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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410650513.7 (22)申请日 2014.11.14 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 佛山市顺德区今日景艺生物科技有 限公司 地址 528313 广东省佛山市顺德区陈村花卉 世界兰花科技园 (72)发明人 陈永得 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 潘雯瑛 (54) 发明名称 金边蝴蝶兰培养基及培养方法 (57) 摘要 本发明公开了一种金边蝴蝶兰培养基及培养 方法， 所述的金边蝴蝶兰培养基包括初代诱导培 养基和继代增殖培养基 ； 所述初代诱导培养基以 MS培养基。
2、为基础培养基， 并添加有6-苄氨基腺嘌 呤、 萘乙酸、 胺鲜酯、 活性炭、 蔗糖和琼脂粉 ； 所述 继代增殖培养基以 MS 培养基为基础培养基， 并添 加有 6- 苄氨基腺嘌呤、 萘乙酸、 玉米低聚肽粉、 椰 乳、 活性炭、 蔗糖和琼脂粉。本发明所述的培养基 能使金边蝴蝶兰快速繁殖， 且叶片金边性状能稳 定遗传。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 (10)申请公布号 CN 104429950 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104429950 A 1/1 页 2 1. 一种金边蝴蝶兰培养基， 其特。
3、征在于 ： 包括初代诱导培养基和继代增殖培养基 ； 所 述的初代诱导培养基以 MS 培养基为基础培养基， 并添加有 6- 苄氨基腺嘌呤、 萘乙酸、 胺鲜 酯、 活性炭、 蔗糖和琼脂粉 ； 所述的继代增殖培养基以 MS 培养基为基础培养基， 并添加有 6- 苄氨基腺嘌呤、 萘乙酸、 玉米低聚肽粉、 椰乳、 活性炭、 蔗糖和琼脂粉。 2. 根据权利要求 1 所述的金边蝴蝶兰培养基， 其特征在于 ： 所述的初代诱导培养基中， 6- 苄氨基腺嘌呤的浓度为 0.6 1.2mg/L， 萘乙酸的浓度为 0.1 0.2mg/L， 胺鲜酯的浓度 为 0.01 0.08mg/L， 活性炭的浓度为 0.2 0.3g。
4、/L， 蔗糖的浓度为 25 30g/L， 琼脂粉的 浓度为 6 7g/L。 3. 根据权利要求 2 所述的金边蝴蝶兰培养基， 其特征在于 ： 所述初代诱导培养基的 pH 值为 5.8。 4. 根据权利要求 1 所述的金边蝴蝶兰培养基， 其特征在于 ： 所述的继代增殖培养基中， 6- 苄氨基腺嘌呤的浓度为 1.0 4.0mg/L， 萘乙酸的浓度为 0.1 0.7mg/L， 玉米低聚肽粉 的浓度为 17 29g/L， 椰乳的浓度为 130 160mg/L， 活性炭的浓度为 0.2 0.3g/L， 蔗糖 的浓度为 25 30g/L， 琼脂粉的浓度为 6 7g/L。 5. 根据权利要求 4 所述的金边。
5、蝴蝶兰培养基， 其特征在于 ： 所述继代增殖培养基的 pH 值为 5.8。 6. 一种金边蝴蝶兰培养方法， 包括以下步骤 ： 1) 初代诱导培养 ： 以金边蝴蝶兰的花梗腋芽为外植体， 用消毒剂对花梗腋芽作消毒处 理， 然后将花梗腋芽与消毒剂接触的切口以倾斜角度切除， 再以倾斜角度接种于权利要求 1 所述的初代诱导培养基中， 使花梗腋芽的切口与培养基表面相平行， 然后置于人工气候箱， 在温度为 23 26、 光照强度为 1500 2000Lux、 光照时间为 12h/d 的条件下培养 20 25 天， 使花梗腋芽萌发得到初培苗 ； 2) 继代增殖培养 ： 将步骤 1) 得到的初培苗接种于权利要求。
6、 1 所述的继代增殖培养基 中， 置于人工气候箱， 在温度为 23 26、 光照强度为 1500 2000Lux、 光照时间为 12h/d 的条件下培养 40 45 天， 得到金边蝴蝶兰丛生芽。 7. 根据权利要求 6 所述的金边蝴蝶兰培养方法， 其特征在于 ： 所述的消毒剂为质量浓 度 70 75的酒精和质量浓度 0.10 0.12的氯化汞溶液 ； 所述的消毒处理包括 ： 对花 梗腋芽用质量浓度为 70 75的酒精浸泡 25 30 秒， 用无菌水清洗干净后， 再用质量浓 度为 0.10 0.12的氯化汞溶液灭菌 10 15 分钟， 然后用无菌水清洗干净。 权 利 要 求 书 CN 10442。
7、9950 A 2 1/7 页 3 金边蝴蝶兰培养基及培养方法 技术领域 0001 本发明涉及兰花组织培养技术领域， 特别是涉及一种金边蝴蝶兰培养基及培养方 法。 背景技术 0002 蝴蝶兰 (Phalaenopsis) 为兰科蝴蝶兰属多年生草本花卉， 原产于热带和亚热带 地区， 其花形似蝴蝶， 花色艳丽， 花期持久， 具有极高的观赏价值和经济价值， 是当今国内外 花卉市场上最热销的盆花之一。而蝴蝶兰的新品种 “金边蝴蝶兰 (Phalaenopsis Blume)” ， 其叶片边缘为金黄色， 既可观花又可赏叶。近年来， 带 “金边” 叶片的蝴蝶兰新产品， 市场需 求量大， 供不应求， 产品附加值。
8、比一般品种高出 3、 4 倍， 市场潜力大。 0003 在组织培养扩大繁殖过程中， 金边蝴蝶兰又比常规的蝴蝶兰品种更难进行无性繁 殖， 在初代培育中需要很漫长的萌发诱导过程 ； 此外， 由于金边蝴蝶兰的叶边为金黄色的特 异性， 其叶片所含的叶绿素比一般的蝴蝶兰少， 在组培过程中生长比较缓慢， 特别在初代诱 导和继代增殖阶段， 幼苗吸收光和营养的能力相对较弱， 极容易发生死苗、 叶片金边性状缺 失等问题 ； 由于叶片的金边性状为特殊的嵌合体彩色斑条， 不能无条件遗传， 在继代增殖培 养过程中， 金边性状率不足 60。这些因素导致了金边蝴蝶兰的生产效率低、 生产成本高， 难以形成规模化生产。 发明。
9、内容 0004 基于此， 有必要针对金边蝴蝶兰培育过程中金边性状容易缺失、 萌发时间长、 生长 缓慢的问题， 提供一种能使金边蝴蝶兰快速繁殖、 叶片金边性状稳定遗传的培养基。 0005 此外， 有必要针对金边蝴蝶兰培育过程中金边性状容易缺失、 萌发时间长、 生长缓 慢的问题， 提供一种能使金边蝴蝶兰快速繁殖、 叶片金边性状稳定遗传的培养方法。 0006 一种金边蝴蝶兰培养基， 其包括初代诱导培养基和继代增殖培养基 ； 所述的初代 诱导培养基以 MS 培养基为基础培养基， 并添加有 6- 苄氨基腺嘌呤、 萘乙酸、 胺鲜酯、 活性 炭、 蔗糖和琼脂粉 ； 所述的继代增殖培养基以 MS 培养基为基础。
10、培养基， 并添加有 6- 苄氨基 腺嘌呤、 萘乙酸、 玉米低聚肽粉、 椰乳、 活性炭、 蔗糖和琼脂粉。 0007 在其中一个实施例中， 所述的初代诱导培养基中， 6- 苄氨基腺嘌呤的浓度为 0.6 1.2mg/L， 萘乙酸的浓度为 0.1 0.2mg/L， 胺鲜酯的浓度为 0.01 0.08mg/L， 活性 炭的浓度为 0.2 0.3g/L， 蔗糖的浓度为 25 30g/L， 琼脂粉的浓度为 6 7g/L。 0008 在其中一个实施例中， 所述的继代增殖培养基中， 6- 苄氨基腺嘌呤的浓度为 1.0 4.0mg/L， 萘乙酸的浓度为 0.1 0.7mg/L， 玉米低聚肽粉的浓度为 17 29g。
11、/L， 椰乳 的浓度为 130 160mg/L， 活性炭的浓度为 0.2 0.3g/L， 蔗糖的浓度为 25 30g/L， 琼脂 粉的浓度为 6 7g/L。 0009 在其中一个实施例中， 所述初代诱导培养基、 所述继代增殖培养基的 pH 值均为 5.8。 说 明 书 CN 104429950 A 3 2/7 页 4 0010 一种金边蝴蝶兰培养方法， 包括以下步骤 ： 0011 1) 初代诱导培养 ： 以金边蝴蝶兰的花梗腋芽为外植体， 用消毒剂对花梗腋芽作消 毒处理， 然后将花梗腋芽与消毒剂接触的切口以倾斜角度切除， 再以倾斜角度接种于本发 明所述的初代诱导培养基中， 使花梗腋芽的切口与培养。
12、基表面相平行， 然后置于人工气候 箱， 在温度为 23 26、 光照强度为 1500 2000Lux、 光照时间为 12h/d 的条件下培养 20 25 天， 使花梗腋芽萌发得到初培苗 ； 0012 2) 继代增殖培养 ： 将步骤 1) 得到的初培苗接种于本发明所述的继代增殖培养基 中， 置于人工气候箱， 在温度为 23 26、 光照强度为 1500 2000Lux、 光照时间为 12h/d 的条件下培养 40 45 天， 得到金边蝴蝶兰丛生芽。 0013 在其中一个实施例中， 所述的消毒剂为质量浓度 70 75的酒精和质量浓度 0.10 0.12的氯化汞溶液 ； 所述的消毒处理包括 ： 对花。
13、梗腋芽用质量浓度为 70 75 的酒精浸泡 25 30 秒， 用无菌水清洗干净后， 再用质量浓度为 0.10 0.12的氯化汞溶 液灭菌 10 15 分钟， 然后用无菌水清洗干净。 0014 本发明所述的金边蝴蝶兰培养基， 能够促使金边蝴蝶兰快速繁殖， 并使其叶片的 金边性状得到稳定遗传。其中， 初代诱导培养基中添加的胺鲜酯 ( 己酸二乙氨基乙醇酯， DA-6) 为广谱和高效的植物生长调节剂， 毒副作用小， DA-6 能够提高植株体内叶绿素、 蛋白 质、 核酸的含量和光合速率， 并能提高过氧化物酶及硝酸还原酶的活性， 促进植株的碳、 氮 代谢， 促进植物细胞的分裂和伸长， 从而增强植株对养分的。
14、吸收和干物质的积累， 促进金边 蝴蝶兰的生长， 此外， 植株吸收 DA-6 后， 还能协同促进植物内源激素 ( 包括促进植物生长 的生长素、 调节植物细胞生长和发育的细胞分裂素、 加速细胞伸长的赤霉素等 ) 和生理活 性物质 ( 包括碳水化合物、 有机酸、 氨基酸、 生物碱等 ) 的作用， 从而调节植物的生长发育。 继代增殖培养基中添加的玉米低聚肽粉富含玉米肽， 玉米肽作为玉米蛋白经过酶降解而 获得的多种小肽的混合物， 除具有肽类物质的优良特性优于氨基酸或蛋白质的直接吸 收、 溶解性强、 稳定性强、 安全性高等特性以外， 还具有抗病毒、 抗氧化、 减少变异率的作用。 6- 苄氨基腺嘌呤 (6-。
15、BA) 和萘乙酸 (NAA) 具有促进种苗生长的作用， 在初代诱导培养基中， 能够促进腋芽萌发， 减少死芽发生 ； 在继代增殖培养基中， 6-BA 和 NAA 则能够促进小苗生长 和增殖， 并具有壮苗的作用。 椰乳为有机添加物， 能够为植物生长提供必要的生理活性物质 及微量成分。 活性炭则能够提供暗环境， 避免培养基中的营养物质和调节物质发生分解， 以 确保其稳定性和活性， 并能够吸附离体培养中的酚类物质， 使多酚氧化酶和过氧化酶失活， 以防止植株发生褐化。此外， 在初代诱导培养基中， 胺鲜酯还能提高植株的同化能力， 加速 植株对培养基中各组分的吸收， 并具有协同促进作用， 因而能降低6-BA。
16、和NAA等的用量， 并 使之发挥更佳的效用， 降低生产成本。 0015 本发明所述的金边蝴蝶兰培养基中， 胺鲜酯能够促进金边蝴蝶兰的腋芽快速萌 发， 实现快速繁殖 ； 而玉米低聚肽粉能够增强金边蝴蝶兰遗传性状的稳定性。实验证明， 采 用本发明的培养基进行培养， 金边蝴蝶兰在增殖培养阶段的繁殖系数提高到 2.8 3.8， 所 培育出来的金边蝴蝶兰中， 叶片金边性状的保持率高达 97.4， 解决了金边蝴蝶兰萌发时 间长、 生长缓慢、 叶片的金边性状容易缺失， 以及难以形成规模产量的问题， 并能降低生产 成本， 增加生产效益。 0016 本发明所述的金边蝴蝶兰培养基中， 所述初代诱导培养基、 继代增。
17、殖培养基的 pH 说 明 书 CN 104429950 A 4 3/7 页 5 值均控制为 5.8， 金边蝴蝶兰外植体在 pH5.8 的弱酸环境下， 其多酚氧化酶的活性及总酚含 量较低， 能有效减缓外植体褐化现象， 提高成活率。 0017 本发明所述的金边蝴蝶兰培养方法， 由于采用了本发明的金边蝴蝶兰培养基， 能 促使金边蝴蝶兰快速繁殖， 并能使其叶片金边性状得到稳定遗传。 花梗腋芽经消毒处理后， 以倾斜角度切去其与消毒剂接触的切口， 再以倾斜角度接种于本发明的初代诱导培养基 中， 花梗腋芽的切口与培养基表面相平行， 能够增大腋芽切口与培养基的接触面积， 增加外 植体吸收养分的能力， 促进外植。
18、体的生长， 缩短腋芽的萌发时间。 具体实施方式 0018 实施例一 ： 制备本发明所述的金边蝴蝶兰培养基 0019 1、 按照以下表 1 的配方， 分别称取 MS 培养基的各成分。 0020 表 1MS 培养基的成分及其用量 0021 0022 说 明 书 CN 104429950 A 5 4/7 页 6 0023 2、 配制初代诱导培养基 0024 按照以下表 2 的配方， 分别称取金边蝴蝶兰初代诱导培养基的各成分。 0025 表 2 金边蝴蝶兰初代诱导培养基成分及其用量 0026 样品编号基础培养基6-BANAA胺鲜酯活性炭蔗糖琼脂粉 培养基 1 号MS 培养基0.6mg0.1mg0.01。
19、mg0.2g30g7g 培养基 2 号MS 培养基0.7mg0.12mg0.02mg0.2g30g7g 培养基 3 号MS 培养基0.8mg0.14mg0.03mg0.2g30g7g 培养基 4 号MS 培养基0.9mg0.16mg0.05mg0.2g30g7g 培养基 5 号MS 培养基1.0mg0.18mg0.06mg0.2g30g7g 培养基 6 号MS 培养基1.2mg0.2mg0.08mg0.2g30g7g 培养基 7 号MS 培养基1.0mg0.2mg0.05mg0.2g30g7g 对照组 1 号MS 培养基1.0mg0.18mg00.2g30g7g 对照组 2 号MS 培养基00。
20、.18mg0.06mg0.2g30g7g 对照组 3 号MS 培养基1.0mg00.06mg0.2g30g7g 0027 配制方法如下 ： 0028 1) 取 100mg 的 6-BA， 用 5mL 浓度为 1N 的盐酸溶液溶解， 然后加蒸馏水定容至 1L， 制得浓度为 0.1mg/mL 的 6-BA 溶液 ； 取 100mg 的 NAA， 用 1mL 质量浓度为 95的酒精溶解， 然后加蒸馏水定容至 1L， 制得浓度为 0.1mg/mL 的 NAA 溶液 ； 0029 2) 按照表 1、 表 2 所示的配方， 分别将 MS 培养基的各成分、 6-BA 溶液、 NAA 溶液、 胺 鲜酯、 活性。
21、炭、 蔗糖及琼脂粉置于烧杯中， 加入 500mL 蒸馏水搅拌溶解， 然后加入蒸馏水定 容至 1L， 并调节 pH 值至 5.8， 得到所述的金边蝴蝶兰初代诱导培养基。 0030 备注 ： 对照组 1 号不需要添加胺鲜酯， 对照组 2 号不需要添加 6-BA， 对照组 3 号不 说 明 书 CN 104429950 A 6 5/7 页 7 需要添加 NAA。 0031 3、 配制继代增殖培养基 0032 按照以下表 3 的配方， 分别称取金边蝴蝶兰继代增殖培养基的各成分。 0033 表 3 金边蝴蝶兰继代增殖培养基成分及其用量 0034 0035 配制方法如下 ： 0036 1) 取 100mg。
22、 的 6-BA， 用 5mL 浓度为 1N 的盐酸溶液溶解， 然后加蒸馏水定容至 1L， 制得浓度为 0.1mg/mL 的 6-BA 溶液 ； 取 100mg 的 NAA， 用 1mL 质量浓度为 95的酒精溶解， 然后加蒸馏水定容至 1L， 制得浓度为 0.1mg/mL 的 NAA 溶液 ； 0037 2) 按照表 1、 表 2 所示的配方， 分别将 MS 培养基的各成分、 6-BA 溶液、 NAA 溶液、 椰 乳、 活性炭、 蔗糖及琼脂粉置于烧杯中， 加入 500mL 蒸馏水搅拌溶解， 再加入玉米低聚肽粉， 然后加入蒸馏水搅拌溶解， 定容至1L， 并调节pH值至5.8， 得到所述的金边蝴蝶。
23、兰继代增殖 培养基。 0038 备注 ： 对照组4号不需要添加玉米低聚肽粉， 对照组5号不需要添加NAA， 对照组6 号不需要添加 6-BA。 0039 实施例二 ： 金边蝴蝶兰组织培养方法 0040 1、 初代诱导培养 0041 以金边蝴蝶兰的花梗腋芽为外植体， 用质量浓度为 70 75的酒精浸泡 25 30 秒， 用无菌水清洗干净后， 再用质量浓度为0.100.12的氯化汞溶液灭菌1015分钟， 再用无菌水清洗干净， 然后用灭菌的手术刀将花梗腋芽与消毒剂接触的切口以倾斜角度切 除， 再以倾斜角度接种于实施例一制得的初代诱导培养基中， 使花梗腋芽的切口与培养基 表面相平行， 然后置于人工气候。
24、箱， 在温度为 23 26、 光照强度为 1500 2000Lux、 光 照时间为12h/d的条件下培养25天， 使腋芽萌发得到初培苗， 并分别记录其萌发时间、 萌发 率， 结果如表 4 所示。 0042 表 4 金边蝴蝶兰初代培养试验结果 说 明 书 CN 104429950 A 7 6/7 页 8 0043 样品编号萌发时间y1萌发率 y2y* 培养基 1 号17.2 天87.319.26 培养基 2 号16.7 天89.1411.17 培养基 3 号16.1 天92.4314.02 培养基 4 号15.8 天95.2516.03 培养基 5 号15.3 天99.0718.94 培养基 6。
25、 号16.1 天94.6515.13 培养基 7 号17.5 天90.7710.39 对照组 1 号18.5 天76.211.11 对照组 2 号18.1 天80.634.11 对照组 3 号17.9 天81.174.79 0044 备注 ： 萌发率 y2初培苗数 / 接种腋芽数 100 ； 0045 y* 表示培养基的综合评分， y* (y1)(-3)+(y2)50。 0046 由表 4 的试验结果可见， 与对照组相比， 采用本发明的初代诱导培养基对金边蝴 蝶兰进行初代培养， 能缩短金边蝴蝶兰腋芽的萌发时间， 并提高其萌发率， 证明胺鲜酯具有 缩短萌发时间、 提高萌发率的作用。随着 6-BA。
26、、 NAA 及胺鲜酯添加量的增加， 金边蝴蝶兰腋 芽的萌发时间越短， 萌发率越高， 其中培养基 5 号的配方， 具有最佳的萌发促进作用， 而含 量高于培养基 5 号的用量时， 开始出现抑制作用。 0047 2、 继代增殖培养 0048 将步骤 1 得到的初培苗分别接种于实施例一制得的继代增殖培养基中， 置于人工 气候箱， 在温度为 23 26、 光照强度为 1500 2000Lux、 光照时间为 12h/d 的条件下培 养45天， 得到金边蝴蝶兰丛生芽， 并分别记录其叶数、 叶长和金边性状率， 结果如表5所示。 0049 表 5 金边蝴蝶兰继代培养试验结果 0050 样品编号叶长 y1单株叶数。
27、 y2增殖系数 y3金边性状率 y4y* 培养基 8 号2.1cm2.1 片2.880.390.55 培养基 9 号2.3cm2.4 片3.387.6100.7 培养基 10 号2.4cm2.6 片3.492.0106.2 说 明 书 CN 104429950 A 8 7/7 页 9 培养基 11 号2.6cm2.8 片3.594.3111.65 培养基 12 号2.7cm3.1 片3.897.4118.1 培养基 13 号2.5cm2.7 片3.694.5110.05 培养基 14 号2.4cm2.5 片3.391.8104.8 对照组 4 号2.0cm1.7 片2.373.280.5 对照。
28、组 5 号2.2cm1.8 片2.476.585.45 对照组 6 号2.3cm1.9 片2.577.388.15 0051 备注 ： 增殖系数 y3有效苗数 / 接种苗数 ； 0052 金边性状率 y4带金边性状的植株数 / 培养基中总植株数 100 ； 0053 y* 表示培养基的综合评分， y* (y1)10+(y2)10+(y3)3+(y4)50。 0054 由表 5 的试验数据可见， 采用本发明的继代增殖培养基对金边蝴蝶兰进行继代培 养， 所获得的金边蝴蝶兰长势更好， 其平均叶长、 叶数、 增殖率及金边性状率的数据均优于 对照组， 证明玉米低聚肽粉能使其金边性状在组培快繁中稳定遗传。。
29、随着 6-BA、 NAA 及玉米 低聚肽粉添加量的增加， 金边蝴蝶兰的丛生芽叶长、 叶数、 带金边性状率增大， 其中培养基 12 号的配方， 具有最佳的培养效果， 而含量高于培养基 12 号的用量时， 开始出现抑制作用。 0055 综上所述， 本发明所述的金边蝴蝶兰培养基， 可使金边蝴蝶兰腋芽快速萌发， 并使 其性状的遗传稳定性增强， 很好地解决了金边蝴蝶兰在较短时间内难以形成规模产量和金 边性状容易缺失的问题， 从而可以快速生产稀缺品种、 降低生产成本、 增加生产效益。 0056 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保 护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说 明 书 CN 104429950 A 9 。