色素相关基因作为直观标记的花粉介导植物转基因方法.pdf

一种色素相关基因作为直观标记的花粉介导植物转基因方法，目的是根据转化处理种子颜色变化直观地对转化种子进行选择，简化筛选步骤，缩短获得转化子的周期；本发明方法以携带色素相关外源基因及其启动子的农杆菌Ti质粒、大肠杆菌质粒或其它DNA载体为基因供体，以植物的雄配子体花粉为受体，在经过通气和低温处理的0.15-1.5mol的蔗糖溶液中使花粉与DNA片段混合，通过超声波辅助对花粉悬浮液的作用使外源基因转移到受体花粉中；然后将处理花粉授到植物柱头上，并在籽粒成熟时予以收获；在随后的生长季根据种子颜色变化对转化处理后收获的种子进行初步选择，使种子发芽，并对成苗株样本DNA进行PCR扩增及Southern杂交等分子检测验证，进一步确定转化株。

权利要求书1.  一种色素相关基因作为直观标记的花粉介导植物转基因方法，其特征是以携带色素相关外源基因及其启动子的农杆菌Ti质粒、大肠杆菌质粒或其它DNA载体为基因供体，以植物的雄配子体花粉为受体，在经过通气和低温处理的0.15-1.5 mol的蔗糖溶液中使花粉与DNA片段混合，通过超声波辅助对花粉悬浮液的作用使外源基因转移到受体花粉中；然后将处理花粉授到植物柱头上，并在籽粒成熟时予以收获；在随后的生长季根据种子颜色变化对转化处理后收获的种子进行初步选择，然后使种子发芽，并对成苗株样本DNA进行PCR扩增及Southern杂交等分子检测验证，进一步确定转化株。2.  根据权利要求1所述的色素相关基因作为直观标记的花粉介导植物转基因方法，其特征是所述的花粉是具有活力的花粉。3.  根据权利要求1所述的色素相关基因作为直观标记的花粉介导植物转基因方法，其特征是使用的外源基因为色素相关的外源基因(转录因子）。4.  根据权利要求1所述的色素相关基因作为直观标记的花粉介导植物转基因方法，其特征是使用的外源基因启动子可以是组成型、诱导型或组织特异性启动子。5.  根据权利要求1所述的色素相关基因作为直观标记的花粉介导植物转基因方法，其特征是在加入花粉和外源DNA片段前需对蔗糖溶液进行通气和低温处理，使用小型空气泵给蔗糖溶液连续通气20分钟以上，使蔗糖溶液中的空气含量达到饱和状态，同时将蔗糖溶液置于0—4℃冰浴或冰箱中预处理，并在以后的操作过程中始终将花粉悬浮液置于0—4℃冰浴中。6.  根据权利要求1或3所述的色素相关基因作为直观标记的花粉介导植物转基因方法，其特征是在加入外源DNA前后，分别对花粉悬浮液进行超声波处理，所用超声波功率为50—500W，每次处理时间为5秒—2分钟，并在籽粒成熟时收获处理种子。7.  根据权利要求６所述的色素相关基因作为直观标记的花粉介导植物转基因方法，其特征是在播种前根据颜色变化对收获的转基因处理种子进行初步筛选，然后根据PCR、Southern杂交等分子检测方法确认转基因株系。8.  根据权利要求７所述的色素相关基因作为直观标记的花粉介导植物转基因方法，其特征是对获得的转基因当代和后代进行连续自交和筛选，直至获得稳定纯合的转基因品系。

说明书色素相关基因作为直观标记的花粉介导植物转基因方法
技术领域
本发明涉及一种改进的植物花粉介导转基因方法，属于生物技术领域。
背景技术
植物转基因研究对于提高农作物产量、抗病虫能力、抗逆性和改进品质等方面具有重要意义。经过三十余年的理论研究和技术开发，植物转基因方法已经取得了长足的进展，技术越来越趋于成熟并于育种中应用。自1983年第一例转基因植物问世以来，植物转基因研究得到迅速发展，1996年第一例转基因产品实现了商业化生产，截止到2013年底，转基因作物商业化种植面积已达1.75亿公顷，17年间增长了100倍以上（James2014,　http://www.isaaa.org/purchasepublications/itemdescription.asp,ItemType=BRIEFS&Control=IB046-2013）。尽管转基因植物不断出现，但是该项技术在食品安全及较大范围内的普及应用还存在不少缺陷，大面积应用到商业化生产中的转基因作物品种只有玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等少数几种作物。对植物转基因技术的研究进展缓慢，缺乏能高效、实用和大规模转化作物品种的转基因方法是阻碍植物基因工程产生更大经济效益的主要原因之一。对绝大多数植物而言，转基因技术还只停留在实验室阶段。目前使用最为广泛的植物转基因方法为农杆菌介导法和基因枪介导法。这两种方法的共同特点是需要经过植物组织培养过程，即被转化的植物细胞要通过组织培养的方法进行再生。这两种方法有以下共同的缺点：1）植物组织培养过程繁琐冗长，耗时长，效率低；2）为了便于筛选转基因后代植株，绝大多数植物表达载体中都含有抗抗生素或抗除草剂等选择标记基因，这就增加了对转基因食品安全性方面的担忧；3）由于只有部分植物种的部分基因型可以通过组织培养途径获得再生植株，因而采用该方法进行转基因有很大的基因型局限性。4）由于必须使用大量的组织培养设备，因而植物转化工作只能由具有相应条件的实验室开展；而常规育种人员无法使用该技术。5）此外，目前常用的两种转基因方法均为国外公司拥有专利，我国科研人员仅可以用这两种方法从事研究，但如果用这两种方法选育出的转基因农作物品种进入大规模商业化生产，将有可能不得不向国外公司支付巨额专利使用费。
自1997年以来，我们研究组一直致力于开发拥有我国自主知识产权的非组培植物转基因方法并已经获得5项相关的发明专利，其中包括利用已转化的花粉进行植物转基因的方法(ZL 99121152.9和ZL 201110041484)和农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法（ZL 01104185.4）。这些方法现已在玉米(王景雪等，植物学报, 2001, 43(3): 275-279；张明义等，生物技术通报, 2011, 5: 80-86；宋鉴达等，玉米科学, 2012, 20(2): 48-51, 55；王守云等，玉米科学2013，21(2)：52～57)、油菜（杜春芳等，作物学报, 2006, 32(5): 749-754； Wang et al, Transgenic Research, 2008，17: 417-424）、高粱(Wang et al，Applied Biochemistry and Biotechnology,2007,48:79–83)、野罂粟（魏玉杰等，中国农学通报2010,26(15):32-37）等作物中成功应用。我们希望能够建立一种更加安全可靠并且易于识别的植物转基因标记，提高植物转基因的效率，简化其程序，加快其进程，并减少公众对其安全性方面的担忧，使其成为安全简便的农作物品种改良技术。
与通过组织培养途径不同的是，花粉介导法通过采用转化花粉授粉后所得到的籽粒中可直接筛选到转基因籽粒，加快了转基因育种进程；而且已被证明对许多开花植物都适用，基本没有对基因型的依赖性。该方法与周光宇（中国农业科学，1978，10（2）：16－20 ）提出的花粉管通道法的本质区别在于，该方法首先利用超声波对花粉进行转化，然后用经过转化处理的花粉进行授粉，获得转化种子；而花粉管通道法是在用正常花粉授粉后滴加DNA溶液，使其通过已形成的花粉管进入胚囊，进而产生转化种子。花粉管通道法虽然简便，易操作，但须种植很大的T0代群体，且长期以来因缺乏确凿的分子生物学证据而未得到国际广泛认可。而我们发明的花粉介导法由于转化处理后获得的种子数目不多，所需要管理的转化后代群体不大，因而转化率（以获得的转化处理T0代种子为基数）较高，最高转化率可达39.6%。
如果能够有高效简便的方法从大量的转化处理种子中直接筛选到转化籽粒，不仅可以使以上转基因方法在育种实践中广泛应用，而且将大大简化利用其它转基因方法进行植物品种改良的步骤，并加快其进程。本发明旨在将花青素基因作为标记基因通过花粉介导的转基因方法使其在玉米胚或其他组织中特异表达，以便通过胚及其他组织的颜色改变直观地选择转化籽粒，从而避免种植大量当代和后代的转化处理种子以及利用分子手段进行初筛的繁琐。
转基因中常用的选择标记基因一般为对除草剂基因或抗生素有抗性的基因及一些能产生对植物细胞有毒害作用的代谢产物的基因（Miki and McHugh,Journal of Biotechnology , 2004, 107(3): 193-232）。由于这类选择标记基因本身对植物有毒，且对人体及动物的影响还没有完全明了，所以这就在很大程度上限制了转基因作物在生产及食品上的广泛应用。而以花青素为代表的天然植物色素对人体是有益的，用其做选择标记可以极大地提高转基因食品的安全性，广泛用于生产。例如，花青素是水溶性天然色素，属类黄酮化合物，广泛存在于植物中，包括日常食物如番茄、茄子、西瓜、草莓、黑米、黑豆、黑麦及黑芝麻等。近年来的研究表明，花青素可以抗氧化，清除体内自由基，所以其对糖尿病、心血管疾病、癌症及与衰老有关的退化性疾病有预防和抵抗作用，故从转基因植物营养角度和安全性的方面来考虑，用花青素作为标记对人和动物是有益无害的（亓燕红等，山东农业大学，2011）。因其在植物中的广泛存在，对自然环境也是安全的。
近年来关于花青素的研究主要集中在其生物合成途径，代谢调控及生物学功能方面。其生物合成需要多种酶的参与。编码这些酶的结构基因的转录表达主要有两种调节基因控制。这两种调节基因分别编码两类转录因子，bHLH factor 和MYB factor。 有关花青素用于转基因中标记基因的研究并不多，在单子叶植物中仅是Doshi等（Plant, 2007, 43: 429-435）构建了花青素调控因子Bperu、C1与胚特异启动子LTP1的载体并通过基因枪法转入了小麦和小黑麦（小麦与黑麦的杂交麦）中，获得了紫色胚的小麦和小黑麦转化种子。Janica等（Plant Cell Reports, 2009, 28 (6): 903-913）用花青素调节基因Lc和C1 作转化标记试验Floral Dip 在小麦上的应用。Shen和Petolino（Molecular Breeding, 2006, 18: 57-67）通过农杆菌介导法将花青素调控因子Bperu、C1与玉米胚特异启动子globulin构建的载体导入玉米，获得了紫色胚的玉米转化种子。由于玉米是单子叶植物，所以用农杆菌介导结合组织培养法再生转基因植株不仅费工耗时，而且成活率低。在双子叶中 Kortstee（Transgenic Research, 2011, 20: 1253-1264） 等用花青素作标记进行了苹果，草莓和马铃薯的转基因试验。所有这些转基因研究都是通过植物组织培养途径进行的，因而未能充分发挥花青素作为直观选择标记的优越性。
发明内容
本发明目的是克服上述已有技术的不足，提供一种可根据转化处理种子颜色变化直观地对转化种子进行选择、简化对转基因种子的筛选步骤、缩短获得转化子的周期并减少对转基因植物的担忧的色素相关基因作为直观标记的花粉介导植物转基因方法。
本发明方法是：以携带色素相关外源基因及其启动子的农杆菌Ti质粒、大肠杆菌质粒或其它DNA载体为基因供体，以植物的雄配子体花粉为受体，在经过通气和低温处理的0.15-1.5 mol的蔗糖溶液中使花粉与DNA片段混合，通过超声波辅助对花粉悬浮液的作用使外源基因转移到受体花粉中；然后将处理花粉授到植物柱头上，并在籽粒成熟时予以收获；在随后的生长季根据种子颜色变化对转化处理后收获的种子进行初步选择，然后使种子发芽，并对成苗株样本DNA进行PCR扩增及Southern杂交等分子检测验证，进一步确定转化株。
所述的花粉是具有活力的花粉。使用的外源基因为色素相关的外源基因(转录因子）。在加入外源DNA前后，分别对花粉悬浮液进行超声波处理，所用超声波功率为50-500W，每次处理时间为5秒-2分钟，并在籽粒成熟时收获处理种子。在播种前根据颜色变化对收获的转基因处理种子进行初步筛选，然后根据PCR、Southern杂交等分子检测方法确认转基因株系。对获得的转基因当代和后代进行连续自交和筛选，直至获得稳定纯合的转基因品系。
使用的外源基因启动子可以是组成型、诱导型或组织特异性启动子。在加入花粉和外源DNA片段前需对蔗糖溶液进行通气和低温处理，使用小型空气泵给蔗糖溶液连续通气20分钟以上，使蔗糖溶液中的空气含量达到饱和状态，同时将蔗糖溶液置于0—4℃冰浴或冰箱中预处理，并在以后的操作过程中始终将花粉悬浮液置于0—4℃冰浴中。
本发明方法采用安全可靠并且易于识别的植物转基因标记可以提高植物转基因的效率，简化其程序，加快其进程，并减少公众对其安全性方面的担忧，使生物技术成为安全简便的和易于被大多数公众所接受的农作物品种改良技术。本发明在先前的花粉介导植物转基因方法发明基础上，利用含有花青素标记的载体进行玉米转基因，将会极大地简化植物转基因操作过程。在以往的研究中，对花青素基因的遗传转化采用的都是农杆菌介导法或基因枪法，这两种方法都需要经过组培过程再生植株，不仅转化率低而且耗时长。本发明非组培植物转基因方法最大的创新之处在于简便高效、无基因型依赖性，可使植物基因工程育种手段从人们普遍认为的实验室高精尖技术转变为广大常规育种工作者易于操作的一种植物遗传改良的常规手段。将这些转基因方法与植物色素选择表达系统相结合，使处理当代和转化后代的转基因籽粒更易于筛选，为植物基因工程提供一种高效、简便、实用、经济、快速的转化新方法，使转基因技术成为常规育种家对植物进行遗传改良的一项基本技术，从而加快生物工程育种进程，并大量拓宽育种资源，对植物转基因方法会产生巨大的推动作用。其主要特点和创新之处如下：
1．本方法采用花粉作为植物转化的天然载体，并使用植物体内含的天然色素基因（调控子）作为标记基因，实现了对转化籽粒的直观选择，可以大大缩短获得转基因种子的时间。用经典的农杆菌或基因枪介导法不仅操作复杂，周期长（通常获得转化种子需要10个月甚至更长时间），而且通过组织培养法再生幼苗的成活率很低。采用组培方法转基因只能用于少数特定品种，其农艺性状往往不佳，因此需要再增加5-6代以上的杂交和回交才能获得农艺性状优良的转基因品种。而用花粉介导法和胚表达天然色素标记基因转化玉米，可以转化大多数品种，仅需40－50天（即从授粉到种子成熟）就可获得转化种子。
2．可以极大地简化转化体的筛选过程。由于色素基因在种子中特异表达，可以直观和直接地选出转化种子，省去了对疑似转化体进行抗性检测的大量工作。
3．可以在很大程度上消除公众对植物转基因产品的疑虑。花青素等天然色素不仅对人体无害，还有抗氧化、清除体内自由基的保健作用，消除了以抗除草剂或抗生素基因做选择标记基因带来的有关安全性方面的担忧。
4．可以减少遗传累赘（genetic drag）对转基因品种产量和其它性状表达的负面影响。组织特异性启动子使植物色素只在玉米胚或其它特定组织内表达，与组成型启动子相比，不会因为色素的过量表达而影响植物的光合作用和正常的生长发育，对植物的农艺性状也不会产生重大影响。
5．本转化体系可供从事常规育种研究的人员使用，使转基因技术成为植物遗传改良的基本技术手段。
6．本转化体系不仅对玉米适用，而且也将能够用于其它植物。这将会大大降低植物转基因的筛选检测工作量。
附图说明
图1为本发明使用含花青素基因质粒的结构图；
图2为采用本发明方法后的部分玉米果穗上的转化T0代籽粒图（左面为未转化对照籽粒，右面为转化籽粒）；
图3为本发明转基因植株的PCR检测图；
图4为转花青素基因T1代玉米籽粒。
具体实施方式
利用含花青素标记基因的载体和花粉介导法转化玉米；利用花粉介导法和含有外源花青素基因的pLtp1CB转化载体对玉米进行了转化处理。其具体操作步骤如下：
利用超声波辅助的花粉介导法进行遗传转化：
（１）供试材料：植物材料为玉米自交系郑58，基因供体质粒为载体pLtp1CB（附图1）
（２）转化处理方法：玉米种子于5月初播种于太原我中心实验田，7月中旬进入盛花期。在开花抽丝前将待转化处理的雌雄穗分别套袋，次日上午10点左右收集新鲜花粉，悬浮于0.45 mol蔗糖溶液中，进行初次超声波处理，加入质粒 DNA（质粒与花粉粒的混合比例大约为1：30000 W/W）后，再次超声波处理。超声波处理参数为：功率 200 W，单次工作时间 6 s，间隙时间10 s，处理次数6次。处理后的花粉略经沉淀后倒掉上清液，涂抹于经过剪切的花丝上，并将雌穗套袋，秋季收获 T0代种子。
根据当代结实种子的颜色变化对收获的转基因处理种子进行初步筛选，种植后获得转化植株；然后根据PCR、Southern杂交等分子生物学检测结果确认转基因株系；
在用处理花粉授粉的3424个玉米雌穗上收获932颗籽粒，其中36颗籽粒的颜色明显加深，呈棕或褐色（图2）。颜色改变籽粒数占总数的3.86%。
对转化株（T０）及其后代（T１．．．．．．）植株根据种子或其他器官颜色改变继续进行筛选；对获得的转基因株系进行连续自交和筛选，直至获得稳定纯合的转基因品系；
待T０代植株长至4-5叶期时，取约200 mg幼嫩叶片样品装到1.5ml离心管中，用液氮超低温速冻，然后置于-20oC冰箱保存，以备提取DNA用或采用改良的CTAB法直接提取总DNA。
用PCR和Southern杂交等分子生物学技术进一步验证转基因后代；对提取的T1代植株进行PCR检测。检测时以质粒DNA pLtp1CB为阳性对照，非转化植株的DNA为阴性对照，提取的转基因植株DNA为模板，用引物LTP1C1/fw1和LTP1C1/rv1（图3）做PCR检测 。
PCR反应体系为：ddH2O 16 uL，10×PCR buffer(含Mg2+) 2 uL， dNTP(10 mmol/L) 0.4 uL， 引物1(10 umol/L) 0.5 uL， 引物2(10 umol/L) 0.5 uL，Taq DNA聚合酶(5 U/uL) 0.2 uL，模板DNA（50-200 ng/uL）0.4 uL，总体系为20ul。
PCR程序
94℃预变性   5 min
94℃变性     30 s
55℃退火     45 s
72℃延伸     30 s
按上述程序进行30个循环后，于72 ℃终延伸10 min。
将PCR产物于1% 琼脂糖凝胶上电泳分离，凝胶成像系统上观察。
从附图3可以看到在预期的位置出现特异性目的条带：泳道1为以质粒pLTP1BC为扩增模板的正对照；泳道2~5扩增模板来源为非转基因植株，6~9扩增模板来源为转基因株系中有紫粒表型的植株。扩增片段大小为700bp。引物序列为：LTP1C1/fw1: GAGGAAGTATAATATAAGGC;  LTP1C1/rv1 : GGCACTTCCCTCCATTTG
将收获的T0代种子播种得到了T1代转化株，于4-5叶期取叶片进行PCR扩增检测。将检测结果为阳性的玉米植株套袋自交，收获T1代种子并根据种子颜色继续筛选转化籽粒。这样不仅获得了转化T0代种子，而且也获得了暗紫或棕色的T1代种子（见图4），说明花青素基因在转化后代种子中仍然能够表达。证明导入的外源花青素基因可以遗传给下一代继续产生转花青素基因的T1种子。我们可以进一步对这些转化后代做鉴定或开发其应用。