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1、(10)申请公布号 CN 102288669 A (43)申请公布日 2011.12.21 CN 102288669 A *CN102288669A* (21)申请号 201110112989.1 (22)申请日 2011.05.04 G01N 27/48(2006.01) G01N 27/30(2006.01) C01B 31/04(2006.01) (71)申请人 青岛大学 地址 266071 山东省青岛市崂山区香港东路 7 号 (72)发明人 王宗花 赵凯 迟德玲 张菲菲 夏建飞 朱玲艳 (74)专利代理机构 济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人 王连君 (54) 发明名称 。
2、一种基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲 皮素的电化学方法 (57) 摘要 本发明公开一种基于石墨烯修饰电极同时测 定芦丁和槲皮素的电化学方法， 该方法采用石墨 烯修饰玻碳电极作为工作电极， 采用循环伏安法 和差示脉冲伏安法对芦丁和槲皮素进行同时测 定。 本发明利用石墨烯作为电极的修饰材料， 使两 种中药黄酮类物质芦丁和槲皮素在此修饰电极上 得到了电化学的分离， 实现了直接电化学测定法 同时测定槐米中芦丁和槲皮素含量的目的。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102288682 A1/2 页。
3、 2 1. 一种基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学方法， 其特征在于 ： 该方 法采用石墨烯修饰玻碳电极作为工作电极， 采用循环伏安法和差示脉冲伏安法对芦丁和槲 皮素进行同时测定。 2. 根据权利要求 1 所述的一种基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学 方法， 其特征在于包括以下步骤 ： a 选取天然石墨为原料制备石墨烯， 或购买商品化的石墨烯 ； b 将步骤 a 得到的石墨烯溶于蒸馏水中， 配制成浓度为 1 2mg/mL 的石墨烯分散水溶 液， 取2L3L上述浓度的石墨烯分散水溶液滴涂到洁净的玻碳电极的表面， 再置于红 外灯下烤干即得石墨烯修饰电极 ； c 将步骤 b 。
4、得到的石墨烯修饰电极作为工作电极， 与作为参比电极的饱和甘汞电极， 作 为对电极的铂丝电极组成三电极系统， 在 CHI-660B 电化学工作站上完成芦丁和槲皮素的 同时电化学测定。 3. 根据权利要求 2 所述的一种基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学 方法， 其特征在于 ： 步骤 a 中， 所述石墨烯的制备方法包括以下步骤 ： a1 选取天然石墨为原料制备氧化石墨 ； a2将氧化石墨溶于蒸馏水中， 按1mg氧化石墨需置于1mL1.2mL蒸馏水的比例添加， 添加完成后所得氧化石墨溶液呈红棕色悬浮液， 超声振荡至溶液清晰透明无颗粒状物质， 再将所得氧化石墨溶液与肼溶液混合， 氧化石墨溶。
5、液与肼溶液的体积比为 4 1， 二者混 合后呈黑色悬浮液， 然后将黑色悬浮液缓慢升温至 95 100， 并在此温度下回流反应 24h， 反应完成后过滤得滤渣， 再对滤渣进行洗涤干燥， 得到石墨烯。 4. 根据权利要求 3 所述的一种基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学 方法， 其特征在于 ： 步骤 a1 中， 所述氧化石墨的制备方法包括以下步骤 ： 将 2.5g 3g 天然鳞片石墨缓慢加入到装有 57mL 65mL 浓硫酸的烧杯中， 搅拌并在 冰浴条件下向烧杯中继续缓慢加入 1.2g 1.25g 硝酸钠与 7g 7.5g 高锰酸钾组成的混 合物， 然后在冰浴条件下反应 2h， 再置于。
6、 32 38水浴中， 保温 25min 30min， 保温完 成后向烧杯中缓慢加入 110mL 115mL 二次蒸馏水， 然后升温至 98， 并在此温度下维持 15min， 再向烧杯中加入温水稀释， 直至烧杯内溶液体积达到 350mL 停止温水加入， 然后向 烧杯中加入 H2O2， 趁热过滤， 直至滤液中无 8O42-， 收集滤渣， 并将滤渣于 50在 P2O5存在下 干燥 24h， 得到氧化石墨。 5. 根据权利要求 2 所述的一种基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学 方法， 其特征在于 ： 步骤 c 中， 所述电化学测定的方法包括以下步骤 ： 将石墨烯修饰电极先在空白底液中进行多。
7、次循环伏安扫描， 扫描电压为 -0.1 0.7V， 扫描速率为 80mV/s， 直到曲线稳定为止 ； 然后将三电极系统放于适量芦丁和槲皮素的标准 溶液中， 开路富集 60s， 静止 2s， 在 -0.1V 0.7V 扫描区间内进行循环伏安法和差示脉冲伏 安分析， 扫描速率为 100mV/s。 6. 根据权利要求 5 所述的一种基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学 方法， 其特征在于 ： 每次扫描结束后， 将石墨烯修饰电极置于 pH 7.0 的空白磷酸盐缓冲溶 液中， 在-0.21.0V电位区间循环伏安法扫描至芦丁和槲皮素的电化学响应消失， 即可更 新电极表面， 更新后的石墨烯修饰电极。
8、室温下保存待用。 权 利 要 求 书 CN 102288669 ACN 102288669 A CN 102288682 A2/2 页 3 7. 根据权利要求 5 所述的一种基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学 方法， 其特征在于 ： 所述空白底液为磷酸盐缓冲溶液， 该磷酸盐缓冲溶液的浓度为 0.1mol/ L， pH 为 7.0。 权 利 要 求 书 CN 102288669 ACN 102288669 A CN 102288682 A1/5 页 4 一种基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学 方法 技术领域 0001 本发明涉及中药黄酮类物质的测定， 特别是一种可以同时测。
9、定芦丁和槲皮素的电 化学方法， 同时涉及该石墨烯修饰玻碳电极的制备方法， 属于电化学分析技术领域。 背景技术 0002 黄酮类物质芦丁(Rutin)和槲皮素(Quercetin)广泛的存在于植物界和人类的日 常饮食中， 它们参与毛细血管壁的构建， 并且可以减低血管的渗透性和脆性， 越来越广泛地 被作为抗癌、 抗氧化等多功效物质。目前， 芦丁已经作为一种药物被应用于临床治疗中。作 为芦丁的糖基， 槲皮素经常和芦丁共存。 如果某些含有芦丁的药片和软胶囊存放不当， 槲皮 素也许会出现在芦丁的水解产物中。而且， 他们经常被发现共同存在于中草药中， 例如红 花， 槐米， 香草， 连翘等。 然而， 同时含。
10、有这两种成分的中草药却具有不同药理作用， 红花， 是 草红花干燥的花瓣， 经常被用来治疗子宫充血， 心血管类疾病， 血栓症和高胆固醇。 槐米， 是 槐角干燥的花蕾， 具有除热， 参与毛细血管构建和预防高血压等作用。 由于组成成分及各组 分的药效在中药医学中是非常重要的， 所以发展一种方法用于天然药物中芦丁和槲皮素成 分的鉴定是非常必要的。 0003 目前对黄酮类成分中槲皮素和 / 或芦丁的分离和鉴定的分析方法主要有 ： 高效液 相色谱法、 毛细管电泳法或流动注射分析并联合其他的检测技术， 例如荧光分光光度法、 质 谱、 脉冲极谱法、 电化学检测和化学发光等。这些检测技术的联用虽然具有高的选择性。
11、， 但 也存在一些不利因素， 如前处理的繁琐， 操作的复杂性， 时间和试剂的大量消耗， 高的成本 等 ； 而且， 在中药的分析中， 应用高效液相色谱经常由于色谱柱的污染造成柱的短寿命。因 此急需要发展一种可以同时检测芦丁和槲皮素的简单， 快速， 准确的方法。 0004 采用电化学法进行芦丁和槲皮素的同时检测具有设备简单， 检测周期短， 操作容 易等优点， 因而具有更广阔的应用前景。并且容易小型化和开发便携式的仪器， 成本低廉， 产业化方便。然而由于芦丁和槲皮素在常规玻碳电极上的氧化电位相近， 芦丁和槲皮素的 氧化峰出现重叠， 这就限制了其应用于芦丁和槲皮素的同时测定。 发明内容 0005 基于。
12、对玻碳电极进行化学修饰可以改善其电化学性能， 本发明提供一种基于石墨 烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学方法。 0006 其技术解决方案是 ： 0007 一种基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学方法， 该方法采用石墨 烯修饰玻碳电极作为工作电极， 采用循环伏安法和差示脉冲伏安法对芦丁和槲皮素进行同 时测定。 0008 上述基于石墨烯修饰电极同时测定芦丁和槲皮素的电化学方法具体包括以下步 骤 ： 说 明 书 CN 102288669 ACN 102288669 A CN 102288682 A2/5 页 5 0009 a 选取天然石墨为原料制备石墨烯， 或购买商品化的石墨烯 ； 0。
13、010 b 将步骤 a 得到的石墨烯溶于蒸馏水中， 配制成浓度为 1 2mg/mL 的石墨烯分散 水溶液， 取2L3L上述浓度的石墨烯分散水溶液滴涂到洁净的玻碳电极的表面， 再置 于红外灯下烤干即得石墨烯修饰电极 ； 0011 c 将步骤 b 得到的石墨烯修饰电极作为工作电极， 与作为参比电极的饱和甘汞电 极， 作为对电极的铂丝电极组成三电极系统， 在 CHI-660B 电化学工作站上完成芦丁和槲皮 素的同时电化学测定。 0012 上述步骤 a 中， 所述石墨烯的制备方法包括以下步骤 ： 0013 a1 选取天然石墨为原料制备氧化石墨 ； 0014 a2 将氧化石墨溶于蒸馏水中， 按 1mg 。
14、氧化石墨需置于 1mL 1.2mL 蒸馏水的比例 添加， 添加完成后所得氧化石墨溶液呈红棕色悬浮液， 超声振荡至溶液清晰透明无颗粒状 物质， 再将所得氧化石墨溶液与肼溶液混合， 氧化石墨溶液与肼溶液的体积比为 4 1， 二 者混合后呈黑色悬浮液， 然后将黑色悬浮液缓慢升温至 95 100， 并在此温度下回流 反应 24h， 反应完成后过滤得滤渣， 再对滤渣进行洗涤干燥， 得到石墨烯。 0015 上述步骤 a1 中， 所述氧化石墨的制备方法包括以下步骤 ： 0016 将 2.5g 3g 天然鳞片石墨缓慢加入到装有 57mL 65mL 浓硫酸的烧杯中， 搅拌 并在冰浴条件下向烧杯中继续缓慢加入 1。
15、.2g 1.25g 硝酸钠与 7g 7.5g 高锰酸钾组成 的混合物， 然后在冰浴条件下反应 2h， 再置于 32 38水浴中， 保温 25min 30min， 保 温完成后向烧杯中缓慢加入110mL115mL二次蒸馏水， 然后升温至98， 并在此温度下维 持 15min， 再向烧杯中加入温水稀释， 直至烧杯内溶液体积达到 350mL 停止温水加入， 然后 向烧杯中加入 H2O2， 趁热过滤， 直至滤液中无 SO42-， 收集滤渣， 并将滤渣于 50在 P2O5存在 下干燥 24h， 得到氧化石墨。 0017 上述步骤 c 中， 所述电化学测定的方法包括以下步骤 ： 0018 将石墨烯修饰电极。
16、先在空白底液中进行多次循环伏安扫描， 扫描电压为 -0.1 0.7V， 扫描速率为 80mV/s， 直到曲线稳定为止 ； 然后将三电极系统放于适量芦丁和槲皮素 的标准溶液中， 开路富集 60s， 静止 2s， 在 -0.1V 0.7V 扫描区间内进行循环伏安法和差示 脉冲伏安分析， 扫描速率为 100mV/s。 0019 每次扫描结束后， 将石墨烯修饰电极置于 pH 7.0 的空白磷酸盐缓冲溶液中， 在 -0.2 1.0V 电位区间循环伏安法扫描至芦丁和槲皮素的电化学响应消失， 即可更新电 极表面， 更新后的石墨烯修饰电极室温下保存待用。 0020 上述空白底液为磷酸盐缓冲溶液， 该磷酸盐缓冲。
17、溶液的浓度为 0.1mol/L， pH 为 7.0。 0021 本发明的有益技术效果是 ： 0022 本发明提供了一种同时测定芦丁和槲皮素的电化学方法， 首先是石墨烯修饰玻碳 电极的制备， 选取石墨烯作为玻碳电极的修饰材料， 先采用改进的哈默法制备氧化石墨， 然 后通过控制氧化石墨与肼添加量的配比、 反应温度与回流反应时间制得具有纳米片层结构 的石墨烯， 选取石墨烯配制合适浓度的石墨烯分散水溶液， 再将适量石墨烯分散水溶液滴 涂到洁净的玻碳电极表面， 并在红外灯下烤干制得石墨烯修饰玻碳电极。再次是选取上述 石墨烯修饰电极为工作电极， 并与饱和甘汞电极、 铂丝电极组成三电极系统， 对芦丁和槲皮 。
18、说 明 书 CN 102288669 ACN 102288669 A CN 102288682 A3/5 页 6 素进行电化学测定。 经验证， 该三电极系统对芦丁和槲皮素具有高的催化活性， 检测的灵敏 度高， 氧化反应的过电位低， 选择性好， 可以实现对芦丁和槲皮素的同时测定， 是一种高稳 定性、 高灵敏度和高选择性的检测电极， 而且其制备工艺简单， 原理可靠， 环境友好。 附图说明 0023 下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步说明 ： 0024 图 1 为实施例 1 制得的石墨烯透射电镜照片 ； 0025 图2为实施例1制得的石墨烯修饰电极同时测定相同浓度的芦丁和槲皮素的差示 脉冲曲。
19、线。 具体实施方式 0026 实施例 1 0027 称取 2.5g 粒度为 200 目的天然鳞片， 将其缓慢加入到装有 57.5mL 浓硫酸的烧杯 中， 搅拌并在冰浴条件下向烧杯中继续缓慢加入1.25g硝酸钠与7.5g高锰酸钾组成的混合 物， 然后在冰浴条件下反应 2h， 再置于 32 38水浴中， 保温 30min， 保温完成后向烧杯 中缓慢加入 115mL 二次蒸馏水， 然后升温至 98， 并在此温度下维持 15min， 再向烧杯中加 入 40的温水稀释， 直至烧杯内溶液体积达到 350mL 停止温水加入， 然后向烧杯中加入质 量百分比浓度为 5的 H2O2， 趁热过滤， 直至滤液中无 S。
20、O42-( 用 BaCl2溶液检测 )， 收集滤渣， 并将滤渣于 50在 P2O5存在下干燥 24h， 得到氧化石墨， 密封保存待用。 0028 称取 100mg 上述氧化石墨放入装有 100mL 蒸馏水的圆底烧瓶中， 添加完成后所得 氧化石墨溶液呈红棕色悬浮液， 超声振荡至溶液清晰透明无颗粒状物质， 再量取 20mL 该 氧化石墨溶液并与 5mL 肼溶液混合， 混合后呈黑色悬浮液， 然后将黑色悬浮液缓慢升温至 100， 并在此温度下回流反应 24h， 反应完成后过滤得滤渣， 再用蒸馏水和甲醇将滤渣洗涤 干净， 再将洗净后的滤渣在空气流通的情况下干燥， 得到石墨烯， 密封保存待用。选取少量 制。
21、得的石墨烯进行透射电镜实验， 所得透射电镜照片如图 1 所示， 从图 1 中可以看出， 本实 施例制得的石墨烯具有纳米片层结构， 形貌良好， 具有完整的二维平面结构。 0029 将上述石墨烯配制成浓度为 1mg/mL 的石墨烯分散水溶液， 取 2L 滴涂到洁净的 玻碳电极的表面， 再置于红外灯下烤于即得石墨烯修饰电极。 0030 将得到的石墨烯修饰电极作为工作电极， 与作为参比电极的饱和甘汞电极， 作为对电极的铂丝电极组成三电极系统， 在 CHI-660B 电化学工作站上用于对浓度为 110-4mol/L 的芦丁和浓度为 110-4mol/L 的槲皮素同时进行电化学测定。电化学测定 方法如下 。
22、： 将石墨烯修饰电极先在空白底液中进行多次循环伏安扫描， 扫描电压为 -0.1 0.7V， 扫描速率为 80mV/s， 直到曲线稳定为止 ； 然后将三电极系统放于上述浓度的芦丁和 槲皮素的标准溶液中， 开路富集 60s， 静止 2s， 在 -0.1V 0.7V 扫描区间内进行循环伏安法 和差示脉冲伏安分析， 扫描速率为 100mV/s。图 2 分别示出在得到的石墨烯修饰电极上浓 度均为 110-4mol/L 的芦丁与槲皮素混合后的差示脉冲曲线 a， 浓度为 110-4mol/L 的槲 皮素单独存在时的差示脉冲曲线 b， 浓度为 110-4mol/L 的芦丁单独存在时的差示脉冲曲 线 c， 浓度。
23、均为 110-4mol/L 的芦丁和槲皮素混合后的混合液在裸玻碳电极上的差示脉冲 曲线 d。从图 2 中可以看出， 未经修饰的裸玻碳电极 ( 图 2 曲线 d) 上芦丁与槲皮素的灵敏 说 明 书 CN 102288669 ACN 102288669 A CN 102288682 A4/5 页 7 度较低且不能分离， 而在石墨烯修饰电极上芦丁与槲皮素得到了很好的分离， 氧化峰电位 差为 124mV， 并且两者同时存在时不会对其中一组分的电化学信号产生影响， 可实现芦丁和 槲皮素的同时测定， 而且峰电流得到明显的增大 ( 是裸玻碳电极的 5 倍以上 ) ； 并得到了芦 丁和槲皮素的工作曲线， 芦丁。
24、 ： ip(A) 14.65+4088.25C(mol/L)， R 0.9996 ； 槲皮素 ： ip(A) 11.35+4018.56C(mol/L)， R 0.9995， 该三电极系统对芦丁和槲皮素的检出限 分别为 1.210-8mol/L 和 9.010-9mol/L。而且， 作为工作电极的石墨烯修饰电极连续检 测的重复性好， 稳定性高且易被更新。 0031 上述电化学测定方法中， 空白底液选用浓度为 0.1mol/L、 pH 为 7.0 的磷酸盐缓冲 液， 该磷酸盐缓冲液采用下述方法制备 ： 将 61.0mL 浓度为 0.2mol/L 的磷酸氢二钠和 39mL 浓度为 0.2mol/L。
25、 的磷酸二氢钠混合， 得到浓度为 0.2mol/L、 pH 为 7.0 的磷酸盐缓冲液， 再 取 25mL 上述磷酸盐缓冲液并稀释到 50mL 即得浓度为 0.1mol/L、 pH 为 7.0 的磷酸盐缓冲 液。 0032 上述浓度为 110-4mol/L 的芦丁和浓度为 110-4mol/L 的槲皮素的混合溶 液的制备方法如下 ： 称取 0.332g 芦丁， 乙醇溶解， 定容到 50mL 容量瓶中， 得到浓度为 110-2mol/L 的芦丁溶液 ； 称取 0.151g 槲皮素， 乙醇溶解， 定容到 50mL 容量瓶中， 得到浓度 为 110-2mol/L 的槲皮素溶液 ； 分别量取 0.5m。
26、L 浓度为 110-2mol/L 的芦丁溶液， 0.5mL 浓 度为 110-2mol/L 的槲皮素溶液， 25mL 浓度为 0.2mol/L、 pH 7.0 的磷酸盐缓冲液一并置于 50mL 容量瓶中， 二次蒸馏水水定容， 得到浓度为 110-4mol/L 的芦丁和 110-4mol/L 的槲 皮素的混合溶液。 0033 进一步的， 将上述方法制得的石墨烯修饰电极作为工作电极， 用于槐米中芦丁和 槲皮素的同时测定。将槐米用蒸馏水洗净后晒干， 然后在烘箱中于 50干燥 4h， 粉碎， 过 筛。称取 2.00g 槐米粉末， 加入 20mL 乙醇中， 超声提取 30min， 抽滤， 滤液旋转蒸发至。
27、少于 10mL， 定容于 10mL 容量瓶。采用上述电化学方法进行分析测定， 得到槐米中槲皮素的浓度 为 4.49mg/g， 芦丁的浓度为 11.18mg/g ； 加标回收结果显示该三电极系统对槲皮素和芦丁 测定的回收率分别为 99.8和 100.1， 相对标准偏差分别为 1.5和 1.3， 得到了满意 的结果。 0034 上述石墨烯修饰电极测定完成后可重复利用， 具体操作方法为 ： 每次扫描结束后， 将石墨烯修饰电极置于 pH7.0 的空白磷酸盐缓冲溶液中， 在 -0.2 1.0V 电位区间循环伏 安法扫描至芦丁和槲皮素的氧化还原峰消失， 即可更新电极表面， 更新后的石墨烯修饰电 极室温下保。
28、存待用。 0035 上述石墨烯修饰电极也可采用下述方法制得。 0036 如 ： 石墨烯的制备方法同上， 将得到的石墨烯配制成浓度为 1.5mg/mL 的分散水溶 液， 取 2L 滴涂到洁净的玻碳电极的表面， 再置于红外灯下烤干即得石墨烯修饰电极。 0037 再如 ： 石墨烯的制备方法同上， 将得到的石墨烯配制成浓度为 2mg/mL 的分散水溶 液， 取 2L 滴涂到洁净的玻碳电极的表面， 再置于红外灯下烤干即得石墨烯修饰电极。 0038 如 ： 将商品化的石墨烯配制成浓度为1mg/mL的分散水溶液， 取3L滴涂到洁净的 玻碳电极的表面， 再置于红外灯下烤干即得石墨烯修饰电极。 0039 应当理。
29、解的是， 上述针对较佳实施例的描述较为详细， 并不能因此而认为是对本 发明专利保护范围的限制， 本领域的普通技术人员在本发明的启示下， 在不脱离本发明权 说 明 书 CN 102288669 ACN 102288669 A CN 102288682 A5/5 页 8 利要求所保护的范围情况下， 还可以做出替换、 简单组合等多种变形， 这些均落入本发明的 保护范围之内， 本发明的请求保护范围应以所附权利要求为准。 说 明 书 CN 102288669 ACN 102288669 A CN 102288682 A1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102288669 ACN 102288669 A 。