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1、10申请公布号CN104245933A43申请公布日20141224CN104245933A21申请号201380018432922申请日20130719201216623320120726JPC12N15/09200601A01H5/00200601C07K14/415200601C07K16/16200601C12N1/15200601C12N1/19200601C12N1/21200601C12N5/1020060171申请人独立行政法人科学技术振兴机构地址日本埼玉县72发明人小林高范西泽直子74专利代理机构中科专利商标代理有限责任公司11021代理人蒋亭54发明名称新的铁锌结合性调控因。
2、子以及通过其表达调节提高植物的耐缺铁性和促进可食用部分中的铁锌蓄积的技术57摘要根据本发明，提供在石灰质土壤中表现出比通常的植物更优良的生长、并且在石灰质土壤和优良土壤这两种土壤中均能够大量地蓄积铁和锌的转化体和基因破坏株、以及它们的制作中使用的基因、载体、蛋白质、抗体、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作方法/制作用组合物/制作用试剂盒/育种方法。本发明的蛋白质的特征在于，由下述AC中任一种氨基酸序列构成，并且为铁锌结合性调控因子。A序列号1或2所示的氨基酸序列、B在序列号1或2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个多个氨基酸而成的氨基酸序列、C与序列号1或2所示的氨基酸序列的。
3、同源性为80以上的氨基酸序列。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014093086PCT国际申请的申请数据PCT/JP2013/0696282013071987PCT国际申请的公布数据WO2014/017394JA2014013051INTCL权利要求书2页说明书17页序列表13页附图20页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书17页序列表13页附图20页10申请公布号CN104245933ACN104245933A1/2页21一种蛋白质，其特征在于，由下述AC中任一种氨基酸序列构成，并且为铁锌结合性调控因子，A序列号1或2所示的氨基酸序列，B在序列。
4、号1或2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个多个氨基酸而成的氨基酸序列，或者，C与序列号1或2所示的氨基酸序列的同源性为80以上的氨基酸序列。2一种基因，其特征在于，编码权利要求1所述的蛋白质。3一种基因，其特征在于，由下述DG中任一种DNA构成，并且编码作为铁锌结合性调控因子的蛋白质，D由序列号3或4所示的碱基序列构成的DNA，E由在序列号3或4所示的碱基序列中缺失、取代或添加一个多个碱基而成的碱基序列构成的DNA，F由与序列号3或4所示的碱基序列的同源性为80以上的碱基序列构成的DNA，或者，G由能够与由序列号3或4所示的碱基序列所构成的DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交。
5、的碱基序列构成的DNA。4一种载体，其特征在于，能够抑制权利要求2或3所述的基因的表达。5如权利要求4所述的载体，其能够表达可在MRNA水平上抑制所述基因的表达的RNAI诱导性核酸。6如权利要求5所述的载体，其中，所述RNAI诱导性核酸为序列号5所示的碱基序列。7一种转化体，其特征在于，通过将权利要求46中任一项所述的载体导入宿主中而形成。8一种基因破坏株，其特征在于，具有权利要求2或3所述的基因由于整合插入序列而被破坏的基因组DNA。9一种抗体，其特征在于，与权利要求1所述的蛋白质特异性地结合。10一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作方法，其特征在于，包括将权利要求46中任。
6、一项所述的载体导入植物中的步骤。11一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用组合物，其特征在于，具备权利要求46中任一项所述的载体。12一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用试剂盒，其特征在于，具备权利要求46中任一项所述的载体。13一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的育种方法，其特征在于，包括对来自植物的提取液中含有的权利要求1所述的蛋白质进行检测的步骤。权利要求书CN104245933A2/2页314一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的育种方法，其特征在于，包括对来自植物的提取液中含有的权利要求2或3所述的基因进行检测的步骤。权。
7、利要求书CN104245933A1/17页4新的铁锌结合性调控因子以及通过其表达调节提高植物的耐缺铁性和促进可食用部分中的铁锌蓄积的技术技术领域0001本发明涉及提高植物的耐缺铁性和促进可食用部分中的铁锌蓄积。详细而言，本发明涉及具有对植物的耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积进行调控的作用的蛋白质、基因、载体、转化体、基因破坏株、抗体、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作方法、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用组合物、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用试剂盒、以及提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的育种方法。0002本申请要求以2012。
8、年7月26日在日本提出的特愿2012166233号为基础的优先权，将其内容援引到本发明中。背景技术0003植物为了生长、进行碳固定和物质生产，需要铁和锌。植物通过吸收土壤中的铁和锌来将它们加以利用。0004然而，在约占世界土壤的30的石灰质碱性土壤中，可溶化的铁和锌少，其中，可溶化的铁极少。因此，对于石灰质碱性土壤中的植物的生长而言，缺铁成为主要的制约因素。0005因此，当务之急是获得在以石灰质碱性土壤为代表的不良土壤中也可良好生长的植物。0006另外，从土壤中吸收铁和锌的植物是人类的主要的矿物质供给源。缺铁症和缺锌症对于全世界的人类、特别是儿童和女性已经成为深刻的问题，因此，期望获得在可食用。
9、部分中含有大量的铁和锌的植物。0007近年来，正在进行与铁和锌特别是铁的吸收和利用相关的基因的鉴定和分析。已经获得了通过改变该基因并导入植物中而提高了耐缺铁性和耐缺锌性的植物、或在可食用部分中蓄积有大量的铁和锌的植物例如，参照非专利文献111。0008现有技术文献0009非专利文献0010非专利文献1TAKAHASHI,M,等,NATUREBIOTECH,2001VOL19,PP4664690011非专利文献2ISHIMARU,Y,等,PROCNATLACADSCIUSA,2007VOL104,PP737373780012非专利文献3SUZUKI,M,等,SOILSCIPLANTNUTR,20。
10、08VOL54,PP77850013非专利文献4OGO,Y,等,PLANTMOLBIOL,2011VOL75,PP5936050014非专利文献5GOTO,F,等,NATUREBIOTECH,1999VOL17,PP2822860015非专利文献6UAUY,C,等,SCIENCE,2006VOL314,PP129813010016非专利文献7MASUDA,H,等,RICE,2008VOL1,PP1001080017非专利文献8MASUDA,H,等,RICE,2009VOL2,PP155166说明书CN104245933A2/17页50018非专利文献9LEE,S,等,PROCNATLACADS。
11、CIUSA,2009VOL106,PP22014220190019非专利文献10WIRTH,J,等,PLANTBIOTECHJ,2009VOL7,PP1140020非专利文献11ISHIMARU,Y,等,PLANTJ,2010VOL62,PP379390发明内容0021发明所要解决的问题0022但是，尚未获得在石灰质土壤中表现出与优良土壤中的生长同等程度或者更高程度的生长的植物。另外，尚未获得在石灰质土壤和优良土壤这两种土壤中均能够大量地例如，以往的2倍量以上蓄积铁和/或锌的植物。0023因此，从获得具有这种性质的植物的观点而言，还有改良的余地。0024本发明基于上述情况而完成，提供在石灰质土。
12、壤中表现出比通常的植物更优良的生长、并且在石灰质土壤和优良土壤这两种土壤中均能够在可食用部分中大量地蓄积铁和锌的转化体和基因破坏株、以及在它们的制作中使用的基因、载体、蛋白质、抗体、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作方法、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用组合物、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用试剂盒、以及提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的育种方法。所谓可食用部分，可举出例如植物的种子、地上部分、茎叶、根等，只要是作为食用、饲料用而可食用的部分，则不一定限定于这些部分。另外，在上述植物为水稻的情况下，可举出作为相当于种子的部分的。
13、糙米、将糙米制成精米而得到的胚芽米、分解米、白米等。0025用于解决问题的手段0026本发明人为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现了具有抑制植物的缺铁应答的作用的蛋白质。并且发现，通过制作抑制了编码该蛋白质的基因的表达的植物，能够提高植物的耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积，从而完成了本发明。0027即，本发明提供具有下述特征的蛋白质、基因、载体、转化体、基因破坏株、抗体、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作方法、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用组合物、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用试剂盒、以及提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的。
14、植物的育种方法。00281一种蛋白质，其特征在于，由下述AC中任一种氨基酸序列构成，并且为铁锌结合性调控因子，0029A序列号1或2所示的氨基酸序列，0030B在序列号1或2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个多个氨基酸而成的氨基酸序列，或者，0031C与序列号1或2所示的氨基酸序列的同源性为80以上的氨基酸序列。00322一种基因，其特征在于，编码上述1所述的蛋白质。00333一种基因，其特征在于，由下述DG中任一种DNA构成，并且编码作为铁锌结合性调控因子的蛋白质，0034D由序列号3或4所示的碱基序列构成的DNA，0035E由在序列号3或4所示的碱基序列中缺失、取代或添加一个多个碱基而。
15、成的说明书CN104245933A3/17页6碱基序列构成的DNA，0036F由与序列号3或4所示的碱基序列的同源性为80以上的碱基序列构成的DNA，或者，0037G由能够与由序列号3或4所示的碱基序列所构成的DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交的碱基序列构成的DNA。00384一种载体，其特征在于，能够抑制上述2或3所述的基因的表达。00395如上述4所述的载体，其能够表达可在MRNA水平上抑制所述基因的表达的RNAI诱导性核酸。00406如上述5所述的载体，其中，所述RNAI诱导性核酸为序列号5所示的碱基序列。00417一种转化体，其特征在于，通过将上述46中任一项所述的载体。
16、导入宿主中而形成。00428一种基因破坏株，其特征在于，具有上述2或3的基因由于整合插入序列而被破坏的基因组DNA。00439一种抗体，其特征在于，与上述1所述的蛋白质特异性地结合。004410一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作方法，其特征在于，包括将上述46中任一项所述的载体导入植物中的步骤。004511一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用组合物，其特征在于，包含上述46中任一项所述的载体。004612一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用试剂盒，其特征在于，包含上述46中任一项所述的载体。004713一种提高了耐缺铁性和可食用部分中。
17、的铁锌蓄积的植物的育种方法，其特征在于，包括对来自植物的提取液中含有的上述1所述的蛋白质进行检测的步骤。004814一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的育种方法，其特征在于，包括对来自植物的提取液中含有的上述2或3所述的基因进行检测的步骤。0049发明效果0050根据本发明，能够制作出在石灰质土壤中表现出比通常的植物更优良的生长、在石灰质土壤和优良土壤这两种土壤中均能够大量地蓄积铁和锌的转化体和基因破坏株。0051此外，根据本发明，能够有助于不良土壤中的碳酸固定、物质生产以及人类的铁锌缺乏症的缓解。附图说明0052图1表示本发明的OSHRZ1蛋白质和OSHRZ2蛋白质的域结构。0。
18、053图2表示本发明的基因破坏株中的基因组结构。0054图3表示具有蚯蚓血红蛋白域的蛋白质的系统树和域结构。0055图4表示使用定量RTPCR得到的OSHRZ1和OSHRZ2的MRNA的表达水平的分析结果。0056图5表示所制作的重组蛋白的域结构。0057图6表示野生型和突变型OSHRZ蛋白质与金属的结合能力的分析结果。说明书CN104245933A4/17页70058图7表示含有各重组蛋白溶解液的管的照片。0059图8表示OSHRZ2表达抑制株中的、使用定量RTPCR得到的OSHRZ2的MRNA的表达水平的分析结果。0060图9表示在缺铁栽培条件下的OSHRZ2表达抑制株的最新叶中的叶绿素含。
19、量的定量结果。0061图10表示在石灰质土壤长期栽培下的OSHRZ2表达抑制株的最新叶中的叶绿素含量的定量结果。0062图11表示在石灰质土壤中栽培28天下的未处理NT的稻和OSHRZ2表达抑制株的株高的照片。0063图12表示OSHRZ破坏株中的基因组PCR的结果。0064图13表示在缺铁栽培条件下的OSHRZ破坏株的最新叶中的叶绿素含量的定量结果。0065图14表示在铁充足条件下和缺铁条件下水培7天后的OSHRZ2表达抑制株的叶中的蓄积铁浓度。0066图15表示在石灰质土壤中和通常的土壤中盆培后的OSHRZ2表达抑制株的稻杆中的蓄积铁浓度。0067图16表示在石灰质土壤中和通常的土壤中盆培。
20、后的OSHRZ2表达抑制株的种子中的蓄积铁浓度。0068图17表示在隔离田内的通常土壤中栽培后的OSHRZ2表达抑制株的糙米和白米中的蓄积铁浓度。0069图18表示在石灰质土壤中和通常的土壤中盆培后的OSHRZ2表达抑制株的种子中的蓄积锌浓度。0070图19表示在隔离田内的通常土壤中栽培后的OSHRZ2表达抑制株的糙米和白米中的蓄积锌浓度。0071图20表示在通常的土壤中盆培后的OSHRZ破坏株的种子中的蓄积铁浓度。0072图21表示在通常的土壤中盆培后的OSHRZ破坏株的种子中的蓄积锌浓度。0073图22表示在通常的土壤中盆培后的OSHRZ破坏株的稻杆中的蓄积铁浓度。0074图23表示在通常。
21、的土壤中盆培后的OSHRZ破坏株的稻杆中的蓄积锌浓度。0075图24表示在铁充足条件下和缺铁条件下水培后的OSHRZ2表达抑制株的根中的、使用44K微阵列得到的基因表达谱的分析结果。0076图25表示通过微阵列分析，对于在铁充足条件下的OSHRZ2表达抑制株的根中确认到表达上升的基因，使用定量RTPCR进行验证的结果。具体实施方式00770078本发明的蛋白质由下述AC中任一种氨基酸序列构成，并且为铁锌结合性调控因子。0079A序列号1或2所示的氨基酸序列，0080B在序列号1或2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个多个氨基酸而成说明书CN104245933A5/17页8的氨基酸序列，或者，。
22、0081C与序列号1或2所示的氨基酸序列的同源性为80以上的氨基酸序列。0082上述A的氨基酸序列为序列号1或2所示的氨基酸序列。0083本发明人将由序列号1和2所示的氨基酸序列构成的蛋白质分别命名为包含水稻蚯蚓血红蛋白模体的真正感兴趣新基因型锌指蛋白ORYZASATIVAHEMERYTHRINMOTIFCONTAININGREALLYINTERESTINGNEWGENERINGANDZINCNGERPROTEIN，以下称为OSHRZ1和OSHRZ2。0084如图1所示，OSHRZ1从N末端侧到C末端侧包括三个推定的蚯蚓血红蛋白也作为HHE而公知结构域、推测参与转录调控/转录后调控/蛋白质分解。
23、调控等的两个ZN指结构域CHY样ZN指结构域和CTCHY样ZN指结构域、作为E3连接酶起作用而参与蛋白质分解调控的RINGZN指结构域和推测为了传递电子而形成铁硫簇的红素氧还蛋白样模体。0085另外，如图1所示，OSHRZ2从N末端侧到C末端侧包括一个蚯蚓血红蛋白结构域、三个ZN指结构域CHY样ZN指结构域、CTCHY样ZN指结构域和RINGZN指结构域和红素氧还蛋白样模体。0086在缺铁栽培条件下，编码这些OSHRZ蛋白质的基因的表达被诱导。0087认为植物中合成的OSHRZ蛋白质通过蚯蚓血红蛋白结构域与铁和锌结合，作为对植物细胞内的铁与其他金属的浓度比进行检测的铁传感器起作用。0088此外。
24、，OSHRZ1和OSHRZ2蛋白质通过推测参与转录调控/转录后调控/蛋白质分解调控等的上述三个ZN指结构域，主要在铁充足条件的栽培下抑制铁摄取相关基因和铁迁移相关基因的表达。0089作为上述B，例如可举出在蚯蚓血红蛋白结构域以外的部位具有突变缺失、插入、取代或添加的蛋白质、或者具有位于蚯蚓血红蛋白结构域且保持铁锌结合活性的突变的蛋白质。0090另外，作为上述B，可举出例如在推测参与转录调控/转录后调控/蛋白质分解调控等的上述三个ZN指结构域以外的部位具有突变的蛋白质、或者具有位于上述ZN指结构域且保持铁摄取相关基因和铁迁移相关基因的表达抑制能力的突变的蛋白质。0091在此，作为可以被缺失、取代。
25、或添加的氨基酸的数量，优选110个，更优选17个，进一步优选15个，特别优选13个，最优选12个。0092构成本发明的蛋白质的氨基酸序列中，对一个或多个氨基酸引入突变可以使用公知技术容易地进行。0093例如，根据公知的定点诱变法，可以使编码蛋白质的基因中的任意碱基发生突变。另外，可以设计与编码蛋白质的基因中的任意部位对应的引物来制作缺失突变体或者添加突变体。0094作为上述C，可举出例如在蚯蚓血红蛋白结构域以外的部位具有突变缺失、插入、取代或添加的蛋白质、或者具有位于蚯蚓血红蛋白结构域且保持铁锌结合活性的突变的蛋白质。0095另外，上述C，可举出例如在推测参与转录调控/转录后调控/蛋白质分解调。
26、控等的上述三个ZN指结构域以外的部位具有突变的蛋白质、或者具有位于上述ZN指结构域且保持铁摄取相关基因和铁迁移相关基因的表达抑制能力的突变的蛋白质。说明书CN104245933A6/17页90096在此，作为与序列号1或2所示的氨基酸序列的同源性氨基酸序列的同源性，优选为80以上，更优选85以上，进一步优选90以上，特别优选95以上，最优选98以上。0097作为表达本发明的蛋白质中使用的表达载体，可举出在宿主细胞中表达本发明的蛋白质的细胞系载体、和在由从适当的细胞提取出的具有蛋白质合成能力的成分构成的蛋白质翻译系统中表达本发明的蛋白质的无细胞系载体。0098作为细胞系载体，可以使用适合宿主细胞。
27、的公知的表达载体。例如可举出大肠杆菌中以PBR322诱导体为代表的COLEI系质粒、具有P15A起点的PACYC系质粒、PSC系质粒、来源于BAC系等的F因子的MINIF质粒。此外，还可以举出具有TRC、TAC等色氨酸启动子、LAC启动子、T7启动子、T5启动子、T3启动子、SP6启动子、阿拉伯糖诱导启动子、冷休克启动子、四环素诱导性启动子等的表达载体。0099作为无细胞系载体，可举出在细胞系载体中列举的具有T7启动子的表达载体、具有T3启动子的表达载体；具有SP6启动子或T7启动子的PEU系质粒等小麦无细胞蛋白质合成用载体等。0100使用无细胞系载体的蛋白质合成中，首先，使用转录系统对CDN。
28、A进行转录，合成MRNA。作为该转录系统，可举出利用RNA聚合酶进行转录的现有公知的转录系统。作为RNA聚合酶，可举出例如T7RNA聚合酶。0101接着，使用作为翻译系统的无细胞蛋白质合成系统对MRNA进行翻译，从而合成蛋白质。该系统中包含核糖体、翻译起始因子、翻译延伸因子、解离因子、氨酰TRNA合成酶等翻译所必需的要素。作为这样的蛋白质翻译系统，可举出大肠杆菌提取液、兔网织红细胞提取液、小麦胚芽提取液等。0102此外，还可举出上述翻译所必需的要素仅由独立纯化的因子构成的再构成型无细胞蛋白质合成系统。0103使用细胞系载体或无细胞系载体合成的蛋白质可以在细胞成分提取液中使用，也可以纯化后再使用。
29、。作为纯化方法，可举出盐析法、使用各种层析法的方法。在表达载体以在目的蛋白质的N末端或C末端表达组氨酸标签等标签序列的方式设计的情况下，可举出使用镍、钴等对该标签具有亲和性的物质的利用亲和柱的纯化方法。此外，也可以通过将离子交换层析法、凝胶过滤层析法等适当组合后进行纯化来提高本发明的蛋白质的纯度。01040105本发明的基因编码由上述AC中任一种氨基酸序列构成且为铁锌结合性调控因子的蛋白质。0106另外，本发明的基因编码由以下的DG中任一种DNA构成且为铁锌结合性调控因子的蛋白质。0107D由序列号3或4所示的碱基序列构成的DNA，0108E由在序列号3或4所示的碱基序列中缺失、取代或添加一个。
30、多个碱基而成的碱基序列构成的DNA，0109F由与序列号3或4所示的碱基序列的同源性碱基序列的同源性为80以上、优选为85以上、更优选为90以上、进一步优选为95以上、特别优选为98以上的碱基序列构成的DNA，或者，说明书CN104245933A7/17页100110G由能够与由序列号3或4所示的碱基序列构成的DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交的碱基序列构成的DNA。0111在此，作为可以被缺失、取代或添加的碱基的数量，优选130个，更优选120个，进一步优选115个，特别优选110个，最优选15个。0112本发明和本申请说明书中，所谓“在严格的条件下”，例如可举出MOLECU。
31、LARCLONINGALABORATORYMANUAL分子克隆实验指南第三版SAMBROOK等、冷泉港实验室出版社中记载的方法。例如可举出通过在由5SSC20SSC的组成3M氯化钠、03M柠檬酸溶液、PH70、01重量N月桂酰肌氨酸、002重量的SDS、2重量的核酸杂交用封闭试剂和50甲酰胺构成的杂交缓冲液中在5570下进行数小时至过夜的温育来进行杂交的条件。作为温育后的洗涤时使用的洗涤缓冲液，优选为含有01重量SDS的1SSC溶液、更优选为含有01重量SDS的01SSC溶液。01130114本发明的载体为能够抑制上述的本发明的基因的表达的载体。优选能够表达可在MRNA水平抑制上述基因的表达的。
32、RNAI诱导性核酸。0115RNAI诱导性核酸是指通过导入到植物细胞内而能够诱导RNA干扰的核酸。所谓RNA干扰是指，含有与MRNA或其部分序列互补的碱基序列的RNA抑制该MRNA的表达的效果。0116RNAI诱导性核酸的作为标靶的MRNA可以是编码区，也可以是非编码区。作为上述RNAI诱导性核酸，优选为序列号5所示的碱基序列，该RNAI诱导性核酸以OSHRZ的3UTRUNTRANSLATEDREGION，非翻译区全长和编码区的一部分作为标靶。0117另外，作为RNAI诱导性核酸，例如可举出SIRNA、MIRNA。作为导入到植物细胞内、与SIRNA同样地引起RNAI的载体，可举出SHRNASH。
33、ORTHAIRPINRNA/SMALLHAIRPINRNA，短发夹RNA/小发夹RNA表达载体。0118利用本发明的载体，能够提高植物的耐缺铁性和铁锌蓄积。0119在此，“植物的耐缺铁性”是指即使在可溶化的铁分少的土壤中也能生长的特性，例如，在碱性土壤中不易发生称为萎黄病由于叶绿素缺陷导致的黄色化的缺铁症的等特性。0120另外，“铁锌蓄积”是指能够在稻的地上部、特别是作为可食用部分的种子中蓄积高浓度的铁和锌的特性。例如，将使用上述载体制作的转化体在隔离田是指基于规定的手续而设置的基因重组用的隔离田内的普通土壤中栽培而得到的种子与未处理的稻的种子相比，含有约38倍量的铁，含有约12倍量的锌。01。
34、21本发明的载体可以利用公知的基因重组技术来制作。01220123本发明的转化体有时也称为表达抑制株是将本发明的载体导入宿主中而得到的。如上所述，本发明的载体能够使作为宿主的植物的耐缺铁性和铁锌蓄积提高。因此，本发明的转化体的耐缺铁性优良，并且特别是能够在可食用部分中蓄积高浓度的铁锌。0124另外，本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作方法是指用于制作耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物体的方法。本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作方法只要包含将本发明的载体导入植物体内的步骤，则没有特别限定。说明书CN104245933A108/17页110125在使用重组表达载体的情况下，植物。
35、体的转化中应使用的载体只要是能够在该植物内抑制本发明的基因的表达的载体，则没有特别限定。0126作为这样的载体，例如可举出具有花椰菜花叶病毒的35S启动子等在植物细胞内使基因进行结构性表达的启动子的载体；具有因外部刺激而诱导性活化的启动子的载体。0127本发明中作为转化对象的植物表示整个植物体、植物器官例如叶、花瓣、茎、根、种子等、植物组织例如表皮、韧皮部、柔软组织、木质部、维管束、栅栏组织、海绵组织等或植物培养细胞、或者各种形式的植物细胞例如，悬浮培养细胞、原生质体、叶的切片、愈伤组织等中的任意一种。作为转化中使用的植物，没有特别限定，优选为稻科植物，更优选为稻、大麦、小麦或玉米。0128基。
36、因向植物中的导入可以使用本领域技术人员公知的转化方法例如，土壤杆菌法、基因枪、PEG法、电穿孔法等，大致分为土壤杆菌介导的方法和直接导入植物细胞的方法。使用土壤杆菌法时，可以使用将构建的植物用表达载体导入适当的土壤杆菌例如，根癌土壤杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENS中，依照叶盘法内宫博文著、植物基因操作指南19902731页、讲谈社SCIENTIFIC、东京等使该菌株感染无菌培养叶片，从而得到转化植物的方法。0129另外，可以使用NAGEL等的方法MICRIBIOLLETT,1990VOL67,PP325。该方法为如下方法首先，将表达载体导入土壤杆菌，接着，将转化后的土壤杆菌。
37、用PLANTMOLECULARBIOLOGYMANUAL植物分子生物学指南SBGELVIN等、学术出版社出版中记载的方法导入植物细胞或植物组织中。在此，“植物组织”包括通过植物细胞的培养得到的愈伤组织。使用土壤杆菌法进行转化时，可以使用PBI系的双元载体例如，PBIG、PBIN19、PBI101、PBI121、PBI221和PPZP202等。0130另外，作为将基因直接导入植物细胞或植物组织的方法，可举出电穿孔法、基因枪法等。使用基因枪时，作为导入基因的对象，可以直接使用植物体、植物器官、植物组织本身，也可以制备切片后使用，还可以制备原生质体后使用。可以使用基因导入装置例如PDS1000伯乐公。
38、司等对这样制备的试样进行处理。处理条件因植物或试样而异，通常以约4502000PSI的压力、约412CM的距离进行。0131对于基因导入后的细胞或植物组织，首先利用潮霉素抗性等药剂抗性进行选择，接着通过常规方法再生为植物体。从转化细胞向植物体的再生可以根据植物细胞的种类通过本领域技术人员公知的方法来进行。作为选择标记物，并不限定于潮霉素抗性，例如可举出对博莱霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等的抗药性。0132在使用植物培养细胞作为宿主的情况下，例如可举出显微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法、基因枪粒子枪法、原生质体融合法、磷酸钙法等。通过这些方法将重组载体导入培养细胞而进行转化。作为转化结果而得到。
39、的愈伤组织、根、毛状根等可以直接用于细胞培养、组织培养或器官培养。可以使用这些现有公知的植物组织培养法，通过施用适当浓度的植物激素生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、芸苔素内酯等等使其再生为植物体。0133基因是否已被导入植物可以通过PCR法、SOUTHERN杂交法、NORTHERN杂交法等进行确认。例如，由转化植物制备DNA，设计DNA特异性引物并进行PCR。PCR可以在本领域技说明书CN104245933A119/17页12术人员公知的条件下进行。然后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等，利用溴化乙锭、SYBRGREEN液等进行染色。然后，使扩增产物成为单。
40、链来进行检测，由此可以确认已被转化。另外，也可以使用预先由荧光色素等标记的引物进行PCR并检测扩增产物。此外，还可以采用使扩增产物结合到微孔板等固相上、利用荧光或酶反应等来确认扩增产物的方法。0134一旦获得在基因组内整合有本发明的载体的转化植物体，则可以通过该植物体的有性生殖或无性生殖获得后代。另外，可以由上述植物体或其后代、或者它们的克隆得到例如种子、果实、穗、块茎、块根、根株、愈伤组织、原生质体等，并在它们的基础上大量生产上述植物体。0135因此，本发明的转化体也包括以可表达的方式导入有本发明的载体的植物体、或与该植物体具有相同性质的上述植物体的后代、或者来源于它们的组织。0136013。
41、7本发明的基因破坏株通过整合插入序列而具有本发明的基因被破坏的基因组DNA。例如，如图2所示，通过利用同源重组使TDNAHRZ11插入到基因组DNA中、或者通过转座子HRZ21的转移，使基因组DNA上存在的本发明的基因被破坏，从而使其表达被抑制。0138利用本发明的基因破坏株，本发明的基因和蛋白质的表达被抑制。因此，铁摄取相关基因、铁迁移相关基因的稳定表达抑制被解除，能够提高植物中的耐缺铁性和铁锌蓄积。0139作为本发明的基因破坏株，优选TOS17插入株ND6059稻基因组资源中心。该插入株不是转化植物，因此，从可在一般的田地中快速生长的方面而言优良。0140本发明的转化体和基因破坏株除了如上。
42、所述可食用部分中的铁锌蓄积的显著提高，还兼具优良的耐缺铁性。因此，对于在半干燥地带、石灰质土壤等容易潜在缺铁的栽培条件下稳定地生产富铁食物而言是特别有用的。01410142本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用组合物含有本发明的载体。另外，本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用试剂盒包括本发明的载体。在此，“组合物”是指各种成分含有在一种物质中的方式。“试剂盒”是指各种成分中的至少一种含有在另一物质中的方式。0143另外，“耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用组合物”为用于制作耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物体的组合物。“耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用试剂盒”。
43、为用于制作耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的试剂盒。0144本发明的转化体通过将本发明的载体导入宿主植物而得到。由此，本发明的基因的表达被抑制，耐缺铁性和铁锌蓄积能够提高。并且，如上所述，如果使用本发明的载体，则能够将本发明的载体导入植物体中。因此，包括本发明的载体的组合物或包括载体的试剂盒优选用于制作耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物。0145即，本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用组合物、或耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用试剂盒可以作为上述的本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作方法中的载体的供给源使用。0146本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用组合。
44、物除了包括本发明说明书CN104245933A1210/17页13的载体以外，还可以包括溶剂、分散介质、试剂等。0147另外，本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用试剂盒除了包括本发明的载体以外，还可以包括溶剂、分散介质、试剂、用于使用它们的说明书等。在此，本发明的试剂盒中，除说明书以外还“包括”溶剂等是指包含在构成试剂盒的各个容器例如，瓶、板、管、碟等中的任意一种的内部。0148另外，本发明的试剂盒例如可以将物质A和物质B混合包括在同一容器内，可以包括在分开的容器内。“说明书”可以书写在纸或其他介质上，也可以印刷在纸或其他介质上，或者还可以附于磁带、计算机可读磁盘或磁带、CDROM。
45、等这样的电子介质上。另外，本发明的试剂盒可以包括内包有稀释剂、溶剂、洗涤液、其他试剂的容器。01490150本发明的抗体只要是与本发明的蛋白质特异性结合的抗体，则没有限定，可以为针对上述蛋白质的多克隆抗体等，但优选为针对上述蛋白质的单克隆抗体。单克隆抗体从下述方面而言优良具有性质均匀且易于供给，可以将其产生细胞以杂交瘤的形式半永久地保存等。0151作为本发明的抗体，可举出免疫球蛋白IGA、IGD、IGE、IGG、IGM和它们的FAB片段、FAB2片段、FC片段，具体而言，可举出多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体和抗独特型抗体等，但不限定于这些。0152需要说明的是，本发明的抗体可以依照各种公知的。
46、方法来制作。例如，单克隆抗体可以通过使用该领域中公知的技术例如，杂交瘤法KOHLER,G和MILSTEIN,C,NATURE256,4954971975、三瘤体法、人类B细胞杂交瘤法KOZBOR,IMMUNOLOGYTODAY4,721983和EBV杂交瘤法参照MONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPY,ALANRLISS,INC,77961985等来制作。0153另外，肽抗体可以依照该领域中公知的方法例如，CHOW,M,等,PROCNATLACADSCIUSA1985VOL82,PP910914；BITTLE,FJ等,JGENVIROL1985VOL66,PP2。
47、3472354来制作。0154本发明的抗体如上所述包括FAB片段、FAB2片段等片段。这样的片段代表地可以通过使用木瓜蛋白酶生成FAB片段或胃蛋白酶生成FAB2片段等酶对抗体进行蛋白质分解来产生。0155或者，这样的片段可以通过应用重组DNA技术或化学合成来产生。01560157第一实施方式0158本实施方式的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的育种方法包括对提取自植物的提取物中含有的本发明的蛋白质进行检测的步骤。0159本实施方式的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的育种方法只要包括为了判断在植物体内本发明的蛋白质的表达是否被抑制而对本发明的蛋白质进行检测的步骤即可。基于本发明的蛋白质的表达的有。
48、无，筛选具有耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物。0160如上所述，本发明的蛋白质抑制在植物从土壤中获得铁时具有重要作用的基因的表达。因此，上述蛋白质的表达被抑制的植物获得铁的能力高，耐缺铁性和铁锌蓄积提高。说明书CN104245933A1311/17页140161另外，依照本实施方式的方法育种得到的植物体可以为天然的植物体，也可以为转化体。0162提取自植物的提取物可以使用利用液体氮气的冷冻破碎法、市售的提取试剂盒来获得，但并不限定于此。另外，“提取物”可以为粗提纯物，也可以为经过若干纯化步骤后的纯化标准品。0163本实施方式的育种方法中，作为上述对提取自植物的提取物中含有的本发明的蛋白质。
49、进行检测的步骤，可举出通过使提取自该植物的提取物与本发明的抗体反应来对本发明的蛋白质进行检测的步骤。如上所述，上述抗体与本发明的蛋白质特异性结合而形成免疫复合物，因此，通过检测该复合物的形成，能够容易地检测在植物体内表达的上述蛋白质。0164上述复合物的形成例如使用将上述抗体预先用同位素等标记的方法、或者使用针对上述抗体的二次抗体的方法等来检测。具体而言，可以使用公知的蛋白免疫印迹法、蛋白芯片法等。0165另外，本发明的抗体优选用于本实施方式的耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积得到提高的植物的育种方法。因此，含有本发明的抗体的组合物或者包括上述抗体的试剂盒优选用于耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积得到提高的植物的育种。0166第二实施方式0167本实施方式的植物的育种方法包括对提取自植物的提取物中含有的本发明的基因进行检测的步骤。0168上述对提取自植物的提取物中含有的本发明的基因进行检测的步骤优选包括将本发明的基因的片段或由其互补序列构成的寡核苷酸与上述提取自植物的提取物进行温育的步骤，更优选包括使提取自植物的提取物与来源于目标植物的基因组DNA、MRNA或针对MRNA的CDNA杂交的步骤。0169通过使用本实施方式的育种方法对杂交后的靶基因进行检测，。