对内源免疫球蛋白表达的抑制.pdf

本发明提供了抑制非人转基因动物中内源免疫球蛋白的表达的新方法，所述非人转基因动物经工程化，以表达一种或几种人或人源化免疫球蛋白转基因座。通过仅在表达内源免疫球蛋白的B细胞中但是不在表达人(源化)免疫球蛋白的细胞中选择性表达自杀基因如毒素，抑制转基因非人动物中内源免疫球蛋白的表达。该方法允许在转基因动物的血液、奶或者卵中主要表达编码人源化或者人抗体的转基因座。

权利要求书
1.  一种方法，用于在携带外源免疫球蛋白转基因座的非人转基因动物的B细胞中选择性抑制内源免疫球蛋白的产生，所述方法包括：在所述非人转基因动物的产生内源免疫球蛋白的B细胞中表达至少一种自杀基因，但是在产生外源免疫球蛋白的B细胞中不表达所述自杀基因，从而产生内源免疫球蛋白的B细胞被耗竭，并且所述内源免疫球蛋白的产生受到抑制，而不抑制所述外源免疫球蛋白的产生。

2.  权利要求1的方法，其中所述外源免疫球蛋白是人(源化)的免疫球蛋白重链和/或轻链序列。

3.  权利要求1或权利要求2的方法，其中导入所述非人转基因动物的B细胞中的所述自杀基因处于B细胞特异性启动子控制下，并且侧翼有重组序列。

4.  权利要求3的方法，其中所述人(源化)免疫球蛋白链转基因座作为额外编码识别所述重组序列的重组酶的表达构建体的一部分，导入所述非人转基因动物的B细胞中，其中通过在表达所述人(源化)免疫球蛋白转基因座的B细胞中表达所述重组酶来失活所述自杀基因的表达。

5.  权利要求1或权利要求2的方法，其中所述自杀基因选自由细菌、真菌、杀虫和植物毒素组成的组.

6.  权利要求1或权利要求2的方法，其中所述自杀基因是白喉毒素链A。

7.  权利要求1或权利要求2的方法，其中所述自杀基因是前体药物转化酶。

8.  权利要求7的方法，其中所述前体药物转化酶是非哺乳动物来源的。

9.  权利要求8的方法，其中所述非哺乳动物来源的前体药物转化酶选自由病毒胸苷激酶(TK)、细菌胞嘧啶脱氨酶(CD)、细菌羧肽酶G2(CPG2)、嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、硝基还原酶(NR)、D-氨基酸氧化酶(DAAO)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)、青霉素-G酰胺酶(PGA)、β-内酰胺酶、多种药物活化酶(MDAE)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、辣根过氧化物酶(HRP)和脱氧核糖核苷酸激酶(DRNK)组成的组。

10.  权利要求7的方法，其中所述前体药物转化酶是人来源的。

11.  权利要求10的方法，其中所述人来源的前体药物转化酶选自由脱氧胞苷激酶(dCK)、羧酸酯酶(CEs)、羧肽酶A(CPA)、β-葡糖醛酸糖苷酶(-Glu)和细胞色素P450(CYP)组成的组。

12.  权利要求4的方法，其中所述重组酶选自由Cre、Cre-样、Flp、φC31、λ整合酶、噬菌体R4重组酶、TP901-1重组酶、原核生物转座酶、真核生物转座酶、病毒逆转座酶、果蝇copia样逆转座酶和非病毒逆转座酶组成的组。

13.  权利要求12的方法，其中所述转座酶或者逆转座酶选自由Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn9、Tn10、Tn30、Tn101、Tn501、Tn903、Tn1000、Tn1681、Tn2901、Drosophila mariner、睡美人转座酶、果蝇P元件、玉米Ac、Ds、Mp、Spm、En、dotted、Mu、I、L1、Tol2 Tc1、Tc3，Mariner(Himar 1)、Mariner(mos 1)和Minos组成的组。

14.  权利要求1或权利要求2的方法，其中所述非人转基因动物在生命早期基本上停止了通过基因重排的抗体多样化。

15.  权利要求14的方法，其中所述非人转基因动物在它生命的第一个月内基本上停止了抗体多样化。

16.  权利要求1或权利要求2的方法，其中所述非人转基因动物选自由啮齿动物、兔、鸟类、奶牛、猪、绵羊、山羊和马组成的组。

17.  权利要求16的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

18.  转基因表达构建体，其包含(1)转基因，(2)人或者人源化的免疫球蛋白重和/或轻链转基因座，(3)自身切割肽，和(4)重组酶。

19.  转基因表达构建体，其包含(1)转基因，(2)自杀基因，其处于B细胞特异启动子控制下，并且侧翼有重组酶识别的重组位点。

20.  转基因表达构建体，其包含：
第一转基因，该第一转基因还包含人或者人源化的免疫球蛋白重和/或轻链基因座、自身切割肽和重组酶，和，
第二转基因，该第二转基因还包含自杀基因，该自杀基因处于B细胞特异启动子控制下，并且侧翼有所述重组酶识别的重组位点。

21.  权利要求18、19或者20的转基因表达构建体，其中所述重组酶是选自由Cre、Cre-样、Flp、φC31、λ整合酶、噬菌体R4和TP901-1重组酶组成的组的位点特异性重组酶。

22.  权利要求18、19或者20的转基因表达构建体，其中所述重组酶是原核生物或者真核生物的转座酶。

23.  权利要求22的转基因表达构建体，其中所述重组酶是病毒、果蝇copia样或者非病毒逆转录转座子。

24.  权利要求23的转基因表达构建体，其中所述逆转录转座子选自由Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn9、Tn10、Tn30、Tn101、Tn501、Tn903、Tn1000、Tn1681、Tn2901、Drosophila mariner、睡美人转座酶、果蝇P元件、玉米Ac、Ds、Mp、Spm、En、dotted、Mu、I、L1、Tol2 Tc1、Tc3、Mariner(Himar 1)、Mariner(mos1)和Minos组成的组。

25.  权利要求19或者20的转基因表达构建体，其中所述重组位点选自由lox P位点、FRT位点、细菌基因组重组位点和噬菌体重组位点组成的组。

26.  权利要求25的转基因表达构建体，其中所述细菌基因组重组位点是attB并且所述噬菌体重组位点是attP或者假-attP或者假-attB位点。

27.  权利要求18或者20的转基因表达构建体，其中所述自身切割肽从病毒2A/2B或2A-like/2B序列得到。

28.  权利要求27的转基因表达构建体，其中所述病毒选自由小RNA病毒家族、马鼻炎A(ERAV)病毒家族、微小RNA病毒样昆虫病毒家族或者C型轮状病毒家族组成的组。

29.  权利要求27的转基因表达构建体，其中所述病毒选自由口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻炎A(ERAV)病毒或者Thosea asogma病毒(TaV)组成的组。

30.  权利要求19或者20的转基因表达构建体，其中使用启动子/增强子在B细胞中特异表达所述自杀基因，所述启动子/增强子选自由CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72、Blimp-1、CD79b、mb-1、酪氨酸激酶blk、VpreB、免疫球蛋白κ轻链、免疫球蛋白λ轻链和免疫球蛋白J链或者其修饰组成的组。

31.  权利要求30的转基因表达构建体，其中所述B细胞特异性启动子/增强子是κ轻链基因启动子或者其修饰。

32.  表达权利要求18和19或者20的转基因表达构建体的非人转基因动物。

33.  权利要求32的非人转基因动物，其通过基因转变大量产生抗体多样性。

34.  权利要求32的非人转基因动物，其选自由啮齿动物、兔、鸟类，包括鸡、火鸡、鸭和鹅组成的组。

35.  权利要求34的非人转基因动物，其是小鼠或者大鼠。

说明书对内源免疫球蛋白表达的抑制
发明领域
本发明涉及抑制非人转基因动物中内源免疫球蛋白的表达的方法，所述方法通过在表达内源免疫球蛋白的B细胞中但不在表达外源免疫球蛋白或者免疫球蛋白链，如人或者人源化免疫球蛋白或者免疫球蛋白链的B细胞中选择性表达自杀基因来实现。该方法允许例如在转基因非人动物的血液、奶或者卵中主要表达人或者人源化抗体。
背景技术
Pluschke等人，Journal of Immunological Methods 215：27-37(1998)已经描述了表达人-小鼠嵌合抗体的小鼠的产生。表达人免疫球蛋白多肽的小鼠的产生已由Neuberger等人，Nature 338：350-2(1989)；Lonberg等人，Int.Rev.Immunol.13(1)：65-93(1995)；和Bruggemann等人，Curr.Opin.Biotechnol.，8(4)：455-8(1997)描述；使用BAC克隆产生转基因小鼠已由Yang等人，Nat.Biotechnol.15：859-65(1997)描述。表达人抗体的奶牛的产生已经由Kuroiwa等人，Nature Biotech 20(9)：889-894(2002)描述。
动物中的基因转移(Transgenesis)已经由Wall RJ，Theriogenology57(1)：189-201(2002)描述。转基因兔的产生已经由Fan，J.等人，PatholInt.49：583-94(1999)；和Brem等人，Mol.Reprod.Dev.44：56-62(1996)描述。对转基因鸡的生产已经由Etches等人，Methods inMolecular Biology 62：433-450(1997)；和Pain等人，Cells TissuesOrgans 165(3-4)：212-9(1999)；和Sherman等人，Nature Biotech16：1050-1053(1998)描述。
具有受损的免疫球蛋白表达的兔已经由Chen等人，J.Immunol.150：2783-2793(1993)；和Lamoyi E，和Mage RG.，J.Exp.Med.162：1149-1160(1985)描述。γ-球蛋白血(globulinemic)鸡已经由Frommel等人，J.Immunol.105(1)：1-6(1970)；和Benedict等人，Adv.Exp.Med.Biol.88(2)：197-205(1977)描述。
从细胞克隆动物已经由T.Wakayama等人，Nature 394：369-374(1998)；J.B.Cibelli等人，Science 280：1256-1258(1998)；J.B.Cibelli等人，Nature Biotechnology 16：642-646(1998)；A.E.Schnieke等人，Science 278：2130-2133(1997)；和K.H.Campbell等人，Nature 380：64-66(1996)描述。兔的核转移克隆已经由Stice等人，Biology ofReproduction39：657-664(1988)，Challah-Jacques等人，Cloning andStem Cells 8(4)：295-299(2003)描述。
在PCT公布号WO 92/03918、WO 02/12437，和美国专利号5,545,807、5,814,318；和5,570,429中已详细描述了对表达人(源化)免疫球蛋白转基因座的非人转基因动物的生产和从此类转基因动物生产抗体。在美国专利号5,416,260中示例了嵌合哺乳动物宿主的同源重组。在美国专利号5,567,607中描述了向胚胎中导入DNA的方法。在美国专利号5,453,357中描述了胚胎干细胞的维持和扩增。
在Leong等人，Science，220：515-7，(1983)；Maxwell等人，CancerResearch，46：4660-4664，(1986)；Palmiter等人，Cell，50：435-443，(1987)；Maxwell等人，Cell，51：4299-4304，(1991)；Maxwell等人，Leukemia and Lymphoma，7：457-462，(1992)；Aguila等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，92：10192-10196(1995)；Grieshammer等人，DevelopmentalBiology，197：234-247，(1998)；Bartell等人，Biology of Reproduction，63：409-416(2000)；Erlandsson等人，J.Exp.Med.，194：557-570(2001)；Lee等人，Human Gene Therapy，13：533-542(2002)中已经描述了使用基于毒素的方法的自杀基因。在(Methods in MolecularMedicine：Suicide Gene Therapy，Methods and Reviews，Caroline JSpringer编著，Humana Press，2004)中描述了使用非毒素前体药物(prodrug)-酶方法的自杀基因。
Palmenberg等人，Virology 190：754-762(1992)，Ryan等人，J GenVirol 72：2727-2732(1991)，Donnelly等人，J Gen Virol 82：1027-1041(2001)，Donnelly等人，J Gen Virol 82：1013-1025(2001)，Szymaczak等人，Nature Biotech 22(5)：589-594(2004)已经描述了含有2A肽序列的病毒蛋白质的切割活性。
Kolb A.F.Cloning Stem Cells 41：65-80(2002)描述了重组酶和它们的性质。其识别并催化两条核酸中非常特异的序列之间的同源重组的位点特异性重组酶是已知的。例如，属于位点特异性重组酶的整合酶家族的φC31和R4是已知的，Groth等人，Proc.，Natl.Acad.Sci.，97：5995-6000(2000)；Olivares等人，Nature Biotechnol.，20(11)：1124-8(2002)。假-attP位点在一些基因组(包括人和小鼠基因组)中是天然的，Thyagarajan等人，Mol.and Cell.Biol.，21：3926-3934(2001)。φC31整合酶介导的、8.9kb的大VII型胶原cDNA在体外向患者皮肤初级祖细胞的基因转移已经由Ortiz-Urda等人，NatureMedicine，8：1166-1170(2002)报导。Hollis等人，Repro.Biol.andEndocrinol.，1：79(2003)已经展示了φC31、TP901-1和R4噬菌体整合酶在操作转基因动物中的用途。
Erlandsson等人，J Exp Med 194(5)：557-570(2001)，Maxwell等人，Cancer Research 51：4299-4304(1991)和Palmiter等人，Cell 50：435-443(1987)已经描述了对细胞(包括B细胞)的切除(ablation)。
发明概述
本发明涉及抑制转基因动物中内源免疫球蛋白产生的方法。该方法涉及：在表达内源免疫球蛋白的B细胞中选择性表达自杀基因，但是不在表达人或者人源化免疫球蛋白的B细胞中表达该自杀基因。具体地，本发明涉及在含有一种或几种人或者人(源化)免疫球蛋白转基因座(transloci)的非人转基因动物中抑制内源免疫球蛋白基因座的表达的方法。由此，人(源化)转基因座能够在基本上不产生内源免疫球蛋白的情况下，在转基因非人动物中经历基因重排和突变过程，产生多样化的人(源化)抗体所有组成成分(repertoire)。
具体地，本发明涉及在携带外源免疫球蛋白转基因座的非人转基因动物中选择性抑制内源免疫球蛋白(Ig)产生的方法，所述方法包括：在所述非人转基因动物的产生内源免疫球蛋白的B细胞中，选择性表达至少一种自杀基因，但是在产生外源免疫球蛋白的B细胞中不表达自杀基因，从而耗竭产生该内源免疫球蛋白的B细胞，并且内源免疫球蛋白的产生受到抑制，而不抑制外源免疫球蛋白的产生。在一种优选实施方案中，外源免疫球蛋白是人源化的免疫球蛋白重和/或轻链序列。
在另一方面，导入非人转基因动物的B细胞的自杀基因处于B细胞特异性启动子控制下，并且侧翼有重组序列。
在再一方面，将人(源化)免疫球蛋白链转基因座作为表达构建体的一部分导入非人转基因动物的B细胞中，所述表达构建体额外编码识别所述重组序列的重组酶，其中，所述自杀基因的表达通过表达人源化免疫球蛋白转基因座的B细胞中该重组酶的表达来失活。
在一些方面，自杀基因选自细菌、真菌、杀虫剂和植物毒素构成的组。在一种优选实施方案中，自杀基因是白喉毒素链A。
在另一实施方案中，自杀基因是前体药物转化酶。在该实施方案的一方面，前体药物转化酶是非哺乳动物来源的。在进一步的方面，非哺乳动物前体药物转化酶选自病毒胸苷激酶(TK)、细菌胞嘧啶脱氨酶(CD)、细菌羧肽酶G2(CPG2)、嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、硝基还原酶(NR)、D-氨基酸氧化酶(DAAO)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)、青霉素-G酰胺酶(PGA)、β-内酰胺酶、多种药物活化酶(MDAE)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、辣根过氧化物酶(HRP)和脱氧核糖核苷酸激酶(deoxyribonucleotide kinase，DRNK)构成的组。
在再一种实施方案中，前体药物转化酶是人来源的。在进一步的方面，人前体药物转化酶选自脱氧胞苷激酶(dCK)、羧酸酯酶(CEs)、羧肽酶A(CPA)、β-葡糖醛酸糖苷酶(-Glu)和细胞色素P450(CYP)构成的组。
在另一方面，重组酶选自Cre、Cre-样、Flp、φC31、λ整合酶、噬菌体R4重组酶、TP901-1重组酶、原核生物转座酶、真核生物转座酶、病毒逆转座酶、果蝇copia样逆转座酶和非病毒逆转座酶构成的组。在进一步的实施方案中，转座酶或者逆转座酶选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn9、Tn10、Tn30、Tn101、Tn501、Tn903、Tn1000、Tn1681、Tn2901、Drosophila mariner、睡美人(sleeping beauty)转座酶、果蝇P元件、玉米Ac、Ds、Mp、Spm、En、dotted、Mu、I、L1、Tol2 Tc1、Tc3、Mariner(Himar 1)、Mariner(mos 1)和Minos构成的组。
在一种实施方案中，非人转基因动物在生命早期基本上停止了通过基因重排的抗体多样化。在进一步的实施方案中，非人转基因动物在它的生命的第一个月基本上停止了抗体多样化。
在另一实施方案中，非人转基因动物选自啮齿动物、兔、鸟类、奶牛、猪、绵羊、山羊和马构成的组。在优选实施方案中，啮齿动物是小鼠或大鼠。
在某一方面，本发明涉及转基因表达构建体，其包含第一转基因，所述第一转基因进一步包含人或者人源化的免疫球蛋白重和/或轻链转基因座、自身切割肽和重组酶。
在另一方面，本发明涉及转基因表达构建体，其包含第二转基因，所述第二转基因进一步包含自杀基因，该自杀基因处于B细胞特异启动子控制下并且侧翼是重组酶识别的重组位点。
在一种实施方案中，本发明涉及转基因表达构建体，其包含第一转基因和第二转基因，所述第一转基因还包含人或者人源化的免疫球蛋白重和/或轻链基因座、自身切割肽和重组酶，所述第二转基因还包含自杀基因，该自杀基因处于B细胞特异启动子控制下并且侧翼是重组酶识别的重组位点。
在一种实施方案中，上述转基因表达构建体包含选自Cre、Cre-样、Flp、φC31、λ整合酶、噬菌体R4和TP901-1重组酶构成的组的位点特异性重组酶。
在另一实施方案中，上述转基因表达构建体包含下述重组酶，所述重组酶是原核生物或者真核生物的转座酶。
在再一种实施方案中，上述转基因表达构建体包含下述重组酶，所述重组酶是病毒、果蝇copia样或者非病毒逆转录转座子(retrotransposon)。
在另一实施方案中，上述转基因表达构建体包含重组酶，所述重组酶选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn9、Tn10、Tn30、Tn101、Tn501、Tn903、Tn1000、Tn1681、Tn2901、Drosophila mariner、睡美人转座酶、果蝇P元件、玉米Ac、Ds、Mp、Spm、En、dotted、Mu、I、L1、Tol2 Tc1、Tc3、Mariner(Himar 1)、Mariner(mos 1)和Minos构成的组。
在某种实施方案中，上述转基因表达构建体包含重组位点，所述重组位点选自lox P位点、FRT位点、细菌基因组重组位点和噬菌体重组位点构成的组。
在另一实施方案中，细菌基因组重组位点是attB，噬菌体重组位点是attP或者假-attP或者假-attB位点。
在某种实施方案中，上述转基因表达构建体包含从病毒2A/2B或2A-like/2B序列得到的自身切割肽。
在另一实施方案中，病毒选自小RNA病毒家族(picornaviridaevirus family)、马鼻炎A(ERAV)病毒家族、微小RNA病毒样昆虫病毒家族(the picornavirus-like insect virus family)构成的组或者来自C型轮状病毒家族(type C rotavirus family)。在再一种实施方案中，病毒选自口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻炎A(ERAV)病毒或者Thosea asigna病毒(TaV)构成的组。
在某种实施方案中，上述转基因表达构建体包含自杀基因，该自杀基因在B细胞中特异表达，这是使用启动子/增强子实现的，所述启动子/增强子选自CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72、Blimp-1、CD79b、mb-1、酪氨酸激酶blk、VpreB、免疫球蛋白κ轻链、免疫球蛋白λ轻链免疫球蛋白J链或者其修饰构成的组。在优选实施方案中，B细胞特异性启动子/增强子是κ轻链基因启动子或者其修饰。
在一方面，本发明涉及产生非人动物的方法，其中通过在产生内源免疫球蛋白的B细胞中选择性表达自杀基因来抑制内源免疫球蛋白产生，而表达人(源化)免疫球蛋白的B细胞不表达该自杀基因，并且因此增殖。
具体地，本发明涉及表达上述转基因表达构建体的非人转基因动物。
在一种实施方案中，非人转基因动物通过基因转变大量产生抗体多样性。
在所有方面，优选的非人动物包括但不限于：啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)、兔、鸟类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅，等等)、奶牛、猪、绵羊、山羊、马、驴和其它农场动物。在优选实施方案中，非人转基因动物是小鼠或者大鼠。

附图简述
图1是对在表达外源免疫球蛋白(Ig)的B细胞和表达内源免疫球蛋白(Ig)的B细胞中发生的事件的概略描述。在具有两种转基因(Ig重链基因座和DTA)的细胞中，转基因免疫球蛋白重链基因座的生产性重排导致重链(HC)和Cre重组酶的表达。随后，Cre-介导的重组导致DTA表达盒外的成环。因此，DTA不表达，并且表达转基因免疫球蛋白HC基因座的此类外源B细胞幸存下来。内源HC基因座的生产性重排不导致Cre重组酶的表达。因此，DTA表达盒被激活，此类内源B细胞死亡。
发明详述
定义
除非另外定义，本文使用的技术和科学数据具有与本发明所属领域技术人员通常理解的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley & Sons(New York，NY 1994)，and March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms andStructure 4th ed.，John Wiley & Sons(New York，NY 1992)为本领域技术人员提供了本申请中所用的许多术语的一般指导。
本领域技术人员将知道可以用于实践本发明的、与本文描述的相似或者等同的许多方法和材料。实际上，本发明绝不限于所描述的方法和材料。对于本发明，在下文定义下面的术语。
“B-细胞”定义为B谱系细胞，其能够经历免疫球蛋白基因片断的重排并且在它们的生命周期的某阶段表达免疫球蛋白基因。这些细胞包括但不限于，早期前B细胞、晚期前B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、记忆B细胞、浆细胞，等等。
“抗体”(Abs)和“免疫球蛋白”(Igs)是具有相同的结构特征的糖蛋白。抗体显示出对特定抗原的结合特征，而免疫球蛋白包括抗体和缺少抗原特异性的其它抗体样分子。术语“抗体”在本文中以最广义使用，其特别覆盖但不限于，单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们显示出所希望的特异性。
术语“Ig基因片断”在本文中用于指编码Ig分子的不同部分的DNA的片断，它们存在于人和动物的种系中，并且在B细胞中聚集而形成重排的Ig基因。本文使用的Ig基因片断包括V基因片断、D基因片断、J基因片断和C区基因片断。VDJ或VJ片断的功能重排导致免疫球蛋白重或者轻链的表达。
本文使用的术语“人Ig基因转基因座或者基因座或者片断”包括人Ig基因基因座的天然发生的序列或者其片断、人Ig基因基因座的天然发生的序列或者其片断的简并形式，以及编码与人Ig基因基因座的天然发生的序列或者其片断编码的多肽实质上同一的多肽序列的合成序列。在该上下文中，“实质”指至少约85％-95％、或者至少约90％-95％，或者至少约95％，或者至少约98％的氨基酸序列同一性程度。在一种具体实施方案中，人Ig基因片断使得免疫球蛋白分子在人中为非免疫原性的。这里，术语“人或者人源化免疫球蛋白(Ig)重和/或轻链基因座”或者“人或者人源化Ig基因座”可互换使用。
术语“人抗体”和“人免疫球蛋白”在本文中指包含完全人序列的抗体和免疫球蛋白分子。
本文使用的术语“人源化抗体”和“人源化免疫球蛋白”指下述免疫球蛋白分子，其包含人免疫球蛋白多肽序列(或者人免疫球蛋白基因片断编码的多肽序列)的至少一部分。本发明的人源化免疫球蛋白分子可以从经工程化以产生人源化免疫球蛋白分子的转基因非人动物分离。相对于从动物或者来自动物的细胞制备的非人源化免疫球蛋白分子而言，此类人源化免疫球蛋白分子对于灵长类，特别是对于人具有较小的免疫原性。人源化免疫球蛋白或者抗体包括在基因转变动物中通过基因转变和体细胞超突变进一步多样化的免疫球蛋白(Ig)和抗体。此类人源化Ig或者抗体不是“人”的，因为它们不是由人天然产生(因为人不通过基因转变多样化它们的抗体所有组成成分)，然而人源化Ig或者抗体对于人不是免疫原性的，因为它们在它们的结构中具有人Ig序列。
“转基因或者转基因构建体”是DNA片段，其具有编码天然的或者通常不在动物或者动物细胞中发现的合成蛋白质的序列。术语“转基因构建体”在本文用于指多核苷酸分子，其含有结构“目的基因”和其它促进基因转移的序列。本发明涉及两种转基因构建体：(1)人Ig基因座自身切割肽-重组酶，和(2)免疫细胞特异性自杀转基因构建体。
“转基因表达构建体”指下述DNA片段，其具有编码本发明的一种或几种转基因构建体的序列与目的转基因在非人转基因动物的特定细胞中暂时、细胞特异性或者增强表达所需的其它调节DNA序列。
“人(源化)Ig基因座自身切割肽-重组酶转基因或者转基因构建体”指转录成单条mRNA的转基因构建体，所述mRNA通过下面讨论的自身切割机制翻译成两种多肽，即，人(源化)免疫球蛋白链和重组酶。
本文使用的术语“自身切割肽”指下述肽序列，所述肽序列与在该肽序列自身内两个氨基酸残基之间发生的切割活性有关。例如，在2A/2B或者在2A/2B样肽中，在2A肽上的甘氨酸残基和2B肽的脯氨酸残基之间发生切割。这通过翻译期间的“核糖体跳跃机制(ribosomalskip mechanism)”发生，其中2A/2B肽的2A甘氨酸残基和2B脯氨酸残基之间的正常肽键形成受损，而不影响2B肽剩余部分的翻译。此类核糖体跳跃机制是本领域公知的，并且已知其被一些病毒用于表达单条信使RNA编码的一些蛋白质。
术语“重组酶”在本文中用于指可以促进确定的位点(称作“重组位点”)之间位点特异性重组的一组酶，其中两个重组位点在单个核酸分子内物理上分离或者在分离的核酸分子上。两个确定的重组位点的序列不一定是相同的。在重组酶的组内，有一些亚家族，包括“整合酶”(例如，位点特异性重组酶，像Cre、Cre-样、FLP和λ整合酶)和“解离酶/转化酶”(例如，φC31整合酶、R4整合酶，和TP-901整合酶)。术语”重组酶”还包括但不限于：原核或者真核转座酶、病毒或者果蝇copia样或者非病毒逆转座酶，其包括哺乳动物反转录转座子。示例性原核生物转座酶包括在Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn9、Tn10、Tn30、Tn101、Tn501、Tn903、Tn1000、Tn1681、Tn2901等的可转座元件(transposable element)中编码的转座酶。真核生物转座酶包括在Drosophila mariner、睡美人转座酶、果蝇P元件、玉米Ac和Ds元件等的转座元件中编码的转座酶。逆转座酶包括在L1、Tol2Tc1、Tc3、Mariner(Himar 1)、Mariner(mos1)、Minos等的元件中编码的那些转座酶。转座酶还可以选自Mp、Spm、En、dotted、Mu、和I转座元件。
本文使用的术语“野生型重组位点”指重组酶(如整合酶)通常使用的重组位点。
“假重组位点”指在其上重组酶可以促进重组的位点，尽管该位点可能不具有与它的野生型重组位点的序列相同的序列。
本文使用的术语“自杀基因或者自杀转基因”指编码下述蛋白质的基因，所述蛋白质的表达导致表达该基因的细胞的死亡。所述蛋白质可以是例如毒素(例如，白喉毒素链A)或者将非毒性前体药物转化成毒性产物的酶(例如，胸苷激酶、羧酸酯酶、羧基肽酶、细胞色素P450同工酶、脱氧核糖核苷酸激酶、硝基还原酶等等)。当自杀基因编码前体药物转化酶时，表达它的细胞暴露于前体药物时会死亡。本文使用的“自杀基因产物”指“自杀基因”编码的蛋白质。通过免疫细胞特异性启动子，优选通过B细胞启动子，来驱动自杀基因表达。
术语“能够失活自杀基因表达的序列”指自杀基因侧翼的被重组酶识别的重组位点。
术语“前体药物”指在体内被代谢转化成毒性药物、代谢物或者药物的化合物。
术语“表达内源Ig(免疫球蛋白)的B细胞”和“内源B细胞”可互换使用，它们指表达动物的内源免疫球蛋白基因座的那些B细胞。本发明的B细胞在它们的基因组中含有自杀基因。内源B细胞表达自杀基因，从而最终被耗竭，并且该动物的内源Ig表达被抑制。
术语“表达外源Ig(免疫球蛋白)的B细胞”和“外源B细胞”指非人动物的那些B细胞，它们经历导入此类B细胞的外源人(源化)Ig转基因座的生产性重排。将人(源化)Ig基因座作为下述表达构建体的部分导入此类B细胞中，该表达构建体还编码位点特异性重组酶。人(源化)Ig基因座的生产性重排导致人(源化)Ig和转基因编码的重组酶的表达。结果，从B细胞的基因组切除自杀基因，细胞避免了细胞死亡。因此优选地，转基因动物表达的Ig产物是人(源化)免疫球蛋白。
“自杀基因的选择性表达”指自杀基因产物优选在免疫细胞内，更优选在B细胞内，最优选在内源B细胞内的表达。通过分别使用免疫特异性或者B细胞特异性启动子驱动自杀基因表达，实现免疫细胞或者B细胞内自杀基因的选择性表达。
术语“选择性失活”指从外源B细胞的基因组对自杀基因或者其部分的选择性切除。因为自杀基因侧翼有重组酶位点，其被外源B细胞中表达的转基因编码的重组酶识别，所以，自杀基因被切除或者失活。
Ig生产细胞的“耗竭”定义为表达非人或者非人源化Ig的内源B细胞群体部分或者完全被杀死、死亡和/或被除去。当所选的转基因动物是其中抗体重排在生命早期停止的转基因动物时，内源B细胞的耗竭可以更有效，如下文进一步解释。
“对内源免疫球蛋白产生的选择性抑制”指由于表达自杀基因的内源B细胞的耗竭，对非人转基因动物的内源免疫球蛋白的产生的选择性抑制。从而，主要由转基因动物表达的免疫球蛋白产物是人(源化)的免疫球蛋白。
术语“抗体多样性”和“抗体所有组成成分”可互换使用，并且指生物能够表达的所有抗体特异性的总和。
能够经历基因重排和基因转变的Ig基因座也在本文中称作“功能性”Ig基因座，并且具有功能性Ig基因座产生的多样性的抗体在本文中也称作”功能性”抗体或者抗体的“功能性”所有组成成分。
术语“单克隆抗体”用于指B细胞的单个克隆合成的抗体分子。
术语“多克隆抗体”指B细胞群体合成的抗体分子的群体。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，并且当以单数或者复数使用时，一般指任何多核糖核苷酸或者多脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或者DNA，或者是经修饰的RNA或者DNA。从而，例如，本文定义的多核苷酸包括但不限于，单链和双链DNA、包括单链和双链区域的DNA、单链和双链RNA以及包括单链和双链区的RNA、包含DNA和RNA的杂种分子，其可以是单链的，或者更通常是双链的，或者包括单链和双链区。此外，本文使用的术语“多核苷酸”指包含RNA或者DNA或者RNA和DNA的三链区。此类区域中的链可以来自相同分子或者不同的分子。所述区域可以包括一种或多种分子的全部，但是更通常包括一些分子的仅一个区域。三螺旋区的分子之一通常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”特别包括cDNA。该术语包括含有一个或多个经修饰的碱基的DNA(包括cDNA)和RNA。从而，具有由于稳定性或者其它原因经修饰的主链的DNA或者RNA是如该术语在本文预期的含义所述的“多核苷酸”。此外，包含稀有碱基，如肌苷或者经修饰的碱基，如氚化碱基的DNA或者RNA包括在本文定义的术语”多核苷酸”内。通常，术语“多核苷酸”包括未经修饰的多核苷酸的所有化学、酶促和/或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括简单和复杂细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。
本文使用的术语”非人(转基因)动物”包括但不限于，哺乳动物，如非人灵长类、啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)、非啮齿类哺乳动物，如兔、猪、绵羊、山羊、奶牛、猪、马和驴，和鸟类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅等等)。本文使用的术语“非灵长类动物”包括但不限于，不同于灵长类的哺乳动物，包括但不限于上面特别列出的哺乳动物。
短语“基本上通过基因转化和/或体细胞超突变(hypermutation)产生抗体多样性来产生初级抗体所有组成成分的动物”或者“基因转变动物”和它们的语法等同物用于指此类动物，其中抗体多样化的主要机制是如与基因重排相反的基因转变和/或超突变。此类动物包括但不限于，兔、鸟类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅等等)、奶牛和猪。尤其优选的非人动物是兔和鸡。
动物“在生命早期停止抗体基因重排”指那些动物，其中免疫球蛋白基因的重排典型地在生命的第一个月内停止。此类动物的例子是兔、鸟类(例如，鸡)、绵羊、山羊、牛、猪和马，但不限于此。
发明详述
本发明提供了抑制非人动物中内源免疫球蛋白产生的方法，例如目的是使得动物更适于表达人(源化)的免疫球蛋白。
根据本发明，通过在表达内源免疫球蛋白的B细胞中选择性表达自杀基因，赖在表达内源免疫球蛋白序列(例如人(源化)免疫球蛋白)的非人转基因动物中选择性抑制内源免疫球蛋白产生。自杀基因作为转基因整合到动物的基因组，其可以例如，作为还导入人(源化)Ig转基因座的转基因表达构建体的部分导入，或者其可以单独导入，例如，使用单独的转基因表达构建体。在后一种情况中，两种表达构建体可以同时或者在不同时间导入转基因动物中。
自杀基因通过免疫特异性启动子，优选B细胞特异性启动子在动物的B细胞中表达，并且侧翼有重组酶识别的重组序列。因此，侧翼有重组序列的自杀基因最初将存在于动物的所有B细胞中。在“外源B细胞”中，编码人(源化)免疫球蛋白-自身切割肽-重组酶分子的外源免疫球蛋白转基因座的生产性重排导致重组酶在此类B细胞中的选择性表达。重组酶识别此类细胞中自杀基因侧翼的重组位点。结果，自杀基因在外源B细胞中被选择性切除，所述B细胞因此避免了细胞死亡。相反，内源B细胞中内源免疫球蛋白基因座的生产性重排不导致该重组酶的表达。因此，内源B细胞中的自杀基因表达导致该细胞群体的死亡，并且因此，在不抑制非人转基因动物对人(源化)免疫球蛋白的表达的情况下，内源免疫球蛋白产生受到抑制。
转基因是下述DNA片段，所述DNA片断具有编码一种或几种天然或者合成的蛋白质的序列，所述蛋白质通常不会在动物或者动物细胞中被发现。可以通过多种技术向动物的基因组导入DNA片段，所述技术包括前核的显微注射、转染、核转移克隆、精子介导的基因转移、睾丸介导的基因转移，等等。本发明涉及两种转基因或者转基因构建体，(1)人Ig基因座-自身切割肽-重组酶转基因，和(2)免疫细胞特异性自杀转基因。每种转基因与其其自身的调节序列可操作地相连。例如，自杀转基因的表达可以由B细胞特异性启动子驱动。两种转基因构建体可以存在于两个单独的载体上，或者同一个载体(质粒)上。在一个实施方案中，两个转基因构建体可以在不同时间导入。备选地，两个转基因构建体可以同时导入动物中。在一种优选实施方案中，将自杀转基因的表达定时为发生重链重排后发生。如从下面讨论的机理中显而易见的，这允许在外源B细胞中表达重组酶的时间，并且因此，允许从外源B细胞的基因组发生重组酶介导的自杀基因切除的时间，从而关闭此类细胞中的自杀基因表达。此外，用于本发明方法中的载体可以含有编码抗生素选择标记(例如庆大霉素、新霉素、卡那霉素等等)以使得能够进行选择的DNA序列。
在本发明的一方面，转基因包含编码自身切割肽(例如，2A肽或者2A样肽)的DNA序列。在转基因中免疫球蛋白编码序列和重组酶编码序列之间插入编码自身切割肽的序列导致产生一种信使RNA。然而，由于肽的自身切割机制，该mRNA的翻译导致两种单独的蛋白质：免疫球蛋白和重组酶。因此，重组酶的表达可以与VDJ或者VJ片断的功能重排偶联。
在本发明的一种此类实施方案中，自身切割肽受病毒的2A/2B肽或者2A-样/2B序列的介导，所述病毒包括小RNA病毒家族、马鼻炎A(ERAV)病毒家族、微小RNA病毒样昆虫病毒家族或者来自C型轮状病毒家族。小RNA病毒家族包括肠-、鼻-、心-和aphtho-和口蹄疫(FMDV)病毒。微小RNA病毒样昆虫病毒家族包括病毒如感染性软化病病毒(IFV)、果蝇C病毒(DCV)、急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)和蟋蟀麻痹病毒(CrPV)昆虫病毒Thosea asigna病毒(TaV)。C型轮状病毒家族包括牛、猪和人C型轮状病毒。在其它实施方案中，切割序列可以包括来自脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、脑炎心肌炎病毒(EMCV)、门戈病毒、猪teschovirus-1或者Theiler’s鼠脑炎病毒(TMEV)等等的2A-样/2B序列。在一种优选实施方案中，自身切割蛋白序列是口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻炎A(ERAV)病毒或者Thoseaasigna病毒(TaV)的2A/2B肽；Palmenberg等人，Virology 190：754-762(1992)，Ryan等人，J Gen Virol 72：2727-2732(1991)，Donnelly等人，J Gen1 Virol 82：1027-1041(2001)，Donnelly等人，J Gen Virol 82：1013-1025(2001)，Szymaczak等人，Nature Biotech 22(5)：589-594(2004)。
用于本发明方法中的其它转基因编码位点特异性重组酶。位点特异性重组酶催化两条核酸(例如DNA片断)之间的同源重组。这些重组酶识别两个重组的配偶体中的非常特异的序列。尽管对于不同类型的位点特异性重组酶来说催化机制可能是不同的，但是它们都包括在本文中(无论潜在的机制是什么)，并且适于本发明的实践。
在一种具体实施方案中，重组酶例如是Cre、Flp重组酶等等。Cre和Flp是两种最常用的酶，其仅作用于非常特异的DNA序列。Cre催化两个34碱基对长的loxP位点之间的DNA重组，而Flp靶定frt位点。美国专利号4,959,317中描述了Cre重组酶用于真核细胞中DNA的位点特异性重组的用途。美国专利号6,632,672中描述了位点特异性重组酶用于转染真核细胞的用途。一般性的位点特异性重组描述于美国专利号4,673,640中。基于Cre/loxP的克隆系统可通过商业途径获得，例如，从BD Biosciences-Clontech，Palo Alto，California(CreatorTM)。或者Invitrogen，Carlsbad，California(EchoTM)购买。
在另一实施方案中，重组酶可以是选自整合酶、φC31、TP901-1和R4构成的组的噬菌体编码的位点特异性重组酶。φC31和R4属于位点特异性重组酶的整合酶家族，而TP901-1属于广义上的(extended)解离酶家族。R4整合酶是来自Streptomyces parvulus的噬菌体R4基因组的位点特异性单向重组酶。位点特异性整合酶TP901-1由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.cremori)的噬菌体TP901-1编码。λ噬菌体是感染大肠杆菌的温和噬菌体。该噬菌体具有一个重组附着位点(attP)并且大肠杆菌细菌基因组具有一个重组附着位点(attB)。在本发明的上下文中，野生型重组位点可以例如来自重组系统并且与异源序列结合。从而，可以将attB位点置于其它系统中作为整合酶的底物。在再一种实施方案中，重组酶可以催化细菌基因组重组位点(attB)和噬菌体基因组重组位点(attP)之间的重组，或者第一个位点可以包含假-attB位点和/或第二个位点可以包含假-attP位点，或者反之亦然(Groth等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，2000，97：5995-6000；Olivares等人，Nature Biotechnol.2002，20(11)：1124-8)；(Thyagarajan等人，Mol.and Cell.Biol.，2001，21：3926-3934)；Hollis 等人，Repro.Biol.and Endocrinol.，2003，1：79.“假重组位点”指重组酶可以促进重组的位点，尽管该位点可以不具有与它的野生型重组位点的序列相同的序列。
在再一种实施方案中，重组酶可以是转座酶或者逆转座酶。转座酶或者逆转座酶是通过剪切和粘贴机制催化它们的转座的酶，它们可以用于任何转基因的转移或者插入。它们提供了将任何DNA序列插入或者转移到宽范围的物种的基因组中的非病毒和非同源方法，所述物种包括脊椎动物，像人、鸟、啮齿类等等。例如，已表明果蝇元件marineri能将它自身转座到鸡种系中，Sherman等人，Nature Biotechnol.，16：1050-1053(1998)。Yant等人，Nature Genetics，25：35-41(2000)；Dupuy等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，99：4495-4499(2002)和Geurts等人，Mol.Therapy，8：108-117(2003)等人已经阐明了使用睡美人转座酶系统获得的长期转基因表达或者转座子DNA向哺乳动物系统(例如小鼠和人基因组)的有效插入。已经表明其它转座子例如L1、Tol2Tc1、Tc3，Mariner(Himar 1)、Mariner(mos 1)、Minos在脊椎动物物种中有活性，因此其可用于基因转移或者作为插入诱变载体，Largaespada，David A.，Repro.Biol.and Endocrinol.，1：80(2003)。示例性转座酶包括但不限于，原核生物或者真核生物转座酶、病毒、果蝇copia样或非病毒反转录转座子，其包括哺乳动物反转录转座子等等。原核生物转座酶包括Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn9、Tn10、Tn30、Tn101、Tn501、Tn903、Tn1000、Tn1681、Tn2901等等的可转座元件中编码的转座酶。转座酶还可以选自Mp、Spm、En、dotted、Mu、和I转座元件。
在本发明的一方面，侧翼有上述位点特异性重组酶识别位点的自杀基因用于选择性杀死内源B细胞。自杀基因侧翼有重组位点导致：当重组酶或者转座子仅在外源B细胞中表达时，内源基因失活。自杀基因表达的失活可以通过切除自杀基因或者其部分来完成。备选地，可以靶定自杀基因表达必需的序列用于切除。根据另一方面，由于转座子跳动(jumping)、转座子插入或者倒位，通过DNA片段的倒位或者插入可以失活自杀基因表达。
用于本发明实践中的自杀基因包括毒素基因和产生毒性产物的、非毒性的前体药物转化酶。可以用于本发明方法中的活性毒素和其片段包括例如，细菌毒素或者其片段(例如白喉毒素链A(DTA))、志贺毒素(Shiga)、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)等等，或者植物或真菌毒素和它们的非结合活性片段，例如蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白II A链、α-帚曲毒素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素、依诺霉素(enomycin)和tricothecenes、杀昆虫毒素、爬行动物毒液，等等。在一种优选实施方案中，使用的毒素是白喉毒素链A(DTA)。
当导入靶标B细胞的自杀基因是前体药物转化酶时，该酶激活特异非毒性前体药物以产生毒性代谢物，所述毒性代谢物最终杀死靶标B细胞。在该方法中，可以设计两步处理方法以抑制内源B细胞产生。在第一步中，可以以本领域已知的多种方法表达外源酶的基因或者将其递送到B细胞中。在第二步中，施用于动物的前体药物被表达该酶的B细胞活化成毒性代谢物，最终杀死该细胞。
可用作自杀基因的前体药物转化酶一般在两个主要类别中发现。第一类是非哺乳动物来源的酶，其具有或者没有人对应物。例子包括病毒胸苷激酶(TK)、细菌胞嘧啶脱氨酶(CD)、细菌羧肽酶G2(CPG2)、嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、硝基还原酶(NR)、D-氨基酸氧化酶(DAAO)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)、青霉素-G酰胺酶(PGA)、β-内酰胺酶、多种药物活化酶(MDAE)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、辣根过氧化物酶(HRP)和脱氧核糖核苷酸激酶(DRNK)。第二类由人来源的酶组成。这些包括脱氧胞苷激酶(dCK)、羧酸酯酶(CEs)、羧肽酶A(CPA)、β-葡糖醛酸糖苷酶(-Glu)和细胞色素P450(CYP)同工酶。酶-前体药物系统的额外例子在通过参考引入本文的Methods in Molecular Medicine：Suicide GeneTherapy，Methods and Reviews，Caroline J Springer编著，HumanaPress，2004的表1中列出。从而，用作本发明中的自杀基因的前体药物转化酶包括但不限于，如上述的非哺乳动物、非人来源和人来源的酶。
用于本发明的合适的前体药物包括但不限于更昔洛韦、阿昔洛韦、5-(吖丙啶-1-基)-2，3二硝基苯甲酰胺、卡培他滨(capecitabine)、伊立替康(irinotecan)、基于氨基甲酸酯-的20(S)-喜树碱、二硝基苯甲酰胺氮丙啶CB 1954和其氮芥类似物SN 23862、2-氨基蒽(2-AA)和4-甘薯黑疤霉醇(4-IM)，等等。用于本发明的前体药物和它们的对应的酶的额外例子在通过参考引入本文的Methods in Molecular Medicine：Suicide Gene Therapy，Methods andReviews，Caroline J Springer编著，Humana Press，2004的表1中列出。酶激活的前体药物有时可以与其它细胞杀伤方法，例如，与辐射致敏药物例如依他硝唑、fluosol、迷索硝唑、硝唑吗啉、替莫泊芬、替拉扎明或者与其它凋亡物质如胱天蛋白酶一起使用，导致杀死靶内源表达Ig的B细胞的协同作用。
从而，通过多种机制表达内源基因可以消除表达内源免疫球蛋白的B细胞。例如，DTA的表达导致对蛋白质合成的抑制和随后的细胞死亡。胸苷激酶将更昔洛韦和阿昔洛维磷酸化成它们的对应的单磷酸盐形式，所述形式随后被细胞激酶转化成毒性三磷酸盐衍生物。毒性三磷酸盐向正分裂的细胞的DNA的掺入导致细胞死亡。硝基还原酶将5-(吖丙啶-1-基)-2，3二硝基苯甲酰胺转化成2-和4-羟氨基衍生物，由此4-羟氨基衍生物与细胞硫酯的非酶促反应产生有效的细胞毒性双功能烷化剂，其能够交联DNA。本领域已知的自杀基因可用于本发明中，不受这些自杀基因清除内源B细胞的机制的束缚或者限制。
在本发明的一种优选实施方案中，自杀基因编码侧翼有野生型或者假-重组位点(例如，Cre识别的lox P位点或者Flp识别的FRT位点)的白喉毒素链A(DTA)。
在本发明的另一实施方案中，自杀基因编码侧翼有野生型或者假重组位点的胸苷激酶。
在一种实施方案中，在导入人Ig基因座-自身切割肽-重组酶转基因之前、同时或者之后，将侧翼有位点特异性重组酶识别位点的自杀基因导入动物中不同的转基因载体上。在另一实施方案中，将侧翼有位点特异性重组酶识别位点的自杀基因导入与人Ig基因座-重组酶转基因导入动物中的转基因载体相同的转基因载体上。在所有方面，自杀基因整合进动物的基因组并且它的表达受到免疫细胞特异性启动子的驱动，确保它仅在免疫细胞中特异表达或者优选地，受到B细胞特异性启动子驱动，确保它仅在B细胞中特异表达，并且不在其它细胞类型中表达。
通过B细胞特异性启动子控制自杀基因的表达，使得它的表达在非人转基因动物的非B细胞或者组织中被“关闭”。控制B细胞特异基因表达的启动子(和增强子)或者其变体或者工程化部分可用于自杀基因的此类B细胞特异性表达。B细胞特异基因的启动子/增强子的例子包括但不限于，CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72、Blimp-1、CD79b(也称作B29或Igβ)、mb-1(也称作Igα)、酪氨酸激酶blk、VpreB、免疫球蛋白κ轻链、免疫球蛋白λ轻链、免疫球蛋白J链等等的启动子/增强子。在一种优选实施方案中，κ轻链启动子/增强子驱动自杀基因的B细胞特异性表达。
从而，对内源免疫球蛋白的产生的抑制导致人(源化)Ig转基因座的显性表达。换句话说，耗竭内源B细胞导致人(源化)抗体的富集。优选地，外源B细胞的富集接近100％。
在本发明的再一个方面，转基因编码免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链或者其部分。基因座可以为种系结构(germlineconfiguration)或者重排的形式。编码序列或者其部分可以编码人免疫球蛋白，导致人(源化)抗体的表达。
编码人(源化)抗体的转基因含有Ig基因座或者含有一个或几个人Ig片断(例如，人Ig V、D、J或C基因片断)的、Ig基因座的大部分。备选地，转基因是人免疫球蛋白基因座或者其大部分。含有此类人Ig基因座或者此类修饰的Ig基因座或者Ig基因座的修饰的部分的转基因也在本文中称作“人(源化)I转基因座”，其能够在转基因非人动物中经历基因重排，从而产生具有人免疫球蛋白多肽序列的至少一部分的抗体的多样化所有组成成分。
免疫球蛋白重链和轻链基因包含个体基因编码的一些片断，它们由内含子序列分开。从而人免疫球蛋白重链的基因在染色体14上发现。重链的可变区(VH)包含三个基因片断：V、D和J片断，接着是编码C区的多个基因。V区被大间隔序列(spacer)的C区分开，编码V、D和J片断的个体基因也被间隔序列分开。
有两种类型的免疫球蛋白轻链：κ和λ。人κ轻链基因被发现在2号染色体上，人λ轻链的基因在22号染色体上。抗体轻链的可变区包括V片断和J片断，它们由单独的基因片断编码。在κ轻链基因的种系构型中，在约100-200个V区基因线性排列，每个基因有其自身的前导序列，接着是约5个J基因片断，和C区基因片断。所有V区都被内含子分开，并且内含子还分开V、J和V区基因片断。
免疫系统保护免受感染的能力在于其特化而产生抗体的多样化所有组成成分的遗传机制。B细胞的抗体编码基因以下述方式装配，所述方式使得允许可变(V)区中结合位点的无数组合。估计从此类机制产生1012种以上可能的结合结构。在所有动物，包括人类中，抗体产生过程以重组免疫球蛋白(Ig)基因座的可变(V)、多样化(D)和结合(J)片段开始。该步骤后，取决于动物物种，两种一般性机制用于产生抗体的种种结合结构。
在一些动物如人和小鼠中，在免疫球蛋白重链基因座上有V、D和J基因片断的多个拷贝，在免疫球蛋白轻链基因座上有V和J基因片断的多个拷贝。主要通过基因重排在这些动物中产生抗体多样性，基因重排即基因片断的不同组合，以形成重排的重链可变区和轻链可变区。然而，在其它动物(例如，兔、鸟类，例如，鸡、鹅和鸭、绵羊、山羊和奶牛)中，基因重排在抗体多样性的产生中起较小的作用。例如，在兔中，仅仅非常有限数目的V基因片断，最通常V区的3’末端的V基因片断，用于基因重排中以形成连续VDJ片断。在鸡中，仅一个V基因片断(与D区相邻的片断，或者“3’邻近的V基因片断”)、一个D片断和一个J片断用于重链重排；仅一个V基因片断(3’相邻的V片断)和一个J片断用于轻链重排。从而，在这些动物中，连接多样化引起的最初重排的可变区序列中有很小的多样性。通过基因转变实现重排Ig基因的进一步多样化，基因转变中，来自上游V基因片断的短序列代替重排Ig基因中V基因内的短序列。通过超突变可以产生抗体序列的额外多样化。
免疫球蛋白(抗体)属于5类(IgG，IgM，IgA，IgE，和IgD)，每一类在免疫防御中具有不同的生物学作用。在血液中最丰富的和应答感染最有效的是IgG类。在人IgG类中，有四个亚类(IgG1，IgG2，IgG3和IgG4同种型)，其通过包含Fc结构域的重链恒定区的结构确定。抗体的F(ab)结构域结合抗原上的特定序列(表位)，而抗体的Fc结构域募集和激活免疫系统的其它组分以清除抗原。
天然抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每条轻链通过共价二硫键连接到重链，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一个末端具有可变结构域(VH)，接着是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐，轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面(Chothia等人，J.Mol.Biol.186：651(1985)；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：4592(1985))。
术语“可变”指抗体之间可变结构域的某些部分在序列上差别很大以及用于每种具体抗体对其特定抗原的结合和特异性这一事实。然而，可变性在抗体的可变结构域各处并不均匀分布。它集中在轻链和重链可变结构域中称作互补决定区(CDR)或者高变区的三个片断中。可变结构域的较高度保守的部分称作构架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域每个包含四个FR区，由三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR区密切保持在一起，并且使用来自其它链的CDR，促进形成抗体的抗原结合部位(见Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，National Institute of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是其显示出多种效应子功能，如抗体参与依赖抗体的细胞毒性。
人-动物转基因座的产生允许产生转基因动物，所述转基因动物以高产量表达多样化的高亲和性人(源化)(多克隆)抗体。通常，非人动物中免疫球蛋白(Ig)基因座的人源化涉及：一种或多种人Ig基因片断整合到动物的基因组中，以产生人(源化)免疫球蛋白基因座。从而，人(源化)重链基因座的产生涉及一种或多种V和/或D和/或J片断和/或C区片断向人基因组的整合。类似地，人源化Ig轻链基因座的产生涉及一种或多种V和/或J片断和/或C区片断向动物基因组的整合。
不管染色体位置，本发明的人(源化)Ig基因座在非人动物中能够经历基因重排和基因转变和超突变，从而产生人(源化)Ig分子的多样化所有组成成分。具有经历基因重排和基因转变的能力的Ig基因座也称作“功能性”Ig基因座，具有通过功能性Ig基因座产生的多样性的抗体也称作“功能性”抗体或者抗体分子的“功能性”所有组成成分。
一方面，其中抗体所有组成成分的多样化在生命早期停止的动物可用于本发明。B细胞从造血干细胞发育而来。在抗原接触前，B细胞经历一系列的成熟步骤并且其终产物是成熟B细胞，其表达独特的膜结合IgM，并且通常在其细胞表面表达IgD和其它细胞表面信号分子。尽管在人中，通过基因重排的抗体多样化在整个生命中发生，但在其它动物中，抗体所有组成成分的多样化在生命早期停止，通常在生命的第一个月停止。
在免疫球蛋白基因的重排在生命早期停止的动物中，杀死全部或者多数在该有限的生命期间内产生的B细胞导致内源免疫球蛋白产生被持久或者永久阻止。在含有一个或几个人或者人源化免疫球蛋白转基因座的转基因动物中，这使得动物不产生内源免疫球蛋白时，产生人或者人源化的免疫球蛋白。这样，内源免疫球蛋白的表达可以在基因重排在生命早期停止的动物中被有效抑制。此类动物的例子是，兔、鸟类(例如鸡)、绵羊、山羊、牛、猪和马，但不限于此。
根据本发明，通过向动物的一种或多种受体细胞导入一种或多种上述转基因载体(载体之一携带人(源化)Ig基因座)，并且从经遗传修饰的一种或多种受体细胞产生动物，制备能够产生人(源化)免疫球蛋白的转基因动物。
受体细胞可以例如，来自非人动物，其通过基因转变和/或超突变产生抗体多样性，例如，鸟(如鸡)、兔、奶牛等等。在此类动物中，3’邻近的V基因片断优选用于产生免疫球蛋白。人V基因片断向转基因载体上Ig基因座的整合导致多数免疫球蛋白中人V区多肽序列的表达，所述整合是通过替换动物的3’邻近V基因片断或者通过与3’邻近V基因片断靠近放置来实现的。备选地，可以将重排的人V(D)J片断插入转基因载体上免疫球蛋白基因座的J基因座中。
可以将含有下述目的基因的转基因载体导入一种或多种受体细胞，然后通过随机整合或者通过定向整合整合进一种或多种受体细胞的基因组中，所述目的基因含有人(源化)的Ig基因座和自杀基因。
对于随机整合，可以通过标准转基因技术向动物受体细胞导入含有人(源化)Ig基因座的转基因载体。例如，可以将转基因载体直接注射到受精卵母细胞的前核(pronucleus)中。还可以通过在卵母细胞受精前将精子与转基因载体共同温育来导入转基因载体。可以从受精的卵母细胞发育转基因动物。导入转基因载体的另一种方法是：通过转染胚胎干细胞以及随后将遗传修饰的胚胎干细胞注射到发育的胚胎中。备选地，可以将转基因载体(裸露的或者与促进试剂组合)直接注射到发育的胚胎中。最后，从胚胎产生嵌合转基因动物，所述胚胎含有整合到转基因动物的至少一些体细胞的基因组的人(源化)Ig转基因。
在一种特定实施方案中，将含有人(源化)Ig基因座的转基因随机整合进从具有内源免疫球蛋白基因表达受损的动物品系获得的受体细胞(如受精的卵母细胞或者发育的胚胎)的基因组中。此类动物品系的使用允许优先表达来自人(源化)转基因Ig基因座的免疫球蛋白分子。此类动物的例子包括Alicia和Basilea兔品系，以及agammaglobinemic鸡品系，以及免疫球蛋白敲除小鼠。备选地，具有人(源化)免疫球蛋白转基因或者基因座的转基因动物可以与具有内源免疫球蛋白表达受损的动物品系交配。可以得到对于受损的内源Ig基因座和人(源化)转基因Ig基因座纯合的后代。
为进行定向整合，可以将转基因载体整合进合适的动物受体细胞，如胚胎干细胞或者已经分化的体细胞中。之后，可以通过标准方法选择出其中转基因已经整合进动物基因组并且已经通过同源重组替换对应的内源Ig基因座的细胞。见例如，Kuroiwa等人，Nature Genetics2004，June 6。然后所选的细胞可以与去核的核转移单位细胞(如卵母细胞或者胚胎干细胞)融合，胚胎干细胞是全能细胞，其能够形成功能的新生儿。根据成熟的常规技术进行融合。还可以使用注射移液器通过显微外科手术来进行对卵母细胞的去核和核转移。(见，例如，Wakayama等人，Nature(1998)394：369.)。然后将所得卵细胞在合适的培养基中培养，并转移到同步化的受体中用于产生转基因动物。备选地，可以将所选的经遗传修饰的细胞注射到发育的胚胎中，所述胚胎随后发育成嵌合动物。
因此，根据本发明，能够产生人(源化)免疫球蛋白的转基因动物可以如下产生：向一种或多种细胞导入一种或多种本文上述的重组载体，所述载体之一携带人Ig基因片断，该片断连接到与内源Ig基因片断的侧翼序列同源的5’和3’侧翼序列，然后选择出其中内源Ig基因片断通过同源重组被人Ig基因片断置换的细胞，并从所选的一种或多种经遗传修饰的受体细胞产生动物。
类似于转基因载体的定向插入，适于用作该方法中的受体细胞的细胞包括胚胎干细胞或者已经分化的体细胞。可以将携带人Ig基因片断的重组载体通过任何可行的方法(如转染)导入此类受体细胞中。之后，可以通过标准方法选择出下述细胞，所述细胞中人Ig基因片断已经通过同源重组替换了对应的内源Ig基因片断。这些经遗传修饰的细胞可以用作用于克隆转基因动物的受体转移步骤中的核供体细胞。备选地，可以将所选的经遗传修饰的胚胎干细胞注射到发育的胚胎中，该胚胎可以随后发育成嵌合动物。
在一种特定实施方案中，可以将本发明的转基因构建体在胚胎生命期间导入转基因动物，这可以通过直接将转基因导入胚胎中，或者间接将它们注射到妊娠母亲或者注射到产卵的母鸡中来实现。结果，可以耗竭表达动物的免疫球蛋白分子的内源B细胞，所以转基因后代将应答抗原免疫而主要产生人(源化)抗体。
通过前述方法中任一种产生的转基因动物形成本发明的另一实施方案。转基因动物在基因组具有至少一个，即一个或多个人(源化)的Ig基因座和自杀基因，从所述基因座产生人(源化)抗体的功能所有组成成分。
在一种特定实施方案中，本发明提供了在基因组中具有一个或多个人(源化)的Ig基因座和自杀基因的转基因兔。本发明的转基因兔能够进行对人(源化)的Ig基因座的重排和基因转变，并表达人(源化)抗体的功能的所有组成成分。
在另一特定实施方案中，本发明提供了在基因组中具有一个或多个人(源化)的Ig基因座和自杀基因的转基因鸡。本发明的转基因鸡能够进行对人(源化)的Ig基因座的重排和基因转变，并表达人(源化)抗体的功能的所有组成成分。在另一特定实施方案中，本发明提供了在基因组中具有一个或多个人(源化)的V区和自杀基因的转基因小鼠。该人(源化)的V区包含侧翼有非人间隔区序列的至少两个人V基因片断。转基因小鼠能够重排人V元件并且表达抗体的功能的所有组成成分。
用抗原免疫导致在所述转基因动物中产生针对该相同抗原的人(源化)抗体。
尽管本发明的优选的实施方案涉及转基因动物，该动物具有人(源化)的Ig基因座和用于耗竭内源B细胞的至少一种自杀基因，并产生人(源化)多克隆抗血清，但是应当理解：具有灵长类化(primatized)Ig基因座和灵长类化的多克隆抗血清的转基因动物也在本发明的精神内。类似于人(源化)多克隆抗血清组合物，灵长类化的多克隆抗血清组合物也可能在人类个体中具有降低的免疫原性。
一旦产生了能够产生人(源化)免疫球蛋白分子的转基因非人动物(如下文进一步描述)，就可以通过用抗原免疫动物，容易地得到人(源化)免疫球蛋白和人(源化)抗体制备物。多种抗原可以用于免疫转基因宿主动物。此类抗原包括，活的、减毒的或死亡的微生物，例如，病毒和单细胞生物(如细菌和真菌)、微生物碎片，或者从微生物分离的抗原性分子。
用于免疫动物的优选的细菌抗原包括从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)纯化的抗原，如5和8型荚膜多糖、重组形式的毒力因子，如α毒素、黏附素结合蛋白、胶原结合蛋白，和纤连蛋白结合蛋白。优选的细菌抗原还包括减毒的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肠球菌、肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，或者这些细菌细胞的培养上清液。可以用于免疫的其它细菌抗原包括从铜绿假单胞菌、肠球菌、肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)纯化的脂多糖(LPS)、荚膜抗原、荚膜多糖和/或重组形式的外膜蛋白、纤连蛋白结合蛋白、内毒素和外毒素。
用于产生针对真菌的抗体的优选抗原包括减毒形式的真菌或者其外膜蛋白，所述真菌包括但不限于白假丝酵母(Candida albicans)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)和新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)。
用于免疫以产生针对病毒的抗体的优选抗原包括病毒的包膜蛋白和减毒形式，所述病毒包括但不限于，呼吸道合胞病毒(RSV)(尤其是F蛋白)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)、EBV和HSV。
用分离的肿瘤细胞或者肿瘤细胞系、肿瘤相关抗原免疫转基因动物可以产生用于治疗癌症的治疗性抗体，所述肿瘤相关抗原包括但不限于：Her-2-neu抗原(针对该抗原的抗体可用于治疗乳腺癌)；CD19、CD20、CD22和CD53抗原(针对该抗原的抗体可以用于治疗B细胞淋巴瘤)，(3)前列腺特异的膜抗原(PMSA)(针对该抗原的抗体可以用于治疗前列腺癌)，和17-1A分子(针对该分子的抗体可以用于治疗结肠癌)。
可以通过任何常规方式，使用或者不用佐剂，将抗原施用于转基因宿主动物，并且可以根据预定的方案施用。
免疫后，可以对经免疫的转基因动物的血清或者奶进行分级分离，用于纯化药物级的对该抗原特异的多克隆抗体。对于转基因鸟，可以通过对卵黄分级分离来制备抗体。通过层析(亲和、离子交换、凝胶过滤等等)，用盐(如硫酸铵)、有机溶剂(如乙醇)或者聚合物(如聚乙二醇)选择性沉淀可以得到纯化的免疫球蛋白级分。
经分级分离的人(源化)抗体可以在无毒性的无致热原的适于静脉内施用于人的介质中溶解或者稀释，所述介质例如无菌缓冲盐水。
用于施用的抗体制剂通常特征是具有0.1到100mg/ml，更通常1到10mg/ml的免疫球蛋白浓度。抗体制剂可以含有多种同种型的免疫球蛋白。备选地，抗体制剂可以含有仅一种同种型或者多种所选的同种型的抗体。
为了制备人(源化)单克隆抗体，从经免疫的转基因动物分离脾细胞，所述动物的表达该动物的内源免疫球蛋白的B细胞已经被耗竭。分离的脾细胞与转化的细胞系用于细胞融合以产生杂交瘤，或者通过标准分子生物学技术克隆编码抗体的cDNA并在转染的细胞中表达。制备单克隆抗体的方法是本领域中成熟的。见例如，欧洲专利申请0 583 980 A1(“Method For Generating Monoclonal Antibodies FromRabbits”)，美国专利号4,977,081(“Stable Rabbit-Mouse HybridomasAnd Secretion Products Thereof”)，WO 97/16537(“Stable Chicken B-cell Line And Method of Use Thereof”)，和EP 0 491 057 B1(“Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G”)，通过引用将它们的公开内容引入本文。Andris-Widhopf等人，“Methods forthe generation of chicken monoclonal antibody fragments by phagedisplay”，J Immunol Methods 242：159(2000)，和Burton，D.R.，“Phagedisplay”，Immunotechnology 1：87(1995)已经描述了从克隆的cDNA分子体外产生单克隆抗体，通过引用将所述文献的公开内容引入本文。
在多数情形中，抗体制剂由从动物制备的未经修饰的免疫球蛋白，例如人(源化)抗体组成，所述抗体没有额外的修饰(例如，通过化学或者酶)。备选地，可以对免疫球蛋白级分进行处理，如酶消化(例如，用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶、糖苷酶、核酸酶等等)、加热，等等和/或进一步分级分离。
本发明的优选的实施方案涉及对产生人源化抗体的转基因非人动物中内源免疫球蛋白产生加以抑制的方法，这允许富集目的人(源化)免疫球蛋白。在一种实施方案中，使用本领域已知的方法，向转基因动物中导入包含人(源化)免疫球蛋白基因、自身切割肽和重组酶的转基因，确保在称作外源B细胞的B细胞中同时表达该人(源化)免疫球蛋白和重组酶基因。本文描述或本领域公知的任一种重组酶、自身切割肽或者免疫球蛋白基因可以用于转基因中。进一步在该实施方案中，通过在表达内源免疫球蛋白的B细胞中选择性表达自杀基因，实现对内源免疫球蛋白产生的抑制，并且因此B细胞由于细胞死亡而耗竭。相应地，由于转基因的表达，通过重组酶介导的机制将自杀基因从外源B细胞的基因组切除。从而，外源B细胞存活并且生产性产生转基因编码的人(源化)免疫球蛋白。前面描述的不同的自杀基因和本领域已知的那些是本发明的实施方案。在该实施方案的一方面，自杀基因通过转基因导入转基因动物的基因组中，并且它们的表达受到免疫细胞特异性启动子，优选受到B细胞特异性启动子的驱动，以在B细胞中选择性表达自杀基因，从而防止非B细胞群体的不必要的细胞死亡。本文描述或本领域公知的多种免疫细胞和B细胞特异性启动子可以用于在B细胞中选择性表达自杀基因。在另一实施方案中，用于本发明的转基因动物是基因转变动物，或者其可以通过基因重排经历抗体多样化，该基因重排在生命的早期停止。此外，使用上述方法产生的转基因载体和转基因动物是本发明的实施方案。
通过下面的实施例进一步阐明本发明，但是本发明不受到这些实施例的限制。
实施例1
floxed DT-A表达载体的构建
为了实现DT-A自杀基因的B细胞特异性表达，修饰编码兔κ1的BAC克隆179L1(Genebank检索号AY495827)。通过ET克隆，亚克隆包含κ1基因座的BAC克隆的46kb片段，该片段从V1下游的间隔区到J基因座、内含子增强子、编码恒定区的外显子、3’增强子到3’增强子下游的序列。用与BAC 179L1有50bp同源性的引物，通过PCR，扩增具有额外的庆大霉素选择盒的pBELOBAC载体骨架。正向引物还具有AttB整合酶识别位点和PvuI限制酶识别位点。反向引物还具有PvuI限制酶识别位点。
用于扩增经修饰的pBELOBAC 11的引物正向SEQ ID NO：1 5′GGACCAGTTTACAATCCCACCTGCCATCTAAGAAA GCTGGTCTCATCGTGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTGGG GGCGCGCGATCGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAA3′反向SEQ ID NO：2 5′ACTTTTGCAGGTAGAGGGGTTTGTCTGTAGGGAAAT TCTGAACAATCATACGATCGAAGATGCGTGATCTGATCCTTC AACTCA3′合成的DT-A片段SEQ ID NO：3cataattggacaaactacctacagagatttaaagctctaaggtaaatataaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattcctaattgtttgtgtattttagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcagatccactaggatctaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcataacttcgtatagcatacattatacgaagttatagttcatttgaagtttttaaagtgaacctcagtgactttgggatgtgaactctccgagtagaagcatgcgcactgcaggtaaacttgtgcagccctggtctgagctggggcagctggagacacagcccctgggctgagttctgagctgccctgggcccttcagctgggcacagccctgccccgcccctgctcatttgcatgtccccagagcaccacccacctctctgggcatttaggagcaggctgctcccgccccatgcaggaggcagtgccaggcaggacccagcatggaccctgatgatgttgttgattctaaatcttttgtgatggaaaacttttcttcgtaccacgggactaaacctggttatgtagattccattcaaaaaggtatacaaaagccaaaatctggtacacaaggaaattatgacgatgattggaaagggttttatagtaccgacaataaatacgacgctgcgggatactctgtagataatgaaaacccgctctctggaaaagctggaggcgtggtcaaagtgacgtatccaggactgacgaaggttctcgcactaaaagtggataatgccgaaactattaagaaagagttaggtttaagtctcactgaaccgttgatggagcaagtcggaacggaagagtttatcaaaaggttcggtgatggtgcttcgcgtgtagtgctcagccttcccttcgctgaggggagttctagcgttgaatatattaataactgggaacaggcgaaagcgttaagcgtagaacttgagattaattttgaaacccgtggaaaacgtggccaagatgcgatgtatgagtatatggctcaagcctgtgcaggaaatcgtgtcaggcgatctctttgacataattggacaaactacctacagagatttaaagctctaaggtaaatataaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattcctaattgtttgtgtattttagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcagatccactaggatctaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcgaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcataacttcgtatagcatcattatacgaagttat用于扩增合成的DT-A片段的引物正向SEQ ID NO：45′acataaatatactgtcttcaggatcttagagctcacctaaggaaacaagcataattggacaaactacctacagag 3′反向SEQ ID NO：55′aaacctactcatttacccacttttataaaatttctacttaaaagtgaatcataacttcgtataatgtatgctatacg3′
对于ET克隆，将PCR产物转化到链霉素抗性大肠杆菌菌株中，该菌株含有BAC 179L1和可诱导的λ噬菌体重组酶Redα、Redβ和γ。这些重组蛋白从共转染的质粒(具有质粒pSC101-γβα的DH10B大肠杆菌)或者从基因组整合的λ原噬菌体(DY380大肠杆菌菌株)表达。用庆大霉素选择阳性克隆179L1(46kb)并通过限制酶消化验证。
化学合成从5’到3’由两个SV40多聚A位点-loxP位点-兔κ1启动子-DT-A-FRT位点-loxP位点-两个SV40多聚A位点组成的DNA片段。通过FLP-介导的整合向FRT-位点引入卡那霉素选择盒。用与179L1(46kb)的亚克隆的46kb片段具有50bp同源性的引物PCR扩增合成的片段。通过ET-克隆对合成的DT-A片段改变J基因座。使用卡那霉素选择阳性克隆并通过限制酶分析验证。
再次通过FLP-介导的重组除去卡那霉素选择盒。通过卡那霉素抗性的丧失选择阳性克隆并通过限制酶消化和测序来验证。
最终的构建体由V1下的间隔区、合成的DT-A片段、内含子增强子、编码恒定区的外显子、3’增强子到3’增强子的下游序列组成。
该构建体用于产生转基因动物。
实施例2
对编码由膜形式的IgM、2A自身切割肽、Cre-重组酶组成的融合蛋白的人(源化)重链基因座的构建
使用对恒定、可变和连接基因片断或者3’增强子区特异的探针，从基因组DNA文库分离含有兔免疫球蛋白重链基因座序列的F黏粒克隆和BAC。对分离的BACs 27N5(Genebank检索号AY386696)、219D23(Genebank检索号AY386695)、225P18(Genebank检索号AY386697)、38A2(Genebank检索号AY386694)和F黏粒Fos15B(Genebank检索号AY3866968)测序(Ros等人，Gene 330，49-59)。
所选的免疫球蛋白编码序列与对应的人对应物通过ET克隆通过大肠杆菌中的同源重组进行交换(E-Chiang Lee等人，Genomics 73，56-65；Daiguan Yu等人，PNAS97，5978-5983；Muyrers等人，Nucleic Acids Research 27，1555-1557；Zhang等人，NatureBiotechnology 18，1314-1317)。
备选地，通过体外连接并随后转化大肠杆菌重组DNA片段。通过体外连接和转化、ET克隆或者通过Cre重组酶介导的整合组合BAC和/或Fos15B或者其部分。
对于ET克隆，将含有靶序列的载体转化进含有可诱导的λ噬菌体重组酶Redα、Redβ和γ的链霉素抗性大肠杆菌菌株中。这些重组蛋白从共转染的质粒(具有质粒pSC101-γβα的DH10B大肠杆菌)或者从基因组整合的λ原噬菌体(DY380大肠杆菌菌株)表达。ET克隆步骤包括两个同源重组步骤。
在第一步中，靶基因座被选择-反选择盒(例如，赋予对新霉素(neo)抗性和对链霉素(rpsL)敏感性的neo-rpsL)置换。分离neo-抗性菌落后，通过限制酶分析和部分测序来证实通过同源重组的对选择盒的插入。
在第二步中，rpsL-neo选择盒与新的序列交换。通过限制性分析和测序分析链霉素抗性克隆。用于ET克隆步骤的片段具有20到50bp长的侧翼序列，其与靶序列相同。用于连接的序列在它们的3’和5’末端具有合适的限制酶位点。这些位点是天然发生的位点或者它们是使用含有合适位点的引物通过PCR引入的。
备选地，合成产生序列。
通过ET克隆，将兔JH、BAC 219D23中的Cμ和BAC 27N5中的Cγ用它们的对应的人对应物置换来构建体人源化重链。通过PCR从人基因组DNA扩增用于ET克隆步骤的人序列。
使用与兔靶序列具有50bp同源性的引物扩增人Cμ、Cγ和JH基因片断。
区域SEQ ID Nos.序列CmSEQ ID NO：65’AAACAGCTTTTCACACCTCCCCTTTCTCTCTTTGCTCCCCTGGGCCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCC3’CmSEQ ID NO：7 5’CAGGGTTAGTTTGCATGCACACACACACAGCGCCTGGTC ACCCAGAGGGGTCAGTAGCAGGTGCCAGCTGTGTCGGACA TG3’CgSEQ ID NO：8 5’GGTCAGGGGTCCTCCAGGGCAGGGGTCACATTGTGCCCC TTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC3’CgSEQ ID NO：9 5’CACAGCTGCGGCGTGGGGGGGGAGGGAGAGGGCAGCTCG CCGGCACAGCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC TTC3’JHSEQ ID NO：10 5’GTGTTATAAAGGGAGACTGAGGGGGCAGAGGCTGTGCTACTGGTACCTGGCTGAATACTTCCAGCACTGGGGCCAGG3’JHSEQ ID NO：11 5’GGCCACAGAAAAGAGGAGAGAATGAAGGCCCCGGAGAG GCCGTTCCTACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCT TG-3’
连接BAC克隆225P18与克隆219D23和BAC 27N5与F黏粒15B后，将连接的构建体转化进大肠杆菌中，并通过Cre重组酶介导的插入连接。这导致功能基因座，其由18个兔可变基因、兔D区、人J区、人Cμ、人Cγ、兔Cε、兔Cα4和3’增强子元件组成。
化学合成DNA片段，其由自身切割的F2A肽的编码序列和CDE重组酶(iCRE)的密码子优化的编码序列组成。
sEQ ID NOs.    合成的F2A-iCre片段SEQ ID NO：12gtgaagcagactttgaattttgaccttctcaagttggcgggagacgtggagtc caacccagggcccatggtgtgcccaagaagaagaggaaagtctccaacctgctgactgtg caccaaaacctgcctgccctgtggatgccacctctgatgaagtcaggaagaacctg atggacatgttcagggacaggcaggccttctctgaacacacctggaagatgctcctgtct gtgtgcagatcctgggctgcctggtgcaagctgaacaacaggaatggttccctgctgaa cctgaggatgtgagggactacctcctgtacctgcaagccagaggcctggctgtgaagac catccaacagcacctgggccagctcaacatgctgcacaggagatctggcctgcctcgcc cttctgactccaatgctgtgtccctggtgatgaggagaatcagaaaggagaatgtggatg ctggggagagagccaagcaggccctggcctttgaacgcactgactttgaccaagtcaga tccctgatggagaactctgacagatgccaggacatcaggaacctggccttcctgggcatt gcctacaacaccctgctgcgcattgccgaaattgccagaatcagagtgaaggacatctcc cgcaccgatggtgggagaatgctgatccacattggcaggaccaagaccctggtgtccac agctggtgtggagaaggccctgtccctgggggttaccaagctggtggagagatggatct ctgtgtctggtgtggctgatgaccccaacaactacctgttctgccgggtcagaaagaatgg tgtggctgccccttctgccacctcccaactgtccacccgggccctggaagggatctttga ggccacccaccgcctgatctatggtgccaaggatgactctgggcagagatacctggcct ggtctggccactctgccagagtgggtgctgccagggacatggccagggctggtgtgtcc atccctgaaatcatgcaggctggtggctggaccaatgtgaacatagtgatgaactacatca gaaacctggactctgagactggggccatggtgaggctgctcgaggatggggactga用于扩增F2A-iCRE片段的引物正向SEQ ID NO：13 5′tccattcccaacacatgaacagcatctcacgccacctctgttgcctgcagg  tgaagcagactttgaattttgaccttc-3′反向SEQ ID NO：14 5′cagggccacggcgggcttgtctcttggcctccgacatccttctcaggtcat  cagtccccatcctcgagcagcctcacc-3′
通过ET克隆将IgM的M2膜外显子与合成的M2-F2A-iCRE片段交换。
ET克隆步骤包括两个同源重组步骤。在第一步中，靶基因座被选择-反选择盒(例如，赋予对新霉素(neo)抗性和对链霉素(rpsL)敏感性的neo-rpsL)置换。为此，用与靶基因座具有50bp同源性的引物PCR扩增rpsL-neo选择盒。分离neo-抗性菌落后，通过限制酶分析和部分测序来证实通过同源重组的对选择盒的插入。
在第二步中，rpsL-neo选择盒与合成的M2-F2A-iCRE片段交换。通过链霉素抗性鉴定阳性克隆，并通过限制性分析和测序分析来分析。
所得BAC用于产生转基因动物。
实施例3
构建人源化轻链基因座
对兔基因组BAC文库的筛选导致对含有兔轻链K1基因片断(Genebank检索号AY495827，AY495826)的两种BAC(179L1和215M22)的鉴定。
通过如上述的ET克隆交换兔Cκ1与人Cκ同种异型Km3。
用具有与靶序列同源的50bp侧翼序列的PCR扩增人Cκ(同种异型Km3)。
区域    序列Ck Km3SEQ ID NO：15   5′GATGTCCACTGGTACCTAAGCCTCGCCCTCTGTGCTT    CTTCCCTCCTCAGGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC3’Ck Km3SEQ ID NO：16   5′GAGGCTGGGCCTCAGGGTCGCTGGCGGTGCCCTGGC    AGGCGTCTCGCTCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTG3
基于兔种系κ(b5；GenBank检索号K01363)的公布的序列设计同源性臂，并与Cκ的内含子-外显子边界匹配。
通过测序验证兔Cκ与BAC 179L1中人Cκ的交换。
通过两次ET克隆修饰BAC 179L1-huCk。用与BAC 179L1具有50bp同源性的引物扩增新霉素选择盒。正向引物额外具有i-CeuI大范围核酸酶位点。PCR产物用于ET克隆。用新霉素选择阳性克隆并通过限制酶消化和测序检查正确性。用含有与BAC 179L150bp同源的引物扩增zeocin选择盒。正向引物还具有i-CeuI大范围核酸酶位点。PCR产物用于ET克隆。用zeozin选择阳性克隆并通过限制酶消化和测序检查正确性。
通过一次ET克隆修饰BAC 215M22。用与BAC215M22具有50bp同源性的引物扩增庆大霉素抗性基因。正向引物额外具有i-CeuI大范围核酸酶位点。PCR产物用于ET克隆。用庆大霉素选择所得克隆并通过限制酶消化和测序检查正确性。
新霉素抗性基因的扩增正向SEQ ID NO：17 5′CTTTCTCTGTCCTTCCTGTGCGACGGTTACGCCG CTCCATGAGCTTATCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGC GATGGACAGCAAGCGAACCGGA-3反向SEQ ID NO：18 5′GGACCAGTTTACAATCCCACCTGCCATCTAAGA AAGCTGGTCTCATCGTGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3Zeocin抗性基因的扩增正向SEQ ID NO：19 5′CCCCCCCCGCCACTTCTCTTCTGTTTCGTTTAAGT TCTACACTGACATACTAGGGATAACAGGGTAATAACGTT TACAATTTCGCCTGATG-3反向SEQ ID NO：20 5′AGTGGGTAGGCCTGGCGGCCGCCTGGCCGTCGA CATTTAGGTGACACTATAGAAGGATCCTAGCACGTGTCA GTCCTGCT-3′
庆大霉素抗性基因的扩增正向SEQ ID NO：21 5′TTACGCCAAGCTATTTAGGTGACACTATAGA ATACTCAAGCTTTGATTGCTAACTATAACGGTCCTA AGGTAGCGATGAAGGCACGAACCCAGTTG-3′反向SEQ ID NO：22 5′GCGGAATTCTATGTCTAGTGGAGGGTGAAG CTGGTGATTATAGAGTGAAAATTACCCTGTTATCCCT ATCGGCTTGAACGAATTGTTAG-3′
用i-CeuI和i-SceI切割经修饰的BAC179L1和225M22。纯化并连接98kb和132kb的片段。所得克隆用卡那霉素和氯霉素选择并通过限制酶消化、含有i-SceI和i-CeuI限制性位点的区域的PCR，和测序检查正确性。所得BAC称作179-215-huCk。
通过ET克隆用合成的人重排的κ1 VJ基因置换BAC 179-215-huCk的兔Jk1和Jk2。化学合成具有兔启动子、兔前导序列、兔内含子和人VJ基因的DNA片段。优化合成的人VJ的密码子使用，以获得与兔Vκ基因最高的DNA序列同源性。
用与BAC 179L1具有50bp同源性的正向引物和与庆大霉素抗性基因具有同源性并且具有FRT位点的反向引物，PCR扩增合成的人VJ。用具有FRT位点的正向引物和与BAC 179L1具有50bp同源性并且具有FRT位点的反向引物，扩增庆大霉素抗性基因。使用合成的人VJ基因的正向引物和庆大霉素抗性基因的反向引物，通过重叠延伸PCR组合人合成的人VJ和庆大霉素抗性基因。所得片段用于ET克隆。用庆大霉素选择阳性克隆，通过限制酶消化和测序检查正确性。
用于扩增合成的人VJ的引物正向SEQ ID NO：23 5′CATAAATATACTGTCTTCCAGGATCTTAG AGCTCACCTAAGGAAACAAGAGTTCATTTGAAGT TTTTAAAGTG-3′反向SEQ ID NO：24 5′ACTCCAGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGA ATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCCTTTGATCT CCACCTTGGTC-3′用于扩增庆大霉素抗性基因的引物正向SEQ IDNO：25 5′GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCT AGAAAGTATAGGAACTTCTGGAGTTGTAGATCCT CTACG-3′反向SEQ IDNO：26 5′AAAACAAACCAATCAGGCAGAAACGGTG AGGAATCAGTGAAACGGCCACTTACGAAGTTCCT ATACTTTCTAGAGAATAGGAAGTTCGGAATAGGA ACTTCAAGATGCGTGATCTGATCC-3′
通过表达Flp重组酶进行位点特异重组，除去庆大霉素抗性基因。重组后，剩下一个FRT。通过ET克隆缺失FRT位点。通过PCR扩增来自合成的人VJ的232bp片段，将其用于ET克隆。所得菌落通过PCR筛选FRT位点的丧失，并通过测序证实。
通过ET克隆置换BAC179-215-huCk的新霉素抗性基因。使用与BAC 179-215-huCk具有50bp同源性的引物，通过PCR扩增庆大霉素抗性(pRep-Genta；GenebTidges)基因。正向引物还具有loxP位点、attB位点和PvuI限制性位点。所得克隆用庆大霉素选择，并通过限制酶消化和测序检查正确性。
所得的BAC用于产生转基因动物。
用于FRT位点缺失的引物正向SEQ ID NO：27    5′TTATGCTGCATCCAGTTTGC-3′反向SEQ ID NO：28    5′AAAACAAACCAATCAGGCAG-3′用于筛选的引物正向SEQ ID NO：29    5′TGTGACATCCAGATGAC-3′反向SEQ ID NO：30    5′AAAACAAACCAATCAGGCAG-3用于扩增庆大霉素抗性基因的引物正向SEQ ID NO：31 5′GGACCAGTTTACAATCCCACCTGCCATCTA AGAAAGCTGGTCTCATCGTGGTGCCAGGGCGTGCC CTTGGGCTGGGGGCGCGATAACTTCGTATAGCATAC ATTATACGAAGTTATCGATCGTGGAGTTGTAGATCC TCTACG-3′反向SEQ ID NO：32 5′TTACGCCAAGCTATTTAGGTGACACTATAG AATACTCAAGCTTTGATTGCAAGATGCGTGATCTGA TCCT-3′
实施例4
产生表达人源化重链免疫球蛋白的转基因小鼠和兔
通过将DNA注射到受精卵母细胞的前核中并将胚胎转移到代孕母亲中，产生转基因兔和小鼠，该转基因兔和小鼠含有处于κ轻链启动子/增强子序列控制下的人源化重链和轻链免疫球蛋白基因座和floxed白喉毒素A基因。通过PCR鉴定转基因建立者(Founder)动物。通过ELISA测量人(源化)免疫球蛋白M和G的表达。人源化IgG的表达为1-5mg/ml。小鼠和兔IgG的表达分别为1-5ug/ml。
实施例5
产生表达人源化重链免疫球蛋白的转基因鸡
通过睾丸介导的基因转移产生转基因鸡。将DNA构建体(50ug)与250ul脂转染试剂(superfect)在500ul 0.9％NaCl中混合，并注射进公鸡的睾丸中。三到四周后，通过PCR分析鉴定出具有转基因精子的雄鸡，将其并与母鸡交配。通过PCR鉴定转基因后代。人源化IgG的表达为1-5mg/ml。鸡IgY的表达为1-5ug/ml。
本公开全文中引用的所有参考文献和参考文献中引用的参考文献都明确通过引用并入本文。
尽管通过参考一些实施方案阐明了本发明，但是本发明不受到这些实施方案的限制。本领域技术人员将理解可以容易地得到多种修改，并且可以在本发明工作的方式不被实质性改变的情况下实践这些修饰。所有此类修改都意欲落入要求保护的本发明的范围内。
序列表
<110>THERAPEUTIC HUMAN POLYCLONALS，INC.
     BUELOW，ROLAND
     PLATZER，JOSEF
<120>对内源免疫球蛋白表达的抑制
<130>39691-0010
<140>TO BE ASSIGNED
<141>2005-10-21
<150>US 60/621,228
<151>2004-10-22
<160>32
<170>FastSEQ for Windows版本4.0
<210>1
<211>111
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>1
ggaccagttt acaatcccac ctgccatcta agaaagctgg tctcatcgtg gtgccagggc 60
gtgcccttgg gctgggggcg cgcgatcggt catagctgtt tcctgtgtga a          111
<210>2
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>2
acttttgcag gtagaggggt ttgtctgtag ggaaattctg aacaatcata cgatcgaaga 60
tgcgtgatct gatccttcaa ctca                                         84
<210>3
<211>1600
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的序列
<400>3
cataattgga caaactacct acagagattt aaagctctaa ggtaaatata aaatttttaa  60
gtgtataatg tgttaaacta ctgattccta attgtttgtg tattttagat tccaacctat  120
ggaactgatg aatgggagca gtggtggaat gcagatccac taggatctaa cttgtttatt  180
gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt  240
ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg  300
atcataactt cgtatagcat acattatacg aagttatagt tcatttgaag tttttaaagt  360
gaacctcagt gactttggga tgtgaactct ccgagtagaa gcatgcgcac tgcaggtaaa  420
cttgtgcagc cctggtctga gctggggcag ctggagacac agcccctggg ctgagttctg  480
agctgccctg ggcccttcag ctgggcacag ccctgccccg cccctgctca tttgcatgtc  540
cccagagcac cacccacctc tctgggcatt taggagcagg ctgctcccgc cccatgcagg  600
aggcagtgcc aggcaggacc cagcatggac cctgatgatg ttgttgattc ttctaaatct  660
tttgtgatgg aaaacttttc ttcgtaccac gggactaaac ctggttatgt agattccatt  720
caaaaaggta tacaaaagcc aaaatctggt acacaaggaa attatgacga tgattggaaa  780
gggttttata gtaccgacaa taaatacgac gctgcgggat actctgtaga taatgaaaac  840
ccgctctctg gaaaagctgg aggcgtggtc aaagtgacgt atccaggact gacgaaggtt  900
ctcgcactaa aagtggataa tgccgaaact attaagaaag agttaggttt aagtctcact  960
gaaccgttga tggagcaagt cggaacggaa gagtttatca aaaggttcgg tgatggtgct  1020
tcgcgtgtag tgctcagcct tcccttcgct gaggggagtt ctagcgttga atatattaat  1080
aactgggaac aggcgaaagc gttaagcgta gaacttgaga ttaattttga aacccgtgga  1140
aaacgtggcc aagatgcgat gtatgagtat atggctcaag cctgtgcagg aaatcgtgtc  1200
aggcgatctc tttgacataa ttggacaaac tacctacaga gatttaaagc tctaaggtaa  1260
atataaaatt tttaagtgta taatgtgtta aactactgat tcctaattgt ttgtgtattt  1320
tagattccaa cctatggaac tgatgaatgg gagcagtggt ggaatgcaga tccactagga  1380
tctaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc  1440
acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta  1500
tcttatcatg tctggatcga agttcctatt ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg  1560
aacttcataa cttcgtatag catacattat acgaagttat                        1600
<210>4
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>4
acataaatat actgtcttcc aggatcttag agctcaccta aggaaacaag cataattgga     60
caaactacct acagag                                                     76
<210>5
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>5
aaacctactc atttacccac ttttataaaa tttctactta aaagtgaatc ataacttcgt     60
ataatgtatg ctatacg                                                    77
<210>6
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
aaacagcttt tcacacctcc cctttctctc tttgctcccc tgggccctca gggagtgcat     60
ccgccccaac ccttttcc                                                   78
<210>7
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
cagggttagt ttgcatgcac acacacacag cgcctggtca cccagagggg tcagtagcag     60
gtgccagctg tgtcggacat g                                              81
<210>8
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
ggtcaggggt cctccagggc aggggtcaca ttgtgcccct tctcttgcag cctccaccaa    60
gggcccatcg gtc                                                       73
<210>9
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
cacagctgcg gcgtgggggg gagggagagg gcagctcgcc ggcacagcgc tcatttaccc     60
ggagacaggg agaggctctt c                                               81
<210>10
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
gtgttataaa gggagactga gggggcagag gctgtgctac tggtacctgg ctgaatactt     60
ccagcactgg ggccagg                                                    77
<210>11
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
ggccacagaa aagaggagag aatgaaggcc ccggagaggc cgttcctacc tgaggagacg 60
gtgaccgtgg tcccttg                                                77
<210>12
<211>1122
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的片段
<400>12
gtgaagcaga ctttgaattt tgaccttctc aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccca 60
gggcccatgg tgcccaagaa gaagaggaaa gtctccaacc tgctgactgt gcaccaaaac 120
ctgcctgccc tccctgtgga tgccacctct gatgaagtca ggaagaacct gatggacatg 180
ttcagggaca ggcaggcctt ctctgaacac acctggaaga tgctcctgtc tgtgtgcaga 240
tcctgggctg cctggtgcaa gctgaacaac aggaaatggt tccctgctga acctgaggat 300
gtgagggact acctcctgta cctgcaagcc agaggcctgg ctgtgaagac catccaacag 360
cacctgggcc agctcaacat gctgcacagg agatctggcc tgcctcgccc ttctgactcc 420
aatgctgtgt ccctggtgat gaggagaatc agaaaggaga atgtggatgc tggggagaga 480
gccaagcagg ccctggcctt tgaacgcact gactttgacc aagtcagatc cctgatggag 540
aactctgaca gatgccagga catcaggaac ctggccttcc tgggcattgc ctacaacacc 600
ctgctgcgca ttgccgaaat tgccagaatc agagtgaagg acatctcccg caccgatggt 660
gggagaatgc tgatccacat tggcaggacc aagaccctgg tgtccacagc tggtgtggag 720
aaggccctgt ccctgggggt taccaagctg gtggagagat ggatctctgt gtctggtgtg 780
gctgatgacc ccaacaacta cctgttctgc cgggtcagaa agaatggtgt ggctgcccct 840
tctgccacct cccaactgtc cacccgggcc ctggaaggga tctttgaggc cacccaccgc 900
ctgatctatg gtgccaagga tgactctggg cagagatacc tggcctggtc tggccactct 960
gccagagtgg gtgctgccag ggacatggcc agggctggtg tgtccatccc tgaaatcatg 1020
caggctggtg gctggaccaa tgtgaacata gtgatgaact acatcagaaa cctggactct 1080
gagactgggg ccatggtgag gctgctcgag gatggggact ga                    1122
<210>13
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的序列
<400>13
tccattccca acacatgaac agcatctcac gccacctctg ttgcctgcag gtgaagcaga  60
ctttgaattt tgaccttc                                                78
<210>14
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>14
cagggccacg gcgggcttgt ctcttggcct ccgacatcct tctcaggtca tcagtcccca  60
tcctcgagca gcctcacc                                                78
<210>15
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>15
gatgtccact ggtacctaag cctcgccctc tgtgcttctt ccctcctcag gaactgtggc 60
tgcaccatct gtcttc                                                 76
<210>16
<211>79
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>16
gaggctgggc ctcagggtcg ctggcggtgc cctggcaggc gtctcgctct aacactctcc 60
cctgttgaag ctctttgtg                                              79
<210>17
<211>96
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>17
ctttctctgt ccttcctgtg cgacggttac gccgctccat gagcttatcg taactataac 60
ggtcctaagg tagcgatgga cagcaagcga accgga                           96
<210>18
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>18
ggaccagttt acaatcccac ctgccatcta agaaagctgg tctcatcgtg tcagaagaac  60
tcgtcaagaa g                                                       71
<210>19
<211>91
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>19
ccccccccgc cacttctctt ctgtttcgtt taagttctac actgacatac tagggataac  60
agggtaataa cgtttacaat ttcgcctgat g                                 91
<210>20
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>20
agtgggtagg cctggcggcc gcctggccgt cgacatttag gtgacactat agaaggatcc 60
tagcacgtgt cagtcctgct                                             80
<210>21
<211>96
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>21
ttacgccaag ctatttaggt gacactatag aatactcaag ctttgattgc taactataac 60
ggtcctaagg tagcgatgaa ggcacgaacc cagttg                           96
<210>22
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>22
gcggaattct atgtctagtg gagggtgaag ctggtgatta tagagtgaaa attaccctgt 60
tatccctatc ggcttgaacg aattgttag                                   89
<210>23
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>23
cataaatata ctgtcttcca ggatcttaga gctcacctaa ggaaacaaga gttcatttga 60
agtttttaaa gtg                                                    73
<210>24
<211>74
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>24
actccagaag ttcctatact ttctagagaa taggaacttc ggaataggaa cttcctttga 60
tctccacctt ggtc                                                   74
<210>25
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>25
gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttctg gagttgtaga 60
tcctctacg                                                         69
<210>26
<211>120
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>26
aaaacaaacc aatcaggcag aaacggtgag gaatcagtga aacggccact tacgaagttc 60
ctatactttc tagagaatag gaacttcgga ataggaactt caagatgcgt gatctgatcc 120
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>27
ttatgctgca tccagtttgc                                              20
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>28
aaaacaaacc aat caggcag                                           20
<210>29
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>29
tgtgacatcc agatgac                                                17
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>30
aaaacaaacc aatcaggcag                                              20
<210>31
<211>143
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物
<400>31
ggaccagttt acaatcccac ctgccatcta agaaagctgg tctcatcgtg gtgccagggc  60
gtgcccttgg gctgggggcg cgataacttc gtatagcata cattatacga agttatcgat  120
cgtggagttg tagatcctct acg                                         143
<210>32
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物
<400>32
ttacgccaag ctatttaggt gacactatag aatactcaag ctttgattgc aagatgcgtg 60
atctgatcct                                                        70