一种重组猪源抗菌肽PG4及其生物合成方法与应用.pdf

本发明公开了一种重组猪源抗菌肽PG4，所述PG4的氨基酸序列为具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列；本发明还公开了一种合成如上所述的重组猪源抗菌肽PG4的方法，包括：(1)构建抗菌肽PG4原核表达载体；(2)抗菌肽PG4原核表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，构建表达工程菌；(3)发酵培养工程菌，进行诱导剂诱导表达；(4)纯化后得到重组猪源抗菌肽PG4。本发明的有益之处在于：本发明表达效率高，分离纯化简单，易操作，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产；本发明对研制新型高效抗菌类药物具有重要价值，在制药行业及生物抗菌材料领域具有广阔的应用前景。

权利要求书
1、  一种重组猪源抗菌肽PG4，其特征在于：所述PG4的氨基酸序列为具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。

2、  一种合成如权利要求1所述的重组猪源抗菌肽PG4的方法，其特征在于依次包括以下步骤：
(1)将合成的低聚核苷酸经退火处理成为双螺旋的目的DNA单体，应用DNA重组技术，构建抗菌肽PG4原核表达载体；
(2)抗菌肽PG4原核表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，构建表达工程菌；
(3)发酵培养工程菌，进行诱导剂诱导表达；
(4)将步骤(3)所得表达产物经亲和层析纯化、溴化氰化学切割，再纯化后得到重组猪源抗菌肽PG4。

3、  根据权利要求2所述的重组猪源抗菌肽PG4的合成方法，其特征在于：步骤(1)所述的低聚核苷酸为：
PG4-1：
5’-ATTCAGGGATCCATGCGCGGTGGCCGTCTGTGCTATTGTCGCGGTTGGATCTGCTTCTGTGTGGGTCGTTAAAAGCTTAATTCG-3’；
PG4-2：
5’-CGAATTAAGCTTTTAACGACCCACACAGAAGCAGATCCAACCGCGACAATAGCACAGACGGCCACCGCGCATGGATCCCTGAAT-3’。

4、  根据权利要求2或3所述的重组猪源抗菌肽PG4的合成方法，其特征在于：步骤(1)具体是将目的基因DNA片段和表达载体进行BamH I和HindIII双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化目的片段，经T4 DNA连接酶连接，构建重组抗菌肽PG4原核表达载体，所用原核表达载体为pGEX-2TK-CMS。

5、  根据权利要求2所述的重组猪源抗菌肽PG4的合成方法，其特征在于：步骤(2)具体是将步骤(1)构建的抗菌肽PG4原核表达载体经BamHI和HindIII双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳验证正确，转化入大肠杆菌宿主细胞，构建表达工程菌。

6、  根据权利要求2所述的重组猪源抗菌肽PG4的合成方法，其特征在于：步骤(3)具体是用TB培养基、25～37℃(最佳温度37℃)发酵培养表达工程菌1.5～4h(最佳时间2.5h)至OD600达到0.4～1.0；加入IPTG诱导剂至终浓度为0.01～1mM(最佳浓度为0.1mM)，诱导培养2～5h。

7、  根据权利要求2所述的重组猪源抗菌肽PG4的合成方法，其特征在于：步骤(4)包括收集步骤(3)诱导后工程菌，经超声破碎后离心，得上清液；亲和层析的分离介质为GSH-Sepharose Resin，用10倍柱体积的pH7.4的PBS缓冲液平衡层析柱，上样，Wash buffer洗树脂，Elution buffer洗脱，收集洗脱液，得重组猪源抗菌肽PG4。

8、  一种如权利要求1或2所述的基因重组猪源抗菌肽PG4在抗菌药物及生物抗菌材料中的应用。

说明书一种重组猪源抗菌肽PG4及其生物合成方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域重组蛋白质的表达和纯化，尤其涉及一种基因重组猪源抗菌肽及其生物合成方法。
背景技术
哺乳动物抗菌肽是哺乳动物对外界病原物质的侵染而产生的一系列非专一性免疫应答反应的产物，是宿主先天性防御系统的重要组成部分。它具有广谱抑菌，热稳定，强碱性，易溶于水，带正电荷，分子量低，对真核细胞几乎没有毒副作用，仅杀死原核细胞和发生病变的真核细胞等特点。由于它是通过改变细菌脂质膜的渗透性来杀灭原核细胞和发生病变的真核细胞，因而细菌不易形成耐药性，而传统抗生素是靠阻断大分子的生物合成来发挥作用，导致愈来愈多的细菌对其产生了抗药性。此外，抗菌肽为短链多肽，其成分为易被人或动物吸收的氨基酸，解决了药残问题。因此，哺乳动物抗菌肽必将取代传统抗生素成为新一代的抗菌物质。
目前在哺乳动物体内发现的十余种具有抗菌活性的肽都属于Defension(防御素)和Cathelicidins两大家族。猪白细胞源性的抗菌肽Protegrins(简称PG)包括5种，即PG 1～5，最初从猪白细胞中分离得到，近年来在仔猪的淋巴组织中也分离得到其mRNA。PG是Cathelicidins家族中一类富含Cys，Arg的小分子肽，仅含有16～18个氨基酸，相对分子质量约2KD，四个半胱氨酸形成两个分子内二硫键，以维持其反平行β-折叠结构的稳定性。PG具有广谱的杀灭微生物活性，抵抗各种革兰氏阴性菌、阳性菌、真菌以及囊膜病毒，其中包括多种性传播病菌及独特的抗人类HIV病毒的生物学活性。在体外，PG在浓度为0.1～8μg/mL时可杀灭革兰氏病原菌如大肠杆菌、绿脓杆菌、伤寒沙门氏菌、沙眼衣原体和结核分枝杆菌等。PG的抗微生物活性保持在生理盐浓度，不受细胞外阳离子或血清成分的抑制。Steinberg等研究发现PG还具有快速的杀菌活性，可在10min内使细菌的CFU下降3个对数单位，而常规的抗生素庆大霉素或诺氟沙星达到相同的效果则需要数小时以上。研究还发现在含有1/2浓度的MHB培养基中，绿脓杆菌和葡萄球菌连续分别传11代和18代而不产生耐药性，而相同条件下诺氟沙星的MIC则增加10-190倍。PG还可以通过结合LPS来中和内毒素，减轻内毒素血症。这一切使得PG成为具有很大潜力的抗菌治疗药物。
目前，许多抗菌肽正在开发成药，但是抗菌肽天然产量非常低，化学合成抗菌肽价格相当昂贵，这成为开发成药的一个瓶颈，而通过基因工程技术生产抗菌肽具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种在原核体系中表达猪源抗菌肽PG4的生物合成方法，表达后的融合蛋白经溴化氰化学切割、纯化后，可获得具有抗微生物活性的重组PG4多肽。
本发明的技术方案为：一种重组猪源抗菌肽PG4，所述PG4的氨基酸序列为具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。
本发明的一种合成如上所述的重组猪源抗菌肽PG4的方法，包括以下步骤：
(1)将合成的低聚核苷酸经退火处理成为双螺旋的目的DNA单体，应用DNA重组技术，构建抗菌肽PG4原核表达载体；
(2)抗菌肽PG4原核表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，构建表达工程菌；
(3)发酵培养工程菌，进行诱导剂诱导表达；
(4)将步骤(3)所得表达产物经亲和层析纯化、溴化氰化学切割，再纯化后得到重组猪源抗菌肽PG4。
步骤(1)所述的低聚核苷酸为：
PG4-1：
5’-ATTCAGGGATCCATGCGCGGTGGCCGTCTGTGCTATTGTCGCGGTTGGATCTGCTTCTGTGTGGGTCGTTAAAAGCTTAATTCG-3’；
PG4-2：
5’-CGAATTAAGCTTTTAACGACCCACACAGAAGCAGATCCAACCGCGACAATAGCACAGACGGCCACCGCGCATGGATCCCTGAAT-3’。
步骤(1)具体是将目的基因DNA片段和表达载体进行BamH I和HindIII双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化目的片段，经T4 DNA连接酶连接，构建重组抗菌肽PG4原核表达载体，所用原核表达载体为pGEX-2TK-CMS。
步骤(2)具体是将步骤(1)构建的抗菌肽PG4原核表达载体经BamH I和HindIII双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳验证正确，转化入大肠杆菌宿主细胞，构建表达工程菌。
步骤(3)具体是用TB培养基、25～37℃(最佳温度37℃)发酵培养表达工程菌1.5～4h(最佳时间2.5h)至OD600达到0.4～1.0；加入IPTG诱导剂至终浓度为0.01～1mM(最佳浓度为0.1mM)，诱导培养2～5h。
步骤(4)包括收集步骤(3)诱导后工程菌，经超声破碎后离心，得上清液；亲和层析的分离介质为GSH-Sepharose Resin，用10倍柱体积的pH7.4的PBS缓冲液平衡层析柱，上样，Wash buffer洗树脂，Elution buffer洗脱，收集洗脱液，得重组猪源抗菌肽PG4。
本发明的基因重组猪源抗菌肽PG4在抗菌药物及生物抗菌材料中的应用。
本发明的有益之处在于：
(1)应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽PG4，经实验验证该重组猪源抗菌肽PG4对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用。
(2)本发明表达效率高，分离纯化简单，易操作，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产。因此，本发明对研制新型高效抗菌类药物具有重要价值，在制药行业及生物抗菌材料领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明的抗菌肽PG4原核表达载体的构建示意图；
图2是本发明的诱导前后融合多肽表达量的SDS-PAGE电泳图；
其中，泳道1是未诱导的BL21-PG4工程菌的电泳条带；泳道2是诱导3h后菌体的电泳条带；泳道3是诱导4h后破碎上清的电泳条带；泳道4是诱导4h后破碎沉淀的电泳条带。
图3是本发明的亲和层析纯化重组融合多肽GST-PG4的SDS-PAGE电泳图；
其中，泳道1是IPTG诱导的BL21-PG4工程菌经超声破碎后可溶性多肽；泳道2是Wash buffer洗脱液；泳道3是经GSH-Sepharose柱分离纯化得到的GST-PG4融合多肽；M是蛋白质分子量标准。
图4为本发明制备的重组抗菌肽PG4抗大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)效果与空白对照试样的比较。
其中，1为空白对照试样，2为重组抗菌肽PG4。
图5为本发明制备的重组抗菌肽PG4抗金黄葡萄球菌Staphylococcusaureus(S.aureus)效果与空白对照试样的比较。
其中，1为空白对照试样，2为重组抗菌肽PG4。
具体实施方式
下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，应理解的是，本发明不限于这些实施例。
实施例1：
1、一种重组猪源抗菌肽PG4基因的克隆
(1)设计和合成两个低聚核苷酸：PG4-1、PG4-2，然后经退火复性得到一段双螺旋DNA片断，其核苷酸序列分别为：
PG4-1：
5’-ATTCAGGGATCCATGCGCGGTGGCCGTCTGTGCTATTGTCGCGGTTGGATCTGCTTCTGTGTGGGTCGTTAAAAGCTTAATTCG-3’；
PG4-2：
5’-CGAATTAAGCTTTTAACGACCCACACAGAAGCAGATCCAACCGCGACAATAGCACAGACGGCCACCGCGCATGGATCCCTGAAT-3’。
采用大肠杆菌偏爱密码子，化学合成PG4-1和PG4-2两个低聚核苷酸片段，PG4-1和PG4-2经退火处理所得双螺旋DNA对应于氨基酸序列为SEQ ID NO4：Ile-Gln-Gly-Ser-Met-Arg-Gly-Gly-Arg-Leu-Cys-Tyr-Cys-Arg-Gly-Trp-Ile-Cys-Phe-Cys-Val-Gly-Arg-终止子-Lys-Leu-Asn-Ser。
在两个低聚核苷酸片段的两端，分别设计了BamH I和HindIII限制性内切酶位点。同时在结构基因上游引入甲硫氨酸编码基因即溴化氰识别位点，在下游引入TAA终止密码子。
(2)将退火产物磷酸化和pSIMPLE-19 EcoR V/BAP(购自大连宝生生物)载体连接后，命名为pSIMPLE-PG4，转化至大肠杆菌感受态JM109(购自Novagen)中，涂布LB平板过夜培养菌体。从转化平板上挑取单菌落，将单菌落在2ml LB培养基中振荡培养。以碱裂解法提取质粒，将质粒pSIMPLE-PG4用BamH I/HindIII双酶切法筛选接入正确外源基因的转化子。以RapidPlasmid DNA Daily Mini-prep Kit小量制备质粒，并经DNA测序确认其序列，得阳性克隆pSIMPLE-PG4。
2、抗菌肽PG4原核表达载体的构建
pGEX-2TK载体是GE公司pGEX系列原核表达载体中的一员，融合有谷胱甘肽-s-转移酶(GST)标记蛋白，GST天然大小为26KD，是一个高度可溶的蛋白，可以增加外源蛋白的可溶性；另外它可以在大肠杆菌中大量表达，起到一种促进表达量提高的作用。外源蛋白与GST融合形成融合蛋白，在非变性条件下通过亲和层析作用在固定化的谷胱甘肽上加以纯化，然后利用具有识别特异位点的溴化氰的切割作用，将融合蛋白中的GST成分除掉。GST分子量较大，对于表达分子量小的目标蛋白来说具有很大优势-融合蛋白分子量较大的比较不容易被降解。本发明将从JM109细胞中克隆出的pSIMPLE-PG4质粒双酶切，构建抗菌肽PG4原核表达载体(pGEX-PG4)(图1)。
(1)用BamHI和HindIII对质粒pSIMPLE-PG4和pGEX-2TK进行双酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别切取含有目的DNA片段的琼脂块，利用DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)(购自碧云天公司)纯化回收DNA片段。
(2)将上述纯化的插入片段和载体依照TaKaRa公司连接反应操作说明进行连接反应。连接产物转入大肠杆菌DH5α(购自Novagen)中，用氨苄青霉素进行克隆选择。将克隆株在2ml LB培养基中过夜培养，用碱裂解法提取重组质粒，经双酶切进行琼脂糖凝胶电泳鉴定正确。将该质粒命名为pGEX-PG4。
3、重组融合多肽的表达和纯化
(1)重组融合多肽的小量表达和鉴定
将电泳验证的pGEX-PG4质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(购自Novagen)，挑取单菌落接种于2ml LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，然后以1∶100接种于含氨苄青霉素的3ml TB液体培养基中培养，当OD600达到0.8～0.9左右时，加入诱导剂IPTG诱导蛋白质表达，IPTG终浓度为0.1mM，诱导温度为28℃。诱导培养5小时，期间每间隔1h取样一次，经离心收集菌体(8000g，4℃离心10分钟)，用Tris-HCl(pH6.8)缓冲液重悬菌体，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后进行考马斯亮蓝染色，分析诱导时间与表达量的关系。
SDS-PAGE电泳后凝胶图像分析系统观察到，诱导后产生分子量为28KD的特异条带，且随诱导时间的延长，表达量逐渐增加，至4h达到最大表达量。
(2)重组融合多肽的发酵培养
以1∶100的比例接种表达重组多肽的工程菌于1升含氨苄青霉素的TB培养基中，37℃发酵培养约2.5h，至细菌培养液的OD600为0.8左右，加入IPTG(终浓度0.1mM)，在28℃进行诱导表达重组多肽，继续发酵培养4h。8000g离心10分钟收集菌体。以5倍湿重体积将菌体重悬于PBS(pH7.4)缓冲液中，在冰浴条件下进行超声波破碎菌体(连续工作2sec，间隔4sec，共处理30min)。4℃下，将破碎后的菌体溶液45000g离心20min，分别收集上清液和破碎沉淀。进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后进行考马斯亮蓝染色，检测多肽的可溶性质(图2)。
图2中，泳道1是未诱导的BL21-PG4工程菌的电泳条带；泳道2是诱导3h后菌体的电泳条带；泳道3是诱导4h后破碎上清的电泳条带；泳道4是诱导4h后破碎沉淀的电泳条带。
SDS-PAGE电泳后凝胶成像观察表明，多肽为可溶性表达。
(3)重组融合多肽的纯化
将破碎后的菌体上清液上样GST层析柱，流速为0.5-1ml/min；待样品自然流过柱床后，10倍柱床体积的Wash buffer(20mM Tris-HCl，pH8.0，0.1M NaCl，10％glycerol，1％Triton X-100)洗树脂以除去非结合的多肽和细菌的其他可溶性成分；然后以3倍柱床体积的elution buffer(10mMglutathione，20mM Tris-HCl，pH8.0，需新鲜配制)洗脱，收集洗脱液。于透析袋中透析以除去多肽溶液中的小分子成分。
SDS-PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色可见，经纯化后得到分子量为28KD的单一条带(图3)。
图3中，泳道1是IPTG诱导的BL21-PG4工程菌经超声破碎后可溶性多肽；泳道2是Wash buffer洗脱液；泳道3是经GSH-Sepharose柱分离纯化得到的GST-PG4融合多肽；泳道4是蛋白质分子量标准。
(4)重组融合多肽的溴化氰化学切割和重组抗菌肽PG4的纯化
透析脱盐后的融合多肽冻干后，重溶于70％甲酸溶液，多肽终浓度为2mg/ml，加入等体积的CNBr溶液(CNBr溶于70％甲酸，终浓度为0.3g/ml)混合均匀。用铝箔包住装有反应混合物的离心管避光，于通风橱中室温反应24h。于反应混合物中加入等体积的纯水结束反应，样品真空抽干。
抽干后样品重溶于PBS(pH7.4)缓冲液中，同上述操作方法，上样GST层析柱。收集流出相，得到重组多肽PG4，然后elution buffer洗脱，收集洗脱液，得到GST标记多肽，重组多肽PG4和GST标记多肽分别经透析除盐纯化。GST-PG4融合多肽和GST标记多肽进行SDS-PAGE凝胶电泳，检验是否切割完全。
SDS-PAGE电泳验证，考马斯亮蓝染色可见，切割后的融合多肽向前迁移一段距离，在分子量约26KD处出现单一特异条带，说明融合多肽大部分被切开。
实施例2
重组抗菌肽PG4抗菌性测试
1、重组抗菌肽PG4抗大肠杆菌E.coli测试：
(1)取直径为1cm的过滤纸两片，紫外照射灭菌(照射时间为30分钟)，分别用无菌水和重组抗菌肽PG4溶液(0.1mg/mL)浸润。在图4中，依次为试样1和试样2；
(2)将上述两个样品分别放至无菌细胞培养皿中，随后各加入50μL大肠杆菌培养液(106CFU/mL)，并在37℃恒温箱中培养2小时；
(3)向每个培养皿中加入1mL磷酸缓冲液，并用超声波清洗(64kHz，2分钟)，然后各取50μL梯度稀释，把50μL不同稀释度的细菌缓冲液加到培养皿中，用涂布棒将菌液均匀涂布在固体琼脂培养基上，并置于37℃恒温箱中培养24小时；
(4)根据固体琼脂培养基上菌落的数目来计算各个样品的抗菌能力。
其中，重组抗菌肽PG4可以有效杀死95.7％的大肠杆菌E.coli。
2、重组抗菌肽PG4抗金黄葡萄球菌S.aureus测试：
(1)取直径为1cm的过滤纸两片，紫外照射灭菌(照射时间为30分钟)，分别用无菌水和重组抗菌肽PG4溶液(0.1mg/mL)浸润。在图5中，依次为试样1和试样2；
(2)将上述两个样品分别放至无菌细胞培养皿中，随后各加入50μL金黄葡萄球菌培养液(106CFU/mL)，并在37℃恒温箱中培养2小时；
(3)向每个培养皿中加入1mL磷酸缓冲液，并用超声波清洗(64kHz，2分钟)，然后各取50μL梯度稀释，把50μL不同稀释度的细菌缓冲液加到培养皿中，用涂布棒将菌液均匀涂布在固体琼脂培养基上，并置于37℃恒温箱中培养24小时；
(4)根据固体琼脂培养基上菌落的数目来计算各个样品的抗菌能力。
其中，重组抗菌肽PG4可以有效杀死90.9％的金黄葡萄球菌S.aureus。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO 1：
15 Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Gly Trp Ile Cys Phe Cys
18 Val Gly Arg
SEQID NO 2：
60 attcagggat ccatgcgcgg tggccgtctg tgctattgtc gcggttggat ctgcttctgt
84 gtgggtcgtt aaaagcttaa ttcg
SEQ ID NO 3：
60 cgaattaagc ttttaacgac ccacacagaa gcagatccaa ccgcgacaat agcacagacg
84 gccaccgcgc atggatccct gaat
SEQ ID NO 4：
15 Ile Gln Gly Ser Met Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Gly
27 Trp Ile Cys Phe Cys Val Gly Arg Lys Leu Asn Ser