利用三裂叶野葛毛状根生产葛根素的方法 (一)技术领域
本发明涉及一种通过生物工程途径生产葛根素的方法，具体地讲，是指利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri质粒(生根质粒)的T-DNA(Ri质粒的一段可转移进入植物细胞基因组中整合并表达的DNA)对三裂叶野葛(Pueraria phaseoloides)细胞的遗传转化所产生的毛状根来生产葛根素的方法。
(二)背景技术
葛根是卫生部第三批公布(1998年)的既是食品又是药品的天然植物之一。其根部含有的主要成分葛根素具有清热解毒、开胃生津、健脾止渴、解肌发汗之功效；主要用于治疗视网膜动、静脉阻塞、突发性耳聋、心肌梗塞、冠心病、心绞痛、高血压等病症。虽然国内外报道可利用野葛愈伤组织或悬浮细胞培养来获得葛根素等异黄酮类组分，但这种未分化的愈伤组织或悬浮细胞的生长既不够快又不能自主生长，必需添加外源激素维持其细胞继续生长；同时其葛根素产率又不高或不稳定，因而至今未见以此方式进行野葛葛根素扩大生产的报道。目前制药工业中仍靠从采挖的野生葛根中提取葛根素。但由于野葛野生资源终究有限，同时挖掘野生葛根，不仅不利于保护野生资源，而且会造成水土流失，破坏生态环境，不符合我国经济的可持续发展。因此，寻找一种新的生产葛根素地方法就显得至关重要。
(三)发明的内容
本发明的目的在于提供一种新的生产葛根素的方法，它是一种利用发根农杆菌生根质粒对三裂叶野葛细胞的遗传转化所产生的毛状根来大规模生产葛根素的方法。由于所产生的毛状根具备在无激素培养基上快速自主生长的特性，因而它能克服利用细胞培养时细胞培养物生长缓慢，需外加激素维持其生长的不足，而且具有葛根素产出率高、培养时操作简便、成本较低等优点。
本发明方法具体包括如下步骤：
(1)三裂叶野葛外植体的选择与处理：以三裂叶野葛无菌苗的幼嫩叶片为材料，切块待用(供感染用)，或切块后置于MS培养基中预培养24-48h后待用(供感染用)。
(2)发根农杆菌的活化培养：取含野生型Ri质粒的发根农杆菌ATCC15834单菌落接种至不添加或添加了20-100μM乙酰丁香酮的YEB液体培养基中，在26±2℃恒温暗环境中振荡培养24-48h；然后对该菌液进行无菌离心，所得菌体沉淀用MS液体培养基进行悬浮、稀释，制成菌悬液待用。
(3)叶片外植体的感染及其毛状根的诱导：将叶片外植体置于用MS液体培养基悬浮稀释的发根农杆菌菌悬液中，26±2℃下浸泡5-30分钟，取出，吸干水分和多余菌液后，于无外源激素的MS培养基中26±2℃放置2-3天后，转接至添加了400-800mg/L头胞噻肟钠或羧苄青霉素的无外源激素的MS培养基上，于26±2℃、12-14h/d光照、光照强度1500-2500lux条件下除菌培养10-15天后，从叶片外植体切口中脉处或从切口表面形成的愈伤组织上产生毛状根。
(4)无菌三裂叶野葛毛状根系的获得：将所产生的毛状根切下，并置于含400-800mg/L头胞噻肟钠或羧苄青霉素的无外源激素的MS培养基上进行单根离体培养，每隔一周转接一次，转接4-6次后获得无菌的能在无激素培养基上自主生长的毛状根；用冠瘿碱高压纸电泳和PCR(聚合酶链式反应)对毛状根进行遗传转化鉴定后，挑选生长迅速的转化毛状根进入下一步操作。
(5)三裂叶野葛毛状根的液体培养及葛根素的产生：将毛状根转接至改良MS液体培养基中，于26±2℃恒温、转速为90-110r/min的条件下振荡暗培养12-16天，取出毛状根、烘干、研磨成粉，用80％(v/v，下同)的甲醇或95％(v/v，下同)乙醇结合2-4分种超声波处理进行过夜浸提，提取液冻干即为所要的葛根素。
在上述方法的步骤(1)中，三裂叶野葛无菌苗通过如下两种通用方式获得：第一，在无菌条件下，将取自三裂叶野葛黄色荚果中的浅黄色种子置于75％(v/v，下同)的酒精中处理30秒，再用0.1％(w/v，下同)升汞表面消毒灭菌20-25分钟，无菌水充分漂洗后，移植于MS固体培养基中萌发，于每天12-14h光照，光照强度为1500-2500lux，26±2℃下培养，得到所需的无菌苗；第二，在无菌条件下，将取自三裂叶野葛黑色荚果中的、已进入休眠的褐色种子置于75％(v/v)的酒精中处理30秒，然后用0.1％(w/v)升汞表面消毒灭菌20-25分钟，无菌水充分漂洗后，再用20mg/L(毫克/升，下同)的6-苄基氨基嘌呤浸泡种子24-36小时，移植于MS固体培养基中萌发，于每天12-14h光照，光照强度为1500-2500lux，26±2℃下培养35-40天，得到所需的无菌苗。叶片切块的具体要求是：在无菌条件下将幼嫩叶片切成0.5-1.5cm2具或不具叶柄的叶块。
步骤(2)中，发根农杆菌单菌落活化培养的最佳培养基为YEB+20μM乙酰丁香酮，其中乙酰丁香酮以过滤灭菌方式加入至YEB培养基中。恒温暗环境中振荡培养24-48h的具体操作如下：将农杆菌置于转速为140r/min-200r/min的摇床或振荡器中培养。农杆菌菌液无菌离心的具体做法是：将菌液置于4℃转速5000r/min的离心机中离心5-10分钟。
在步骤(3)中，三裂叶野葛叶片外植体用发根农杆菌菌悬液浸泡的最好时间为20分钟；受感染的叶片外植体在无激素MS培养基上共培养的最合适时间为48h；培养时间太长，外植体周围发根农杆菌繁殖旺盛，易导致叶片外植体变黄，叶片外植体产生毛状根的百分数显著降低。共培养后的叶片外植体的除菌培养所用抗生素的最适浓度为500mg/L，但头胞噻肟钠的除菌效果比相同浓度的羧苄青霉素好。
在步骤(4)中，获得无菌毛状根的具体做法如下：切取从叶片外植体产生的毛状根根段并转接至添加抗生素羧苄青霉素或头胞噻肟钠的MS培养基中，每周转接一次，转接时剔除生长缓慢的毛状根，仅转接生长迅速的毛状根，直到将毛状根转接至无抗生素的培养基上培养一周后都不会形成农杆菌菌落，才可用此能自主生长的无菌三裂叶野葛毛状根进入第(5)步操作。
在步骤(5)中，改良液体MS培养基是指在MS培养基中添加了Mes(Mes，2-morpholinoethanesulfonic acid)，以稳定该培养基的pH值，使毛状根在恒定的pH条件下生长，其用量为10mM，其余均与MS培养基相同。毛状根在液体培养基中生长及产生葛根素的最佳培养条件如下：MS培养基+10mM Mes，转速为100r/min，26±2℃。液体培养12天后毛状根中的葛根素含量达到最高，约每克干重毛状根含5.16mg。培养16天后毛状根的生长量达到最高值。用95％乙醇提取毛状根中葛根素的效果比80％的甲醇略好。
在本发明中，MS培养基(Murashige and Skoog 1962)是本领域常用的培养基，在组织培养方面的教材或著作中均可查到其配方。YEB培养基是基因工程领域常用的用来培养发根农杆菌的培养基，在基因工程的实验指导或有关的实验手册中均可获得其配方。本实验所选用的含农杆碱型野生Ri(生根质粒)的发根农杆菌ATCC15834，可通过向美国典型培养物保存中心(ATCC，American Typical Cultures Center)购买获得。所用的抗生素头胞噻肟钠或羧苄青霉素均可凭医生处方从医院药房购得；所用的6-苄基氨基嘌呤及乙酰丁香酮，购自Sigma公司；Lux是光照强度的计量单位，即勒克斯。min为分钟；mM为毫摩尔浓度。μM为微摩尔浓度。h指小时。r/min表示每分钟的转速。
与现有的技术相比，本发明方法具有如下的优点或效果：
(1)与从野生葛根提取葛根素的现今生产方式相比，利用毛状根来生产以根入药的药用植物的有效成分葛根素，既具有生长快，葛根素产量高而稳定等特点；又不会造成水土流失，破坏生态环境和占用耕地，而且其葛根素含量又不受产地和生长季节的影响。
(2)与已报道的利用愈伤组织或愈伤组织产生的悬浮细胞生产葛根素的方式相比，由于发根农杆菌生根质粒遗传转化所产生的三裂叶野葛毛状根具有生长迅速，又可以在无激素培养基上快速自主生长及遗传稳定等特点。因而，与必须添加昂贵或对人体有害的外源激素或植物生长调节剂以维持细胞正常生长的细胞培养方式相比，毛状根的生长速度不仅比悬浮细胞快得多，而且不需添加外源激素或植物生长调节剂来维持其旺盛生长，而且毛状根中的葛根素产出率有很大幅度提高，同时操作更方便，生产成本更低廉。
(3)本发明利用的是具有葛根素含量高且遗传稳定的毛状根来生产葛根素，因而可望避免利用愈伤组织或悬浮细胞易产生变异的不足，能达到利用毛状根稳定生产葛根素的目的。
(四)具体的实施方式
实施例1：
(1)三裂叶野葛外植体的选择与处理：将三裂叶野葛无菌幼苗的幼嫩叶片切成适当大小的小方块，并置于盛MS培养基的无菌玻璃培养瓶中预培养24h后待用。
(2)发根农杆菌的活化培养：取发根农杆菌单菌落接种至添加了20μM乙酰丁香酮的YEB液体培养基中，并置于恒温摇床中，28℃、160r/min下暗培养30h；该菌液经5000r/min无菌离心5分钟后，菌体沉淀用MS液体培养基将菌体沉淀悬浮、稀释后，进入第三步操作。
(3)叶片外植体的感染及其毛状根的诱导：将上述预培养的三裂叶野葛叶片小块置于用MS液体培养基悬浮稀释的发根农杆菌菌悬液中，于28℃下浸泡20分钟后；取出、用无菌滤纸吸干水分和多余菌液后，将该叶片外植体接回至原预培养的无激素MS培养基中，28℃共培养2天后，转接至添加了500mg/L头胞噻肟钠的无外源激素的MS培养基上，于28℃，每天12h光照，光照强度为2000lux下除菌培养。2周后，从叶片外植体切口中脉处产生的浅绿色愈伤组织上产生毛状根或从切口中脉处直接产生出白色的毛状根，产生毛状根的叶片外植体百分数约为80％。
(4)无菌三裂叶野葛毛状根系的获得：将三裂叶野葛叶片植体产生的毛状根切下并置于含500mg/L头胞噻肟钠的无外源激素的MS培养基上进行单根除菌培养，并每隔一周转接1次。转接5次后获得无菌的、能在无外源激素培养基上自主生长的毛状根后，通过冠瘿碱高压纸电泳和PCR(聚合酶链式反应)对毛状根进行遗传转化鉴定，挑选生长迅速的转化毛状根进入下一步操作。
(5)三裂叶野葛毛状根的液体培养及其葛根素的产生：将毛状根转接至无外源激素的改良MS液体培养基中，在26±2℃、转速为100r/min的恒温摇床中振荡暗培养。12天后取出毛状根，于60℃烘干，研磨成粉末后，用95％乙醇结合3分种超声波处理进行过夜浸提，共浸提3次，合并提取液并冻干成粉末，即获得葛根素。用高效液相色谱法测定毛状根的葛根素含量为每克干重5.16mg，约为三裂叶野葛种子萌发幼苗根葛根素含量的10.7倍。
实施例2：
其它同实施例1，在步骤(1)中，叶片外植体预培养48h。步骤(2)中，发根农杆菌单菌落在添加40μM乙酰丁香酮的YEB液体培养基中26℃、140r/min振荡培养36h。步骤(3)中，叶片外植体在发根农杆菌菌悬液中浸泡10分钟，在无外源激素的MS培养基中共培养3天后，移入添加了400mg/L羧苄青霉素的培养基中除菌培养。步骤(4)中，毛状根在添加400mg/L羧苄青霉素的培养基中除菌培养。转接4次后获得无菌的、能在无外源激素培养基上自主生长的毛状根。步骤(5)中，毛状根在24℃、95r/min振荡培养14天后，用95％乙醇及4分钟超声波处理过夜浸提毛状根干粉末。
实施例3：
其它同实施例1，在步骤(1)中，无菌苗叶片外植体勿经无外源激素的MS培养基中预培养。步骤(2)中，发根农杆菌单菌落在不加乙酰丁香酮的YEB液体培养基中180r/min振荡暗培养48h，无菌离心培养时间为10分钟。步骤(3)中，叶片外植体在发根农杆菌菌悬液中浸泡30分钟，共培养3天后，转入添加了800mg/L头胞噻肟钠的无外源激素的MS培养基上，在24℃、每天14h光照、光照强度为2500lux下除菌培养10天；步骤(4)中，毛状根在添加800mg/L头胞噻肟钠的无外源激素培养基中除菌培养。转接6次后获得无菌的、能在无外源激素培养基上自主生长的毛状根。步骤(5)中，毛状根在28℃、110r/min振荡培养16天后，用95％乙醇及2分钟超声波处理过夜浸提毛状根干粉末。
实施例4：
其它同实施例1，在步骤(1)中，叶片外植体预培养40h。步骤(2)中，发根农杆菌单菌落在添加100μM乙酰丁香酮的YEB液体培养基中26℃、150r/min振荡培养40h。步骤(3)中，叶片外植体在发根农杆菌菌悬液中浸泡5分钟，在无外源激素的MS培养基中共培养3天后，移入添加了800mg/L羧苄青霉素的培养基中，在25℃、每天14h光照、光照强度为1500lux下培养15天。步骤(4)中，毛状根在添加800mg/L羧苄青霉素的培养基中除菌培养。步骤(5)中，毛状根在24℃、转速为90r/min的恒温摇床中振荡暗培养14天后，用80％甲醇及4分钟超声波处理过夜浸提毛状根干粉末。
实施例5
其它同实施例1，在步骤(1)中，叶片外植体预培养36h。步骤(2)中，发根农杆菌单菌落在不加乙酰丁香酮的YEB液体培养基中200r/min振荡暗培养48h。步骤(3)中，叶片外植体在发根农杆菌菌悬液中浸泡5分钟，共培养3天后，转入添加了400mg/L头胞噻肟钠的无外源激素的MS培养基上除菌培养；步骤(4)中，毛状根在添加400mg/L头胞噻肟钠的无外源激素培养基中除菌培养。步骤(5)中，采用95％乙醇及2分钟超声波处理过夜浸提毛状根粉末。
实施例6：
其它同实施例1，在步骤(1)中，叶片外植体预培养30h。步骤(2)中，发根农杆菌单菌落在不加乙酰丁香酮的YEB液体培养基中140r/min、26℃振荡暗培养48h。步骤(3)中，叶片外植体在发根农杆菌菌悬液中浸泡5分钟，共培养3天后，转入添加了400mg/L头胞噻肟钠的无外源激素的MS培养基上除菌培养；步骤(4)中，毛状根在添加400mg/L头胞噻肟钠的无外源激素培养基中除菌培养。步骤(5)中，采用95％乙醇及4分钟超声波处理过夜浸提毛状根粉末。
实施例7：
其它同实施例1，在步骤(1)中，无菌苗叶片外植体预培养36h。步骤(2)中，发根农杆菌单菌落在添加60μM乙酰丁香酮的YEB液体培养基中24℃、180r/min振荡暗培养40h。步骤(3)中，叶片外植体在发根农杆菌菌悬液中浸泡15分钟，共培养3天后移入添加了400mg/L头胞噻肟钠的无外源激素的MS培养基上除菌培养。步骤(5)中，毛状根干粉末经80％甲醇结合2分钟超声波处理浸提。所测得的葛根素含量为每克干重4.83mg。
实施例8：
其它同实施例1，在步骤(1)中，无菌苗叶片外植体预培养36h。步骤(2)中，发根农杆菌单菌落在25℃、180r/min振荡暗培养40h。步骤(3)中，叶片外植体在发根农杆菌菌悬液中浸泡15分钟，共培养3天后移入添加了600mg/L头胞噻肟钠的培养基上，在27℃、每天14h光照、光照强度为1500lux下除菌培养。步骤(5)中，毛状根干粉末用80％甲醇结合4分钟超声波处理浸提毛状根干粉末。