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1、(10)申请公布号 CN 103160491 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103160491 A *CN103160491A* (21)申请号 201310129238.X (22)申请日 2013.04.15 CCTCC NO: M 2013112 2013.03.28 C12N 11/10(2006.01) C12N 11/08(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C02F 101/34(2006.01) (71)申请人 江西师范大学 地址 330000 江西省南昌市紫阳大道 99 号 (72)发明人 彭仁 。
2、杨贵娟 杜芸芸 王启明 (54) 发明名称 赤红球菌SD3的诱变菌M1的固定化细胞及其 在降解苯酚污染物中的应用 (57) 摘要 一种赤红球菌SD3的诱变菌M1的固定化细胞 及其在降解苯酚污染物中的应用， 赤红球菌 SD3 通过 0.3% 氯化锂诱变后筛选得到的诱变菌 M1 在 72h内对1.5g/L 的苯酚降解率为99.77%。 诱变菌 M1 用 1% 海藻酸钠和 1% 聚乙烯醇包埋制备直径为 6mm 的固定化细胞。固定化细胞重复使用 5 次， 在 72h 内对 2g/L 的苯酚降解率均在 98% 以上。因此 赤红球菌SD3的诱变菌M1及其固定化细胞在降解 苯酚污染物具有高效性， 可用于生物。
3、法处理含酚 工业废水。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103160491 A CN 103160491 A *CN103160491A* 1/1 页 2 1. 一种赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1 的固定化细胞， 其特征是固定化细胞用质量分数 1 % 海藻酸钠和质量分数1 %聚乙烯醇包埋制备， 取10 g湿菌体与10 ml 1 %海藻酸钠-1 %聚 乙烯醇溶液在常温下均匀混合， 将以上混合液加入无菌的注射器。
4、中， 缓慢的滴入冰冷的 0. 1 mol/L 无菌饱和硼酸 - 氯化钙溶液中， 将含有凝胶珠的饱和硼酸 - 氯化钙溶液放入 4 冰箱中固定 24 h， 弃去饱和硼酸 - 氯化钙溶液， 加入无菌蒸馏水洗涤一次， 再加入无菌蒸馏 水， 4 保存备用。 2. 根据权利要求 1 所述的赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1 的固定化细胞， 其特征在于， 所述 的固定化细胞的直径为 6mm。 3. 一种权利要求 1 所述的赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1 的固定化细胞在降解苯酚污染物 中的应用， 其特征在于， 所述的固定化细胞重复使用五次， 在72h内对2g/L的苯酚降解率均 在 98% 以上。 4. 根据权。
5、利要求 1 所述的一种赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1 的固定化细胞， 其特征是所 述菌体为赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1， 现保存在国家知识产权局指定的保藏单位保藏， 保藏 单位是中国典型培养物保藏中心， 保藏日期为 2013 年 3 月 28 日， 保藏编号为 CCTCC NO: M 2013112， 拉丁文学名为 Rohodococcus ruber M1。 权 利 要 求 书 CN 103160491 A 2 1/3 页 3 赤红球菌SD3的诱变菌M1的固定化细胞及其在降解苯酚污 染物中的应用 技术领域 0001 本发明属于环境生物技术领域， 尤其涉及一种赤红球菌SD3的诱变菌M1的。
6、固定化 细胞在降解苯酚污染物中的应用。 背景技术 0002 苯酚是工业废水中的主要污染物。我国把苯酚列入环境优先污染物黑名单之中， 并且对含酚废水的排放有严格的规定 ： 一般条件下， 饮用水的含挥发性酚的浓度为 0.001 mg/L， 水源水体中含酚最高允许浓度为 0.002 mg/L。生物法是目前废水处理领域中较为 先进的方法及应用最广泛的处理技术， 也是我国含酚废水无害化处理的主要方法。但是由 于含酚废水的毒性及难降解的特性， 所以引入的菌种必须要有较强的适应能力和降苯酚能 力。目前从自然环境中分离获得了一些苯酚降解菌， 其中Pseudomonas putida, Bacillus bre。
7、vis, Candida maltosa,Candida tropicalis和 Alcaligenes faecalis 能够耐受高达 1000mg L-1以上的苯酚。然而有关Rhodococcus ruber对苯酚的降解却没有报道。 0003 此外， 对于降解苯酚， 固定化细胞是一种有效的方法， 它能够提高细胞对苯酚的耐 受性， 而且可以重复使用。迄今为止， 有多种固定化技术和固定化材料用于废水处理。包埋 法是应用最广的方法。 海藻酸钙由于价格低、 固定步骤简单、 对细胞没有毒性而成为一种普 通的包埋介质。但是， 海藻酸钙制成的小球易碎， 并且易被微生物破坏。如果加入聚乙烯醇 形成复合物，。
8、 那将提高小球的机械性能和热稳定性。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1 的固定化细胞及其在降解 苯酚污染物中的应用， 可以有效提高苯酚降解性能。 0005 本发明是这样实现的， 一种赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1 的固定化细胞， 固定化细胞 用质量分数 1 % 海藻酸钠和质量分数 1 % 聚乙烯醇包埋制备， 取 10 g 湿菌体与 10 ml 1 % 海藻酸钠 -1 % 聚乙烯醇溶液在常温下均匀混合， 将以上混合液加入无菌的注射器中， 缓慢 的滴入冰冷的 0. 1 mol/L 无菌饱和硼酸 - 氯化钙溶液中， 将含有凝胶珠的饱和硼酸 - 氯化 钙溶。
9、液放入4 冰箱中固定24 h， 弃去饱和硼酸-氯化钙溶液， 加入无菌蒸馏水洗涤一次， 再加入无菌蒸馏水， 4 保存备用。 0006 所述的固定化细胞的直径为 6mm。 0007 所述的固定化细胞重复使用五次， 在 72h 内对 2g/L 的苯酚降解率均在 98% 以上。 0008 所述菌体为赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1， 现保存在国家知识产权局指定的保藏单 位保藏， 保藏单位是中国典型培养物保藏中心， 保藏日期为 2013 年 3 月 28 日， 保藏编号为 CCTCC NO: M 2013112， 拉丁文学名为 Rohodococcus ruber M1。 0009 本发明所述赤红球菌 。
10、SD3 为已保藏并公开的菌种， 现保存在国家知识产权局指定 的保藏单位保藏， 保藏单位是中国典型培养物保藏中心， 保藏日期为 2012 年 2 月 26 日， 保 说 明 书 CN 103160491 A 3 2/3 页 4 藏编号为 CCTCC NO: M 2012035， 拉丁文学名为 Rhodococcus ruber SD3。 0010 赤红球菌 SD3 通过 0.3 % 氯化锂诱变后筛选得到的诱变菌 M1 在苯酚无机盐培养 基 （NaCl 1 g， NH4Cl 1 g， MgSO47H2O 3 g， K2HPO4 1.5 g， KH2PO4 0.5 g， 苯酚 1.5g， 无酚蒸 馏。
11、水定容至 1000 mL） 中， 35、 200r/min 摇床震荡培养 72h 后， 苯酚降解率为 99.77%。因 此赤红球菌SD3的诱变菌M1在降解苯酚污染物具有高效性， 可用于生物法处理含酚工业废 水。 0011 本发明的技术效果是 ： 固定化细胞重复使用五次， 在 72h 内对 2g/L 的苯酚降解率 均在 98% 以上， 因此赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1 的固定化细胞在降解苯酚污染物具有高效 性， 可用于生物法处理含酚工业废水。 附图说明 0012 图 1 为赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1 的降解苯酚性能图。 0013 图 2 为赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1 的固定化细胞。
12、图。 具体实施方式 0014 实施例 1 ： 赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1 的降解苯酚性能 用接种环挑取赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1， 复活于 LB 培养基中， 待菌种生长至对数期。 按 2 % 的量接种于苯酚无机盐培养基 （NaCl 1 g， NH4Cl 1 g， MgSO47H2O 3 g， K2HPO4 1.5 g， KH2PO4 1.5 g， 苯酚 1.5g， 无酚蒸馏水定容至 1000 mL） ， 35 、 200 r/min 摇床震荡培养 72 h。采用 4 - 氨基安替比林分光光度法测得苯酚的降解率为 99.77%（图 1） 。 0015 实施例 2 ： 赤红球菌 SD3。
13、 的诱变菌 M1 的固定化方法 1、 从保存的斜面上挑取赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1， 接种于 LB 培养基液体中， 35、 200 rpm 摇床振荡活化培养 28 h。取活化的菌液按照 2 % 的接种量接种后在 35、 200 rpm 摇 床振荡培养。 0016 2、 将培养的菌液分别于 4000 rpm 离心 10 min， 收集菌体于 50 ml 无菌离心管中， 加入 50 ml 无菌水振荡洗涤后 4000 rpm 离心 10 min， 重复上述步骤再洗涤一次。 0017 3、 取 10 g 湿菌体与 10 ml 1 % 海藻酸钠 （SA） -1 % 聚乙烯醇 （PVA） 溶液在常温。
14、下 均匀混合。 0018 4、 将以上混合液加入无菌的注射器中， 缓慢的滴入冰冷的0. 1 mol/L无菌饱和硼 酸 - 氯化钙溶液中。 0019 5、 将含有凝胶珠的饱和硼酸 - 氯化钙溶液放入 4 冰箱中固定 24 h。 0020 6、 弃去饱和硼酸 - 氯化钙溶液， 加入无菌蒸馏水洗涤一次， 再加入无菌蒸馏水， 4 保存备用 （图 2） 。 0021 实施例 3 ： 赤红球菌 SD3 的诱变菌 M1 的固定化细胞的重复使用性 1、 将固定化细胞加入苯酚无机盐培养基 （NaCl 1 g， NH4Cl 1 g， MgSO4 7H2O 3 g， K2HPO4 1.5 g， KH2PO4 0.5。
15、 g， 苯酚 2.0g， 无酚蒸馏水定容至 1000 mL） 中， 35、 200 rpm 摇床振荡培 养 72 h。 0022 2、 从培养后的培养基中取出固定化细胞， 用无菌水洗涤两次。将洗涤后的固定化 细胞加入新的苯酚无机盐培养基 （NaCl 1 g， NH4Cl 1 g， MgSO47H2O 3 g， K2HPO4 1.5 g， 说 明 书 CN 103160491 A 4 3/3 页 5 KH2PO4 0.5 g， 苯酚 2.0g， 无酚蒸馏水定容至 1000 mL） 中， 35、 200 rpm 摇床振荡培养 72 h， 重复使用五次。第一次至第五次苯酚降解率分别为 99.99%、 99.99%、 98.98%、 99.78%、 98.53%。 说 明 书 CN 103160491 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103160491 A 6 。