百部生物碱有效部位及其应用.pdf

本发明涉及百部生物碱有效部位药物提取及其在药物制剂中的应用。本发明百部生物碱有效部位是通过下述方法提取得到的：(1)采用乙醇或酸水提取；(2)阳离子交换树脂进行纯化。最终提取的百部生物碱有效部位含量在50％以上。本发明的整个提取、分离过程除乙醇外，没有使用其他有毒有机溶剂。离子交换树脂可以重复使用，工业化生产安全，成本低。包含百部生物碱的药物组合可用于治疗皮肤或呼吸系统疾病，还可用于防治植物病虫害。

权利要求书
1、  一种百部生物碱有效部位，其特征在于：所述百部生物碱有效部位是通过下述方法提取的，包括两步：
(1)、采用乙醇或酸水提取：将百部药材粉碎成粗粉，并用70％-90％乙醇或者用pH值为1-5的酸水提取；
(2)、阳离子交换树脂纯化：将(1)步骤提取的上清液通过阳性交换树脂，洗脱除去水溶性杂质，以氨水和乙醇溶液洗脱，至碘化铋钾反应成阴性，停止洗脱，洗脱液减压回收至干，粉碎，得百部总生物碱提取物，百部生物碱有效部位含量在50％以上。

2、  根据权利要求1所述的百部生物碱有效部位，其特征在于：所述(1)步骤中采用70％-90％乙醇采用加热回流或渗漉的方法来进行提取。

3、  根据权利要求2所述的百部生物碱有效部位，其特征在于：所述(1)步骤中采用的是90％乙醇提取，提取3次，每次1小时。

4、  根据权利要求1所述的百部生物碱有效部位，其特征在于：所述(2)步骤的氨水和乙醇洗脱液体积比为：4∶1～1∶4。

5、  根据权利要求1所述的百部生物碱有效部位，其特征在于：所述(2)步骤所用阳离子交换树脂为强酸性或弱酸性阳离子交换树脂。

6、  根据权利要求5所述的百部生物碱有效部位，其特征在于：阳离子交换树脂为HZ004或JK008。

7、  权利要求1-6所述的百部生物碱有效部位的应用，其特征在于：百部生物碱可制成软膏剂、凝胶剂、洗剂、栓剂药品或化妆品用于治疗螨虫、脚癣、体癣、酒渣鼻、皮炎、湿疹、荨麻疹、体虱、头虱、滴虫性阴道炎等疾病。

8、  权利要求1-6所述的百部生物碱有效部位的应用，其特征在于：所述药物组合可制成片剂、分散片、软胶囊剂、微囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸、散剂、滴丸剂、缓释制剂、控释制剂、胃肠定位制剂、口服液体制剂、注射液、粉针等药剂学上所有可以接受的剂型，用于咳嗽、支气管炎、肺炎、肺结核等呼吸系统疾病。

9、  权利要求1-6所述的百部生物碱有效部位的应用，其特征在于：所述药物组合还具有广谱杀虫性，可以治疗蛲虫病、蛔虫病等人体和动物寄生虫疾病，防治果树、蔬菜、花卉、玉米等多种植物病害虫害。

说明书百部生物碱有效部位及其应用
技术领域
本发明涉及一种中药有效部位及其药物制剂的应用，具体涉及一种百部生物碱有效部位及包含百部生物碱有效部位的药物制剂及其应用。
技术背景
查阅国内外关于百部的文献报道，发现关于百部总生物碱的提取方法较少。林文翰{[1]林文翰，叶阳，徐任生.狭叶百部中新生物碱的结构研究.有机化学，1991，11：500-3；[2]林文翰，徐任生.钟琼芯百部生物碱的化学研究I.细花百部新生物碱.化学学报，1991，49：927-31.[3]林文翰，徐任生，钟琼芯.百部生物碱的化学研究II.细花百部中微量生物碱的结构研究.化学学报，1991，49：1034-37.}等分别在其上述文章中报道了几种提取方法。
方法一：取600g生药根部经切片后用95％工业酒精冷渗漉一周，渗漉液减压浓缩，经3％HCI酸化，过滤，滤液用二氯乙烷洗两次，再用氨水碱化至pH11，氯仿萃取，减压浓缩，得粗总碱2.0g；
方法二：取2.5kg海南岛产细花百部根部，经磨粉后，于索氏提取器中用氯仿回流提取，提取液经浓缩后用4％稀盐酸酸化，过滤后滤液用氨水碱化，氯仿萃取，减压浓缩.得粗总碱8.2g；
方法三：取2.5kg海南岛产细花百部根部，经磨粉，以95％工业酒精冷渗漉，渗漉液经减压浓缩成浸膏，然后用4％HCL溶解过滤，滤渡用浓氨水碱化至pH-10，氯仿萃取，减压浓缩得粗总碱11g。
Ge Lin等在其美国专利US2003229071里报道百部总生物碱的提取工艺为：百部粉碎，用95％乙醇回流提取2小时，倾出提取液10℃放置过夜，滤过，滤液减压回收至稠膏，用4％的盐酸酸化，5℃，3000转/分钟离心40分钟，上清夜用氨水碱化至pH9，然后用分别用二乙醚和氯仿萃取，合并有机相，减压回收，干燥得总生物碱的提取物。由上述报道可知，发现目前提取工艺中均大量采用氯仿等有机溶剂萃取的方法，提取量只有0.33％～0.44％，不利于规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度、疗效佳的百部生物碱有效部位。
本发明的另一目的在于提供百部生物碱有效部位的应用。
本发明的技术方案如下：
一种百部生物碱有效部位，是通过如下方法提取得到的，包括两步：
(1)、采用乙醇或酸水提取：将百部药材粉碎成粗粉，并用70％-90％乙醇加热回流或渗漉提取或者用pH值为1-5的酸水提取；
(2)、阳离子交换树脂纯化：将(1)步骤提取的上清液通过阳性交换树脂，洗脱除去水溶性杂质，以氨水和乙醇溶液洗脱，至碘化铋钾反应成阴性，停止洗脱，洗脱液减压回收至干，粉碎，得百部总生物碱提取物。所得百部生物碱有效部位的纯度在50％以上。
在上述方法中，优选地，步骤(1)是采用90％乙醇提取，不浸泡，提取3次，每次1小时；步骤(2)的氨水和乙醇洗脱液体积比为：4∶1～1∶4。
所用阳离子交换树脂为强酸性或弱酸性阳离子交换树脂。阳离子交换树脂可以反复再生使用。
上述百部生物碱有效部位可制成软膏剂、凝胶剂、洗剂、栓剂药品或化妆品用于治疗螨虫、脚癣、体癣、酒渣鼻、皮炎、湿疹、荨麻疹、体虱、头虱、滴虫性阴道炎等疾病；可制成片剂、分散片、软胶囊剂、微囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸、散剂、滴丸剂、缓释制剂、控释制剂、胃肠定位制剂、口服液体制剂、注射液、粉针等药剂学上所有可以接受的剂型，用于咳嗽、支气管炎、肺炎、肺结核等呼吸系统疾病；还可以治疗蛲虫病、蛔虫病等人体和动物寄生虫疾病，防治果树、蔬菜、花卉、玉米等多种植物病害虫害。
本发明的优点：本专利采用了可规模化生产的乙醇/酸水提取-阳离子交换树脂纯化的技术制备对百部总生物碱进行富集，百部生物碱有效部位含量在50％以上。整个提取、分离过程除乙醇外，没有使用其他有毒有机溶剂。离子交换树脂可以重复使用，工业化生产安全，成本低、制备的百部生物碱有效部位纯度高。
具体实施方式
实施例1
百部药材2000g，粉碎，用pH为1的酸水溶液渗漉提取，取上清液通过HZ004型阳性交换树脂，树脂∶药材(1∶3)，先以去离子水洗脱除去水溶性杂质，至无多糖反应，以氨水和乙醇2∶1配比的溶液洗脱，至碘化铋钾反应成阴性，停止洗脱，洗脱液减压回收至干，粉碎，得百部总生物碱提取物35g。
实施例2
百部药材100kg，粉碎，90％乙醇渗漉提取。减压回收乙醇，得稠浸膏。以1％盐酸水浴加热溶解，用量以每克药材1毫升1％盐酸最佳，酸水液离心，取上清夜，通过JK008阳性交换树脂(树脂∶药材1∶4)，先以去离子水洗脱除去水溶性杂质，至无多糖反应，以氨水和乙醇1∶1配比的溶液洗脱，至碘化铋钾反应成阴性，停止洗脱，洗脱液减压回收至干，粉碎，得百部总生物碱提取物1.5kg。
实施例3
百部生物碱有效部位软膏剂
百部生物碱1g，硬脂酸15g，羊毛脂2g，液体石蜡25ml，三乙醇胺2g，甘油5ml，蒸馏水50ml。
取百部生物碱用少量液体石蜡研匀，备用。硬脂酸、羊毛脂和液体石蜡置容器内，水浴加热至熔化，继续加热至70～80℃；另取三乙醇胺、甘油和蒸馏水，加热至70～80℃，慢慢倒入硬脂酸等混合物，随加随向同一方向搅拌，并加入百部生物碱，至乳化凝结。外用，用于杀灭寄生于人体的蠕性螨虫。
实施例4
百部生物碱有效部位分散
按百部生物碱有效部位50-120g，乳糖250g，甘露醇50g，交联聚乙烯吡咯烷酮(交联PVP)50g，95％乙醇适量，硬脂酸镁8g压制成片。可用于治疗咳嗽、支气管炎、肺炎、肺结核等呼吸系统疾病。
实施例5
百部生物碱有效部位气雾剂
在百部生物碱有效部位100～200g中加入100ml二甲基亚砜，1000ml丙二醇振摇使溶解，加水至10,000，摇匀，滤过，得澄清药液，将上述药液在无菌室内定量分装于气雾剂容器中，将阀件固定于容器上然后在784.6kPa(8kg/cm2)压力下，向瓶内压入经微孔滤膜滤过的抛射剂F127.0g，即得溶液型气雾剂。共制得1000瓶。可作为安全、有效的杀虫剂。
本发明是由发明人经过反复多次的试验获得的发明结果，包括对百部总生物碱的提取实验研究、有效部位的精制试验和药效学实验，内容如下：
1.百部总生物碱的提取实验
1.1预试验
提取工艺研究发现，百部(浙江鄞州医药药材有限公司，蔓生百部，总生物碱含量1.32％)饮片直接用加热回流法提取，其总生物碱的提取率较低，分析原因可能是由于百部总碱在药材中含量较低，直接以饮片为原料提取时，生物碱很难从植物细胞中提出，导致提取率较低。而把百部饮片粉碎成粗粉后再提取。提取率有明显提高，用水作为溶剂时提取率为76.3％，用90％乙醇作为溶剂时提取率为91.6％。试验结果见表1。
表1百部中生物碱提取的预试验结果
 药材量(g)    粉碎程度提取溶剂提取条件    提取率(％) 50    饮片90％乙醇12倍，2小时，2次    16 50    粗粉水12倍，2小时，2次    76 50    粗粉90％乙醇12倍，2小时，2次    92
百部的提取工艺确定为：百部药材粉碎成粗粉，用乙醇提取，并通过正交试验进一步优化乙醇的提取工艺条件。
1.2正交试验
1.2.1因素水平表
根据预试验，固定提取溶剂为8倍量，对乙醇浓度(A)、浸泡时间(B)、提取时间(C)、提取次数(D)四个影响因素，分别在三个水平进行正交优选，按L9(34)正交表进行实验，因素水平安排见表2。
表2百部醇提正交实验因素水平表
    水平    醇浓度(％)/A   浸泡时间(h)/B    提取时间(h)/C    提取次数/D    1    90    0    1    1    2    70    1    2    2    3    50    2    3    3
1.2.2正交试验及结果
分别称取百部(浙江鄞州医药药材有限公司，蔓生百部，总生物碱含量1.32％)粗粉50克27份(平行3份)，按正交试验表5选择的条件进行提取，合并提取液，滤过，精密移取滤液适量，蒸干，用甲醇定容成10ml。精密吸取样品液100μl，置分液漏斗中，加蒸馏水5.0ml，加0.1％溴甲酚绿(pH5.0)的缓冲液2.0ml，氯仿10.0ml，振摇2分钟，静置1小时，精密移取氯仿溶液5.0ml，精密加入含0.01mol/l氢氧化钾的无水乙醇液1ml，摇匀，置比色池中，随行空白，用分光光度计于620nm处测定吸光度，并计算样品中总生物碱的含量，试验结果见表3。
表3百部醇提正交试验结果表
  NO.    A    B    C    D  提取量(mg)  Yi(mg)  1    1    1    1    1  576.75  520.75  580.77  1678.28  2    1    2    2    2  535.46  551.42  585.29  1672.16  3    1    3    3    3  576.88  607.62  588.62  1773.12  4    2    1    2    3  621.20  577.01  558.13  1756.34  5    2    2    3    1  481.41  482.03  482.54  1445.98  6    2    3    1    2  613.03  599.03  587.84  1799.90  7    3    1    3    2  494.05  474.16  450.74  1418.96  8    3    2    1    3  646.65  623.77  654.62  1925.05  9    3    3    2    1  481.66  503.28  535.59  1520.53  I    5123.56    4853.57    5403.23    4644.79  CT＝8322571.68  l总＝87854.5  le＝l总-lA-lB-lC-lD＝9368.86  II    5002.22    5043.19    4949.03    4891.02  III    4864.53    5093.55    4638.05    5454.50  R    259.03    239.98    765.17    809.71
1.2.3正交试验结果的方差分析
正交试验结果的方差分析结果见表4。
表4正交试验结果的方差分析结果
    方差来源  离差平方和   自由度  方差    F值  显著性    A  3732.43    2  1866.22    3.59  P＜0.05    B  3558.66    2  1779.33    3.42  P＞0.05    C  32906.93    2  16453.47    31.61  P＜0.01    D  38287.60    2  19143.80    36.78  P＜0.01    误差E  9368.86    18  520.49
F0.05(2，18)＝3.55    F0.01(2，18)＝6.01
直观分析，最佳工艺为A1B3C1D3，即90％乙醇，浸泡2小时，提取3次，每次1小时，其中A(醇浓度)、C(提取时间)和D(提取次数)因素对提取率有显著性影响。因素B(浸泡时间)对提取率无显著性影响，可根据需要选择不同的水平。为了节省时间和成本，选择的最佳工艺为90％乙醇，不浸泡，提取3次，每次1小时。
1.2.4正交试验结果的验证试验
为进一步考察上述优选工艺的稳定性，按所得最佳条件，进行验证试验，平行提取3份百部药材(浙江鄞州医药药材有限公司)，每份600g，提取物测定百部总碱的含量，结果见表5。
表5正交试验结果的验证试验结果表
    NO.   百部总碱(g)    得膏率(％)    平均值(％)    提取率(％)  平均值(％)   RSD(％)    1    6.68    32.13    32.12    84.35   85.52   2.23    2    6.95    32.25    87.72    3    6.69    31.97    84.48
2.百部总生物碱有效部位的精制试验
根据试验结果，百部醇提液减压干燥后，得膏率为32％，不利于制剂的制备。在保证百部总碱转移率的前提下，为了降低得膏率，通过离子交换树脂法对百部总碱进行精制。
2.1离子交换树脂型号及最大吸附量的考察
方法：称取百部粗粉1kg，按正交试验优选的方法提取，提取液减压回收溶剂至稠浸膏状，用1％盐酸约1000ml充分溶解，酸水液离心，取上清液，分别通过不同型号的强酸性阳离子交换树脂，至流出液用碘化铋钾反应成阳性，停止上样，用去离子水洗脱，至Molish反应呈阴性(无多糖)，停止洗脱，分别测定上样液、流出液和水洗液中百部总生物碱的量，按下式计算单位树脂的最大吸附量：
最大吸附量＝(m上样-m流出-m水洗)/m树脂
树脂：华东理工大学华震科技贸易公司生产的HZ004、HD008、JK008、HZ0016型4种阳离子离子交换树脂，三菱化学株式会社生产的SK1B阳离子交换树脂。
结果：分别称取上述各树脂适量(按干树脂计为10g)，装入R＝1.8cm的层析柱中，按上述方法操作，计算最大吸附量，结果见表6。
表6单位树脂的最大吸附量考察结果表
  树脂型号    含水量(％)   1g干树脂吸附的总生物碱量(g)  HZ004    68.5    0.3175  HD008    57.5    0.1832  JK008    57.1    0.3052  HZ0016    28.2    0.0196  SK1B    46.0    0.1086
结果：由表6可知，HZ004型强酸性阳离子交换树脂对百部总生物碱的吸附量最大，故初步选用HZ004型强酸性阳离子交换树脂。
2.2 HZ004型强酸性阳离子交换树脂精制总生物碱的条件优化
方法：取HZ004型强酸性阳离子交换树脂100g(按干树脂计约31g)，装入层析柱中，上样600g药材的提取液，上样液的流速为1BV/h，上样结束后，用去离子水洗脱，至Molish反应呈阴性，停止洗脱，换成表1.9中所列的洗脱剂继续洗脱，至洗脱液碘化铋钾反应成阴性，测定洗脱液中总生物碱的含量，见表7。
表7HZ-4型强酸性阳离子交换树脂精制总生物碱的条件优化
树脂量  上样液中  总碱量   洗脱剂   (V氨水∶V乙醇) 洗脱剂 用量 得膏 率    干膏中总    碱含量  干膏中  总碱量  洗脱率100g  6.77g    2∶1 280ml 1.19％    51.5％  3.68g  54.32％100g  6.77g    1∶1 240ml 1.17％    58.6％  4.12g  60.79％100g  6.77g    1∶2 380ml 1.38％    42.2％  3.50g  51.63％
结果：选择V氨水∶V乙醇＝1∶1为洗脱液洗脱。
2.3 HZ004型强酸性阳离子交换树脂精制总生物碱的验证实验
方法：取HZ004型强酸性阳离子交换树脂200g(按干树脂计62g)，装入层析柱中，上样1200g药材的提取液，上样液的流速为1BV/h，上样结束后，用去离子水洗脱，至Molish反应成阴性，停止洗脱，换V氨水∶V乙醇＝1∶1为洗脱液洗脱，至洗脱液碘化铋钾反应成阴性，测定洗脱液中总生物碱的含量，按下式计算相对比洗脱率。
相对比洗脱率(％)＝(m洗脱/m上样)×100％，结果见表8。
表8HZ004型强酸性阳离子交换树脂精制总生物碱的条件验证
 序号    上样TA    量(g)  洗脱液用  量(ml)    得膏率    (％) 干膏中TA含量     (％)   干膏中   TA量(g)    洗脱率    (％) 1    13.55  500    1.20    53.2    7.67    56.6 2    13.55  500    1.18    56.5    8.00    59.0 3    13.55  480    1.16    57.6    8.02    59.2 均值    1.18    55.8    7.90    58.3
总结：百部药材醇提平均得膏率32％，干浸膏中总生物碱含量3.5％，总生物碱转移率85％。醇提再通过强酸性阳离子交换树脂精制后平均得膏率降为1.18％，浸膏中总生物碱含量55.8％，总生物碱转移率49.8％。说明通过强酸性阳离子交换树脂精制可保留大部分指标成分，而浸膏得率大大下降，减少了服用剂量，便于制剂成型。
2.4 HZ004型强酸性阳离子交换树脂使用次数和再生次数考察
当树脂使用一定时间和次数后，树脂就会受到污染导致吸附能力降低，此时必须经过再生处理后才能继续使用。
树脂再生方法为：①1N盐酸洗脱：用1N盐酸洗脱，用量为树脂体积的2～3倍，水洗至pH为5。流速为每小时树脂体积的2～3倍。②5％氯化钠洗脱：用树脂体积的5倍量的5％氯化钠洗脱。流速为每小时2～3倍树脂体积。③1N氢氧化钠洗脱：用1N氢氧化钠洗脱，用量为树脂体积的2～3倍，水洗至pH为9。流速为每小时树脂体积的2～3倍。④1N盐酸洗脱：用1N盐酸洗脱，用量为树脂体积的2～3倍，水洗至pH为6。流速为每小时树脂体积的2～3倍。
参考生产厂家说明书，HZ-4型强酸性阳离子交换树脂使用后，以蒸馏水冲柱pH＜8，以2倍树脂体积1N浓度盐酸冲洗转换成H型，以蒸馏水冲柱pH＞6可继续使用。一般认为，当树脂吸附量下降30％时，树脂应进行按照上述再生方法进行再生，考察的结果见表9。
表9 HZ-4型强酸性阳离子交换树脂使用次数及再生次数考察情况
    使用次数  总生物碱的吸附量(mg/g干树脂)    占初始百分比(％)    1    0.3175    100    5    0.3023    95.2    10    0.2715    85.5    14    0.2273    71.6    15    0.2108    66.4    再生1次    1    0.3026    95.3    5    0.2388    75.2    6    0.2184    68.8
实验结果表明：HZ004型强酸性阳离子交换树脂使用15次后需要再生，再生后使用5次不可再用。
2.5中试
按确定的精制工艺进行四批中试放样，测定各步过程中总碱的含量，总转移率，结果见表10。
表10制备工艺中试试验结果
批号    050525    050526    050527  050408品种    对叶百部    对叶百部    蔓生百部  蔓生百部投料量(kg)    15    15    15  225药材TA含量(％)    1.58    1.58    0.81  0.79药材TA总量(g)    236.4    236.4    121.5  1777.5浸膏量(g)    260    269    130  4400浸膏得率(％)    1.73    1.79    0.87  ？浸膏中TA含量(％)    50.2    50.8    42.4  ？提取精制过程TA转移率(％)    55.21    57.81    45.37  ？
结果表明，中试工艺条件稳定。
3.百部总生物碱有效部位的药效学实验
3.1百部生物碱有效部位除螨试验
用改良的刮压法最大限度地取人体蠕形螨到载玻片，置显微镜下观察计数，每份标本含有运动活泼的蠕形螨20条以上，取螨虫成功后立即在载玻片上分别加入不同浓度的百部总生物碱溶液3滴，并使其涂布均匀，保证药液与虫体的充分接触。空白组、对照组分别滴加等量的液体石腊和2％甲硝唑水剂。滴加药液后稍等片刻，把玻片置于显微镜下观察，计算各组活螨数量和标出各虫所在位置(方便实验过程中的观察)。如果实验时室温低于25℃，则把标本置于温度为25～28℃，相对湿度70％～80％的温箱中保暖，每隔1～2h取出在显微镜下观察1次，记录螨虫的活动情况，直至玻片上所有螨虫死亡为止。螨虫死亡判断标准如下：①虫体收缩或透明者；②虫体破裂，外周有油滴样堆积物者；③在高倍镜下连续观察1min，虫体或虫足不活动者。结果见表11。
表11百部生物碱除螨试验
  组别实验螨条数          作用时间(h)  死亡率  与空白  组比较  与对照  组比较    1    3    5  百部生物碱  (20mg/ml)    40    21    12    0  100％  P＜0.05  P＜0.05  百部生物碱  (10mg/ml)    45    32    26    12  73％  P＜0.05  P＞0.05  百部生物碱  (5mg/ml)    40    31    25    20  50％  P＜0.05  P＜0.05  空白组    42    40    38    32  24％  2％甲硝唑    38    25    16    5  87％  P＜0.05
由表可知，百部生物碱在10mg/ml浓度时与甲硝唑无显著性差异，在20mg/ml浓度时优于甲硝唑，在5mg/ml浓度时弱于甲硝唑。
3.2百部生物碱有效部位镇咳祛痰作用的实验研究
3.2.1氨水致咳嗽试验
灌胃给予相应药液1次，给药后1h，将小鼠分别置于自制的引咳装置中(带盖的300ml广口瓶)，使小鼠接受氨水(定量吸取50ul氨水于滤纸条上)刺激至预定时间，立即取出小鼠，观察1min内小鼠的咳嗽次数。咳嗽声音通过麦克风录音并放大，在电脑中用WaveCN 1.90软件分析，若1min内出现3次以上典型咳嗽动作(腹肌收缩或缩胸，同时张大嘴为一次咳嗽，有时可有咳声)者，算作“有咳嗽”，否则算作“无咳嗽”。按统计学“上下法/序贯法”求半数有数量(EDT50)的原理，改变每只小鼠接受刺激的时间(相邻两个时刻的对数之差在一次实验中是固定的为0.1)，以观察咳嗽反应是“有咳嗽”或“无咳嗽”。当前一只小鼠出现咳嗽反应，则后一只就用低一级的时间给予氨气刺激；相反，若未出现咳嗽，则下一只就用高一级的时间给予氨气刺激；最后一只动物不试验，以前一只小鼠相反的反应计数。用加权法分别计算给药组和对照组半数致咳时间(EDT50)及相对值R。
EDT50＝log-1∑rixi/∑ni
ni为各刺激时间段试验动物数(不论咳嗽与否)，xi为各刺激时间段对数，i为相邻刺激对数之差。
R＝(给药组EDT50/对照组EDT50)×100％
若R＞130％，认为药物有镇咳作用；若R＞150％，认为药物有明显镇咳作用。
3.2.2分组和给药
昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为5组，即生理盐水组，对叶百部、直立百部和蔓生百部提取物组，磷酸可待因组。给药途径均为灌胃，给药体积为0.01ml/g。磷酸可待因的给药剂量为0.030g/kg，对叶百部、直立百部和蔓生百部按生药折算的给药剂量为20g/kg，按提取物折算的给药量分别为0.408g/kg、0.200g/kg、0.240g/kg。
3.1.3镇咳作用的试验结果
对三种百部提取物的进行镇咳实验，结果见表12。
表12三种百部提取物的镇咳实验比较
组别剂量(g/kg) EDT50(s) R生理盐水/ 15.5 100％可待因0.030 33.9 219％对叶百部提取物0.408 28.2 182％直立百部提取物0.200 25.1 162％蔓生百部提取物0.240 29.1 188％
由表12可知，三种百部提取物都有明显的的镇咳作用。
对三种百部提取物的生物碱有效部位的镇咳试验，结果见表13。
表13三种百部提取物的生物碱部分和非生物碱部分镇咳实验结果
    组别    剂量(mg/g)    R    平均值    生理盐水    /    100％    可待因    0.03    214％    224％    240％    219％    蔓生百部生物碱    0.058    193％    192％    186％    196％    直立百部生物碱    0.057    151％    158％    164％    对叶百部生物碱    0.13    191％    185％    179％
3.3祛痰作用研究
方法：小鼠给药前禁食不禁水8～12小时，灌胃给药后0.5h，分别由腹腔注射0.5％酚红溶液0.5mL，0.5h后颈椎脱臼法处死小鼠，背位固定，分离气管，于喉头下将磨平的7号针头插入气管内约0.3cm，用丝线结扎固定后，用1ml注射器吸取5％碳酸氢钠溶液0.5mL，通过针头来回灌洗呼吸道3次，冲洗液置于试管中，再重复2次，合并冲洗液，高速离心(9500r·min-1)5min，小心取上清液于紫外可见分光光度计波长560nm处测定吸收度值，带入酚红的标准曲线，求算排泌酚红的量。结果见表14。
表14各组祛痰效果比较(n＝10，X±S)
    组别    剂量(mg/g)  酚红含量(ug/ml)    生理盐水    /  1.667±0.1665    氯化铵    0.03  3.152±0.4359#    对叶百部    0.204  3.147±0.8160#    直立百部    0.20  2.136±0.4008#*    蔓生百部    0.24  2.185±0.4999#*
#与生理盐水比较有显著性差异；*与氯化铵比较有显著性差异。
由表可知，对叶百部、直立百部和蔓生百部总生物碱的祛痰作用与生理盐水相比较都有非常显著性差异，氯化铵和对叶百部总生物碱相比无显著性差异，但和直立百部、蔓生百部总生物碱相比有显著性差异。
3.4液体培养法检测百部生物碱有效部位抗结核菌生长效果
方法：菌株H37Rv经过碾磨后在Middlebrook7H9培养基中(含改良的OADC营养添加剂)配制成1mg/ml浓度，在1.9ml含不同浓度药物的7H9培养基中各加入0.1ml菌液；实验设空白对照组，溶剂对照组，阳性对照药为利福平(终浓度1ug/ml)，每组设2个平行管；混匀反应管，37℃培养15天后，检测药物对结核菌生长的作用。对照组菌量达++以上的视为有效实验。结果见表15。
表15液体培养法检测药物抗结核菌生长药效结果表
  组别  剂量(ug/ml)         菌量 备注  空白对照  100％    +++    +++  10％    ＜+    +  1％    -    -  DMSO  2.5％    +++    +++  1.25％    +++    +++  利福平  1ug/ml    -    -  蔓生百部  生物碱  250ug/ml    -    - 对照：DMSO1.25％  50ug/ml    +++    ++  10ug/ml    +++    +++
经液体培养法检测均发现蔓生百部生物碱样品在250ug/ml时能抗结核菌生长，表明蔓生百部生物碱在体外有抗结核菌生长的作用，但作用弱于利福平。
3.5百部生物碱有效部位杀虫试验
按照GB13917.2-92进行(即密闭圆筒法)；将供试昆虫(淡水库蚊20，羽化后第2～3d未吸血雌成蚊；家蝇30只，羽化后第4～5d成虫，雌雄各半)麻醉后放入圆筒内，待试虫恢复正常后，按0.5g/筒和1.0g/筒的剂量将药液喷入圆筒内，并立即用胶塞，将圆孔塞住，1min后抽出挡板，并及时记录每段时间所击倒的试虫数，20min后，将圆筒内全部试虫移至清洁笼中用5％的葡萄糖水棉球正常饲养，并观察24h试虫死亡数，计算KT50和死亡率，试验重复3次，同时设空白对照组。结果见表16。
表16百部生物碱杀虫试验
    试验虫种    剂量(g/筒)    KT50(min) 24h死亡率(％)    淡水库蚊    0.5    4.78    80.2    1.0    2.51    92.4    家蝇    0.5    5.86    78.6    1.0    1.68    90.5
由表可知，百部生物碱对淡水库蚊和家蝇均有杀灭作用。
3.6不同提取物在大、小鼠体内的药代动力学参数计算与比较
蔓生百部生物碱有效部位和原百部碱在大、小鼠体内的药代动力学参数比较，结果见表17。
表17大、小鼠体内的药代动力学参数比较
动物品种给药方式  性别    主要药动学参数    AUC/M    (1/mg/kg)  Ke  (1/h)  Tpeak  (h)   Cmax   (ug/ml)大鼠原百部碱静注  雌、雄    0.38  0.69  /    /原百部碱灌胃  雄    0.03  0.62  0.81    0.46  雌    0.15  0.62  0.84    2.21生物碱有效部位灌胃  雄    0.04  0.71  1.16    0.93  雌    0.26  0.70  1.29    2.99小鼠原百部碱灌胃  雌、雄    0.25  0.58  0.25，2    3.16，2.30生物碱有效部位灌胃  雌、雄    0.32  0.59  0.17，2    10.28，5.48
由表4.22可知，无论是大鼠还是小鼠，灌胃给药百部生物碱有效部位生物利用度高于原百部碱单体。提示百部生物碱有效部位中可能含有促进原百部碱吸收的物质或含有与原百部碱类似结构的成分，在吸收时能饱和代谢原百部碱的酶，减少原百部碱的首过效应。