一种在离体培养下诱导伊犁贝母多倍体的方法.pdf

本发明涉及一种在离体培养下诱导伊犁贝母多倍体的方法，该方法利用新鲜鳞茎诱导产生不定芽，通过含有不同浓度秋水仙素的MS液体培养基进行诱导处理，诱导产生多倍体伊犁贝母植株，通过改变染色体倍性使植株产生优良性状以提高其鳞茎产量及药用成分的含量，通过多倍体的筛选鉴定得到多倍体伊犁贝母，克服伊犁贝母在长期种植中出现品种退化问题。此方法可快速获得多倍体伊犁贝母，有效提高活性成分的含量，缩短种植周期。

权利要求书
1.  一种在离体培养下诱导伊犁贝母多倍体的方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、将伊犁贝母新鲜鳞茎用自来水冲洗净表面，大鳞茎于太阳下晾晒12-24h，小鳞茎晾晒8-12h，然后将鳞茎在超净工作台上采用75％酒精时间30s或0.1-1％高锰酸钾水溶液处理1h或84消毒液浸泡20min进行表面消毒，然后用0.1％升汞6-10min或3-5％次氯酸钠水溶液处理5-10min，再用15％双氧水处理30-60min，无菌水冲洗2-3次；
b、将步骤a中处理后的鳞茎切成0.1-0.2cm3大小接入不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0.5-1.0mg/L+NAA 0.1-0.4mg/L，温度20±1℃，光照2000lx，时间18h/d进行培养；
c、将步骤b中伊犁贝母不定芽切成单芽，浸泡在含有秋水仙素50-1000mg/L，2％二甲基亚砜的液体MS培养基中，浸泡12-48h进行多倍体的诱导；
d、将步骤b中伊犁贝母不定芽切成单芽，浸泡在不加秋水仙素的MS液体培养基，置于转速为100r/min摇床上浸泡，浸泡12-48h；
e、将步骤c和d单芽分别用无菌水冲洗2-3次后，于无菌的滤纸上15-25min晾干后转入步骤b不含秋水仙素和二甲基亚砜的不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0.5-1.0mg/L+NAA 0.1-0.4mg/L中培养；
f、伊犁贝母多倍体筛选：多倍体伊犁贝母的筛选根据二倍体与秋水仙素处理后不定芽在叶片宽度、叶面积、气孔保卫细胞大小及密度确定疑似株，将疑似株转入1/2 MS+NAA0.5-1.0mg/L生根培养基中生根；
g、伊犁贝母多倍体鉴定：取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽组织，在4℃下，经过8-羟基喹啉预处理4-6h或饱和对二氯苯水溶液预处理5-10h或20％风油精预处理3-7h或0.1％秋水仙素预处理6-8h，卡诺固定液固定12-18h，1-2mol/L盐酸60℃解离8-10min，改良苯酚品红染色液染色5-10min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽染色体，确定多倍体植株。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述的表面消毒优选为75％酒精或1％高锰酸钾水溶液，然后用0.1％升汞6-10min，再用15％双氧水处理30-60min。

3.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中所述的表面消毒最佳为75％酒精，然后用0.1％升汞6-10min，再用15％双氧水处理30-60min。

4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c中的秋水仙素200-800mg/L，浸泡时间12-24h。

5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c中的秋水仙素400mg/L，浸泡时间24h。

6.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤g中所述的预处理优选0.002mol/L 8-羟基喹啉或饱和对二氯苯水溶液。

7.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤g中所述的预处理最佳为0.002mol/L 8-羟基喹啉。

说明书一种在离体培养下诱导伊犁贝母多倍体的方法
技术领域
本发明涉及药用植物育种领域，具体地说，涉及一种伊犁贝母多倍体诱导方法。
背景技术
伊犁贝母(Fritillaria Pallidiflora Schrenk)，百合科(Liliaceae)贝母属(Fri tillaria L.)多年生草本植物，以鳞茎入药，是一味重要的常用中药，具有清热润肺、化痰止咳的功效。由于伊犁贝母生物碱的含量在同类贝母中相对较高，并且抗病力强，药材价格相对较低，近年来倍受人们的关注。伊犁贝母在新疆及内地均有种植，已成为一种重要的中草药及经济创收作物。然而，人工栽培的伊犁贝母存在繁殖系数低、品质退化的问题，野生伊犁贝母长期以来被大量采挖，分布面积日益缩减，资源破坏严重，因此探求伊犁贝母新种质资源的研究越来越受到人们的重视。
伊犁贝母主要成分为异甾体生物碱及其苷，主要包括D，E环双氢顺式的西贝素和新甾体生物碱-新贝甲素等，其中D，E环双氢顺式西贝素属西藜芦碱类(cevine groups)，为伊贝母中主要生物碱之一，尤以西贝素(imperialine)和西贝素苷(imperialine-3β-D-glucoside)为主要成分(伊江兰，麦迪尼亚提伊贝母总生物碱的研究概述新疆中医药2002 4)。到目前为止，从伊犁贝母总生物碱中已经分离到单体生物碱有：西贝素(Imperialine)，西贝素苷(imperialine-3β-D-glucoside)，贝母辛(Peimisine)，伊贝碱苷A(Yibeinoside A)，伊贝碱苷B(Yibeinoside B)，伊贝碱苷C(Yibeinoside C)，伊贝辛(Yibeisine)。
伊犁贝母总生物碱的镇咳、祛痰和平喘研究方面，王林辉等以小鼠、豚鼠、猫和大鼠作为测试对象，在10mg/kg剂量下，十二指肠给药对电刺激猫喉上神经引咳具有显著的镇咳作用。连续灌胃给药5d，伊犁贝母总生物碱在40，20，10mg/kg的剂量下对小鼠氨水引咳具有显著的镇咳作用；在20，10mg/kg的剂量下对豚鼠枸橼酸引咳具有显著的镇咳作用，能显著增加大鼠毛细管排痰量；在40，20mg/kg的剂量下具有显著增加小鼠酚红排泌量的作用，对乙酰胆碱.组胺所致的豚鼠哮喘具有显著的平喘作用。结果表明伊犁贝母总生物碱对实验动物具有显著的镇咳、祛痰及平喘作用。这与中医的清热润肺、化痰止咳的功效相吻合(王林辉，季晖，王长礼，何倩，李萍伊犁贝母总生物碱的药效学研究中国药科大学学报200 334 172-176)。
多倍体植物由于染色体加倍，往往具有根茎叶的巨大性，即根茎叶的产量较高，能较好地满足药材生产的要求；另一方面，植物染色体倍性的变化，也往往会导致次生代谢产物含量的变化，有可能获得有效成分含量高的药用植物。同时多倍体植株生态适应性及对逆境的抗性也有所增强(Sandra De Schepper et al.Somatic polyploidpetals：regeneration offers new roads for breeding Belgian potazaleas Plant Cell，Tissue and Organ Culture 76：183-188；M.Lotfi et al.Production of haploid and doubled haploid plantsof melon(Cucumis melo L.)for use in breeding or multiple virusresistance Plant Cell Rep(2003)21：1121-1128；M.J.KermaniOryzalin-induced chromosome doubling in Rosa and its effect onplant morphology and pollen viabil ity Theor Appl Genet(2003)107：1195-1200)。
贝母属植物多倍体育种研究较少，王志安等利用秋水仙素处理浙贝种子进四倍体的育种研究(王志安许复华诱导浙贝母多倍体的研究初报浙江农业大学学报1991 17(1)89～92)。王强等用秋水仙素对川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)愈伤组织进行四倍体诱导(王强，兰利琼，傅华龙秋水仙素诱导川贝母(Fritillariacirrhosa D.Don)愈伤组织多倍体的研究武汉植物学研究2002，20(6)：449-452)。
在伊犁贝母育种中，本发明结合伊贝母鳞茎切块不定芽快速诱导与增殖技术，利用秋水仙素处理不定芽使染色体加倍，诱导产生多倍体伊犁贝母植株，通过改变染色体倍性使植株产生优良性状以提高其鳞茎产量及药用成分的含量，克服伊犁贝母在长期种植中出现品种退化问题。这对扩大新疆特有珍稀经济类作物种植面积，提高贝母种植收入，推广常用中药开发利用有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在离体培养下诱导伊犁贝母多倍体的方法，该方法利用新鲜鳞茎切块诱导产生不定芽，通过含有不同浓度秋水仙素的MS液体培养基进行诱导处理，诱导产生多倍体伊犁贝母植株，通过改变染色体倍性使植株产生优良性状以提高其鳞茎产量及药用成分的含量，通过多倍体的筛选鉴定得到多倍体伊犁贝母，克服伊犁贝母在长期种植中出现品种退化问题。此方法可快速获得多倍体伊犁贝母，有效提高活性成分的含量，缩短种植周期。
发明所述的一种在离体培养下诱导伊犁贝母多倍体的方法，按下列步骤进行：
a、将伊犁贝母新鲜鳞茎用自来水冲洗净表面，大鳞茎于太阳下晾晒12-24h，小鳞茎晾晒8-12h，然后将鳞茎在超净工作台上采用75％酒精时间30s或0.1-1％高锰酸钾水溶液处理1h或84消毒液浸泡20min进行表面消毒，然后用0.1％升汞6-10min或3-5％次氯酸钠水溶液处理5-10min，再用15％双氧水处理30-60min，无菌水冲洗2-3次；
b、将步骤a中处理后的鳞茎切成0.1-0.2cm3大小接入不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0.5-1.0mg/L+NAA 0.1-0.4mg/L，温度20±1℃，光照2000lx，时间18h/d进行培养；
c、将步骤b中伊犁贝母不定芽切成单芽，浸泡在含有秋水仙素50-1000mg/L，2％二甲基亚砜的液体MS培养基中，浸泡12-48h进行多倍体的诱导；
d、将步骤b中伊犁贝母不定芽切成单芽，浸泡在不加秋水仙素的MS液体培养基，置于转速为100r/min摇床上浸泡，浸泡12-48h；
e、将步骤c和d单芽分别用无菌水冲洗2-3次后，于无菌的滤纸上15-25min晾干后转入步骤b不含秋水仙素和二甲基亚砜的不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0.5-1.0mg/L+NAA 0.1-0.4mg/L中培养；
f、伊犁贝母多倍体筛选：多倍体伊犁贝母的筛选根据二倍体与秋水仙素处理后不定芽在叶片宽度、叶面积、气孔保卫细胞大小及密度确定疑似株，将疑似株转入1/2 MS+NAA0.5-1.0mg/L生根培养基中生根；
g、伊犁贝母多倍体鉴定：取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽组织，在4℃下，经过8-羟基喹啉预处理4-6h或饱和对二氯苯水溶液预处理5-10h或20％风油精预处理3-7h或0.1％秋水仙素预处理6-8h，卡诺固定液固定12-18h，1-2mol/L盐酸60℃解离8-10min，改良苯酚品红染色液染色5-10min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽染色体，确定多倍体植株。
步骤a中所述的表面消毒优选为75％酒精或1％高锰酸钾水溶液，然后用0.1％升汞6-10min，再用15％双氧水处理30-60min。
步骤a中所述的表面消毒最佳为75％酒精，然后用0.1％升汞6-10min，再用15％双氧水处理30-60min。
步骤c中的秋水仙素200-800mg/L，浸泡时间12-24h。
步骤c中的秋水仙素400mg/L，浸泡时间24h。
步骤g中所述的预处理优选0.002mol/L 8-羟基喹啉或饱和对二氯苯水溶液。
步骤g中所述的预处理最佳为0.002mol/L 8-羟基喹啉。
本发明所述伊犁贝母多倍体诱导方法优点在于：
诱导材料的选择。伊犁贝母是多年生草本，每年地上部分生长时间只有60天左右，而后地下鳞茎便转入体眠状态，利用鳞茎诱导的不定芽作为诱变材料可以克服贝母地上部分生长期短，多倍体育种受季节限制的缺点。组织培养中不定芽生长旺盛，细胞分裂活跃利用秋水仙素处理不定芽可以保证诱变效率，降低筛选的工作量。
诱导方法的选择。本发明以附加2％二甲基亚砜的液体MS培养基为基质添加不同浓度的秋水仙素诱导不定芽染色体多倍化，利于秋水仙素渗透入不定芽发挥诱变作用。诱变处理后采用水洗或者浸泡在无菌水中一段时间释放吸附在表面的秋水仙素，降低了秋水仙素对幼嫩组织的毒害作用，可以提高诱变后不定芽的成活率。
附图说明
图1为本发明诱导不定芽的鳞茎切块图
图2为本发明鳞茎切块分化产生的不定芽芽点图
图3为本发明诱导多倍体的单芽图
图4为本发明二倍体(左)与多倍体(右)表型比较图
图5为本发明二倍体(A)与多倍体(B)气孔比较图
图6为本发明二倍体染色体(A)2n＝2x＝24与四倍体染色体(B)2n＝4x＝48图
具体实施方式
实施例1
a、将伊犁贝母新鲜鳞茎用自来水冲洗净表面，大鳞茎于太阳下晾晒12h，小鳞茎晾晒8h，然后将鳞茎在超净工作台上用体积比75％酒精表面消毒30s，质量体积百分比0.1％升汞灭菌6min，15％双氧水处理30min，无菌水冲洗2次；
b、将步骤a中处理后的鳞茎切成0.1-0.2cm3大小接入不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L，温度20±1℃，光照2000lx，时间18h/d进行培养；
c、40天后，步骤b中每个鳞茎切块可长出5-10个不定芽，将这些不定芽切成单芽，随机取40个单芽浸泡在含有50mg/L秋水仙素，2％二甲基亚砜的液体MS培养基中，置于转速为100r/min摇床上浸泡12h；
d、随机取步骤b中伊犁贝母不定芽切成的单芽40个，浸泡在不加秋水仙素的MS液体培养基，置于转速为100r/min摇床上浸泡12h作为对照；
e、将步骤c和d单芽分别用无菌水冲洗2次后，于无菌的滤纸上15min晾干后转入步骤b不含秋水仙素和二甲基亚砜的不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L中培养；
f、伊犁贝母多倍体筛选：多倍体伊犁贝母的筛选根据二倍体与秋水仙素处理后不定芽在叶片宽度、叶面积、气孔保卫细胞大小及密度确定疑似株，将疑似株转入1/2 MS+NAA0.5mg/L生根培养基中生根；
g、伊犁贝母多倍体鉴定：3周后，秋水仙素处理过的部分不定芽生长快，叶片面积比对照组平均大50％以上，取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽组织，经0.002mol/L 8-羟基喹啉预处理4h，卡诺固定液固定18h，1mol/L盐酸60℃解离8min，改良苯酚品红染色液染色5min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽染色体，确定多倍体植株。每个生根的不定芽取四个根尖，一个幼嫩不定芽芽点，每个根尖统计20个分裂相细胞，不定芽统计20个分裂相细胞染色体数。经50mg/L秋水仙素处理12h不定芽存活率可以达到100％，多倍体诱变率可以达到2％。诱变率：多倍体芽数/(处理芽数-死亡芽数)。
实施例2
a、将伊犁贝母新鲜鳞茎用自来水冲洗净表面，大鳞茎于太阳下晾晒18h，小鳞茎晾晒10h，然后将鳞茎在超净工作台上用1％高锰酸钾水溶液处理1h，3％次氯酸钠水溶液处理10min，15％双氧水处理45min，无菌水冲洗3次；
b、将步骤a中处理后的鳞茎切成0.1-0.2cm3大小接入不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L，温度20±1℃，光照2000lx，时间18h/d进行培养；
c、40天后，步骤b中每个鳞茎切块可长出5-10个不定芽，将这些不定芽切成单芽，随机取40个单芽浸泡在含有秋水仙素400mg/L，2％二甲基亚砜的液体MS培养基中，置于转速为100r/min摇床上浸泡24h；
d、另随机取步骤b中伊犁贝母不定芽切成的单芽40个，浸泡在不加秋水仙素的MS液体培养基，置于转速为100r/min摇床上浸泡24h作为对照；
e、将步骤c和d单芽分别用无菌水冲洗3次后，于无菌的滤纸上20min晾干后转入步骤b不含秋水仙素和二甲基亚砜的不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L中培养；
f、伊犁贝母多倍体筛选：多倍体伊犁贝母的筛选根据二倍体与秋水仙素处理后不定芽在叶片宽度、叶面积、气孔保卫细胞大小及密度确定疑似株，将疑似株转入1/2 MS+NAA 1.0mg/L生根培养基中生根；
g、伊犁贝母多倍体鉴定：3周后，处理过的部分不定芽生长快，叶片面积比对照组平均大50％以上，取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽芽点，经饱和对二氯苯水溶液预处理8h，卡诺固定液固定18h，1mol/L盐酸60℃解离10min，改良苯酚品红染色液染色8min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽染色体，确定多倍体植株。每个生根的不定芽取四个根尖，一个幼嫩不定芽芽点，每个根尖统计20个分裂相细胞，不定芽统计20个分裂相细胞染色体数。经秋水仙素400mg/L处理24h不定芽存活率可以达到75％，多倍体诱变率可以达到33％。诱变率：多倍体芽数/(处理芽数-死亡芽数)
实施例3
a、将伊犁贝母新鲜鳞茎用自来水冲洗净表面，大鳞茎于太阳下晾晒24h，小鳞茎晾晒12h，然后将鳞茎在超净工作台上用84消毒液浸泡20min，0.1％升汞灭菌10min，15％双氧水处理60min，无菌水冲洗3次；
b、将步骤a中处理后的鳞茎切成0.1-0.2cm3大小接入不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0.8mg/L+NAA 0.4mg/L，温度20±1℃，光照2000lx，时间18h/d进行培养；
c、40天后，步骤b中每个鳞茎切块可长出5-10个不定芽，将这些不定芽切成单芽，随机取40个单芽浸泡在含有秋水仙素1000mg/L，2％二甲基亚砜的液体MS培养基中，置于转速为100r/min摇床上浸泡48h；
d、另随机取步骤b中伊犁贝母不定芽切成的单芽40个，浸泡在不加秋水仙素的MS液体培养基，置于转速为100r/min摇床上浸泡48h作为对照；
e、将步骤c和d单芽分别用无菌水冲洗3次后，于无菌的滤纸上25min晾干后转入步骤b不含秋水仙素和二甲基亚砜的不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0.8mg/L+NAA0.4mg/L中培养；
f、伊犁贝母多倍体筛选：多倍体伊犁贝母的筛选根据二倍体与秋水仙素处理后不定芽在叶片宽度、叶面积、气孔保卫细胞大小及密度确定疑似株，将疑似株转入1/2 MS+NAA 1.0mg/L生根培养基中生根；
g、伊犁贝母多倍体鉴定：3周后，处理过的部分不定芽生长快，叶片面积比对照组平均大50％以上，取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽芽点，经20％风油精预处理5h，卡诺固定液固定18h，1mol/L盐酸60℃解离10min，改良苯酚品红染色液染色10min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽染色体，确定多倍体植株。每个生根的不定芽取四个根尖，一个幼嫩不定芽芽点，每个根尖统计20个分裂相细胞，不定芽统计20个分裂相细胞染色体数。经秋水仙素1000mg/L处理48h不定芽存活率可以达到45％，多倍体诱变率可以达到9.1％。诱变率：多倍体芽数/(处理芽数-死亡芽数)
实施例4
a、将伊犁贝母新鲜鳞茎用自来水冲洗净表面，大鳞茎于太阳下晾晒18h，小鳞茎晾晒10h，然后将鳞茎在超净工作台上用75％酒精表面消毒30s，0.1％升汞灭菌10min，15％双氧水处理60min，无菌水冲洗2次；
b、将步骤a中处理后的鳞茎切成0.1-0.2cm3大小接入不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L，温度20±1℃，光照2000lx，时间18h/d进行培养；
c、将步骤b中伊犁贝母不定芽切成单芽，随机取40个单芽浸泡在含有秋水仙素400mg/L，2％二甲基亚砜的液体MS培养基中，置于转速为100r/min摇床上浸泡36h；
d、将步骤b中伊犁贝母不定芽切成单芽，随机取40个单芽浸泡在不加秋水仙素的MS液体培养基，置于转速为100r/min摇床上浸泡36h作为对照；
e、将步骤c和d单芽分别用无菌水冲洗2-3次后，于无菌的滤纸上18min晾干后转入步骤b不含秋水仙素和二甲基亚砜的不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L中培养；
f、伊犁贝母多倍体筛选：多倍体伊犁贝母的筛选根据二倍体与秋水仙素处理后不定芽在叶片宽度、叶面积、气孔保卫细胞大小及密度确定疑似株，将疑似株转入1/2 MS+NAA0.2mg/L生根培养基中生根；
g、伊犁贝母多倍体鉴定：取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽组织，经过0.1％秋水仙素预处理8h，卡诺固定液固定12h，盐酸60℃解离8min，改良苯酚品红染色液染色5min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽染色体，确定多倍体植株。每个生根的不定芽取四个根尖，一个幼嫩不定芽芽点，每个根尖统计20个分裂相细胞，不定芽统计20个分裂相细胞染色体数。经秋水仙素400mg/L处理36h不定芽存活率可以达到57.5％，多倍体诱变率可以达到21.7％。诱变率：多倍体芽数/(处理芽数-死亡芽数)
实施例5
a、将伊犁贝母新鲜鳞茎用自来水冲洗净表面，大鳞茎于太阳下晾晒24h，小鳞茎晾晒12h，然后将鳞茎在超净工作台上用0.1％高锰酸钾水溶液处理1h，0.1％升汞灭菌8min，15％双氧水处理45min，无菌水冲洗3次；
b、将步骤a中处理后的鳞茎切成0.1-0.2cm3大小接入不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 1.0mg/L+NAA 0.4mg/L，温度20±1℃，光照2000lx，时间18h/d进行培养；
c、将步骤b中伊犁贝母不定芽切成单芽，随机取40个单芽浸泡在含有秋水仙素800mg/L，2％二甲基亚砜的液体MS培养基中，置于转速为100r/min摇床上浸泡48h；
d、将步骤b中伊犁贝母不定芽切成单芽，随机取40个单芽浸泡在不加秋水仙素的MS液体培养基，置于转速为100r/min摇床上浸泡36h作为对照；
e、将步骤c和d单芽分别用无菌水冲洗2-3次后，于无菌的滤纸上15-25min晾干后转入步骤b不含秋水仙素和二甲基亚砜的不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 1.0mg/L+NAA 0.4mg/L中培养；
f、伊犁贝母多倍体筛选：多倍体伊犁贝母的筛选根据二倍体与秋水仙素处理后不定芽在叶片宽度、叶面积、气孔保卫细胞大小及密度确定疑似株，将疑似株转入1/2 MS+NAA1.0mg/L生根培养基中生根；
g、伊犁贝母多倍体鉴定：取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽组织，经过0.002mol/L 8-羟基喹啉预处理6h，卡诺固定液固定18h，盐酸60℃解离9min，改良苯酚品红染色液染色10min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽染色体，确定多倍体植株。每个生根的不定芽取四个根尖，一个幼嫩不定芽芽点，每个根尖统计20个分裂相细胞，不定芽统计20个分裂相细胞染色体数。经秋水仙素800mg/L处理48h，多倍体诱变率可以达到11％。诱变率：多倍体芽数/(处理芽数-死亡芽数)
实施例6
a、将伊犁贝母新鲜鳞茎用自来水冲洗净表面，大鳞茎于太阳下晾晒12h，小鳞茎晾晒8h，然后将鳞茎在超净工作台上用75％酒精表面消毒30s，0.1％升汞灭菌6min，15％双氧水处理30min，无菌水冲洗2次；
b、将步骤a中处理后的鳞茎切成0.1-0.2cm3大小接入不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0.8mg/L+NAA 0.3mg/L，温度20±1℃，光照2000lx，时间18h/d进行培养；
c、将步骤b中伊犁贝母不定芽切成单芽，随机取40个单芽浸泡在含有秋水仙素200mg/L，2％二甲基亚砜的液体MS培养基中，置于转速为100r/min摇床上浸泡48h；
d、将步骤b中伊犁贝母不定芽切成单芽，随机取40个单芽浸泡在不加秋水仙素的MS液体培养基，置于转速为100r/min摇床上浸泡36h作为对照；
e、将步骤c和d单芽分别用无菌水冲洗2-3次后，于无菌的滤纸上25min晾干后转入步骤b不含秋水仙素和二甲基亚砜的不定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0.8mg/L+NAA 0.3mg/L中培养；
f、伊犁贝母多倍体筛选：多倍体伊犁贝母的筛选根据二倍体与秋水仙素处理后不定芽在叶片宽度、叶面积、气孔保卫细胞大小及密度确定疑似株，将疑似株转入1/2 MS+NAA0.8mg/L生根培养基中生根；
g、伊犁贝母多倍体鉴定：取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽组织，经过0.002mol/L 8-羟基喹啉预处理5h，卡诺固定液固定12h，盐酸60℃解离8min，改良苯酚品红染色液染色10min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽染色体，确定多倍体植株。每个生根的不定芽取四个根尖，一个幼嫩不定芽芽点，每个根尖统计20个分裂相细胞，不定芽统计20个分裂相细胞染色体数。经秋水仙素200mg/L处理48h，多倍体诱变率可以达到15％。诱变率：多倍体芽数/(处理芽数-死亡芽数)