艾可特耐思地作抗炎药.pdf

我们发现艾可特耐思地化合物的抗炎活性。此类化合物已经被广泛公开，并且可以具有下面的通式(I)，其中：R5是OH，烷氧基或烷酰氧基；R6是氢，烷基，链烯基，链炔基或芳基；R12是氢，烷基，链烯基，链炔基或芳基；R16是氢，烷基，链烯基，链炔基或芳基；R17是OH，烷氧基或烷酰氧基；R18是OH，烷氧基或烷酰氧基；R21是H、OH、CN或另一亲核性基团；和Ra是氢和Rb是选择性取代的氨基，或Ra和Rb构成羰基官能团＝O，或Ra、Rb与其所连的碳构成四氢异喹啉基。

权利要求书
1.  一种治疗炎症的方法，其包括施用有效量的通式(I)的艾可特耐思地化合物：

其中：
R5是OH，烷氧基或烷酰氧基；
R6是氢，烷基，链烯基，链炔基或芳基；
R12是氢，烷基，链烯基，链炔基或芳基；
R16是氢，烷基，链烯基，链炔基或芳基；
R17是OH，烷氧基或烷酰氧基；
R18是OH，烷氧基或烷酰氧基；
R21是H、OH、CN或另一亲核性基团；和
Ra是氢和Rb是选择性取代的氨基，或
Ra和Rb构成羰基官能团＝O，或
Ra、Rb与其所连的碳构成四氢异喹啉基。

2.  权利要求1的方法，其中所述的炎症是由选自慢性炎症疾病、自身免疫性疾病和动脉粥样硬化的疾病引起的。

3.  权利要求1的方法，其中在式(I)的艾可特耐思地化合物中，基团R5是烷酰氧基。

4.  权利要求1的方法，其中在式(I)的艾可特耐思地化合物中，基团R6是甲基。

5.  权利要求1的方法，其中在式(I)的艾可特耐思地化合物中，基团R12是甲基。

6.  权利要求1的方法，其中在式(I)的艾可特耐思地化合物中，基团R16甲基。

7.  权利要求1的方法，其中在式(I)的艾可特耐思地化合物中，基团R17是甲氧基。

8.  权利要求1的方法，其中在式(I)的艾可特耐思地化合物中，基团R18是OH。

9.  权利要求1的方法，其中在式(I)的艾可特耐思地化合物中，基团R21是H、OH或CN；和Ra是氢和Rb是酰氨基，或
Ra和Rb构成＝O，或
Ra、Rb与其所连的碳构成式(II)的基团：


10.  权利要求1的方法，其中所述的艾可特耐思地化合物是式(III)的化合物：

其中
Ra是氢和Rb是式-NHRf-的酰氨基，其中Rf是烷酰氨基，或
Ra和Rb构成＝O，或
Ra、Rb与其所连的碳构成式(II)的基团：

Rd是烷酰氨基；和
R21是H、OH或CN。

11.  权利要求10的方法，其中所述的艾可特耐思地化合物选自基团：



12.  通式(I)的艾可特耐思地化合物在制备用于上述权利要求所述方法中的药物中的应用：


13.  一种治疗炎症包括通式(I)的艾可特耐思地化合物和药用载体，

其中：
R5是OH，烷氧基或烷酰氧基；
R6是氢，烷基，链烯基，链炔基或芳基；
R12是氢，烷基，链烯基，链炔基或芳基；
R16是氢，烷基，链烯基，链炔基或芳基；
R17是OH，烷氧基或烷酰氧基；
R18是OH，烷氧基或烷酰氧基；
R21是H、OH、CN或另一亲核性基团；和
Ra是氢和Rb是选择性取代的氨基，或
Ra和Rb构成羰基官能团＝O，或
Ra、Rb与其所连的碳构成四氢异喹啉基。

说明书艾可特耐思地作抗炎药
本发明涉及抗炎药。更具体地，本发明涉及在一类已知的化合物中发现抗炎活性。
发明背景
单核细胞/巨噬细胞是先天免疫和适应性免疫的公认的重要因素。循环单核细胞是具有分化为不同形式的组织巨噬细胞的能力的万能前体。巨噬细胞起防卫外来入侵者的作用并且能够即时保护机体对抗病原体，并且发射信号用于募集其他免疫有效细胞并且呈递抗原给T淋巴细胞。另一方面，巨噬细胞还参与若干疾病的发作或进程，主要是通过其促炎和促血管生成介质的产生起作用。此类病症包括，例如，在若干慢性疾病(例如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、红斑狼疮)和肿瘤中存在的显著炎症。
在肿瘤位点，与肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)占据着浸润基质细胞的主要组分。TAM在肿瘤内具有复杂含糊的作用，正如巨噬细胞平衡假说中所述。事实上，用LPS和IFNγ刺激的巨噬细胞(也称作M1巨噬细胞或典型活化的巨噬细胞)具有潜能杀死肿瘤细胞，若干系列的证据也支持这种意见，即肿瘤微观环境内的巨噬细胞或者倾向于活化的巨噬细胞，或M2巨噬细胞。更加常见的，TAM是非细胞毒性的，并且产生若干生长和血管生成因子。TAM还生产免疫抑制分子(例如IL-10，TGFb)和许多炎症介质，包括趋化因子。趋化因子激活消化基质蛋白质并促进肿瘤扩散的基质金属蛋白酶。所以，TAM在肿瘤位点处的蓄积和炎症分子的连续表达实际上有利于肿瘤进程。
发明概述
艾可特耐思地(Ecteinascidin)化合物包括天然和合成化合物。它们具有稠合的五员环系和1，4桥。我们已经发现艾可特耐思地化合物中的抗炎活性。此类化合物已经被广泛描述，并且可以具有下面的通式(I)：

其中：
R5是OH，烷氧基或烷酰氧基；
R6是氢，烷基，链烯基，链炔基或芳基；
R12是氢，烷基，链烯基，链炔基或芳基；
R16是氢，烷基，链烯基，链炔基或芳基；
R17是OH，烷氧基或烷酰氧基；
R18是OH，烷氧基或烷酰氧基；
R21是H，OH，CN或另一亲核性基团；和
Ra是氢和Rb是选择性取代的氨基，或
Ra和Rb构成羰基官能团＝O，或
Ra、Rb与其所连的碳构成四氢异喹啉基。
所以，本发明提供一种治疗炎症的方法，该方法包括施用有效量的具有通式(I)的艾可特耐思地。
本发明还提供含有通式(I)的艾可特耐思地与药学可接受载体或稀释剂的药物。
本发明进一步提供具有通式(I)的艾可特耐思地在制备用于治疗炎症的药物中的应用。
发明详述
我们已经发现艾可特耐思地化合物具有抗炎活性。所以，本发明涉及定义如上的通式(I)的化合物的新临床适应症。
在这些化合物中取代基可以根据下列指导进行选择：烷基和烷氧基优选具有1-12个碳原子。一类更优选的烷基和烷氧基具有1-约6个碳原子，并且最优选1、2、3或4个碳原子。在本发明的化合物中特别优选甲基、乙基和丙基，包括异丙基。在本发明的化合物中特别优选甲氧基、乙氧基和丙氧基，包括异丙氧基。另一类更优选的烷基和烷氧基具有4-约12个碳原子，更优选5-约8个碳原子，和最优选5、6、7或8个碳原子。在本文中，术语烷基，除非另外指出，是指环状和非环状，尽管环状基团应包括至少三个碳环成员。
本发明的化合物中优选的链烯基和链炔基具有一个或多个不饱和键和2-约12个碳原子。一类更优选的链烯基或链炔基具有2-约6个碳原子，并且最优选2、3或4个碳原子。另一类更优选的链烯基或链炔基具有4-约12个碳原子，更优选5-约8个碳原子，和最优选5、6、7或8个碳原子。本文的术语链烯基和链炔基是指环状和非环状两者。
本发明化合物中适当的芳基包括单环和多环化合物，包括含有分开和/或稠合芳基的多环化合物。典型的芳基含有1-3独立或稠合环和6-约18个碳环原子。尤其优选芳基包括取代或未取代的苯基、萘基、联苯基、菲基和蒽基。
适当的烷酰氧基和烷酰基具有2-约20个碳原子，更优选2-约8个碳原子，仍然更优选2-约6个碳原子，更优选2个碳原子。另一类优选的烷酰氧基具有12-约20个碳，更优选14-约18个碳原子，和最优选15、16、17或18个碳原子。
上述基团可以在一个或多个可利用位置上被一个或多个适当的基团取代，例如OR′，＝O，SR′，SOR′，SO2R′，NO2，NH R′，N(R′)2，＝N-R′，NHCOR′，N(COR′)2，NHSO2R′，CN，卤素，OC(＝O)R′其中各个R′基团独立地选自H，OH，NO2，NH2，SH，CN，卤素，O，C(＝O)H，C(＝O)CH3，CO2H，取代或未取代的C2-C12烷基，取代或未取代的C2-C12链烯基，取代或未取代的C2-C12链炔基和取代或未取代的芳基。在本发明的化合物中适当的卤素取代基包括F，Cl，Br和I。
本发明的优选化合物是通式(I)的那些，其中一个或多个下列定义适用：
R5是烷酰氧基；
R6是甲基；
R12是甲基；
R16是甲基；
R17是甲氧基；
R18是OH；
R21是H，OH或CN；和
Ra是氢和Rb是酰氨基，或Ra与Rb构成＝O，或
Ra，Rb与其所连的碳一起构成式(II)的基团：

本发明化合物的实例包括公开在US 5,089,273、US 5,478,932、US5,654,426、US 5,721,362、US 6,124,293、US 5,149,804、US 09/546,877、US 5,985,876和WO 01/77115中的天然艾可特耐思地s，例如艾可特耐思地743和其他1，4桥连稠合艾可特耐思地化合物。
特别优选艾可特耐思地743，也称作ET743或艾可特耐思地743。ET743是由海洋被囊动物Bcteinascidinia turbinata产生的具有有效抗肿瘤活性的天然产物。临床实验中它是新的有效药物并且被证实在某些人实体瘤内具有抗癌活性，包括软组织肉瘤，乳腺和卵巢癌。
特别优选下式(III)的化合物：

其中
Ra是氢和Rb是式-NHRf的酰氨基，其中Rf是烷酰氨基，或
Ra与Rb构成＝O，或
Ra，Rb与其所连的碳构成式(II)：

Rd是烷酰氨基；和
R21是H，OH或CN。
烷酰氨基可以是乙酰基或更高级，例如高达C20。
所以，本发明的优选化合物包括：


和具有不同酰基的相关化合物。
本发明提供的药物是含有艾可特耐思地化合物和药学可接受载体的药物组合物。药物可以是常规形式，并且可以设计适当给药途径。
如本文所述，本发明的化合物是有效的抗炎药。所以，这些化合物可以用于治疗炎症造成的疾病，特别是治疗慢性炎症和自身免疫疾病(例如类风湿性关节炎、干燥综合症、克罗恩氏病)和用于动脉粥样硬化。
附图
附图1.实验组A：血液单核细胞、淋巴细胞和胸腺细胞用艾可特耐思地743培养的细胞生存活力。
附图1.实验组B：用艾可特耐思地743处理的单核细胞的细胞凋亡。
附图2.用M-CSF预处理部分保护单核细胞免于艾可特耐思地743的促细胞凋亡作用。
附图3.实验组A：艾可特耐思地743对单核细胞的的细胞毒性作用的动力学。
附图3.实验组B：巨噬细胞分化的抑制作用。
附图4.实验组A：来自相同供体的单核细胞和巨噬细胞对ET743的敏感性。
附图4.实验组B：由LPS和IFNγ或IL-4典型激活的巨噬细胞对于ET743的敏感性。
附图4.实验组C：肿瘤相关性巨噬细胞(TAM)对ET743的敏感性。
附图5.肿瘤患者中艾可特耐思地743诱发暂时性单核细胞减少症的体内融合作用。
附图6.艾可特耐思地743抑制单核细胞和巨噬细胞的CCL2(实验组A)和IL-6(实验组B)生成。
附图7.E艾可特耐思地743抑制TAM和新分离的肿瘤细胞中的CCL2(实验组A)和IL-6(实验组B)。
附图8.实验组A：艾可特耐思地743不影响单核细胞、巨噬细胞和TAM的TNF生成。
附图8.实验组B：CCL2和TNF复制在暴露在艾可特耐思地743下的LPS-刺激的单核细胞的实时-PCR。
附图9.实验组A：艾可特耐思地743、阿霉素、紫杉醇和Cis-DDP对单核细胞的细胞毒性。星号表示各个药物对于体外培养的肿瘤细胞系的IC50。
附图9.实验组B：用指定剂量的抗肿瘤药物处理的LPS-刺激的单核细胞的CCL2和TNF生成。
附图10.用艾可特耐思地743和其他艾可特耐思地化合物预处理的LPS-单核细胞的CCL2分泌。
发明的实施例
在此研究中我们证实，在药理学范围的浓度内，艾可特耐思地743对于骨髓世系具有选择性毒性并且诱发单核细胞/巨噬细胞的细胞凋亡。在非细胞毒性浓度下艾可特耐思地743显著抑制体外巨噬细胞分化并且诱发分化和降低选择性炎症细胞因子的生成。这些发现可以在多种人类疾病中以单核细胞/巨噬细胞为目标靶向的治疗途径。
此外，还测试了ET743、ET637衍生物A、ET637衍生物B、ET594、ET743衍生物A和ET745。它们还被证实可以减少选择性炎症细胞因子的生成。
材料和方法
细胞制备：
按照上述方法通过差异密度离心法在Ficoll和Percoll梯度上制备人血液单核细胞的纯化群(参见Allavena，P.，Piemonti，L.，Longoni，D.，Bernasconi，S.，Stoppacciaro，A.，Ruco，L.，和Mantovani，A.IL-10prevents the differentiation of monocytes to dendritic cells but promotestheir maturation to macrophages.Eur J Immunol，28：359-369，1998)。单核细胞通常85％ CD14+细胞。在Percoll梯度上按照上述方法得到纯化的T淋巴细胞(95％ CD3+)(参见Chieppa，M.，Bianchi，G.，Doni，A.，Del Prete，A.，Sironi，M.，Laskarin，G.，Monti，P.，Piemonti，L.，Biondi，A.，Mantovani，A.，Introna，M.，和Allavena，P.Cross-linking of themannose receptor on monocyte-derived dendritic cells activates an anti-infiammatory immunosuppressive program.J Immunol，171：4552-4560，2003)。人胸腺细胞分离自接受手术的儿童患者所提供的切除后胸腺。在Percoll梯度上通过针拔法和分离得到胸腺细胞。
将细胞以106个细胞/ml在完全培养基RPMI(Biochrom，Berlin，FRG)+10％ FCS(Hyclone，Logan，UT)中培养。通过单核细胞单核细胞-集落刺激因子(M-CSF)Peprotech(20ng/ml)培养5天得到体外分化的巨噬细胞。在某些实验中，巨噬细胞用LPS(100ng/ml)Sigma Aldrich，IFNγ(500IU/ml)或IL-4(20ng/ml)(Schering Plough)处理24小时。
由被诊断为卵巢腺癌的患者的腹水分离出纯化的T淋巴细胞(95％ CD3+)，该患者入住Obstetrics和Gynecology of the University ofMilan-Bicocca，S Gerardo医院的临床科。将腹水中所含的细胞离心并且通过Ficoll和Percoll的差异密度梯度法分离，并且如上所述成形粘附(参见Allavena，P.，Peccatori，F.，Maggioni，D.，Erroi，A.，Sironi，M.，Colombo，N.，Lissoni，A.，Galazka，A.，Meiers，W.，Mangioni，C1等.Intraperitoneal recombinant gamma-interferon in patients withrecurrent ascitic ovarian carcinoma：modulation of cytotoxicity和cytokine production in tumouw-associated effectors和of majorhistocompatibility antigen expression on tumour cells.Cancer Res，50；7318-7323，1990)。TAM和肿瘤细胞制剂的纯度通过形态学和表型分析通常65±10％。细胞用艾可特耐思地743在指定浓度下处理并且培养1-5天，如附图说明所述。在孵育阶段结束时收集细胞，洗涤并且用于DNA分析或功能实验。
细胞存活力的测定
通过DNA含量用流式细胞术分析细胞存活力
暴露处理的细胞用乙醇70％固定，在PBS中洗涤并且用在PBS中含有10ug/ml PI的碘化propidiurn(PI)溶液和25μl RNAse 10,000单位在避光下染色过夜。用FACS Calibur仪器在620nm下在至少20.000细胞/样本上评估PI掺杂(Becton Dickinson，Sunnyvale，CA，USA)，该仪器带有通带滤波器。通过用AnnexinV和PI染色检测细胞凋亡。用分别用于绿色{AnnexinV}和红色(PI)荧光的530和620nm的通带滤波器与570nM二色镜进行FACS分析。
表型分析
由免疫荧光进行细胞膜标记的表达并且通过流式细胞术分析。细胞与抗-CD 14、抗-CD 16、抗-CD68、抗-CD206(甘露糖醇受体)培养并且随后与所述FITC-山羊抗-小鼠Ig培养。分析至少10.000个细胞。
细胞因子的生产
将未处理的细胞或用艾可特耐思地743或其他抗肿瘤药物处理的细胞的上清液在培养24小时后收集并冷冻。单核细胞、巨噬细胞和TAM用100ng/ml LPS刺激以诱导最大的细胞因子生产。细胞因子CCL2、TNF和IL-6的测定按照制造商的说明通过特异性ELISA测定。
肿瘤患者
接受使用艾可特耐思地743的H期试验的患有肉瘤或卵巢癌的患者住院到意大利米兰的欧洲肿瘤学院。患者接受3个小时输注的艾可特耐思地743(1300mg/m2)。处理之前和输注(+3h)接受即时收集血样(40ml)。立刻处理血样并且Percoll纯化的单核细胞(通常106个细胞)用M-CSF(20ng/ml)培养5天。按照上述方法将分化的细胞收获、计数并分析表型表达。结果表示为标记阳性细胞的绝对数/10.000细胞。巨噬细胞分化的显著抑制是指来自相同患者的标记细胞相对于治疗之前收集的细胞而言减少50％。
实施例1
艾可特耐思地743对于单核吞噬细胞表现出选择性细胞毒性作用。
我们首先研究艾可特耐思地743处理对于人白细胞子集的体外存活力的影响。将血液单核细胞、淋巴细胞和胸腺细胞的纯化制剂与不同浓度的艾可特耐思地743一起培养48小时。通过DNA分析法和流式细胞术的碘化propidium(PI)染色法来评估细胞存活力。血液单核细胞的纯化制剂对于药物的细胞毒性作用高度敏感。培养48小时后2.5-5nM的致死剂量下具有剂量-依赖性的50％死亡率(IC50)(附图IA)。纯化的T淋巴细胞非常不敏感并且在5nM下全部存活。淋巴细胞的IC50是20nM。新分离的胸腺细胞(IC50＞40nM，附图IA)更加耐受。
事实上，暴露于艾可特耐思地743下对于Annexin V呈染色阳性的所有染色单核细胞表明药物引起细胞凋亡(附图IB)。单核细胞死亡率还通过DNA分析法以流式细胞术进行证实(附图2)。在M-CS，一种单核细胞的生长和分化因子F的存在下，观察到抵抗艾可特耐思地743的毒性作用的部分保护作用。M-CSF使单核细胞死亡在5nM艾可特耐思地743下培养48小时后由55％移动到30％，并且在10nM下处理24小时由65％移动到35％(附图2)。M-CSF只有在艾可特耐思地743加入之前或同时加入时才有效，而在给药4小时后不再有效。
艾可特耐思地743的细胞毒性作用的动力学分析是在M-CSF的存在下进行。细胞用M-CSF(20ng/ml)和不同浓度的艾可特耐思地743的处理。在指定时间收集样本并且试验DNA分析。在较高的浓度下，培养24小时之后已经观察到显著的毒性作用并且随着时间增高(附图3A)。较低的浓度(2.5nM)在5天后诱发40-50％死亡率。
我们随后研究了艾可特耐思地743对于已分化巨噬细胞的影响，该巨噬细胞得自用M-CSF体外培养5天的单核细胞。在最后48小时加入艾可特耐思地743造成显著的死亡率，但达到比与新分离单核细胞相比更低的程度。附图4A表示对比来自相同供体的单核细胞和巨噬细胞的敏感性的代表性试验。单核细胞通过与M-CSF(20ng/ml)培养分化为巨噬细胞。第3天，将艾可特耐思地743加入到培养物内并且培养48小时。结果显示由相同供体得到的单核细胞和巨噬细胞的对比结果。通过PI染色评估死亡率并且通过流式细胞术分析。在其他4个实验中得到类似结果。在一系列的4个不同试验中，分化的体外IC50是10nM。
我们随后测试对由LPS和IFNγ(或M1巨噬细胞)典型活化的巨噬细胞和另外由IL-4(或M2巨噬细胞)活化的巨噬细胞的艾可特耐思地743的敏感性。体外分化的巨噬细胞在存在或不存在艾可特耐思地743的条件下用LPS(100ng/ml)+IFNγ(500UI；ml)、11-4(20ng/ml)刺激48小时。通过PI染色评估死亡率并且通过流式细胞术分析。LPS-刺激和IL-4-刺激的巨噬细胞均对药物处理敏感，类似于非刺激的巨噬细胞(附图4B)。
我们还测试未处理卵巢腺癌患者的腹水分离出的肿瘤相关性巨噬细胞(TAM)。由患有卵巢癌的三名不同患者分离的TAM的富集制剂用艾可特耐思地743体外处理48小时。通过PI染色评估死亡率并且通过流式细胞术分析。TAM在体外10nM艾可特耐思地743的作用下被大量杀死并且死亡率为40-70％。附图4C表示由三个不同患者获得的结果。
所有这些试验证实人单核吞噬细胞在治疗范围内的浓度下对于艾可特耐思地743的细胞毒性高度敏感。应当注意即使在M-CSF的存在下，单核细胞不曾进行细胞周期的进程，这是通过DNA分析法利用流式细胞术得到的。所以艾可特耐思地743对于单核细胞的毒性作用独立于细胞周期并且为研究这种药物对于非复制细胞的生物作用提供了唯一的机会。
实施例2
艾可特耐思地743体外和体内抑制巨噬细胞分化的非细胞毒性浓度
为了研究艾可特耐思地743对巨噬细胞分化的影响，使用非细胞毒性剂量的药物。将单核细胞与M-CSF(20ng/ml)并且与亚细胞毒性浓度的艾可特耐思地743一起培养5天。通过间接免疫应该进行表型分析并且利用流式细胞术通过门控大的细胞进行分析。通常，平均65±15％(10个试验的平均值+SD)的输入单核细胞分化为表达典型巨噬细胞标记的大细胞，包括CD 16、CD68和CD206(甘露糖受体)。通过流式细胞术中用碘化propidium染色评估，培养5天的单核细胞存活力在0.5和1nM艾可特耐思地743下分别为未处理细胞的92％和70％。巨噬细胞分化的过程受到部分抑制，因为CD68、CD 16和CD206的重新表达在1nM艾可特耐思地743下减少(附图3B)。
为了确认上述体外发现，我们试验了在肿瘤患者中的体内施用艾可特耐思地743是否能够对单核细胞存活力和巨噬细胞体外分化的能力具有可测到的作用。艾可特耐思地743的II期试验一般在晚期卵巢腺癌患者中进行，这些患者难以用两个不同周期的常规顺铂和紫杉醇基础的化疗治疗。本研究选择的肿瘤患者用1300ug/ml/m2的艾可特耐思地743处理。在给药之前和3小时输注结束时采集患者的血样。立刻分离纯化的单核细胞并且用M-CSF(20ng/ml)培养5天以诱导巨噬细胞分化并且随后分析表型表达。在12名可评估的患者中，6名对象的单核细胞表现出在用艾可特耐思地743处理之后巨噬细胞分化减少。表1表示患者的体外分化巨噬细胞的表型分析，所述患者治疗之后的细胞与治疗之前收集的细胞相比至少50％的CD206、CD 16和CD68表达受到抑制。这些所示的数据是标记阳性的细胞相对于总共10.000输入细胞的绝对值。由其他6名患者收集的单核细胞在其分化能力上没有明显降低。
表1.用艾可特耐思地743的体外处理对于肿瘤患者值的巨噬细胞的分化的影响  患者  标记阳性巨噬细胞/10,000细胞的绝对数量  未暴露 暴露在艾可特耐思地743下 ％抑制率*  UPN 1  CD206  4350 550 88  CD16  3110 1248 60  CD68  2703 1473 45  UPN 2  CD206  2810 595 79  CD16  2705 1105 60  CD68  3500 1060 70  UPN 3  CD206  3590  474  87  CD68  3260  632  80  UPN 4  CD16  5130  3050  41  CD68  5550  2460  55  UPN 5  CD16  1575  594  63  CD68  1620  815  50  UPN 6  CD16  2750  480  83  CD68  2320  505  79
*巨噬细胞分化的％抑制率是指输注之前的细胞
我们还研究了使用艾可特耐思地743的体外处理是否在癌症患者中引起可观测到的单核细胞减少症。由常规临床分析的血液公式得到单核细胞值。在记录和可利用单核细胞的形态分析的9名患者中，7名患者表现出单核细胞数量的减少{与输注之前的值相比25％抑制率，至少一个周期)，评估未单核细胞相对于全部白细胞的％，和作为单核细胞/ul血液的绝对数。3名代表性患者的结果如附图5所示。尽管白细胞总数的水平恒定或暂时增加，在药物输注后第一个数天内，单核细胞没有增加并且事实上经常减少。
实施例3
艾可特耐思地743抑制炎性细胞因子/趋化因子的生产
单核细胞/巨噬细胞是协调炎症/免疫反应的可溶因素的有效发生子。所以我们测试艾可特耐思地743处理对于这些细胞的分泌功能的影响。趋化因子CCL2是单核细胞吞噬细胞的主要趋化剂并且通过免疫和数种肿瘤细胞产生。肿瘤衍化的CCL2吸引肿瘤位点的循环单核细胞并且肿瘤的TAM含量与CCL2的水平有关，这在多种肿瘤中得到证实。
用LPS(100ng/ml)刺激单核细胞和体外分化的巨噬细胞。LPS刺激1小时后，将它们用艾可特耐思地743处理。培养16小时后，收获细胞上清液并且利用ELISA测试。在这些处理条件下，细胞的存活力对于最高5nM的浓度而言通常为85％。使用艾可特耐思地743的处理剂量依赖性地降低LPS-刺激的单核细胞和体外衍化的巨噬细胞的CCL2的生产(附图6A)。单核细胞在5nM下的平均值是65％{范围是50-80％，n＝5)并且对于体外分化的巨噬细胞来说是50％(范围是25-75％，n＝5)。结果是3-5个试验的平均值+/-SE。
此后，测试与卵巢癌有关的TAM。将新分离的卵巢肿瘤细胞和TAM与艾可特耐思地743一起培养16小时。用LPS(100ng/ml)刺激TAM。收获细胞上清液并且利用ELISA进行试验。结果是4个试验中TAM的平均值+/-SE和1个试验中肿瘤细胞的平均值+/-SE。LPS-刺激的CCL2的生成降低50％(范围40-60％，n＝4)(附图7A)，同时其组成生产降低43％(范围是30-50％，n＝4)。
我们还试验了两种由巨噬细胞和肿瘤细胞产生的细胞因子IL-6和TNF，它们具有炎症行政并且也在某些肿瘤中其生长因子的作用。IL-6生产一般在艾可特耐思地743处理之后减小，并且在单核细胞和巨噬细胞中在5nM下分别是54％(范围51-57％，n＝2)和69％(范围66-72％，n＝2)(附图6B)。TAM中是否的IL-6不知何故对于处理更加耐受：在5nM下平均抑制率是35％(范围25-53％，n＝4)；在10nM下是47％(范围是33-63％，n＝4)，(附图7B)。
令人感兴趣的是，艾可特耐思地743还减少新分离肿瘤细胞的CCL2和IL-6的组成生产。代表性试验如附图7所示。
相反，并且相当令人吃惊，当用LPS(100ng/ml)刺激单核细胞、体外分化的巨噬细胞和TAM时，用艾可特耐思地743处理进行1小时的LPS刺激，并且16小时培养之后，收获细胞上清液并且利用ELISA测试，观察到单核细胞/巨噬细胞的TNF的生产，以及TAM的TNF生产不曾受到抑制，即使在TAM高达10nM时也如此(附图8A)，提示了艾可特耐思地743仅仅干扰所选的基因。这些结果还表明，在这些条件下，细胞没有在处理下受损。为了验证艾可特耐思地743对于细胞因子生产的抑制作用处于转录水平，我们通过CCL2的实时-PCR分析LPS-刺激的巨噬细胞产生的CCL2和TNF的mRNA并且TNF转录到暴露于艾可特耐思地743下的LPS-刺激的单核细胞。如附图8B所示，艾可特耐思地743处理之后，观察到CCL2转录持续降低，同时不影响TNF mRNA，符合Elisa中获得的结果。
总之这些结果表明，在药理学浓度下艾可特耐思地743降低单核吞噬细胞和肿瘤细胞内两种重要炎性细胞因子的生成。
实施例4
其他艾可特耐思地化合物也抑制炎性细胞因子/趋化因子的生成
我们还对5种其他艾可特耐思地化合物(表2)进行测试，测试其体外抑制人体单核细胞的CCL2的生产的能力。在5种试验化合物中，只有ET637衍生物A在2.5和5nM的浓度下表现出明显和持续的下调单核细胞生产炎性细胞因子的能力。这些浓度在接触48小时后不影响单核细胞存活力。ET637衍生物A的抑制程度更加相当于ET743的。在表2中表示了通过单核细胞暴露于肿瘤细胞上清液下诱导的CCL2的生产在2.5和5nM下在两个不同供体中分别最多被抑制80％和97％。在相同的试验中ET743抑制30％-70％。其他化合物也表现出抑制活性，但与其他上述两种化合物相比水平较低。
表2.ET743和其他艾可特耐思地化合物对于炎性趋化细胞因子CCL2的生产的抑制作用
  供体A％抑制率  供体B％抑制率 ET743  2.5nM  30  60  5nM  70  70 ET637 衍生物A  2.5nM  80  80  5nM  97  87 ET594  5nM  25  -  10nM  25  - ET743 衍生物A  2.5nM  30  -  5nM  35  30 ET745  2.5nM  -  -  5nM  23  - ET637 衍生物B  2.5nM  -  -  5nM  25  -
当单核细胞用LPS(100ng/ml)刺激并且用ET743和气体艾可特耐思地化合物处理时得到类似结果，而总的抑制作用无法明显与上述用肿瘤上清液作为CCL2-优点的刺激的使用相比。
在附图10中，证实ET637衍生物A对CCL2生产具有显著的抑制作用。
实施例5
艾可特耐思地743与卵巢癌常用的抗肿瘤药物的对比
由于已经将艾可特耐思地743主动用于研究卵巢腺癌的治疗，感兴趣的是比较艾可特耐思地743与常用的其他化合物在这种疾病中的这些抗炎作用，它们是阿霉素，顺铂和紫杉醇。单核细胞与指定浓度的艾可特耐思地743、阿霉素、紫杉醇和顺铂一起培养48小时。通过PI染色法评估存活率并且通过流式细胞术分析。附图9A表示，在对于肿瘤细胞而言的活性浓度(0,5μM)下，阿霉素在处理48小时后对于单核细胞呈高达细胞毒性，而顺铂和紫杉醇没有。顺铂的显著毒性只能在非常高的浓度(40μM)时观察到，而紫杉醇即使在300nM下也无效。
另外试验了用指定剂量的抗肿瘤药物处理的LPS刺激的单核细胞的CCL2和TNF生产。在24小时培养之后收获细胞上清液并且利用ELISA测试。如附图9B所示，紫杉醇和阿霉素无效，但DDP{顺铂}(10μM)减少CCL2的生成。这些化合物无一能够干扰TNF的生成。这些结果表明，单核细胞细胞毒性和CCL2的抑制不是卵巢癌治疗常用抗肿瘤药物的普遍性质。
讨论
在此研究中我们评估了艾可特耐思地743对单核吞噬细胞的细胞毒性作用。血循环单核细胞对于药物高达敏感并且在5nM/48小时的浓度下发射细胞凋亡。体外分化的巨噬细胞和肿瘤相关性巨噬细胞(TAM)在5-10nM下敏感。这些数值介于有效治疗浓度的范围内。在低浓度的艾可特耐思地743下，抑制单核细胞分化为巨噬细胞。我们已经通过研究接受艾可特耐思地743治疗的肿瘤患者的单核细胞证实这些结果。在12名试验患者的6名当中，输注3小时(1300mg/m2)后收集的单核细胞与治疗之前即刻收集的单核细胞相比表现出体外巨噬细胞分化的抑制率50％。此外，在大多数患者中在药物输注后第一个数天内已经观察到明显的单核细胞减少症。这些结果表明，短暂地体内与艾可特耐思地743接触足以对单核细胞产生细胞毒性作用。
我们工作的重要发现在于艾可特耐思地743对于炎性细胞因子的生产的抑制活性。在许多由单核细胞/巨噬细胞产生的炎性细胞因子中，我们已经测试了IL-6、TNF和趋化因子CCL2。CCL2是吸引单核细胞和其他白细胞子集的趋化因子，并且可以由单核细胞/巨噬细胞两者和数种肿瘤细胞产生。已经报导卵巢腺癌细胞产生大量的CCL2并且其水平与肿瘤的巨噬细胞含量有关。因此CCL2是一种条件肿瘤位置的单核细胞/巨噬细胞募集的最重要因素。艾可特耐思地743强有力地抑制LPS活化的单核细胞、巨噬细胞和TAM的CCL2释放。艾可特耐思地743还强有力的地抑制新分离卵巢肿瘤细胞的CCL2的组成生产。因此，TAM和肿瘤细胞的低水平CCL2似乎减少了肿瘤位置的巨噬细胞募集的数量。在上述体外试验中在整个16小时的周期期间存在艾可特耐思地743。我们还检验了是否与艾可特耐思地743接触的较短时间足以影响细胞因子的生产。暴露于艾可特耐思地743的单核细胞在培养1小时后洗涤并且置于新鲜培养基内。在这些条件下，CCL2生产的抑制仍然显著，尽管略微低于结束16小时处理的细胞(分别为57％和69％抑制率)。
IL-6是对于免疫/造血系统有重要作用的促炎细胞因子并且是生产CCL2的辅因子。此外，若干研究指出IL-6可能在某些肿瘤细胞内发挥生长因子的作用，包括卵巢癌。对于CCL2，LPS诱导的IL-6在艾可特耐思地743作用下在单核细胞/巨噬细胞内急剧减少。也减少了新分离腹水肿瘤细胞的IL-6生产。
IL-6的一个新的最近公开的作用是其从调节T细胞(Treg)-介导的抑制作用挽回T淋巴细胞。Treg是T淋巴细胞的一个小的、非常重要的子集，它们控制T细胞的自身反应性并维持内稳态。在自身免疫疾病中Treg的作用是被公认的。Treg抑制的自身反应性T淋巴细胞可以通过IL-6挽回，因此保持自身免疫的反应性。所以，艾可特耐思地743介导的减少IL-6可以有利于治疗作用。艾可特耐思地743不曾被考虑过用于慢性炎症疾病的治疗。这个研究的结果指明其对抗炎呈递细胞(即单核细胞类)的前体的细胞毒性作用和减少IL-6的性能，使艾可特耐思地743成为抗炎治疗中令人感兴趣的候选物。
与CCL2和IL-6不同，艾可特耐思地743对于TNF，另一种重要LPS刺激的单核细胞/巨噬细胞产生的炎性介质的生产没有影响。
我们已经证实其他艾可特耐思地化合物以及ET743能够抑制人单核细胞的CCL2的生产。从试验的化合物看出，ET637衍生物A具有明显和持续的下调CCL2生产的性能。ET637衍生物A的抑制程度非常相当于ET743的。其他化合物也表现出抑制活性，单水平较低。
总之，有关艾可特耐思地743和其他艾可特耐思地化合物影响单核细胞/巨噬细胞的存活力和功能的发现揭示了这些化合物的新功效和新的治疗适应症。