发酵乳的制造方法和发酵乳饮料食品.pdf

提供可以在发酵乳中高效率地产生具有降压作用等有用功能的特定的肽、而且可以简便赋予发酵乳饮料食品优异风味或降压作用等功能性的发酵乳的制造方法；和使用该发酵乳的可以赋予风味优异和功能性的发酵乳饮料食品。本发明的制造方法的特征在于：将用含有木瓜蛋白酶等特定蛋白酶的蛋白酶(1)酶解兽乳酪蛋白的步骤(A)、和将兽乳酪蛋白等进行乳酸菌发酵的步骤(B)组合来生成VPP、IPP和YP。本发明的发酵乳饮料食品含有利用本发明的制造方法得到的发酵乳或其浓缩物，该饮料食品的特征在于：以饮用时换算计，含有特定量以上的VPP、IPP和YP。

权利要求书
1.  发酵乳的制造方法，其特征在于：将用蛋白酶(1)酶解兽乳酪蛋白的步骤(A)、和将兽乳酪蛋白和/或兽乳酪蛋白的上述蛋白酶(1)的酶解产物进行乳酸菌发酵的步骤(B)组合来生成Val-Pro-Pro、Ile-Pro-Pro和Tyr-Pro中的至少一种，上述蛋白酶(1)含有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和属于显示与上述酶有类似的酶反应的超家族的蛋白酶中的至少一种。

2.  权利要求1的制造方法，其中用含有上述蛋白酶(1)和乳酸菌两者的培养基对兽乳酪蛋白进行酶解和乳酸菌发酵，进行上述步骤(A)和步骤(B)。

3.  权利要求1的制造方法，其中上述蛋白酶(1)包含：将(Xaa)m-Val-Pro-Pro-(Xbb)n、(Xaa)m-Ile-Pro-Pro-(Xbb)n或(Xaa)m-Tyr-Pro-(Xbb)n表示的至少一种肽在(Xaa)m的羧基末端切断的蛋白酶，其中Xaa和Xbb独立表示任意的氨基酸；上述一种肽序列中的Xaa与其他肽序列中的Xaa可以相同或不同，上述一种肽序列中的Xbb和其他肽序列中的Xbb可以相同或不同；m和n为整数，当m为2以上时，Xaa可以相同或不同；当n为2以上时，Xbb可以相同或不同。

4.  权利要求1的制造方法，其中上述蛋白酶(1)包含属于木瓜蛋白酶亚科的蛋白酶。

5.  权利要求1的制造方法，其中上述蛋白酶(1)包含菠萝提取物和/或木瓜提取物中所含的蛋白酶。

6.  权利要求1的制造方法，其中上述乳酸菌为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgarius)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)中的至少一种。

7.  权利要求1的制造方法，其中在上述步骤(A)和步骤(B)中，在温度25～45℃下进行酶解和乳酸菌发酵。

8.  权利要求1的制造方法，其中使用酪蛋白浓度为3～10％重量的兽乳作为上述兽乳酪蛋白，且相对于酪蛋白量，上述蛋白酶(1)的添加量为0.005～0.1％重量。

9.  发酵乳饮料食品，该饮料食品包含利用权利要求8的制造方法得到的发酵乳或其浓缩物，其中含有1.2mg/100ml以上的Val-Pro-Pro、1.0mg/100ml以上的Ile-Pro-Pro和0.5mg/100ml以上的Tyr-Pro。

说明书发酵乳的制造方法和发酵乳饮料食品
技术领域
本发明涉及可以在发酵乳中高效率地产生具有降压作用等有用功能的Val-Pro-Pro、Ile-Pro-Pro和Tyr-Pro等肽、而且可用作发酵乳饮料食品且可以简便赋予优异风味等的发酵乳的制造方法和使用由该方法得到的发酵乳的发酵乳饮料食品。
背景技术
以往，显示降压作用等有用功能的肽已从食品用蛋白质的酶解产物或发酵食品中分离出来并已有报道。特别是羧基末端具有Pro残基的肽，其往往在机体内调节血压，具有所谓的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性，在机体内表现出降压作用。非专利文献1和2中报道了在显示降压作用的肽中，乳蛋白(酪蛋白)的分解肽-Val-Pro-Pro、Ile-Pro-Pro或Tyr-Pro对自发性高血压大鼠显示出特别强的血压抑制效果。
作为上述功能性肽的制备方法，例如，专利文献1中记载了用瑞士乳酸菌(Lactobacillus helveticus)等乳酸菌使乳成分发酵来进行制备的方法。另外，专利文献2～4中提案了通过酶解主要乳蛋白(酪蛋白)来进行制备的方法。
在专利文献2～4所示酶解的方法中，通过适当设定酶的使用量或条件，可以高效率地生产上述功能性肽。
但是，欲将通过上述酶解得到的功能性肽用于含有高浓度该肽的、风味良好的发酵乳食品等乳加工制品时，必需在酶解之后进行纯化、浓缩、粉末化等，不可避免地导致制造工序的繁杂化。
另一方面，在上述利用乳酸菌发酵的方法中，可以直接得到可作为饮料食品或其原料的发酵乳，在该发酵乳中可以产生功能性肽，因此未必进行功能性肽的纯化、浓缩、粉末化等，可以将所得发酵乳容易地用于乳加工制品等中。
但是，在专利文献1所记载的利用乳酸菌发酵的方法中，发酵乳中含有大量未分解的酪蛋白，在直接得到的发酵乳中功能性肽的含有比例低，因此希望开发进一步改善功能性肽的生产效率的方法。
因此，专利文献5中提案了可以改善显示降压作用等的功能性肽的生产效率和可以更高效率地分解酪蛋白的特定乳酸菌、以及使用该乳酸菌的发酵乳。
然而，非专利文献3中报道了：为了以Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro作为有效成分来得到降压作用，以这些肽的总计换算值计，成人每天的有效量为3.4mg以上。例如，使用上述专利文献5所记载的利用乳酸菌发酵得到的发酵乳来制造含有上述有效量肽的具有降压功能的最终制品时，必需使用60ml以上的该发酵乳来制造最终制品。
另一方面，近年来在发酵乳饮料食品方面要求开发进一步改善风味效果的技术。因此，为了更容易地开发发酵乳饮料食品的配方，得到风味更好的功能性食品材料或提高功能性肽的有效量的发酵乳饮料食品，希望开发可以进一步提高乳酸菌发酵乳内的功能性肽浓度的发酵乳的制造方法等。
专利文献1：日本专利第2782142号公报
专利文献2：日本特开平6-128287号公报
专利文献3：日本特开2001-136995号公报
专利文献4：WO2005/012542号小册子
专利文献5：日本专利第3028411号公报
非专利文献1：Nakamura等人.J.Dairy Sci.78：1253-1257页(1995)
非专利文献2：Yamamoto等人.J.Dairy Sci.82：1388-1393页(1995)
非专利文献3：Hata et al.Am J.Clin.Nutr.，767-771页(1996)
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于提供可以在发酵乳中高效率地产生具有降压作用等有用功能的特定的肽、而且可以简便赋予发酵乳饮料食品优异风味或降压作用等功能性等的发酵乳的制造方法；和使用该发酵乳的、可以赋予风味优异和功能性的发酵乳饮料食品。
解决问题的方法
根据本发明，提供发酵乳的制造方法，其特征在于：将用蛋白酶(1)酶解兽乳酪蛋白的步骤(A)和将兽乳酪蛋白和/或兽乳酪蛋白的上述蛋白酶(1)的酶解产物进行乳酸菌发酵的步骤(B)组合来生成Val-Pro-Pro(以下，有时简称为VPP)、Ile-Pro-Pro(以下，有时简称为IPP)和Tyr-Pro(以下，有时简称为YP)中的至少一种，上述蛋白酶(1)含有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和属于显示与上述酶有类似的酶反应的超家族的蛋白酶中的至少一种。
根据本发明，还提供发酵乳饮料食品，该饮料食品包含：在上述制造方法中使用酪蛋白浓度为3～10％重量的兽乳作为上述兽乳酪蛋白、相对于酪蛋白量上述蛋白酶(1)的添加量为0.005～0.1％重量而得到的发酵乳或其浓缩物，该饮料食品的特征在于：含有1.2mg/100ml以上的Val-Pro-Pro、1.0mg/100ml以上的Ile-Pro-Pro和0.5mg/100ml以上的Tyr-Pro。
发明效果
本发明的发酵乳制造方法，由于将上述步骤(A)和步骤(B)组合，因此可以在发酵乳中高效率地产生具有降压作用等有用功能的特定肽。而且可以简便赋予发酵乳饮料食品优异风味或降压作用等功能性等。特别是通过同时进行步骤(A)和(B)使制造步骤简化，同时还可以提高特定肽的生产效率。
本发明的发酵乳饮料食品，由于使用由本发明的制造方法得到的、含有大量具有有用功能的特定肽的发酵乳，因此可以作为风味调整容易、可赋予风味优异和功能性的发酵乳饮料食品。

附图简述
图1是表示实施例4中在不同菠萝蛋白酶添加量下VPP和IPP肽的生产量的图。
实施发明的最佳方式
以下，进一步详细说明本发明。
本发明的制造方法包括用特定的蛋白酶(1)酶解兽乳酪蛋白的步骤(A)。
上述特定的蛋白酶(1)包含：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和属于显示与上述酶有类似的酶反应的超家族的蛋白酶中的至少一种。该蛋白酶(1)包含：特别是对具有VPP、IPP、YP等肽序列的β-酪蛋白显示特异性，补足和强化在通常的乳酸菌发酵中在兽乳酪蛋白的初期分解加工方面认为不足的蛋白酶活性，可以提高具有所需功能性的肽的生成率的蛋白酶。
上述木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和属于显示与上述酶有类似的酶反应的超家族的蛋白酶通常包含：将(Xaa)m-Val-Pro-Pro-(Xbb)n、(Xaa)m-Ile-Pro-Pro-(Xbb)n或(Xaa)m-Tyr-Pro-(Xbb)n表示的至少一种肽在(Xaa)m的羧基末端切断的蛋白酶。其中，Xaa和Xbb独立表示任意的氨基酸。上述一种肽序列中的Xaa与其他肽序列中的Xaa可以相同或不同，上述一种肽序列中的Xbb和其他肽序列中的Xbb可以相同或不同。m和n为整数，当m为2以上时，Xaa可以相同或不同。另外，当n为2以上时，Xbb可以相同或不同。
木瓜蛋白酶可以使用木瓜提取物，菠萝蛋白酶可以使用菠萝提取物。
作为属于上述超家族的蛋白酶，可以列举如：ananain、菠萝酶(ananase)、extranase、pinase、凤梨酶(pineapple enzyme)、traumanase、番木瓜酶(papayotin)、summetrin、velardon、木瓜肽酶(papaya peptidase)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、番木瓜蛋白酶(papaya proteinase)、PPIV、caricain、蛋白酶ω(proteinase omega)、属于肽酶家族C1的酶等象木瓜蛋白酶一样在活性中心具有半胱氨酸的植物性半胱氨酸肽酶等，特别优选列举属于木瓜蛋白酶亚科的蛋白酶。还包含活性中心与上述酶极其相似而认为具有类似基质特异性的组织蛋白酶等。
用于步骤(A)的蛋白酶(1)可以是多种酶的混合物。为了提高分解性还可以包含除上述以外的特定蛋白酶。
蛋白酶(1)还可以使用市售品，例如可以使用：商品名木瓜蛋白酶(Papain F)(天野Enzyme公司制)、商品名VERON L10(樋口商会制)、商品名菠萝蛋白酶(Bromelain)(Great Food Co.，Ltd.制或Genencor协和制)、商品名木瓜蛋白酶W-40(Papain W-40)(天野Enzyme公司制)、食品用精制木瓜蛋白酶(Nagase Chemtex公司制)。
对用于步骤(A)或后述步骤(B)的兽乳酪蛋白没有特别限定，只要是包含兽乳酪蛋白的食品原料即可，上述兽乳酪蛋白具有具降压作用等功能性的VPP、IPP和YP肽序列。可以列举如：以牛乳为代表的兽乳、脱脂粉乳、加工乳、兽乳酪蛋白提取物。还可以列举：在上述原料中进一步添加了维生素类、核酸、酵母提取物等乳酸菌发酵助剂的食品原料。
在用于本发明的制造方法的兽乳酪蛋白中，对酪蛋白浓度没有特别限定，为了更有效率地获得本发明所需的效果，酪蛋白浓度通常为3～15％重量左右，优选为3～10％重量。
在步骤(A)中，蛋白酶(1)的使用量可以根据效价适当决定，使具有所需效果，但由于步骤(A)的酶解与后述步骤(B)的乳酸菌发酵组合，因此通常以少于仅用蛋白酶酶解兽乳酪蛋白所需的使用量就可达到目的。例如，优选相对于兽乳酪蛋白量，蛋白酶(1)为0.005～0.1％重量的比例。蛋白酶(1)不足0.005％重量时，有可能无法得到本发明所需的效果；蛋白酶(1)超过0.1％重量时，生成的肽类过剩，有可能损及风味。
在步骤(A)中，酶解条件可以在蛋白酶(1)的最适温度和pH下进行，通常可以在25～45℃下、维持在中性pH左右来进行。酶解时间可以根据蛋白酶(1)的量和效价来适当选择。
当在后述步骤(B)之前进行步骤(A)时，酶解后可以在60～100℃左右使蛋白酶(1)失活，接下来供给步骤(B)。当同时进行步骤(A)和后述步骤(B)、即用含有上述蛋白酶(1)和乳酸菌两者的培养基对兽乳酪蛋白进行酶解和乳酸菌发酵时，通常优选在乳酸菌的最适增殖条件温度25～45℃下、乳酸菌发酵时间通常为5～30小时的条件下进行。此时，也可以通过增加酶添加量来缩短发酵时间。
本发明的制造方法包括：将兽乳酪蛋白和/或兽乳酪蛋白的上述蛋白酶(1)的酶解产物进行乳酸菌发酵的步骤(B)。
作为用于步骤(B)的兽乳酪蛋白，可以使用上述兽乳酪蛋白，当使用该兽乳酪蛋白时，如上所述，同时施行步骤(A)和步骤(B)。另一方面，通过步骤(B)对上述蛋白酶(1)的酶解产物进行乳酸菌发酵时，可以在步骤(A)结束后施行步骤(B)。
作为用于步骤(B)的乳酸菌，可以列举出：属于链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属等的乳酸菌，优选乳杆菌属。具体可以列举如：保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)等。从可以更有效率地产生VPP、IPP、YP的角度考虑，特别优选瑞士乳杆菌或嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌。使用时也可以使用两种以上的上述乳酸菌。
作为上述保加利亚乳杆菌的菌株，优选菌体外蛋白酶活性高的菌株。例如，优选以Twining等人的方法(Twining，S.Anal.Biochem.1433410(1984))为基础的、按照Yamamoto等人的方法(Yamamoto，N.等，J.Biochem(1993)114，740)测定的U/OD590的值显示400以上的菌株。
可以列举如：瑞士乳杆菌CM4(Lactobacillus helveticus CM4)菌株(独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6保藏号：FERM BP-6060，保藏日1997年8月15日)(以下称作CM4)。该CM4根据专利手续上的微生物保藏国际认定相关的布达佩斯条约，以上述保藏号登记，该菌株已经获得专利。
上述乳酸菌优选以事先预培养的活性足够高的引子(starter)的形式使用。初始菌数优选为105～109个/ml左右。
为了使所得发酵乳的风味等更加良好，还可以在上述乳酸菌中结合使用酵母进行步骤(B)。对酵母的菌种没有特别限定，例如优选啤酒酵母等酵母菌属酵母。酵母的含有比例可以根据其目的适当选择。
另外，在乳酸菌发酵中，还可以添加各种乳酸菌发酵辅助剂。该辅助剂可以列举如：氨基酸、维生素、矿物质、核酸、盐类、微生物提取物、去垢剂。
无论步骤(B)是与步骤(A)同时进行或在步骤(A)之后进行，在步骤(B)中，乳酸菌发酵条件均优选在乳酸菌的最佳增殖条件温度、通常在25～45℃下进行5～30小时。为了促进发酵优选进行中和培养。
按照本发明的制造方法，仅利用不进行步骤(A)的普通乳酸菌发酵也可以得到含有大量VPP、IPP、YP中的任一种的发酵乳。而且，由于包括步骤(B)，因此可直接得到作为发酵乳的包含VPP、IPP、YP等肽的产物。并且，无论是在步骤(A)之后进行步骤(B)，还是同时进行步骤(A)和步骤(B)，都期待着VPP、IPP、YP中至少一种的生成量较仅进行乳酸菌发酵时多。
本发明的发酵乳饮料食品包含：在上述制造方法中使用酪蛋白浓度为3～10％重量的兽乳作为上述兽乳酪蛋白、相对于酪蛋白量上述蛋白酶(1)的添加量为0.005～0.1％重量而得到的发酵乳或其浓缩物，该饮料食品中含有1.2mg/100ml以上的VPP、1.0mg/100ml以上的IPP和0.5mg/100ml以上的YP。
尚需说明的是，本发明的发酵乳饮料食品中所含有的特定肽量可以通过使用各种HPLC法的方法来测定，但作为用于简易评价更多种肽的一种方法，使用LC/MS法。LC/MS分析法使用已经报道的Matsuura等人的方法(Milchwissenschaft，2004，60，24～27)。
本发明的发酵乳饮料食品包含利用本发明的制造方法得到的上述发酵乳或其浓缩物，例如可以作为酸乳、乳酸菌饮料、乳制品乳酸菌饮料、其他各种加工乳饮料食品，可以制成常温乳饮料、冷冻乳饮料、普通食品、营养补助食品等形式。
在本发明的发酵乳饮料食品中，从营养平衡或改善风味的角度考虑，根据其形态可以添加各种辅助添加剂。可以列举如：碳水化合物、脂质、维生素类、矿物质类、营养添加剂、甜味剂、香料、色素、质地改善剂等。
本发明的发酵乳饮料食品含有上述VPP、IPP、YP等已知具有降压作用的特定肽，因此可以作为特定保健用食品等功能性饮料食品或标示了用于降压作用的效能的功能性饮料食品。
将本发明的发酵乳饮料食品作为标示了用于降压作用的效能的功能性饮料食品时，一次的摄取量以所含发酵乳换算量计，通常为0.1ml/kg体重～5.0ml/kg体重，特别优选为0.3ml/kg体重～0.6ml/kg体重。
实施例
以下，通过实施例和比较例来进一步具体说明本发明，但本发明的范围并不受限于此。
实施例1～3和比较例1～6
在37℃下，将CM4用100℃下巴氏灭菌的含有固体成分为9％重量的脱脂粉乳的乳培养基预培养20小时，制备乳酸菌引子。接着，向30ml新准备的同样为9％重量的脱脂粉乳中添加上述引子，使达到3％重量，再分别添加0.5mg以下成分：实施例1中添加商品名木瓜蛋白酶F(天野Enzyme公司制，来源于番木瓜(Carica papaya L.))、实施例2中添加商品名精制木瓜蛋白酶(Nagase生化学公司制，来源于番木瓜)、实施例3中添加商品名菠萝蛋白酶F(天野Enzyme公司制，来源于菠萝(Ananas comosus M.))、比较例1中添加商品名蛋白酶P(Protease P)(天野Enzyme公司制，来源于米曲霉(Aspergillus oryzae))、比较例2中添加商品名蛋白酶A(天野Enzyme公司制，来源于米曲霉)、比较例3中添加商品名Newrase F3G(天野Enzyme公司制，来源于得氏根霉(Rhizopusniveus))、比较例4中添加商品名Neutrase(Novozymes公司制，来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens))、比较例5中添加商品名Sumizyme FP(新日本化学工业公司制，来源于米曲霉)。作为比较例6，准备未添加蛋白酶而仅添加了乳酸菌引子的脱脂粉乳。接下来，分别在32℃下保持24小时，进行酶解和乳酸菌发酵或仅进行乳酸菌发酵，来制备各发酵乳。
将所得各发酵乳以10000g的离心力离心10分钟，用LC/MS(岛津制作所制，型号LCMS2010A)分析1ml培养上清液中的VPP和IPP肽量。结果如表1所示。
比较例7～9
向30ml 100℃下巴氏灭菌的含有固体成分为8％重量的脱脂粉乳的乳培养基中分别添加0.5mg以下成分：比较例7中添加实施例1中使用的商品名木瓜蛋白酶F(天野Enzyme公司制，来源于番木瓜)、比较例8中添加实施例2中使用的商品名精制木瓜蛋白酶(Nagase生化学公司制，来源于番木瓜)、比较例9中添加实施例3中使用的商品名菠萝蛋白酶F(天野Enzyme公司制，来源于菠萝)。接下来，分别在32℃下保持24小时，进行酶解，来制备各酶解产物。对于所得酶解产物，与实施例1同样分析VPP和IPP肽量。结果如表1所示。
尚需说明的是，在比较例7～9得到的酶解产物中检测包含Val-Pro-Pro或Ile-Pro-Pro序列的肽的存在并分析其肽序列时，在与实施例1和2使用相同蛋白酶的比较例7和8中检测到Val-Pro-Pro-Phe-Leu和Ile-Pro-Pro-Leu-Thr，在与实施例3使用相同蛋白酶的比较例9中检测到Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gln-Pro-Glu-Val-Met和Ile-Pro-Pro-Leu-Thr。
由该结果可以推测：在实施例1～3中，通过蛋白酶的酶解，以Xaa-Val-Pro-Pro-(Xbb)n、Xaa-Ile-Pro-Pro-(Xbb)n表示的肽的氨基末端侧的氨基酸残基(Xaa)被切断；通过实施例1～3的乳酸菌发酵，相同肽的羧基末端侧的氨基酸残基((Xbb)n)被切断，在发酵乳中有效率地产生了Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro。
[表1]
  蛋白酶的商品名  乳酸菌  VPP量  (μg/ml)  IPP量  (μg/ml)  实施例1  木瓜蛋白酶F  CM4菌株  39  41  实施例2  精制木瓜蛋白酶  CM4菌株  35  42  实施例3  菠萝蛋白酶F  CM4菌株  45  43  比较例1  蛋白酶P  CM4菌株  2  3  比较例2  蛋白酶A  CM4菌株  2  4  比较例3  Newrase F3G  CM4菌株  5  3  比较例4  Neutrase  CM4菌株  4  6  比较例5  Sumizyme  CM4菌株  7  6  比较例6  -  CM4菌株  26  18  比较例7  木瓜蛋白酶F  -  0  0  比较例8  精制木瓜蛋白酶  -  0  0  比较例9  菠萝蛋白酶F  -  0  0
由表1确认：在仅通过CM4的乳酸菌发酵而得到的比较例6的发酵乳中，VPP和IPP的生产效率高。相对于此，在含有木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶的特定蛋白酶组合的实施例1～3的发酵乳中，可以确认VPP和IPP的产生量为比较例1的1.7～1.9倍。
另一方面，与不含用于本发明的特定蛋白酶的蛋白酶组合的比较例1～5的发酵乳，与仅通过CM4菌株的乳酸菌发酵得到的比较例6的发酵乳相比，VPP和IPP的产生量极少。特别是在使用已知具有由兽乳酪蛋白产生VPP和IPP的活性的来源于米曲霉的蛋白酶的比较例1、2和5的发酵乳中，VPP和IPP的产生量极少。并且，在仅使用实施例1～3中使用的蛋白酶的比较例7～9的酶解产物中，没有确认到VPP和IPP的产生。
因此，通过将特定蛋白酶的酶解和乳酸菌发酵组合，可以确认到由它们的结合使用产生的协同效应。
实施例4
除了将蛋白酶中的菠萝蛋白酶量替换为0.1mg、0.25mg和1.0mg以外，与实施例3同样制备发酵乳，与实施例3同样分析VPP和IPP肽量。结果如图1所示。尚需说明的是，图1中也显示了蛋白酶中的菠萝蛋白酶量为0.5mg的实施例3的结果和未添加蛋白酶的比较例6的结果。图1中，各左侧的棒表示VPP含量，各右侧的棒表示IPP含量。
其中，“相对于30ml发酵乳添加0.1、0.25、0.5和1mg菠萝蛋白酶”是指，相对于发酵乳中的酪蛋白量，分别添加0.008％重量、0.021％重量、0.042％重量和0.084％重量的蛋白酶。
由图1可以确认：与未添加菠萝蛋白酶时相比，添加菠萝蛋白酶时两肽的生产效率提高。特别是蛋白酶添加量为0.25～1.0mg范围时，可以确认VPP和IPP肽的生产效率为未添加时的约1.5倍左右。
实施例5和比较例10
在37℃下，将CM4用95℃巴氏灭菌的含有固体成分为9％重量的脱脂粉乳的乳培养基预培养24小时，制备乳酸菌引子。接着，向1升新准备的同样含有9％重量脱脂粉乳的培养基中添加上述引子，使达到3％重量。并且，在实施例5中添加10mg商品名菠萝蛋白酶F(天野Enzyme公司制，来源于菠萝)。另外，作为比较例10还准备了未添加蛋白酶而仅添加有乳酸菌引子的脱脂粉乳。接下来，分别在32℃下保持20小时，进行酶解和乳酸菌发酵或仅进行乳酸菌发酵，制备各发酵乳。
向所得各发酵乳中添加稳定剂和香料，分别制备发酵乳含有比例最终含有约60％重量和30％重量的120g发酵乳饮料。按照实施例1分析所得各发酵乳饮料中的VPP、IPP和YP量。并测定各发酵乳的酸度。结果如表2所示。
[表2]

由表2可知：在仅用CM4进行乳酸菌发酵的、比较例10的混合有约60％重量发酵乳的发酵乳饮料中，具有降压作用的肽-VPP和IPP的总量为31μg/ml，因此120g中含有3.7mg的两种三肽。
另一方面，在添加菠萝蛋白酶进行发酵的、实施例5的混合有约60％重量发酵乳的发酵乳饮料中，同样计算时，120g中含有8.4mg的三肽。
另外，在比较例10的混合有约30％重量发酵乳的发酵乳饮料中，同样计算时，120g中含有1.9mg的三肽；相对于此，在实施例5的混合有约30％重量发酵乳的发酵乳饮料中，同样计算时，120g中含有4.3mg的三肽。另外，在动物试验中还确认了产生具有降压作用的YP。
可是，已知对于人而言，以VPP和IPP两种肽得到降压作用的一次给药的最小有效量以VPP换算值＝VPP+1.7×IPP计为3.4mg以上，因此例如将比较例10的混合有约60％重量发酵乳的发酵乳饮料作为标示了降压作用的功能性食品时，必需制成120g制品。另一方面，使用实施例5的混合有约60％重量发酵乳的发酵乳饮料，即使60g左右也可充分达到上述最小有效量；另外，用实施例5的混合有约30％重量发酵乳的发酵乳饮料，即使发酵乳含量为比较例10的约60％重量制品的一半，也可以用120g制品达到上述最小有效量。另外，在评价实施例5和比较例10中制备的发酵乳自身的风味时，蛋白酶添加与否，风味并没有明显不同。
由以上结果可知：使用了由本发明的制造方法得到的发酵乳的发酵乳饮料，可以以少于以往由CM4发酵的发酵乳使用量来制造标示了降压作用的功能性食品，因此大大扩大了最终制品制造中风味设计的配合上的限制范围，从而可以制造在风味方面品质高的制品。
参考例1
为了确认不同于瑞士乳杆菌的乳酸菌种能否由上述实施例1和2、比较例7和8中检测到的肽、Val-Pro-Pro-Phe-Leu和Ile-Pro-Pro-Leu-Thr生成Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro，研究向乳酸菌培养基中添加两种五肽进行培养时的Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro的生成量。菌株分别使用保加利亚乳杆菌JCM1002菌株(独立行政法人理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室日本国埼玉县和光市広沢2-1)、嗜酸乳杆菌JCM1132菌株(同上)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei ssp.casei)JCM1136菌株(同上)。
向乳酸菌用培养基-MRS培养基中加入化学合成的Ile-Pro-Pro-Leu-Thr和Val-Pro-Pro-Phe-Leu，使浓度分别为10μg/ml，和菌一起在37℃下培养4天后，用LC/MS测定上清组分中Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro的浓度。结果如表3所示。
[表3]
  VPP量  (μg/ml)  IPP量  (μg/ml) 瑞士乳杆菌CM4菌株  1.1  0.3 保加利亚乳杆菌JCM1002菌株  2.2  0.6 嗜酸乳杆菌JCM1132菌株  5.2  3.2 干酪乳杆菌JCM1136菌株  7.6  4.4
根据参考例1的结果，由于在所有菌株中均生成了Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro，因此可以期待与由酪蛋白生成Val-Pro-Pro-Phe-Leu和Ile-Pro-Pro-Leu-Thr的蛋白酶组合的上述乳酸菌的发酵乳含有Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro，判明所使用的乳酸菌并不限于瑞士乳杆菌。