0.4％的SRB100μL(1％色谱纯乙酸溶解)，室温下放置20min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍，去除未结合的染料，空气中干燥后用10mmol/L Tris150μL/孔溶解，振荡5min，使用酶标仪(EL×800)测定，所用波长为490nm。
抑制率的计算  抑制率按如下公式计算：

药效结果见表1。根据HL 60肿瘤细胞抑制率结果，丹参有效组分对抑制HL 60肿瘤细胞增殖有非常显著效果。
表1
    丹参组分  阴性  空白  阳性平均细胞存活数    0.166  0.835  0.075  0.212抑制率(％)    88.059  0  100  82.039RSD(％)    3.318  4.590  0.669  2.132
2.2药理模型：K562肿瘤细胞
细胞培养与种板  细胞培养：使用RPMI 1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氧钠]90％，小牛血清(赛乐)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养K 562细胞。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL-1×VT(ρ＝8×103个/mL)，其中VT＝0.1mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL，加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1 mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2 mL加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT-V2 mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μL PBS，以减少培养液的蒸发。
给药方案  丹参有效组分加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20℃。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50μg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200μL的培养液，将吸取0.88μL DMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4μg/mL)。SRB染色：细胞培养结束后，取出培养板，每孔加入40％(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)70μL固定细胞，4℃冰箱中放置1h。培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去除TCA。在空气中干燥后，每孔加0.4％的SRB100μL(1％色谱纯乙酸溶解)，室温下放置20min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍，去除未结合的染料，空气中干燥后用10mmol/LTris150μL/孔溶解，振荡5min，使用酶标仪(EL×800)测定，所用波长为490nm。
抑制率的计算  抑制率按如下公式计算：

药效结果见表2。根据K562肿瘤细胞抑制率结果，丹参有效组分对抑制K562肿瘤细胞增殖有非常显著效果。
表2
    丹参组分  阴性  空白  阳性平均细胞存活数    0.191  0.799  0.064  0.139抑制率(％)    82.69  0  100  89.80RSD(％)    7.123  6.908  7.342  7.636
2.3药理模型：MCF-7肿瘤细胞
细胞培养与种板  细胞培养：使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90％，小牛血清(赛乐)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养MCF-7细胞。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL-1×VT(ρ＝2×103个/mL)，其中VT＝0.1mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL，加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1 mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2 mL加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT-V2 mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μL PBS，以减少培养液的蒸发。
给药方案丹参有效组分根据所称量的药品的重量，加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20℃。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50μg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200μL的培养液，将吸取0.88μLDMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4μg/mL)。MTT比色法测定：取出培养板，去处每孔上清，加入培养液-MTT混合溶液(培养液∶MTT溶液＝10∶1)100μL，孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150μL的DMSO，振荡10min，550nm酶标仪(El×800)测定。
抑制率的计算  抑制率按如下公式计算：

药效结果见表3。根据MCF-7肿瘤细胞抑制率结果，丹参有效组分对抑制MCF-7肿瘤细胞增殖有非常显著效果。
表3
    丹参组分  阴性  空白  阳性平均细胞存活数    0.133  0.293  0.103  0.125抑制率(％)    84.211  0  100  88.421RSD(％)    7.838  8.755  4.327  6.299
2.4药理模型：KB肿瘤细胞
细胞培养与种板  细胞培养：使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90％，小牛血清(赛乐)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养KB细胞。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL-1×VT(ρ＝2×103个/mL)，其中VT＝0.1mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL，加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1 mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2 mL加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT-V2 mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μL PBS，以减少培养液的蒸发。
给药方案  丹参有效组分根据所称量的药品的重量，加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20℃。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50μg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200μL的培养液，将吸取0.88μLDMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4μg/mL)。MTT比色法测定：取出培养板，去处每孔上清，加入培养液-MTT混合溶液(培养液∶MTT溶液＝10∶1)100μL，孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150μL的DMSO，振荡10min，550nm酶标仪(El×800)测定。
抑制率的计算  抑制率按如下公式计算：

药效结果见表4。根据KB肿瘤细胞抑制率结果，丹参有效组分对抑制KB肿瘤细胞增殖有非常显著效果。
表4
    丹参组分  阴性  空白  阳性平均细胞存活数    0.089  0.489  0.058  0.063抑制率(％)    92.749  0  100  98.956RSD(％)    5.518  2.219  2.160  2.066
2.5药理模型：Hep G2肿瘤细胞
细胞培养与种板  细胞培养：使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90％，胎牛血清(四季青)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养Hep G2细胞。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL-1×VT(ρ＝2×103个/mL)，其中VT＝0.1mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL，加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1 mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2 mL加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT-V2 mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μL PBS，以减少培养液的蒸发。
给药方案  丹参有效组分根据所称量的药品的重量，根据所称量的药品的重量，加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20℃。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50μg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200μL的培养液，将吸取0.88μLDMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4μg/mL)。MTT比色法测定：取出培养板，去处每孔上清，加入培养液-MTT混合溶液(培养液∶MTT溶液＝10∶1)100μL，孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150μL的DMSO，振荡10min，550nm酶标仪(El×800)测定。
抑制率的计算  抑制率按如下公式计算：

药效结果见表5。根据Hep G2肿瘤细胞抑制率结果，丹参有效组分对抑制Hep G2肿瘤细胞增殖有非常显著效果。
表5
    丹参组分  阴性  空白  阳性平均细胞存活数    0.232  0.662  0.173  0.208抑制率(％)    87.880  0  100  92.940RSD(％)    5.552  9.711  3.974  2.768