枣树叶柄培养直接成芽方法及其新型培养基 【技术领域】
本发明涉及一种利用枣树叶柄培养直接成芽方法及其新型培养基，尤其适用于枣树的快繁及育种。
背景技术
目前，公知的枣树组培是以枣树叶片或茎段、茎尖作为外植体进行快繁，以叶片为外植体诱导出不定芽，这两种方法除外植体不同外，均以公知的MS(多数)或WPM(少数)为基本培养基，前者要经过初代培养、继代培养形成不定芽，后者要经过脱分化培养形成愈伤组织，再经愈伤组织分化培养诱导出不定芽。显见，由于对外植体和培养基选择的不同、以及至少需两步法培养，即先用一种培养基脱分化培养诱导出愈伤组织，再更换另一种培养基经分化培养再诱导出不定芽，前后至少需60-70天。即需更换培养基，分两次培养，就造成了枣树组培对外植体选择的局限性，以及枣树叶片培养再生植株培养程序的繁琐与诱导率低的影响，从而限制了枣树快繁育种的进展。
【发明内容】
为了克服背景技术的不足，本发明提供一种枣树叶柄培养直接成芽方法及其新型培养基，利用枣树叶柄培养直接分化出不定芽继而培养成完整植株。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：以枣树叶柄作为外植体，在无菌条件下接种在新型培养基上，经培养由叶柄切口处直接分化出不定芽。
枣树叶柄培养直接成芽方法，选择枣树组培苗由顶部向下的倒数第3-4片带叶片的叶柄作为外植体或者无组培苗时选择健康枣树上月内新萌发的枣头上的幼嫩叶柄，在无菌条件下接种在新型培养基上，置于培养架上进行培养，在夜间温度23℃±1℃，白天温度27℃±1℃，相对湿度60％-70％，光照强度1500-2000LX，光照时数12h/d的培养室条件下，经40天左右培养可直接分化出不定芽。
用于枣树叶柄培养直接成芽方法的新型培养基，组成含量为：氯化钙(CaCl2·2H2O)300-400mg/L，硝酸氨(NH4NO3)1000-1400mg/L，硝酸钾(KNO3)1200-1600mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)155-185mg/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)250-300mg/L，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)25-29mg/L，己二胺四乙酸二纳(Na2EDTA)34-40mg/L，硼酸(H3BO3)9-12mg/L，硫酸锰(MnSO4·H2O)17.0-20.0mg/L，硫酸锌(ZnSO47H2O)9.0-11.0mg/L，钼酸纳(Na2MoO4·2H2O)0.20-0.30mg/L，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.010-0.030mg/L，盐酸噻胺(维生素B1)0.4-1.2mg/L，盐酸吡哆辛(维生素B6)0.2-0.6mg/L，烟酸0.2-0.6，肌醇60.0-110mg/L，氨基己酸1.5-2.2mg/L，蔗糖20-40g/L，琼脂5.5-8.0g/L，6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0-2.0mg/L，噻苯隆(TDZ)0.005-0.02mg/L，3-吲哚丁酸(IBA)0.2-0.5mg/L，pH5.8-6.5。
本发明的有益效果是，可以以枣树叶柄为外植体，在新型培养基上能通过一步法培养(即一次培养，不需更换培养基)直接诱导出枣树不定芽，诱导率达41.95％(95％置信区间为38.21％-45.69％)。本发明不仅扩大了枣树组培的外植体取材范围，简化了培养程序，而且为枣树的快繁及育种提供了一条新的技术途径。与公知的培养基相比，新型培养基的总盐浓度有所降低，尤其是大量元素，而有机物浓度有所增加，这对于生长速度较慢的枣属植物，避免了盐浓度过高引起的一些毒副作用，使其营养素含量更切近枣树叶柄培养需要；另外，增加了外源植物生长调节剂噻苯隆(TDZ)，TDZ是苯丙脲类衍生物，具有细胞分裂素和生长素的作用，因而该新型培养基更适于枣树叶柄培养。
【附图说明】
图1、2为将木枣组培苗叶柄接种在新型培养基上，由叶柄愈伤处直接分化出不定芽示意图。
【具体实施方式】
选择枣树组培苗的叶柄作为外植体，通过正交与随机区组实验，研制出一种新型培养基，其组成为：氯化钙(GaCl2·2H2O)330mg/L(以下单位同)，硝酸胺(NH4NO3)1238，硝酸钾(KNO3)1425，磷酸二氢钾(KH2PO4)170，硫酸镁(MgSO4·7H2O)278，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8，己二胺四乙酸二纳(Na2EDTA)37.3，硼酸(H3BO3)10.0，硫酸锰(MnSO4·H2O)19.0，硫酸锌(ZnSO47H2O)10.0，钼酸纳(Na2MoO4·2H2O)0.25，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025，盐酸噻胺(维生素B1)1.0，盐酸吡哆辛(维生素B6)0.5，烟酸0.5，肌醇100.0，氨基己酸2.0，蔗糖30000，琼脂6000，6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.8，噻苯隆(TDZ)0.01，3-吲哚丁酸(IBA)0.3，pH6.0。培养基配制方法：将所需化合物按性质和用量分类配成培养母液，其中，培养基大量成分由硝酸胺(NH4NO3)、硝酸钾(KNO3)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、硫酸镁(MgSO4·7H2O)组成，可配成20倍(20x)储藏母液；培养基微量成分由硼酸(H3BO3)、硫酸锰(MnSO4·H2O)、硫酸锌(ZnSO47H2O)、钼酸纳(Na2MoO4·2H2O)、硫酸铜(CuSO4·5H2O)组成，可配成400倍(40x)储藏母液；培养基有机成分由盐酸噻胺(维生素B1)、盐酸吡哆辛(维生素B6)、烟酸、氨基己酸组成，可配成400倍(40x)储藏母液；培养基铁盐由硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和己二胺四乙酸二纳(Na2EDTA)组成，可配成10倍(10x)储藏母液；培养基钙盐由氯化钙(GaCl2·2H2O)组成可单配成40倍(40x)储藏母液(虽为大量元素，但与其它大量元素混配在一起储藏中易发生沉淀)；培养基中肌醇可单配成200倍(200x)储藏母液(虽为有机元素，但与其它有机元素混配在一起储藏中易发生污染)；培养基中6-BA、IBA分别单配成0.2mg/ml储藏母液；培养基中TDZ可单配成0.01mg/ml储藏母液。以上储藏母液均用无菌水配制，在4℃保藏。具体培养基配制(以配制1000mL培养基为例)：称取6g琼脂，加300-350ml蒸馏水煮溶，在加入30g蔗糖溶解，之后依次加入以下储藏母液：培养基大量成分(20x)50ml、培养基微量成分(400x)5ml、铁盐(10x)10ml、钙盐(40x)25ml、培养基有机成分(400x)5ml、肌醇(200x)10ml，6-BA(0.2mg/ml)9ml、IBA(0.2mg/ml)1.5ml、TDZ(0.01mg/ml)1ml，加蒸馏水定容至1000ml，搅匀，趁热分装，每培养瓶分装培养液约2cm厚度。分装好的培养液于121℃下高压灭菌20分钟，取出后冷却成半固体培养基即成新型培养基。将外植体在无菌条件下接种在培养基上，经培养由叶柄切口处直接分化出不定芽。
如图1所示，选择枣树组培苗由顶部向下的倒数第3-4片带叶片的叶柄作为外植体或者无组培苗时也可选择健康枣树上月内新萌发的枣头上的幼嫩叶柄，按照陈宗礼等的方法(大枣组织培养中外植预处理的研究，《延安大学学报》(自然科学版)，1994，13(1)：66-69.)消毒后作接种外植体，在无菌条件下接种在新型培养基上，置于培养架上进行培养。在夜间温度23℃±1℃，白天温度27℃±1℃，相对湿度60％-70％，光照强度1500-2000LX，光照时数12h/d的培养室条件下，经40天左右诱导培养，由叶柄愈伤处直接分化出不定芽。图1中A为枣树叶柄末端先愈伤化后，由愈伤处直接分化出不定芽；图1中B为枣树叶柄末端先形成少量愈伤组织，由愈伤组织直接分化出丛生不定芽；
如图2所示，将木枣组培苗叶柄接种在新型培养基上，在夜间温度23℃±1℃，白天温度27℃±1℃，相对湿度60％-70％，光照强度1500-2000LX，光照时数12h/d的培养室条件下，经40天左右诱导培养，由叶柄处直接分化出不定芽。图2中A为枣树叶柄末端直接分化出不定芽；图2中B为枣树叶柄末端先形成少量愈伤组织，由愈伤组织直接分化出丛生不定芽。
实验结果统计，共接种174块叶柄，有73块叶柄诱导出不定芽，诱导率41.95％(95％置信区间为38.21％-45.69％)。以此为基础，可进行快繁或育种(如诱变或基因工程操作)研究。