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1、10申请公布号CN104220458A43申请公布日20141217CN104220458A21申请号201380017477422申请日20130222102012001922120120224KRC07K16/28200601A61K39/395200601A61K47/42200601A61K47/4820060171申请人阿特根公司地址韩国大田72发明人朴淳宰郑惠信权善勳李善培柳善儿金容模74专利代理机构北京律诚同业知识产权代理有限公司11006代理人徐金国54发明名称结合有含半胱氨酸残基的基序的修饰抗体,含该修饰抗体的修饰抗体药物缀合物以及其制造方法57摘要本发明涉及一种抗体,其中由。
2、包括一个或多个半胱氨酸残基的氨基酸或肽序列组成的基序结合于亲本抗体的末端,特别是亲本抗体的重链末端。并且,本发明涉及一种包括结合于所述抗体的药物的修饰抗体药物缀合物MADC,以及一种用于制造所述抗体或所述修饰抗体药物缀合物的方法。由于其对抗原的高度特异性,根据本发明的修饰抗体药物缀合物能够准确地递送药物至靶细胞,因而能够提高药物的治疗效果。并且,其能够提高药物,特别是抗癌药物的可用性,所述抗癌药物尽管具有高功效,但由于其毒性而使用受到限制。而且,本发明涉及用于治疗疾病,特别是癌症的组合物,所述组合物包括修饰抗体药物缀合物。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014092886PCT。
3、国际申请的申请数据PCT/KR2013/0014172013022287PCT国际申请的公布数据WO2013/125891KO2013082951INTCL权利要求书8页说明书28页序列表26页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书8页说明书28页序列表26页附图5页10申请公布号CN104220458ACN104220458A1/8页21一种修饰抗体,包括在抗体末端处的含半胱氨酸的基序,所述含半胱氨酸的基序具有下式1的代表性结构XAMCYSNXBNN式1其中MCYSN表示简单半胱氨酸残基或者含有半胱氨酸残基并具有特定功能的肽基序或二级或三级结构,XA和XBN各独立。
4、地表示包括0到20个除半胱氨酸以外的氨基酸残基的肽;N是1到20范围的整数。2权利要求1所述的修饰抗体,其中具有由上式1表示的结构的含半胱氨酸的基序结合到亲本抗体的重链末端。3权利要求2所述的修饰抗体,其中具有由上式1表示的结构的含半胱氨酸的基序结合到亲本抗体的重链的C末端。4权利要求1所述的修饰抗体,其中所述具有特定功能的肽基序或二级或三级结构是选自由以下物质构成的组中的任何一种或多种锌指蛋白的C2H2组CYS2HIS2类CYSX24CYSX12HISX35HIS,C4组C4类CYSX2CYSXNCYSX2CYSXMCYSX2CYSXNCYSX2CYS或C6组C6类CYSX2CYSX6CYS。
5、X512CYSX2CYSX68CYS;基于锌指基序或金属离子结合蛋白基序而人工设计的金属离子结合基序;转录调节蛋白、金属螯合蛋白,金属离子转运蛋白或超氧化物歧化酶中的CYSXMCYS基序、METXCYSXXCYS基序或CQCQCAC基序;膜蛋白ATP酶的SERPROCYS基序;具有环状结构的金属离子结合肽基序;和CGH或HGC基序,其中在上述具有特定功能的所述肽基序的结构中或所述二级或三级结构中,X表示除CYS之外的氨基酸残基;M是1到10范围的整数,优选1到5范围的整数;XM或XMQ表示M个或M到Q个除CYS之外的氨基酸残基。5权利要求4所述的修饰抗体,其中所述锌指蛋白的C2H2组、C4组或。
6、C6组是选自由以下序列组成的组中的任何一种YKCKQCGKAFGCPSNLRRHGRTHSEQIDNO1,QCNICGGKCFSCNSNLHRHQRTHSEQIDNO2,YSCGICGKSFSDSSAKRRHCILHSEQIDNO3,YTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTHSEQIDNO4,YRCKYCDRSFSDSSNLQRHVRNIHSEQIDNO5,YKCKECGKAFNHSSNFNKHHRIHSEQIDNO6,FKCPVCGKAFRHSSSLVRHQRTHSEQIDNO7,YRCKYCCDRSFSISSNLQRHVRNIHSEQIDNO8,YECDHCGKAFSIGSNLNVHR。
7、RIHSEQIDNO9,YGCHLCCKAFSKSSNLRRHEMIHSEQIDNO10,YKCKECGQAFRQRAHLIRHHKLHSEQIDNO11,YKCHQCGKAFIQSFNLRRHERTHSEQIDNO12,FQCNQCGASFTQKGNLNRHIKLHSEQIDNO13,权利要求书CN104220458A2/8页3YTCSYCGKSFTQSNTLKQHTRIHSEQIDNO14,YACHLCGKAFTQSSHRRHEKTHSEQIDNO15,YKCGQCGKFYSQVSHLTRHQKIHSEQIDNO16,YACHLCGKAFTQCSHLRRHEKTHSEQIDNO17,YAC。
8、HLCAKAFIQCSHLRRHEKTHSEQIDNO18,YVCRECGRGFRQHSHLVRHKRTHSEQIDNO19,YKCEECEGKAFRQSSHLTTHKIIHSEQIDNO20,YECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTHSEQIDNO21,YMCSECGRGFSQKSNLTIHQRTHSEQIDNO22,YKCEECGKAFTQSSNLTKHKKIHSEQIDNO23,FECKDCGKAFIQKSNLIRHQRTHSEQIDNO24,YVCRECRRGFSQKSNLIRHQRTHSEQIDNO25,YECEKCGKAFNQSSNLTRHKKSHSEQIDNO26,YECVQ。
9、CGKSYSQSSNLFRHQRRHSEQIDNO27,YECVQCGKGFTQSSNLITHQRVHSEQIDNO28,YECNTCRKTFSQKSNLIVHQRTHSEQIDNO29,YVCSKCGKAFTQSSNLTVHQKIHSEQIDNO30,YKCDECGKNFTQSSNLIVHKRIHSEQIDNO31,YECDVCGKTFTQKSNLGVHQRTHSEQIDNO32,YKCPDCGKSFSQSSSLIRHQRTHSEQIDNO33,YECQDCGRAFNQNSSLGRHKRTHSEQIDNO34,YECNECGKFFSQSSSLIRHRRSHSEQIDNO35,YKCEECGK。
10、AFNQSSTLTRHKIVHSEQIDNO36,YECNECGKAFAQNSTLRVHQRIHSEQIDNO37,YEVHDCGKSFRQSTHTLTQHRRIHSEQIDNO38,YECHDCGKSFRQSTHLTRHRRIHSEQIDNO39,HKCLECGKCFSQNTHLTRHQRTHSEQIDNO40,YVCDVEGCTWKFARSDELNRHKKRHSEQIDNO41,YHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHSEQIDNO42,YRCSWEGCEWRFARSDELTRHFRKHSEQIDNO43,FSCSWKGCERRFARSDELSRHRRTHSEQIDNO44,FA。
11、CSWQDCNKKFARSDELARHYRTHSEQIDNO45,YHCNWDGCGWKFARSDELTRHYRKHSEQIDNO46,FLCQYCAQRFGRKDHLTRHMKHSHSEQIDNO47,CRCNECGKSFSRRDHLVRHQRTHSEQIDNO48,FQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHSEQIDNO49,FACEVCGVRFTRNDKLKIHMRKHSEQIDNO50,YVCDVEGCTWKFARSDKLNRHKKRHSEQIDNO51,YKCMECGKAFNRRSHLTRHQRIHSEQIDNO52,权利要求书CN104220458A3/8页4YICRKCGRG。
12、FSRKSNLIRHQRTHSEQIDNO53,YECKECGKAFSSGSNFTRHQRIHSEQIDNO54,FHCGYCEKSFSVKDYLTKHIRTHSEQIDNO55,YECDHCGKAFSVSSNLNVHRRIHSEQIDNO56,YTCKQCGKAFSVSSSLRRHETTHSEQIDNO57,YECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIHSEQIDNO58,YRCEECGKAFRWPSNLTRHKRIHSEQIDNO59,FACDICGRKFARSDERKRHTKIHSEQIDNO60,CPVESCDRRFSRSDELTRHIRIHSEQIDNO61,和CDICGRKFARS。
13、DERKRHTKIHSEQIDNO62;所述基于锌指基序或金属离子结合蛋白基序而人工设计的金属离子结合基序是选自由以下序列组成的组中的任何一种PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTCSEQIDNO86,PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTMSEQIDNO87,PYKCPECGKSFSQKSALVKHQRTHTMECSEQIDNO88,PYKMECPECGKSFSQKSALVKHQRTHTHSEQIDNO89,PYKCPEMECGKSFSQKSALVKHQRTHTHSEQIDNO90,PYKCPEMECGKSFSQKSALVKHQRSEQIDNO91,GLKALEEKC。
14、KALEEKLKALEEKLKALEEKGSEQIDNO92,GLKALEEKLKALEEKLKACEEKLKALEEKGSEQIDNO93,GLKALEEKCKALEEKLKACEEKLKALEEKGSEQIDNO94,GLKALEEKLKALEEKCKALEEKLKALEEKGSEQIDNO95,GLKALEEKLKALEEKLKALEEKCKALEEKGSEQIDNO96,GLKALEEKLKALEEKLKALEEKLKAAEEKCKALEEKGSEQIDNO97,GLKALEEKLKALEEKCKALEEKLKAAEEKCKALEEKGSEQIDNO98,ELYALEKELGALEKE。
15、LACLEKELGALEKELYALEKSEQIDNO99,KLYALKEKLGALKEKLACLKEKLGALKEKLYALKESEQIDNO100,ELYALEKELGALEKELACLKEKLGALKEKLYALKESEQIDNO101,和KLYALKEKLGALKEKLACLEKELGALEKELYALEKSEQIDNO102;所述转录调节蛋白、金属螯合蛋白,金属离子转运蛋白或超氧化物歧化酶中的CYSXMCYS基序、METXCYSXXCYS基序或CQCQCAC基序是选自由以下序列组成的组中的任何一种CEIFCYDEEKVNRIQGDLQTVDISGVSQILKAIADENRAKITYA。
16、LCQDEELCVCSEQIDNO63,CDTHLVHLDNVRSSQAQILPTDKAQQMAEIFGVLADTNRIRLLSALASSELCVCSEQIDNO64,CDQPLVHLEQVRQVQPEVMSLDQAQQMAEFFSALADPSRLRLMSALARQELCVCSEQIDNO65,CDRAHLVDCSRVGDIQTQVLNTAKAQRMAEFFSLLGDANRLRVVSVLAKQELCVCSEQIDNO66,LSDETRLGIVLLLREMGELCVCDLCMSEQIDNO67,CCTLATGPLSSDESEHYADLFKVLGDPVRLRILSQLAAGGCSEQIDNO68,。
17、YRAAMPVVRALVAYLTENCCHGTRDCSEQIDNO69,权利要求书CN104220458A4/8页5CLRGCGLVVATYEGRQVRYALADSHLARALGELVQVVLAVDTDQPCSEQIDNO70,CLRDCGLVVTVPDGRRSRYELADERLGHALDDLRAAVVAVDADRTCPDADELECCSEQIDNO71,HXXWFYLX2128CXLFMVIGXWFLVIX1827HXXH其中X表示任何氨基酸,而XMQ表示除CYS之外的任何氨基酸残基,其数量由M到Q标明,VSGMDCAACARKVENAVRQLAGVNQVQVLFASEQIDNO72,VPG。
18、MTCSACPITVKKAISEVEGVSKVDVTFESEQIDNO73,ITGMTCDSCAAHVKEALEKVPGVQSALVSYSEQIDNO74,VQGFTCANCAGKFEKNVKKIPGVQDAKVNFGSEQIDNO75,VEGMTCNSCVWTIEQQIGKVNGEHHIKVSLESEQIDNO76,VVMTCSGCSGAVNKVLTKLEPDVSKIDISSEQIDNO77,GMTCASCVANIERNLRREEGIYSVSEQIDNO78,YEGMTCQSCVSSIEGKYRKLQGVVRYKVSLSEQIDNO79,GMSCQGCAGAVRRVLTKMEGVETFDID。
19、MESEQIDNO80,VPSITCSHCVDKIEKFVGEIEGVSFIDANVESEQIDNO81,VTGMTCAACSNSVEAALMNVNGVDVGGMTCGGCSASVKKLLESQPCVASASVSEQIDNO82,VSGMVCAACSTAVENALLSCSGVSEQIDNO83,DVGGMTCGGCSASVKKILESQPSEQIDNO84,和DVGGMKCGGCVEHVKKILEEQFGVTSASSEQIDNO85;所述具有环状结构的金属离子结合肽基序是环K1,12QCGVCGKCIACK;以及所述CGH基序具有由以下化学式1表示的结构化学式1其中M表示金属离子,R表示除半胱。
20、氨酸之外的氨基酸残基。6权利要求1所述的修饰抗体,其中所述亲本抗体是选自由单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体组成的组中的一种或多种。7权利要求1所述的修饰抗体,其中所述亲本抗体是选自由IGA、IGD、IGE、IGG和IGM组成的组中的一种或多种。8权利要求1所述的修饰抗体,其中所述亲本抗体具有对癌症特异性抗原、细胞表面受体蛋白、细胞表面蛋白、跨膜蛋白、信号蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织进化或分化相关的分子、淋巴因子、细胞因子、参与细胞周期调节的分子、参与血管发生的分子和与血管新生有关的分子的结合亲和性和特异性。9权利要求8所述的修饰抗体,其中所述对一种或多。
21、种蛋白质具有结合亲和性的亲本抗体选自由以下物质组成的组1BMPRIB骨形态发生蛋白受体IB型;GENBANK登录号NONM_001203;权利要求书CN104220458A5/8页62E16LAT1,SLC7A5;GENBANK登录号NONM_003486;3STEAP1前列腺六次跨膜上皮抗原;GENBANK登录号NONM_012449;40772PCA125,MUC16,GENBANK登录号NOAF361486;5MPFMPF,MSLN,SMR,巨核细胞促进因子,间皮素;GENBANK登录号NONM_005823;6NAPI3BNAPI3B,NPTIIB,SLC34A2,溶质携带物家族34磷。
22、酸钠,成员2,II型钠依赖的磷酸盐转运蛋白3B;GENBANK登录号NONM_006424;7SEMA5BFLJ10372,KIAA1445,MM42015,SEMA5B,SEMAG,壁板蛋白5BHLOG,SEMA结构域,七个血小板反应蛋白重复类型1和类型1样,跨膜结构域TM和短胞质结构域,壁板蛋白5B;GENBANK登录号NOAB040878;8PSCAHLG2700050C12RIK,C530008O16RIK,RIKENCDNA2700050C12,RIKENCDNA2700050C12;GENBANK登录号NOAY358628;9ETBR内皮素B型受体;GENBANK登录号NOAY27。
23、5463;10MSG783RNF124,假定蛋白质FLJ20315,GENBANK登录号NONM_017763;11STEAP2HGNC_8639,IPCA1,PCANAP1,STAMP1,STEAP2,STMP,前列腺癌相关基因1,前列腺癌相关蛋白1,前列腺六次跨膜上皮抗原2,六次跨膜前列腺蛋白,GENBANK登录号NOAF455138;12TRPM4BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,瞬时受体电位阳离子通道,M亚家族,成员4;GENBANK登录号NONM_017636;13CRIPTOCR,CR1,CRGF,CRIPTO,TDGF1,畸胎瘤衍生生长因子;GENBAN。
24、K登录号NONP_003203ORNM_003212;14CD21CR2补体受体2或C3DRC3D/EPSTEINBARR病毒受体或HS73792;GENBANK登录号NOM26004;15CD79BCD79B,CD79,IGB免疫球蛋白相关,B29,GENBANK登录号NONM_000626;16FCRH2IFGP4,IRTA4,SPAP1A含SH2结构域磷酸酶锚蛋白1A,SPAP1B,SPAP1C;GENBANK登录号NONM_030764;17HER2GENBANK登录号NOM11730;18选自EGFR、HER3和HER4的ERBB受体;19NCAGENBANK登录号NOM18728;。
25、20MDPGENBANK登录号NOBC017023;21IL20RGENBANK登录号NOAF184971;22BREVICANGENBANK登录号NOAF229053;23EPHB2RGENBANK登录号NONM_004442;24ASLG659GENBANK登录号NOAX092328;25PSCAGENBANK登录号NOAJ297436;26GEDAGENBANK登录号NOAY260763;27BAFFRB细胞活化因子受体,BLYS受体,BR3,NP_4431771;28CD22B细胞受体CD22B同种型;NP0017621;29CD79ACD79A,CD79,免疫球蛋白相关,与IGCD7。
26、9B共价相互作用并在表权利要求书CN104220458A6/8页7面上与IGM分子形成复合物的B细胞特异性蛋白,转导参与B细胞分化的信号;GENBANK登录号NONP_0017741;30CXCR5BURKITTS淋巴瘤受体1,由CXCL13趋化因子活化的G蛋白偶联受体,在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥功能,在HIV2感染中起作用并参与AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的发展;GENBANK登录NONP_0017071;31HLADOB与肽结合并将肽递呈到CD4T淋巴细胞的MHCII类分子的亚单元LA抗原;GENBANK登录号NONP_0021111;32P2X5嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5。
27、,由细胞外ATP门控的离子通道,可参与突触传递和神经发生,缺乏可导致特发性逼尿肌不稳定的病理生理学;GENBANK登录号NONP_0025522;33CD72B细胞分化抗原CD72,LYB2;GENBANK登录号NONP_0017731;34LY64淋巴细胞抗原64RP105,富含亮氨酸重复LRR家族的I型膜蛋白,调节B细胞活性和细胞凋亡,功能丧失与在系统性红斑狼疮患者中增加的疾病活性相关;GENBANK登录号NONP_0055731;35FCRH1FC受体样蛋白1,含类C2型IG免疫球蛋白FC结构域和ITAM结构域的假定受体,可在B淋巴细胞分化中起作用;GENBANK登录号NONP_4431。
28、701;36IRTA2免疫球蛋白超级家族受体转运相关蛋白2,在B细胞发育和淋巴瘤发生中可能起作用的假定免疫受体;通过转运对基因的失调控在一些B细胞恶性肿瘤中发生;GENBANK登录号NONP_1125711;和37TENB2假定跨膜蛋白聚糖,与生长因子和卵泡抑素EGF/HEREGULIN家族有关;GENBANK登录号NOAF179274;38MAGEC1/CT7睾丸癌中过表达的蛋白;39雄性激素受体,PTEN,人胰舒血管素相关肽3前列腺癌中过表达的蛋白;40CD20;41CD30;42CD33;43CD52;44EPCAM;45CEA;46GPA33;47粘液素;48TAG72;49碳酸酐酶I。
29、X;50PSMA;51叶酸结合蛋白;52神经节糖苷GD2、GD3、GM2;53水合物/糖LEWISY;54VEGF;55VEGFR;权利要求书CN104220458A7/8页856AVB3;57A5B1;58ERB3;59CMET;60EPHA3;61TRAILR1,TRAILR2;62RANKL;63FAP;和64细胞粘合素。10权利要求8所述的修饰抗体,其中所述亲本抗体包括选自由以下物质组成的组中的一种或多种曲妥单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗PANITUMUMAB、易普利姆玛IPILIMUMAB、阿仑单抗ALEMTUZUMAB、奥法木单抗OFATUMUMAB、吉姆单抗GE。
30、MTUZUMAB、贝伦妥单抗BRENTUXIMAB、90Y替伊莫单抗90YIBRITUMOMAB、131I托西莫单抗131ITOSITUMOMAB、CBR96、CACLO、抗CD20抗体、抗EPHB2抗体、抗IL8、E选择素抗体、抗MUC16抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体和抗CD52抗体。11一种修饰抗体药物缀合物,包括结合于权利要求1到10中任一项的修饰抗体的药物,其中所述药物缀合于所述基序中的半胱氨酸残基的巯基上,所述基序结合于亲本抗体并具有上式1所表示的结构。12权利要求11所述的修饰抗体药物缀合物,其中所述药物通过接头缀合于所述基序中的半胱氨酸残基,具有由上式1表示的结构的所述基。
31、序结合于所述亲本抗体上。13权利要求12所述的修饰抗体药物缀合物,其中所述接头是选自由以下物质组成的组中的一种或多种含卤代乙酰基基团的烷基卤化物衍生物、含马来酰亚胺基团的衍生物、环乙亚胺衍生物、丙烯酰基衍生物和含氟代苯的芳基卤化物衍生物或类似物。14权利要求13所述的修饰抗体药物缀合物,其中所述衍生物包括烷基化反应基团、芳基化反应性基团、马来酰亚胺基团、环乙亚胺基团、丙烯酰基基团、或含吡啶基二硫化物和硫硝基苯甲酸的二硫键交换反应基团,所述基团与所述基序中的半胱氨酸残基的巯基基团反应并共价结合于其上。15权利要求11所述的修饰抗体药物缀合物,其中所述药物为选自由以下物质组成的组中的一种或多种微管。
32、蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或能够起到DNA嵌入剂作用的化学治疗剂、抗癌剂、能够起到酶作用的蛋白质毒素、能够抑制特定癌基因表达的微小RNAMIRNA、SIRNA或SHRNA以及放射性同位素。16权利要求11所述的修饰抗体药物缀合物,其中所述药物为选自由以下物质组成的组中的一种或多种类美坦素、奥里斯他汀、氨基蝶呤、放线菌素、博来霉素BLEOMYCIN、他利霉索TALISOMYCIN、喜树碱CAMPTOTHECIN、N8乙酰基亚精胺、12氯乙基1,2二甲基甲苯磺酰肼、紫杉醇、埃斯培拉霉素ESPERAMICIN、依托泊苷ETOPOSIDE、6巯基嘌呤、多拉司他汀、单端孢霉烯、CC10。
33、65细胞毒性化合物、卡奇霉素及其它烯二炔抗生素、紫杉烷TAXANE、蒽环类ANTHRACYCLINE、甲氨蝶呤、阿霉素ADRIAMYCIN、长春地辛、长春花碱、长春新碱、长春碱、依托泊苷、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、正定霉素、道诺霉素及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物,核权利要求书CN104220458A8/8页9水解酶、抗生素,细菌、植物或动物来源的毒素,以及诸如顺铂、CPT11,多柔比星、紫杉醇和多西他赛。17一种制造修饰抗体药物缀合物的方法,包括A将所述修饰抗体与接头反应剂反应形成抗体接头中间产物,其中所述修饰抗体带有由下式1所表示的结构的基序;和B使所述中间产物与。
34、活性药物部分反应以生成修饰抗体药物缀合物XAMCYSNXBNN式1其中MCYSN表示简单半胱氨酸残基或者含有半胱氨酸残基并具有特定功能的肽基序或二级或三级结构,XA和XBN各独立地表示包括0到20个除半胱氨酸以外的氨基酸残基的肽,N是1到20范围的整数。18一种制造修饰抗体药物缀合物的方法,包括A将药物部分的亲核基团与接头试剂反应以形成药物接头中间产物;B使所述中间产物与亲本抗体反应,所述亲本抗体包括结合于其上的基序,并且其中所述基序具有由下式表示的结构XAMCYSNXBNN式1其中MCYSN表示简单半胱氨酸残基或者含有半胱氨酸残基并具有特定功能的肽基序或二级或三级结构,XA和XBN各独立地表。
35、示包括0到20个除半胱氨酸以外的氨基酸残基的肽,N是1到20范围的整数。19一种制造修饰抗体的方法,所述修饰抗体包括结合于亲本抗体的基序,所述方法包括如下步骤A构建表达载体,所述表达载体包括多核苷酸序列,其中编码所述基序的多核苷酸基序和编码所述亲本抗体的多核苷酸序列重组地彼此连接;B使用宿主细胞在培养物中表达所构建的表达载体;和C从所述培养物中分离和纯化所述修饰抗体,其中所述基序具有由下式表示的结构XAMCYSNXBNN式1其中MCYSN表示简单半胱氨酸残基或者含有半胱氨酸残基并具有特定功能的肽基序或二级或三级结构,XA和XBN各独立地表示包括0到20个除半胱氨酸以外的氨基酸残基的肽,N是1到。
36、20范围的整数。20权利要求19所述的方法,其中所述宿主细胞选自由以下物质组成的组猴肾细胞7COS7、NSO细胞、SP2/0细胞、中国仓鼠卵巢CHO细胞细胞、W138、幼仓鼠肾BHK细胞、MADINDARBY犬肾MDCK细胞、骨髓瘤细胞系、HUT78细胞和HEK293细胞。21一种治疗组合物,包括权利要求11至16中任何一项所述的修饰抗体药物缀合物。权利要求书CN104220458A1/28页10结合有含半胱氨酸残基的基序的修饰抗体,含该修饰抗体的修饰抗体药物缀合物以及其制造方法技术领域0001本发明涉及一种修饰抗体,该修饰抗体包括结合于亲本抗体,优选所述亲本抗体的末端,更优选所述亲本抗体的重。
37、链或轻链的末端,最优选所述亲本抗体的重链或轻链的C末端的含半胱氨酸CYS的基序MOTIF;一种包括结合于所述修饰抗体且用于诊断或治疗的药物的修饰抗体药物缀合物MADC;以及一种用于制造所述修饰抗体或所述修饰抗体药物缀合物的方法。0002由于包括在缀合物中的亲本抗体的高度抗原特异性,根据本发明的修饰抗体药物缀合物能够准确地将药物递送至靶细胞,因而能够提高药物的治疗效果。而且,其能够提高药物,特别是具有高抗癌功效的抗癌药物的效用,所述具有高抗癌功效的抗癌药物由于毒性而使用受到限制。0003此外,本发明涉及一种治疗疾病特别是癌症的组合物,所述组合物包括所述修饰抗体药物缀合物,本发明还涉及一种利用所述。
38、修饰抗体药物缀合物来治疗疾病的方法。0004根据本发明的修饰抗体药物缀合物可含有许多能够用于与药物缀合的半胱氨酸残基,因为含有一个或多个半胱氨酸残基的基序结合于亲本抗体。因而,其能够包含大量结合于其上的药物,且该大量的结合药物能够被有效地递送至靶细胞或靶组织。此外,由于能够容易地控制结合于亲本抗体的半胱氨酸残基的数量,所以能够将包含在该修饰抗体药物缀合物MADC内的药物的量容易地控制在所希望的水平。背景技术0005在生物制药当中,对利用抗体的治疗剂被进行了最为积极的研究,该治疗剂特异性地结合于在特定疾病中特异性地表达的靶标即抗原。特别地,正在积极地进行对在癌细胞表面上表达的肿瘤相关抗原的识别,。
39、并且利用结合于所述抗原以抑制细胞生长或诱导细胞死亡的抗体即抗癌抗体来诊断和治疗肿瘤的方法正在被广泛使用,这些方法的领域也具有非常好的前景。0006这种抗癌抗体具有非常高的靶特异性,但它们在癌细胞上的细胞毒性效应通常低于现有的细胞毒性药物即抗癌药物或抗癌剂的细胞毒性效果。故在许多情况下,这些抗癌抗体被用于与细胞毒性药物或其它细胞增殖抑制药物的组合治疗。0007关于上述组合治疗,对修饰抗体药物缀合物MADC进行了积极的研究,其中结合的细胞毒性药物的治疗效果提高同时毒性降低。人们认识到,当使用修饰抗体药物缀合物时,能够减少药物的全身毒性并且能够增加药物的细胞毒性,尤其是在其中具有过表达的靶标的细胞中。
40、特别是癌细胞中,从而提高药物的治疗效果。0008事实上,已经成功地开发出用于治疗非霍奇金淋巴瘤NONHODGKINLYMPHOMA或急性骨髓性白血病的、包含缀合于抗体的细胞毒性药物或放射性同位素的修饰抗体药物缀合物,如EVALINTMWITZIG等人,JCLINONCOL,2002,201532623269或说明书CN104220458A102/28页11MYLOTARGTMDRUGSOFTHEFUTURE,2000,257686。此外,已经进行了许多尝试以将高毒性的美坦新MERTANSINE如莫坎妥单抗美坦新CANTUZUMABMERTANSINEIMMUNOGEN,INCXIE等人,JOF。
41、PHARMANDEXPTHER2004,308310731082或曲妥单抗美坦新TRASTUZUMABMERTANSINEROCHEISAKOFF等人,JCLINONCOL2011,2943514与抗体缀合,或者将其它的细胞毒性药物,例如多拉司他汀DOLASTATIN衍生物,如奥里斯他汀肽AURISTATINPEPTIDES、奥里斯他汀EAURISTATINE,AE、单甲基奥里斯他汀MMAE或MMAF与抗体缀合,所述抗体如CBR96特异于癌上的LEWISY、对血液系统恶性肿瘤上的CD30特异的CAC1O、或用于治疗表达CD20癌症的抗CD20抗体、或针对免疫失调的RITUXAN、用于治疗结肠癌。
42、的抗EPHB2R抗体、2H9、抗IL8或E选择素ESELECTIN抗体KLUSSMAN等人,BIOCONJUGATECHEMISTRY,2004,154765773;DORONINA等人,NATUREBIOTECHNOLOGY,2003,217778784;FRANCISCO等人,BLOOD,2003,102414581465US2004/0018194A1WO04/032828A3;MAO等人,CANCERRESEARCH,2004,643781788;BHASKAR等人,CANCERRES,2003,6363876394。0009另外,还已经对开发利用道诺霉素DAUNOMYCIN、多柔比星。
43、DOXORUBICIN、甲氨蝶呤METHOTREXATE或长春地辛VINDESINE的修饰抗体药物缀合物进行了尝试。已知诸如白喉毒素的细菌毒素、诸如蓖麻毒素的植物毒素或诸如格尔德霉素MANDLER等人,JOFTHENATCANCERINST,2000,921915731581;MANDLER等人,BIOORGANICMEDCHEMLETTERS,2000,1010251028;MANDLER等人,BIOCONJUGATECHEM,2002,13786791,类美坦素MAYTANSINOIDEP1391213A1;LIU等人,PROCNATLACADSCIUSA,1996,9386188623或。
44、卡奇霉素CALICHEAMICINLODE等人,CANCERRES,1998,582928;HINMAN等人,CANCERRES,1993,5333363342的小分子可以用作抗体药物缀合物中的药物。这些细胞毒性药物通过诸如微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制之类的机制来表现细胞毒性和细胞增殖抑制效果。0010当采用用于诱导药物与抗体之间共价键连接的常规工艺来制备如上所述的抗体药物缀合物时,药物将结合于抗体中的许多位点,产生非均匀性的混合物。例如细胞毒性药物很可能通过包含在抗体中的许多赖氨酸残基而结合于抗体,从而产生非均匀性的抗体药物缀合物混合物。而且,该非均匀性的混合物根据反应条件可能具。
45、有范围从0到大约8的不同药物结合分布,这意味着每单位抗体所结合的药物分子的数量有所变化。0011而且,对于具有限定数量的药物结合的抗体药物缀合物而言,根据不同的缀合位点,还可能有另一种潜在的非均匀性。对这种非均匀性的混合物进行均匀性纯化并不适合用于药物的大规模生产HAMBLETT等人,CLINCANCERRES,2003,10,70637070,WANG等人,PROTEINSCI2005,14,24362446。0012将药物缀合于抗体的另一种方法是通过还原剂来还原抗体中半胱氨酸残基之间的二硫键,然后将药物缀合于被还原的半胱氨酸残基的游离巯基基团。这种方法同样具有缺点,即抗体固有的特性可能失去。
46、且产生大量的非均匀性的混合物。具体而言,免疫球蛋白M是一个二硫键连接的五聚体的实例,而免疫球蛋白G是一个以内部二硫桥将亚基键接在一起的蛋白质的实例。在这种蛋白质中,用诸如二硫苏糖醇DTT或硒醇之类的试剂还原二硫键会生成反应性游离巯基SINGH等人,ANALBIOCHEM2002,304147156。这种途径可导致抗体三级结构和抗原结合特异性的丧失JAGATH等人,NATUREBIOTECHNOLOGY,说明书CN104220458A113/28页122008,26892532。0013如上所述的常规的抗体药物缀合方法的代表性缺点在于难以精确地控制抗体中的药物缀合位点和缀合药物的数量。在一种为克。
47、服这一问题并引入游离巯基基团的尝试中,特定的氨基酸被半胱氨酸所取代,而取代的半胱氨酸不会损害抗体功能。为此,在预测抗体中每个可能的突变位点中的巯基基团的反应性之后,开发了针对最佳半胱氨酸突变体的筛选方法韩国专利公开第20070054682号,“THIOFABTECHNOLOGY”。通过该方法生产的曲妥单抗美坦新的抗体药物缀合物在临床试验中用于治疗转移性乳腺癌BURRISIII等人,JCLINONCOL,2011,294398405。上述THIOFAB技术具有这样的优点,即对亲本抗体中二硫键的破坏能够通过将新的半胱氨酸引入抗体而最小化,但是关于结构修饰和亲本抗体功能的担心仍然存在,因为亲本抗体中。
48、的一些氨基酸被半胱氨酸突变。0014因此,迫切需要开发一种新的抗体药物缀合物及其制造方法,其中能够准确地控制缀合于亲本抗体的药物分子的数量和位置,同时保持亲本抗体的结构和功能特征。发明内容0015为解决上述存在于现有技术中的问题而做出本发明,本发明的一个目标在于提供一种新抗体下文中称为“修饰抗体”,该抗体包括含有一个或多个结合于亲本抗体的半胱氨酸残基以提供多个药物结合位点的基序。本发明的另一目标在于提供一种包含结合于所述修饰抗体的药物的修饰抗体药物缀合物。0016根据本发明的修饰抗体能够高效地缀合与各种药物,同时保留亲本抗体的特征,因而其具有高度的靶特异性并且提高了所述缀合药物的治疗效果。00。
49、17本发明的修饰抗体具有如下优点其包括含有一个或多个半胱氨酸残基的基序,因而药物能够缀合于这些半胱氨酸残基并且缀合的药物能够被有效地递送至靶组织。另外,能够准确地控制能结合药物的半胱氨酸残基的数量,因而能够控制在修饰抗体药物缀合物中药物分子的数量或用量。因此,本发明的修饰抗体药物缀合物能够用作优异的药物递送系统,该药物递送系统克服了常规抗体药物缀合物的问题并能够高效地用于治疗诸如癌症之类的疾病。0018另外,由于根据本发明的修饰抗体药物缀合物对抗原的高度特异性,从而能够准确地将药物递送至靶细胞,故其能够提高药物的治疗效果,并且还改善了药物,特别是抗癌药物的效用,所述抗癌药物尽管具有高抗癌功效,但由于毒性而使用受到限制。附图说明0019图1是包括含半胱氨酸的曲妥单抗的修饰抗体表达载体的载体图谱。0020图2示出在曲妥单抗右边两道和含半胱氨酸的曲妥单抗变体HRCYS,左边两道纯化后的HRCYS的WESTERN印记图像。0021图3示出进行UVVIS光谱A和SDSPAGEB的结果以证实多柔比星是否缀合于HRCYS。0022图4示出针对HERM2CYSALEXA488,即HERM2CYS抗体变体与ALEXA488的缀合物,ASDSPAGE凝胶电泳和B结合于重链和轻链每个的ALEXA488染料的相对荧光强度分析的结果。说明书CN104220458A124/28页130023图。